Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Pålideligt at konstruere og kontrollere stabile optogenetiske genkredsløb i pattedyrceller

Published: July 6, 2021 doi: 10.3791/62109
Automatic Translation
1,2,3, *2, *2, 1,2
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program
* These authors contributed equally

Summary

Pålidelig styring af lysresponsive pattedyrceller kræver standardisering af optogenetiske metoder. Mod dette mål skitserer denne undersøgelse en pipeline af genkredsløbskonstruktion, celleteknik, optogenetisk udstyrsoperation og verifikationsassays for at standardisere undersøgelsen af lysinduceret genekspression ved hjælp af et optogenetisk genkredsløb med negativ feedback som et casestudie.

Abstract

Pålidelig genekspressionskontrol i pattedyrceller kræver værktøjer med høj foldændring, lav støj og bestemte input-to-output-overførselsfunktioner, uanset hvilken metode der anvendes. Mod dette mål har optogenetiske genekspressionssystemer fået stor opmærksomhed i løbet af det sidste årti for spatiotemporal kontrol af proteinniveauer i pattedyrceller. Imidlertid varierer de fleste eksisterende kredsløb, der styrer lysinduceret genekspression, i arkitektur, udtrykkes fra plasmider og bruger variabelt optogenetisk udstyr, hvilket skaber et behov for at udforske karakterisering og standardisering af optogenetiske komponenter i stabile cellelinjer. Her giver undersøgelsen en eksperimentel pipeline af pålidelig genkredsløbskonstruktion, integration og karakterisering til styring af lysinducerbar genekspression i pattedyrceller ved hjælp af et negativt feedback optogenetisk kredsløb som et case-eksempel. Protokollerne illustrerer også, hvordan standardisering af optogenetisk udstyr og lysregimer pålideligt kan afsløre genkredsløbsfunktioner såsom genekspressionsstøj og proteinekspressionsstørrelse. Endelig kan dette papir være til nytte for laboratorier, der ikke er bekendt med optogenetik, der ønsker at vedtage en sådan teknologi. Den her beskrevne rørledning bør gælde for andre optogenetiske kredsløb i pattedyrceller, hvilket giver mulighed for mere pålidelig, detaljeret karakterisering og kontrol af genekspression på transkriptionelt, proteomisk og i sidste ende fænotypisk niveau i pattedyrceller.

Introduction

I lighed med andre ingeniørdiscipliner sigter syntetisk biologi mod at standardisere protokoller, hvilket gør det muligt at bruge værktøjer med meget reproducerbare funktioner til at udforske spørgsmål, der er relevante for biologiske systemer1,2. Et domæne inden for syntetisk biologi, hvor mange kontrolsystemer er blevet bygget, er området for genekspressionsregulering3,4. Genekspressionskontrol kan målrette mod både proteinniveauer og variabilitet (støj eller variationskoefficient, CV = σ / μ, målt som standardafvigelsen over gennemsnittet), som er afgørende cellulære egenskaber på grund af deres roller i fysiologiske og patologiske cellulære tilstande5,6,7,8. Mange syntetiske systemer, der kan styre proteinniveauer og støj4,9,10,11,12, er blevet konstrueret, hvilket skaber muligheder for at standardisere protokoller på tværs af værktøjer.

Et nyt sæt værktøjer, der kan kontrollere gennetværk, der for nylig er opstået, er optogenetik, der muliggør brug af lys til at kontrollere genekspression13,14,15,16,17. I lighed med deres kemiske forgængere kan optogenetiske genkredsløb indføres i enhver celletype, lige fra bakterier til pattedyr, hvilket muliggør ekspression af ethvert nedstrøms gen af interesse18,19. På grund af den hurtige generering af nye optogenetiske værktøjer er der imidlertid opstået mange systemer, der varierer i genetisk kredsløbsarkitektur, ekspressionsmekanisme (f.eks. plasmidbaseret vs. viral integration) og lysforsyningskontroludstyr11,16,20,21,22,23,24,25 . Derfor giver dette plads til standardisering af optogenetiske træk såsom genkredsløbskonstruktion og optimering, metode til systemudnyttelse (f.eks. Integration vs. forbigående ekspression), eksperimentelle værktøjer, der anvendes til induktion, og analyse af resultater.

For at gøre fremskridt med at standardisere optogenetiske protokoller i pattedyrceller beskriver denne protokol en eksperimentel pipeline til at konstruere optogenetiske systemer i pattedyrceller ved hjælp af et negativt feedback (NF) genkredsløb integreret i HEK293-celler (human embryonal nyrecellelinje) som et eksempel. NF er et ideelt system til at demonstrere standardisering, da det er meget rigeligt26,27,28 i naturen, hvilket gør det muligt at indstille proteinniveauer og støjminimering at forekomme. Kort fortalt giver NF mulighed for præcis genekspressionskontrol af en repressor, der reducerer sit eget udtryk tilstrækkeligt hurtigt og derved begrænser enhver ændring væk fra en stabil tilstand. Steady state kan ændres af en inducer, der inaktiverer eller eliminerer repressoren for at muliggøre mere proteinproduktion, indtil en ny stabil tilstand er nået for hver inducerkoncentration. For nylig blev der oprettet et konstrueret NF-optogenetisk system, der kan producere et bredt dynamisk respons af genekspression, opretholde lav støj og reagere på lysstimuli, der muliggør potentialet for rumlig genekspressionskontrol11. Disse værktøjer, kendt som lysinducerbare tunere (LITere), blev inspireret af tidligere systemer, der tillod genekspressionskontrol i levende celler4,10,29,30 og blev stabilt integreret i humane cellelinjer for at sikre langsigtet genekspressionskontrol.

Her er der ved hjælp af LITer som et eksempel skitseret en protokol til oprettelse af lysresponsive genkredsløb, inducering af genekspression med et lyspladeapparat (LPA, en optogenetisk induktionshardware)31 og analysere reaktioner fra de konstruerede, optogenetisk kontrollerbare cellelinjer til brugerdefinerede lysstimuli. Denne protokol giver brugerne mulighed for at bruge LITer-værktøjerne til ethvert funktionelt gen, de ønsker at udforske. Det kan også tilpasses til andre optogenetiske systemer med forskellige kredsløbsarkitekturer (f.eks. Positiv feedback, negativ regulering osv.) ved at integrere de metoder og optogenetisk udstyr, der er beskrevet nedenfor. I lighed med andre syntetiske biologiske protokoller kan de videooptagelser og optogenetiske protokoller, der er skitseret her, anvendes i enkeltcellestudier på forskellige områder, herunder, men ikke begrænset til, kræftbiologi, embryonal udvikling og vævsdifferentiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Genkredsløb design

  1. Vælg genetiske komponenter, der skal kombineres til et enkelt genkredsløb/plasmid (f.eks. pattedyrs DNA-integrationssekvensmotiver32, lysresponsive elementer33 eller funktionelle gener34).
  2. Ved hjælp af enhver form for genteknologi og/eller molekylær kloningssoftware skal DNA-sekvenserne opbevares til senere brug og reference, kommentere hver sekvens og undersøge alle de nødvendige funktioner (f.eks. START-kodoner, regulatoriske eller oversatte sekvenser)35.
  3. Udvikle eller vedtage dele i henhold til det overordnede genkredsløbsdesign36. For optogenetiske repressorer som i LITers11 kan man f.eks. sammensmelte en gensekvens, der koder for et domæne, der er i stand til lysinducerbar nedbrydning37,38 eller inaktivering af en repressors DNA-bindingsevne39, der støder op til og inden for rammerne af repressorgenet (f.eks. TetR)4.
    1. For optogenetiske aktivatorer skal du sikre tilstedeværelsen af et aktivatordomæne40, der fremmer genekspression ved lysinduceret DNA-binding41. Ved negativ eller positiv autoregulering skal det sikres, at der er et regulatorisk bindingssted i eller opstrøms for regulatorgenets promotor (f.eks. tetO-steder i eller opstrøms for TetR-ekspressionen)42.
  4. Design primerne til DNA-sekvensamplifikation eller sekventering af plasmidet ved hjælp af den molekylære kloningssoftware til hvert genkredsløb.
  5. Valider primerne beregningsmæssigt til plasmidkonstruktion gennem de indbyggede feastures af molekylær kloningssoftware (f.eks. Sekvensjustering).
  6. Bestil oligonukleotidprimere fra producenten. Plasmider konstrueret og anvendt i dette arbejde kan findes i det originale understøttende materiale11 sammen med de primere, der er designet og brugt.
  7. Fortynd primerne til 100 mM lagerkoncentration i dobbeltdestilleret vand (ddH2O).
  8. Fortynd bestanden af 100 mM lagerprimere til 10 mM koncentration for PCR.
  9. PCR-blandingen forberedes med 1 μL fremadrettet primer, 1 μL omvendt primer, 1 μL skabelon-DNA til en samlet masse på 0,5-500 ng for genomisk eller 0,5 pg-5 ng for plasmid eller viralt DNA, 12,5 μL DNA-polymerase 2x masterblanding (eller det volumen, der opfylder producentens fortyndingsfaktor) og 9,5 μL ddH2O for et samlet reaktionsvolumen på 25 μL.
  10. Inkuber PCR-blandingen i en termocyklist ved passende indstillinger afhængigt af det valgte enzym43. Foreslåede reaktionscyklusser omfatter:
    Trin 1: En cyklus på 30 s indledende denatureringstrin ved 95 ° C.
    Trin 2: 40 cyklusser af 5 s denatureringstrin ved 98 °C.
    Trin 3: En cyklus på 30 s udglødningstrin ved 65 °C (bestemt af primere designet tidligere).
    Trin 4: En cyklus på 1 minuts forlængelse ved 72 ° C (~ 1 kilobase (kb) skabelonfragmentlængde).
    Trin 5: En cyklus med en 2 minutters forlængelse ved 72 °C.
    Reaktionen holdes ved 4 °C, indtil den kan testes via gelelektroforese. Denne protokol vil variere afhængigt af de anvendte reagenser (f.eks. Polymerase og buffere).
  11. Gentag trin 1.9 for at forstærke alle de fragmenter, der skal anvendes i en DNA-samlingsreaktion, der kræves for at forbinde lineære PCR-produkter til en enkelt cirkulær DNA-vektor.
  12. Kør PCR-produkterne på en 1% agarosegel efterfulgt af rensning af båndene af den ønskede længde.
  13. Forbered masterblandingen til en DNA-samlingsreaktion (tabel 1).
    BEMÆRK: I dette eksempel opdeles modervektoren i to fragmenter for at øge effektiviteten af PCR-trinnene uden at forårsage væsentlige ændringer i det samlede samlingsresultat.
  14. Inkuber DNA-samlingsreaktionsmasterblandingen i en termocyklist ved 50 °C i 1 time (medmindre andet er specificeret i DNA-samlingsreagensprotokollen), og reaktionen opbevares ved 4 °C for at anvende reaktionsproduktet til bakteriel transformation.
  15. Opsæt bakteriel transformation (kemisk eller elektroporation) ved hjælp af kompetente E. coli (Escherichia coli) celler og den tilsvarende bakterielle transformationsprotokol. Efter transformation skal du bruge de bakterielle Luria-Bertani (LB) agarplader, der indeholder den valgte bakterielle selektionsmarkør (f.eks. Ampicillin) til at plade transformationsblandingen. Inkuber pladerne ved 37 °C natten over44.
  16. Kontroller pladerne den følgende dag. For at inokulere kolonierne skal du plukke individuelle kolonier fra pladerne og genudsætte dem i en flydende LB-bouillon med den tilsvarende bakterielle udvælgelsesmarkør i kulturrør. Inkuber i en shaker inkubator ved 37 °C, 300 o / min natten over.
  17. Udfør plasmidforberedelsesprotokol for at ekstrahere plasmid-DNA'et fra bakteriekulturen.
  18. Valider kredsløbet i to trin. Udfør først en testfordøjelse ved hjælp af restriktionsenzymer som en rå verifikation for at se, om det omtrentlige plasmidprodukt blev opnået. For det andet, hvis testfordøjelsen er bestået/bekræftet, skal plasmidet indsendes til en Sanger-sekventeringsfacilitet (eller proces ved hjælp af det tilgængelige udstyr) for at opnå den nøjagtige DNA-sekvens for senere at sammenligne den med den forventede sekvens i designsoftwaren.
    1. For at udføre testfordøjelsen skal du vælge mindst to restriktionsenzymer, der producerer mindst to fragmenter, baseret på den anvendte molekylære kloningssoftware. Når enzymer er udvalgt, forberedes testprøverne ved at tilsætte 1 μL af hvert enzym, 5 μL af det genererede DNA og 13 μL vand med passende salte og buffere afhængigt af de anvendte enzymer. Inkubere reaktionen ved 37 °C i 1 time, eller som enzymproducenten antyder. Kør testfordøjelsesprodukterne på en 1% agarosegel og bestem, om båndene er korrekte.
      BEMÆRK: Hvis båndene er korrekte, skal du fortsætte til sekventering.
    2. For at udføre sekventering skal du generere primere baseret på DNA'et, der er gemt i softwaren, så udglødningsområderne i primerne er ca. 500 bp (basepar) fra hinanden og dækker fragmentet af interesse (genkredsløbskomponent) eller det fulde plasmid. Fortynd primerne med rent nukleasefrit vand (NF-H2O) til 10 mM koncentration. Sekventeringsprøverne forberedes ved at tilsætte 1 μL 10 ng/μL DNA, 1 μL primer og 8 μL NF-H2O til et 0,2 ml rør. Gentag dette for hver primer.
      BEMÆRK: Når prøver er forberedt, skal du aflevere dem på sekventeringsanlægget og sammenligne resultaterne med plasmidsekvens ved hjælp af molekylær kloningssoftware.
  19. På dette trin genereres ca. 100-1000 ng / μL DNA-prøve til integration af plasmiderne indeholdende genkredsløb i den relevante cellelinje.

2. Stabil cellelinjeteknik

  1. Bestil en pattedyrcellelinje designet til hurtig generering af stabile underlinjer, der sikrer ekspression på højt niveau af proteinet af interesse fra en pattedyrs ekspressionsvektor. Celletypen og letheden ved cellelinjeteknik kan variere afhængigt af hvad brugerne foretrækker eller sigter mod at opnå.
    1. For eksempel, hvis brugerne foretrækker cellelinjeteknik med minimale mellemliggende trin, skal du bestille de celler, der indeholder et enkelt stabilt integrationssted (f.eks. FRT) på et transkriptionelt aktivt genomisk locus. Hvis mere nuanceret celleteknik foretrækkes, skal du oprette integrationssteder på foretrukne steder ved hjælp af genteknologiske værktøjer som CRISPR / Cas9.
  2. Dyrk celler i 5% CO2 i befugtet luft ved 37 °C. Juster vækstbetingelserne efter behov for celletypen.
  3. Transfektere genkredsløbene designet ovenfor i de ønskede celler opnået fra de foregående trin for at starte en stabil cellelinjegenereringsproces. For at opnå dette skal du bruge en liposomblanding45 af genkredsløbets DNA med passende rekombinase (for eksempel Flp-rekombinase til Flp-FRT-rekombination) eller gennem andre metoder såsom elektroporation.
  4. To dage efter transfektion opdeles cellerne til 25% sammenløb.
  5. Seks timer efter opdeling af cellerne begynder antibiotikaudvælgelsen ved at udveksle mediet til et nyt medie, der indeholder 50 μg/ml hygromycin-antibiotikum (eller et andet antibiotikummiddel svarende til det pattedyrs antibiotikaresistensgen, der blev valgt under plasmidkonstruktionen).
    BEMÆRK: Der er en række pattedyrs antibiotikaresistensgener, der anvendes i genkredsløbskonstruktion, som hver især har en anden drabskurve. Derfor, uanset hvilket pattedyrs antibiotikaresistensgen der vælges til kredsløbskonstruktion, bør en ordentlig drabskurve undersøges i de celler, der er af interesse. Dette trin sikrer, at celler, der indeholder genkredsløbets nyttelast, beriges, mens de uden systemet dræbes.
  6. Lad cellerne vokse i antibiotikaudvælgelsesmediet, skift til friske medier hver 2-3 dage, indtil pladen eller kolben har et par dusin foci. Passage adhæftende kulturer, når de er i logfasen, før de når sammenløbet.
  7. Når der er tilstrækkeligt mange foci, trypsinisere cellerne med 1 ml 0,25% trypsin, 0,1% EDTA i Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) uden calcium, magnesium og natriumbicarbonat i flere minutter. Neutraliser trypsin med friske medier og send alle cellerne i en frisk beholder.
  8. Når cellerne i den friske beholder er 80%-100% sammenflydende, fryses de ned i en blanding af 45% gamle medier, 45% friske medier og 10% DMSO. Overfør de resterende celler til et sterilt rør og udfør enkeltcellesortering for at isolere monoklonale celler i en 96-brønds plade.
  9. Ca. 2-3 uger efter monoklonal sortering skal brønde inden for 96-brøndspladen have foci. Når ca. 50% -60% sammenflydende, opdeles cellerne i en 12-brønds plade.
  10. Når pladen med 12 brønde er 80-100 % sammenflydende, opdeles den i en vævskultur behandlet T-25-kolbe. Når cellerne i T-25-kolben er 80%-100% sammenflydende, fryser cellerne og opretholder en passage til karakterisering og testning af monoklonale cellelinjer.
    1. Karakteriser de monoklonale cellelinjer ved mikroskopi og flowcytometriassays for at rapportere genekspressionsprofiler baseret på den inducerede fluorescerende reporterproduktion. Kontroller funktionel proteinproduktion via fluorescerende antistofmærkning og immunofluorescensassay. Test transkriptionelt niveau genekspressionsinduktion via kvantitativ real-time PCR (qRT-PCR). Valider den genetiske sekvens og integrationsnøjagtighed via lokal og helgenomsekventering af klonerne.

3. Induktionsassays til lette pladeapparater

  1. Konstruer en LPA-enhed31,46, der skal bruges til lysinduktion af konstruerede celler. Kort fortalt er flere brede trin afgørende for at skabe LPA til brug for at kontrollere genekspression. Disse omfatter 3D-udskrivning af LPA-rammekomponenter, printkortkonstruktion, programmering af kredsløbet via mikrocontrollerprogrammør, samling af komponenterne til en endelig LPA, programmering af hukommelseskortet via IRIS-software, og kalibrering af den færdige enhed. For en mere grundig forklaring henvises til ovenstående referencer.
    1. Udskriv 3D-delene som skitseret i Gerhardt et al. (2016 og 2019) 31,46.
    2. Saml printkortet som beskrevet i Gerhardt et al. (2016 og 2019)31,46.
    3. Føj firmwaren til det samlede LPA-kredsløb ved hjælp af mikrocontrollerprogrammør som beskrevet i Gerhardt et al. (2016 og 2019) 31,46.
    4. Kombiner 3D-trykte dele og det samlede printkort som beskrevet i Gerhardt et al. (2016 og 2019) 31,46. Dette inkluderer at tage monteringspladen, printkortet, LED-afstandsrummet (lysemitterende dioder), pladeadapteren, en plade med 24 brønde, et pladelåg, monteringsbolte, og vingemøtrikker og stablingskomponenter som vist i den filmede video og figur 2.
    5. Følg nedenstående trin for hukommelseskortprogrammering og kalibrering af enheden.
  2. Brug IRIS-softwaren, der er tilgængelig på Tabor Lab-webstedet47 , til at programmere et SD-kort til Light Plate Apparatus (LPA)31 og udforske passende lysforhold, der er nødvendige for at starte et optogenetisk eksperiment.
    BEMÆRK: IRIS-softwaren er en webbaseret applikation til programmering af den optogenetiske elektroniske hardware, kendt som LPA, udviklet af Tabor Lab. Softwaren tillader programmering af relative IRIS-værdier, der styrer de enkelte lysemitterende dioder (LED'er) i hver brønd i LPA-hardwaren.
  3. Vælg rullemenuen LPA (4 x 6) efterfulgt af at klikke på den relevante belysningsmetode (Steady-state, Dynamic, Advanced).
    BEMÆRK: For dette manuskript vil alle assays fokusere på steady-state-eksemplerne. De avancerede indstillingseksempler kan dog bruges til pulsvarigheder og arbejdscyklusregimer.
  4. Vælg, om de øverste eller nederste lysdioder skal belyses ved at indtaste værdier i cellerne svarende til pladens brønde. For de LPA'er, der blev brugt i dette arbejde, blev blå lysdioder placeret i øverste position brugt i alle eksperimenter. Hver LED, når den er programmeret, kan give kontinuerlig lyseksponering med en konstant lysintensitet. IRIS-softwaren giver mulighed for 4096 intensitetsniveauer, som kan programmeres.
  5. Når LED-placeringerne er valgt, skal du indtaste intensitetsværdier for den ønskede eksperimentelle kontur. Indtast f.eks. 8 forskellige lysintensiteter (eller pulsvarigheder eller driftscyklusser) med tre tekniske replikater pr. plade (tabel 2). G.s. henviser til gråtoneenheder - de måleværdier for lysintensitetsniveau, der bruges til LPA-programmering i IRIS-softwaren.
    1. Når du designer IRIS-eksperimentelle filer, skal du huske på kanteffekter fra tilstødende brønde på LPA-enheden, lystoksicitet fra stigende intensiteter af eksponering for blåt lys og bestemmelse af den ønskede type dosisrespons (f.eks. Monotonisk vs. ikke-monotonisk).
    2. Hvis brugerne programmerer celler i LPA'en i stigende/faldende rækkefølge af en bestemt lysparameter (f.eks. intensitet), kan brønde producere kanteffekter af lyskrydsning eller endda varme, som kan påvirke tilstødende brønde. Dette kan utilsigtet påvirke resultatet af målte output, når eksperimenterne er færdige. For at afhjælpe dette kan brugerne implementere en randomiseringsmatrix på IRIS-softwaren for at kryptere brøndplaceringer, hvilket minimerer kanteffekter. Et eksempel er beskrevet i de repræsentative resultater nedenfor (figur 4A-B).
    3. Derudover har højere intensiteter af blåt lys vist sig at forstyrre cellulær vækst og levedygtighed48. For at afbøde lystoksiciteten er det derfor vigtigt at udarbejde en kurve for lysintensitet, pulsvarighed eller responskurve for driftscyklus afhængigt af den modalitet, der undersøges.
      1. For eksempel program 8 lysintensitetsværdier med tre replikater pr. 24-brønds plade, med et interval fra intet lys til en maksimal intensitet af LPA. Kør derefter disse prøver på et flowcytometer med en SSC-FSC-port eller en levende plet såsom propidiumiodid for at kvantificere populationscelleoverlevelsen (levende celler sammenlignet med samlede hændelser, herunder døde celler / cellulært affald) ved hver lysværdi.
      2. Bestem derefter den ideelle mængde populationsoverlevelse for forsøgsopsætningen, da enhver stimulus kan påvirke proliferation, genekspression eller overlevelse negativt (f.eks. Indstilling af 80% celleoverlevelse som en passende afvejning). For eksempel oversteg intensiteten i dette arbejde, når den var kalibreret, ikke 3000 g.s. enheder (~ 3/4 den maksimale intensitet af LPA-enheden). Et eksempel på dette er beskrevet i de repræsentative resultater nedenfor.
    4. Ud over at begrænse lysværdier på grund af toksicitet kan brugerne ønske at begrænse lysværdier for at karakterisere en bestemt del af dosisresponsen, såsom området for det monotone respons.
      1. For at opnå dette skal du i første omgang scanne en lang række lysintensiteter, pulsvarigheder eller arbejdscyklusser afhængigt af den modalitet, der analyseres ved bestemmelse af det ønskede dosisrespons (tabel 2) for at indsnævre sig til det lette regime af interesse, f.eks. hvor genekspression korrelerer positivt med stigende lysværdier for et monotonisk dosisrespons.
      2. For at bestemme det lette interesseområde skal du programmere en enkelt LPA med op til 24 brønde med forskellig intensitet / pulsvarighed / driftscyklus / osv. Eller flere brønde (f.eks. 48, 72, 96 osv.), Afhængigt af om flere LPA'er er kalibreret til at levere tilsvarende lysmængder og fortsætte med cellekulturarbejdet eller assays, der er beskrevet nedenfor. Start derfor karakterisering af et optogenetisk system med et bredt dosisområde af lysstimuli for at bestemme det intervalinterval, der giver det ønskede genekspression og efterfølgende udføre eksperimenter i det raffinerede dosisområde.
      3. For eksempel i dette arbejde, når 3000 g.s. enheder blev bestemt som tærsklen for giftig lysintensitet; denne tærskel blev anvendt som den øvre grænse for lys for assays, der er skitseret nedenfor (f.eks. Immunofluorescens).
        BEMÆRK: Ovenstående trin er uafhængige af LPA'ens optiske kalibrering og henviser til en kalibrering på molekylært niveau for hvert optogenetisk system.
  6. Når de relevante lysintensitetsværdier er programmeret i IRIS, skal du indsætte et hukommelseskort med USB 3.0-stikket i LPA'en for at downloade og overføre filerne.
  7. Hvis kalibreringen af LPA'en er fuldført31, skal du fortsætte med cellekulturarbejdet med henblik på initiering af lysinduktionsassay. Hvis kalibreringen ikke er udført, kalibreres LPA'en ved hjælp af en billedanalysemetode (trin 3.7.1-3.7.3), når LPA'en er programmeret med mikrocontrollerprogrammøren.
    1. Kort programmere LPA til at have det samme IRIS-niveau som beskrevet af Gerhardt et al. (2016) 31.
      BEMÆRK: Til kalibrering blev LPA programmeret til at have en værdi på 2000 g.s.
    2. Når enheden er programmeret med hukommelseskortet, og der trykkes på nulstillingsknappen (fysisk knap på LPA'en), skal du hente et billede af hele enheden (f.eks. gelstationsbillede, scannerenhed osv.). Til kalibreringen skal du hente to billeder med enheden drejet med 180°.
    3. Brug derefter open source-software designet af Gerhardt et al. (2016) 31 til at vise variabiliteten i LED-intensitet på LPA-pladen og beregne LED-kompensationsværdierne for at gøre intensiteten ens på tværs af brønde. Et eksempel på dette er beskrevet i de repræsenterede resultater nedenfor (figur 3). Når denne kalibrering er afsluttet, skal du fortsætte med cellekulturarbejde til initiering af lysinduktionsassay.
  8. Der opnås kolber af konstruerede monoklonale celler fra det foregående afsnit for at undersøge lysinduktionseffekter på genekspression.
  9. Fjern det gamle medie fra kolben.
  10. Tilsæt 1 ml trypsin til cellerne og inkuber i 5 minutter.
  11. Efter 5 minutter neutraliseres trypsin ved at tilsætte 4 ml Dulbecco-modificeret Eagle's medium (DMEM eller andre ønskede medier) suppleret med de nødvendige kemikalier (dette arbejde anvendte 50 μg/ml hygromycin, 1% penicillin/streptomycinopløsning, 10% føtalt kvægserum, FBS).
  12. Tilsæt ~ 75.000 celler pr. Brønd i en 24-brønds sort plade i et samlet volumen på 500 μL. Antallet af celler, der er podet, kan variere afhængigt af varigheden af det ønskede eksperiment og den anvendte celletype.
    BEMÆRK: Bemærk desuden, at cellesåningstætheden påvirker kulturvedligeholdelsen og potentielt varigheden af eksperimentet. At starte ved et lavere antal celler pr. brønd sikrer længere tidsvarighed, før kulturen når sammenløb. Desuden vil den type optogenetiske komponenter, der er integreret i de genkredsløb, der er af interesse, påvirke, hvornår genekspression når en stabil tilstand og derfor påvirke forsøgets varighed. Andre faktorer, der kan overvejes, er cellelinjespecifikke vækstrater, mediesammensætning og betingede væksteffekter (dvs. lys).
  13. Efter plettering placeres cellerne i en befugtet inkubator med 5% CO2 , så de kan nøjes med 2-6 timer.
  14. Efter inkubationen overføres cellerne til en vævskulturhætte, fjernes plastlåget og tilsættes en klæbende foliestrimmel til toppen af pladen (figur 2D). Dette trin tillader minimal lysoverførsel mellem brønde, da toppen og siderne af brøndene er belagt, og lyset kan nu kun komme ind fra bunden af brønden, hvor LED'en er placeret.
  15. Anbring pladen i de monterede 3D-dele af LPA'en. Dæk derefter pladen med det 3D-printede LPA-låg, som passer over enhedens skruer i hvert hjørne.
  16. Sæt enheden i strømkilden, og tryk på nulstillingsknappen på LPA-enheden for at sikre, at de opdaterede LPA-eksperimentindstillinger anvendes.
  17. Inkuber cellerne i forsøgssystemet i en passende mængde tid afhængigt af den oprindelige såtæthed, cellelinjespecifik væksthastighed og vækstbetingelser. I dette eksempel blev cellelinjerne induceret i 3 dage kontinuerligt for genekspression for at nå en stabil tilstand. Det skal dog bemærkes, at mange optogenetiske systemer (f.eks. VVD) kan nå steady-state genekspression meget hurtigere (f.eks. 24 timer), og derfor kan eksperimentelle induktionstider reduceres eller forlænges efter behov.
  18. I slutningen af lysinduktionseksperimentet skal du bruge prøverne til en af de følgende fire assays til at karakterisere de konstruerede cellelinjer (afsnit 4-7).

4. Fluorescensmikroskopi af lysinducerede konstruerede celler

  1. 24-72 timer efter induktion, fjern cellerne i LPA fra inkubatoren og læg dem i en vævskulturhætte.
  2. Fjern foliestrimlen og lad pladen sidde i 1-2 min. Dette forhindrer, at der dannes kondens på plastlåget, hvis det placeres straks på pladen.
  3. Efter 1-2 minutters siddende skal du sætte det originale plastlåg tilbage på pladen.
  4. Forestil dig cellerne med den passende fasekontrast eller fluorescensmikroskop.
  5. Afhængigt af instrumentet skal du justere eksponeringstiden, lyskildeintensiteten og forstærkningen til visning af konstruerede celler. I dette eksperiment blev følgende parametre anvendt: 50 ms for FITC/GFP (grønt fluorescerende protein) lyskildeeksponeringstid og 1-5 ms for eksponeringstid for fasekontrast ved 100% intensitet for hver.
    BEMÆRK: Det skal bemærkes, at optimale eksponeringstider, forstærkningsniveauer og lyskildeintensiteter ofte udledes empirisk af erfaringerne fra dette arbejde for at minimere overmætning i fluorescensreporteren, minimere cellulær skade og fange passende billeder til kvalitativ og kvantitativ analyse. Ved bestemmelse af niveauerne for hver af disse parametre omfatter de aspekter, der skal tages i betragtning, maksimering af signal-støj-forhold, minimering af fototoksicitet, minimering af overmætning af fluorescenssignaler og forøgelse af evnen til at forstærke svage fluorescenssignaler.
    1. Optimer disse parametre groft ad hoc; Tidligere eksperimentelle værdier (f.eks. lyskildeintensitet, der forårsager overmætning af fluorescensreporter) kan dog styre fremtidige eksperimentelle indstillinger, når det er relevant. For eksempel kan forstærkningsindstillingerne, eksponeringstiderne og startværdierne for lysintensitet fra et kredsløb (LITer1.0) eller eksperimentel opsætning (f.eks. Lysintensitet) bruges som udgangspunkt, når man flytter til et lignende, men anderledes genkredsløb (LITer2.0)11 eller en anden lysmodalitet (f.eks. Light Duty Cycle).
  6. Strømlin pladebilleddannelse ved hjælp af en koordinatskabelon, der er programmeret ind i mikroskopisoftwaren, så hele pladestørrelsen (f.eks. 24 brønde) kan få automatiseret billedoptagelse fra flere billedplaceringer pr. Brønd.

5. Flowcytometri af lysinducerede konstruerede celler

  1. 24-72 timer efter induktion, fjern cellerne fra LPA i inkubatoren eller fra mikroskopet efter billeddannelse og læg dem i vævskulturhætten.
  2. Hvis den fjernes direkte fra LPA'en, skal du fjerne foliestrimlen og lade pladen sidde i et minut eller to.
  3. Aspirer medierne fra hver brønd (af hele 24-brøndspladen, hvis alle brønde bruges).
  4. Tilsæt 100 μL 0,25% trypsin til hver brønd, dæk pladen med et plastiklåg og læg den tilbage i inkubatoren.
  5. Lad cellerne stå uforstyrret i inkubatoren i 5 minutter.
  6. Efter 5 minutter skal du fjerne pladen og returnere den til vævskulturhætten.
  7. Neutraliser hver trypsiniseret brønd med 400 μL DMEM.
  8. Mærk et 5 ml polystyren rundbundet rør med cellesil (eller passende flowcytometrirør, der kan filtreres for at fjerne store klumper af celler, der ikke er fuldt trypsiniseret) med et navn svarende til hver brønd.
  9. Brug en P1000-pipette til at pipette indholdet af hver brønd op og ned 6-8 gange for at bryde celleklumper og oprette enkeltcellede prøver til flowcytometri49.
  10. Overfør hele indholdet af hver brønd (~ 500 μL) til de mærkede rør med silen.
  11. Bring celler til det passende flowcytometriinstrument med lasere med de korrekte bølgelængder (kan bringe rør med celler på eller uden for is).
    BEMÆRK: Flowcytometeret, der blev brugt i dette arbejde, var en del af en kernefacilitet placeret på universitetshospitalet.
  12. Opret en fremadrettet og sidespredningsport (henholdsvis FSC og SSC) for at fange de enkelte celler af passende størrelse og granularitet for at udelukke snavs og cellulære klumper på flowcytometrisoftwaren.
  13. Når porten er indstillet, skal du fange ca. 10.000 celler med den relevante port. Juster dette tal afhængigt af mængden af mobildata, som brugerne søger. Gentag for hvert rør, der indeholder cellerne fra eksperimentet.
  14. Når eksperimentet er afsluttet, skal du importere dataene til den tilgængelige flowcytometridatasoftware til analyse.
  15. Opret en FSC-SSC-port (som før under anskaffelsen), og anvend den på hver batch af eksperimentelle data. En referencebrønde for den ikke-inducerede cellepopulation bruges til at skabe denne port i dette manuskript, men der findes andre målinger til portoprettelse, såsom tæthedsbaserede porte.
  16. Med de eksperimentelle betingelser gated med en FSC-SSC-port, plotte flowcytometridataene som histogrammer eller repræsentere på andre måder for at illustrere de opnåede ekspressionsmønstre. I dette eksperiment blev fluorescensen fanget af GFP / FITC eller PE / TexasRed kanalerne.

6. RNA-ekstraktion og kvantitativ PCR af genkredsløbskomponenter

  1. 24-72 timer efter induktion, fjern cellerne fra LPA i inkubatoren eller fra mikroskopet efter billeddannelse og læg dem i vævskulturhætten.
  2. Hvis den fjernes direkte fra LPA'en, skal du fjerne foliestrimlen og lade pladen sidde i et minut eller to.
  3. Aspirer medierne fra hver brønd (af hele 24-brøndspladen, hvis alle brønde bruges).
  4. Fortsæt med at ekstrahere RNA fra cellerne ved hjælp af det relevante RNA-ekstraktionssæt.
  5. Når RNA-ekstraktionen er afsluttet, udføres en omvendt transkriptionsreaktion af hver prøve (tabel 3).
  6. Udfør endvidere kvantitativ PCR for hver prøve (tabel 4). Brug en DNA-polymerase og tilhørende protokol til at oprette PCR-reaktioner. Til dette trin skal du oprette en multiplexeret reaktion med et husholdningsgen og et gen af interesse eller oprette separate reaktioner. I dette eksempel blev GFP-, KRAS- og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) niveauer undersøgt. Efter at have afsluttet qRT-PCR-eksperimentet, fortsæt med analysen via tilgængelig software til at illustrere genkredsløbsfoldningsændring på RNA-niveau.

7. Immunofluorescens af genkredsløbskomponenter

  1. Brug et isbad eller fryser til at afkøle metanol.
  2. 24-72 timer efter induktion, fjern cellerne fra LPA i inkubatoren eller fra mikroskopet efter billeddannelse og læg dem i vævskulturhætten.
  3. Hvis den fjernes direkte fra LPA'en, skal du fjerne foliestrimlen og lade pladen sidde i 1-2 minutter.
  4. Aspirer medierne fra hver brønd (af hele 24-brøndspladen, hvis alle brønde bruges).
  5. Tilsæt 100 μL 0,25% trypsin til hver brønd, dæk pladen med et plastiklåg og læg den tilbage i inkubatoren.
  6. Lad cellerne stå uforstyrret i inkubatoren i 5 minutter.
  7. Efter 5 minutter skal du fjerne pladen og returnere den til vævskulturhætten.
  8. Neutraliser hver trypsiniseret brønd med 400 μL DMEM.
  9. Mærk minicentrifugerør med navne, der svarer til hver brønd.
  10. Brug en P1000-pipette og pipette indholdet af hver brønd op og ned 6-8 gange for at bryde celleklumperne.
  11. Overfør hele indholdet af hver brønd (~ 500 μL) til de mærkede rør.
  12. Centrifugering af cellerne i 5 minutter ved 400 x g.
  13. Når du er færdig, skal du kassere supernatanten og flytte prøverne til en kemisk røghætte.
  14. Resuspend cellerne (brug en P1000-pipette og pipette op og ned 6-8 gange i hvert rør for at bryde celleklumper) i 750-1000 μL 4% paraformaldehyd (fortyndet i fosfatbufret saltvand, PBS).
  15. Lad cellerne sidde i 15 minutter ved stuetemperatur.
  16. Efter inkubationen tilsættes 750-1000 μL PBS. Pipette op og ned flere gange.
  17. Centrifugering af cellerne i 5 minutter ved 400 x g.
  18. Når du er færdig, skal du kassere supernatanten og flytte prøverne til en kemisk røghætte.
  19. Resuspend cellerne (brug en P1000 pipette og pipette op og ned 6-8 gange i hvert rør for at bryde celleklumper) i 750-1000 μL iskold methanol.
  20. Lad cellerne sidde i 30 minutter på is eller i en -20 °C fryser.
  21. Efter inkubationen tilsættes 750-1000 μL PBS. Pipette op og ned flere gange.
  22. Centrifugering af cellerne i 5 minutter ved 400 x g.
  23. Når du er færdig, skal du kassere supernatanten og flytte prøverne til en kemisk røghætte.
  24. Afhængigt af den anvendte type antistoffer skal du ændre protokollen fra dette tidspunkt og fremefter. Følg enten trin 7.24.1-7.24.14 eller 7.24.15-7.24.22.
    1. Hvis du bruger et primært og sekundært antistof, skal du resuspend cellerne ved hjælp af en P1000 / P200 pipette og pipette op og ned 6-8 gange i hvert rør for at bryde celleklumper i 100 μL primært antistof. I dette tilfælde blev der foretaget en fortynding på 1:800 for lagerantistoffer, herunder KRAS-antistof eller ERK-antistof, og fik lov til at sidde i 1 time ved stuetemperatur. Antistoffer blev fortyndet i en inkubationsbuffer fremstillet af 1x PBS med 0,5 g BSA.
      BEMÆRK: Bestem den nøjagtige fortynding af antistoffet empirisk ved at oprette en standardkurve for antistoffortyndinger vs. det antigen, der er af interesse.
    2. Efter tilsætning af antistoffer skal du dække rørene med en folie for at forhindre lyseffekter på mærkede antistoffer.
    3. Efter inkubation tilsættes 750-1000 μL af inkubationsbufferen. Pipette op og ned flere gange.
    4. Centrifugering af cellerne i 5 minutter ved 400 x g.
    5. Når du er færdig, skal du kassere supernatanten og flytte prøverne til en kemisk røghætte.
    6. Resuspend cellerne ved hjælp af en P1000 / P200 pipette og pipette op og ned 6-8 gange i hvert rør for at bryde celleklumper i 100 μL sekundært antistof. I dette tilfælde blev cellerne resuspended i 100 μL sekundært antistof ved en fortynding på 1:800 for KRAS-antistof eller 1:2000 for ERK-antistof og fik lov til at sidde i 30 minutter ved stuetemperatur. I lighed med primære antistoffer fortyndes de sekundære antistoffer i inkubationsbufferen som beskrevet ovenfor. Bestem fortyndingerne af de sekundære antistoffer baseret på de empiriske fund af en standardkurve.
    7. Efter tilsætning af antistoffer skal du dække rørene med en folie for at forhindre lyseffekter på de mærkede antistoffer.
    8. Efter inkubationen tilsættes 750-1000 μL af inkubationsbufferen. Pipette op og ned flere gange.
    9. Centrifugering af cellerne i 5 minutter ved 400 x g.
    10. Når du er færdig, skal du kassere supernatanten og flytte prøverne til en kemisk røghætte.
    11. Resuspend cellerne ved hjælp af en P1000 pipette og pipette op og ned 6-8 gange i hvert rør for at bryde celleklumper i 500 μL PBS.
    12. Overfør hele indholdet af hvert rør (~ 500 μL) til de mærkede rør med sil.
    13. Bring cellerne til passende flowcytometriinstrumenter med lasere med de korrekte bølgelængder (kan bringe rør med celler på eller uden for is).
      BEMÆRK: Det skal bemærkes, at det at have flere kontroller er vigtigt for at komme videre med flowcytometrimåling og analyse af konstrueret cellegenekspression. For eksempel kan det at have helt ufarvede celler, celler farvet med primært antistof alene og celler farvet med sekundært antistof alene være nyttige til at sammenligne resultater med baggrundssignaler fra antistoffer.
    14. Fortsæt derefter med analysen som beskrevet i afsnit 5.
    15. Hvis du kun bruger et primært antistof, skal du resuspend cellerne ved hjælp af en P1000 / P200-pipette og pipette op og ned 6-8 gange i hvert rør for at bryde celleklumper i 100 μL mærket primært antistof. Bestem passende antistoffortynding og inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Bestem antistoffortyndingen fra standardkurven empirisk.
    16. Efter tilsætning af antistoffer skal du dække rørene med en folie for at forhindre lyseffekter på mærkede antistoffer.
    17. Efter inkubation tilsættes 750-1000 μL af inkubationsbufferen. Pipette op og ned flere gange.
    18. Centrifugering af cellerne i 5 minutter ved 400 x g.
    19. Resuspend cellerne ved hjælp af en P1000 pipette og pipette op og ned 6-8 gange i hvert rør for at bryde celleklumper i 500 μL PBS.
    20. Overfør hele indholdet af hvert rør (~ 500 μL) til mærkede rør med sil.
    21. Bring cellerne til passende flowcytometriinstrumenter med lasere med de korrekte bølgelængder (kan bringe rør med celler på eller uden for is).
      BEMÆRK: Det skal bemærkes, at det at have flere kontroller er vigtigt for at komme videre med flowcytometrimåling og analyse af konstrueret cellegenekspression. At have helt ufarvede celler og celler farvet med primært antistof alene er nyttige til at sammenligne resultater med baggrundssignaler fra antistoffer.
    22. Fra dette tidspunkt skal du fortsætte med analysen som beskrevet i afsnit 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Genkredsløbssamling og stabil cellelinjegenerering i denne artikel var baseret på kommercielle, modificerede HEK-293-celler indeholdende et transkriptionelt aktivt, enkelt stabilt FRT-sted (figur 1). Genkredsløbene blev konstrueret i vektorer, der havde FRT-steder i plasmidet, hvilket muliggør Flp-FRT-integration i HEK-293-cellegenomet. Denne tilgang er ikke begrænset til Flp-In-celler, da FRT-steder kan føjes til enhver cellelinje af interesse overalt i genomet ved hjælp af DNA-redigeringsteknologi som CRISPR / Cas950.

Når passende cellelinjer var konstrueret og valideret til den korrekte indsættelse, blev LPA- og IRIS-softwaren valgt som en standardiseret protokol til lysinduktion af genekspression31,51. LPA-systemet gør det muligt at programmere 24-brønde til induktion af pattedyrceller under flere eksperimentelle forhold afhængigt af lysintensitet, pulsvarighed og arbejdscyklus (figur 2). Inden for denne artikel blev rumligt ensartet lysintensitet, pulsvarighed og arbejdscyklus prioriteret. Forskere kan dog bruge IRIS-softwaren og LPA til mere avanceret programmering af tidsmæssige lysbølgemønstre.

Et afgørende aspekt ved LPA'en, der skal behandles, inden eksperimenter påbegyndes, er den optiske kalibrering, der kan udføres for enkelt eller flere enheder. Den tidligere beskrevne billedanalysemetode31 , der anvendes til kalibrering, kræver et billede af hele LPA'en med alle lysdioder af interesse tændt, som kan erhverves fra en række forskellige kilder52, herunder et gelbillede. Her blev en computerscanner brugt til billedoptagelse (figur 3A). Når billedet var erhvervet, blev open source-softwaren oprettet af Gerhardt et al. (2016) 31 brugt til at beregne kompensationsværdier for hver LED for at sikre, at hver LPA udsender den samme intensitet ved en given gråtoneværdi. Softwaren trækker baggrundssignalet fra, tærskler billedet til en binær kategori og beregner pixelintensiteten (figur 3B). Fra kalibreringen blev der fundet en minimal variation blandt lysdioderne med et CV på 0,04 mellem 96 brønde (eller 4 plader kalibreret, figur 3C). Endelig, ved hjælp af kalibreringssoftwaren demonstrerede LED-variationen efter placering (figur 3D) og skabte en gråtonejustering (figur 3E), så hver LED normaliseres til samme intensitet.

Ud over kalibrering omfatter andre vigtige aspekter ved brugen af LPA integration af flere kontroller i den eksperimentelle pipeline, som kan minimere systemiske fejl ved at begrænse forvirrende variabler såsom lystoksicitetseffekter og designbegrænsninger baseret på eksperimentelle materialer. For eksempel illustrerer figur 4 to forskellige konfigurationer til programmering af forskellige lysintensiteter i LPA-brøndene. Det første underpanel i figur 4A viser en stigende organisering af lysintensitet. Dette kan gøre programmering og dataanalyse lettere, men kan producere kanteffekter, hvor den nederste række af LPA har den højeste lysintensitet og potentielt kan forårsage uønsket varme- og lysinduktion af nærliggende brønde. Tilsvarende er der i det andet underpanel i figur 4A anvendt en randomiseringsmatrix på IRIS-softwaren, hvilket skaber forskellige lysintensiteter i tilfældige positioner. Dette kan minimere systemiske påvirkninger af kanteffekter. En descrambled matrix (figur 4B) oprettes med IRIS-softwaren, som derefter kan bruges til at bestemme de eksperimentelle betingelser efter afslutningen af eksperimentet og under analysen. I lighed med randomisering af brønde bør brugerne også være opmærksomme på lystoksicitetseffekter, der kan forekomme (blåt lys inden for dette arbejde). I figur 4C er to forskellige lysintensiteter, der anvendes til genkredsløbsinduktion, vist med den samme FSC-SSC-port baseret på den ikke-inducerede population af konstruerede celler. Som sådan bør brugerne udføre en dosisrespons på den lette modalitet af interesse (f.eks. puls, arbejdscyklus osv.) for at bestemme lystoksicitetseffekter, der kan forekomme i den høje ende af eksponeringen (figur 4D). Her forårsagede stigende niveauer af blåt lys dosisafhængigt cellulært affald, døde celler og klumper sammenlignet med ikke-stimulerede celler. Som sådan var den kontinuerlige lysintensitet begrænset til omkring 3/4 af den maksimale LPA-intensitet (~ 3000 g.s. enheder).

Når korrekt udstyr var oprettet, blev genekspression derefter induceret i konstruerede LITer-genkredsløb via fluorescensmikroskopi (figur 5). Celler blev induceret ved forskellige lyspulsvarigheder på LPA, hvilket gav et let dosisrespons af genekspression på populationsniveau. Celler i dette arbejde blev afbildet til GFP-ekspression ved hjælp af 50 ms til FITC / GFP lyskildeeksponeringstid og til lysfeltbilleddannelse ved hjælp af 1-5 ms til eksponeringstid for fasekontrast. I betragtning af robustheden af denne cellelinjetekniske protokol kunne enhver fluorescensmarkør anvendes i stedet for GFP. Cellerne kan induceres med flere lysregimer og producere en lang række reaktioner (figur 5). Sidstnævnte er gavnlig til yderligere at kontrollere ekspressionen af funktionelle gener (f.eks. KRAS (G12V) onkogen i det oprindelige værk53).

Umiddelbart efter fluorescensmikroskopi kunne celler analyseres i en række eksperimentelle protokoller, herunder flowcytometri, qRT-PCR og immunofluorescens. I dette arbejde blev flowcytometri udført som en første valideringsprocedure og udført efter de ovenfor beskrevne metoder (figur 6). I lighed med mikroskopi blev celler induceret ved forskellige pulslængdeværdier og viste et dosisrespons af genekspression på over fire gange ændring fra ikke-inducerede tilstande på populationsniveau (figur 6A-B). Tilsvarende kan genekspressionsstøjreduktion vises ved at sammenligne forskellige lysintensitetsværdier (figur 6C-D) for LITer-systemet versus et positivt reguleringssystem (ingen feedback) som VVD / LightOn54. Når man sammenligner LITer med VVD-systemet, opnår negativ feedback over fem gange reduktion af genekspressionsstøj. De samme præinducerede celler afbildet på mikroskopi kunne også analyseres via qRT-PCR (figur 7). I lighed med flowcytometri kunne de konstruerede LITer-celler udtrykke RNA-niveauer på en dosisresponsiv måde (over 10 gange induktion fra ikke-inducerede tilstande), der matcher dosisresponset af proteinniveauer kvantificeret ved GFP-ekspression på flowcytometri. De nævnte fluorescensmikroskopi- og flowcytometridata kan kalibreres ved hjælp af ikke-fluorescerende celler, der konstitutivt udtrykker fluorescerende celler og fluorescerende 6-8-peak valideringsperler (f.eks. FL1-kanals grønne, fluorescerende perler). Hver af disse komponenter kan tillade normalisering af genekspression i et enkelt eksperiment. Disse faktorer kan dog også tillade normalisering af kredsløb og konstruerede celler på tværs af forskellige eksperimentelle plader, eksperimentelle tilstande og dage for at muliggøre sammenligning og standardisering af genekspressionsdata.

Endelig kan LITer-genkredsløbene konstrueres til at udtrykke funktionelle gener, såsom KRAS (G12V, figur 8). Alsidigheden af denne pipeline giver brugerne mulighed for at udnytte LITer-arkitekturen med celleteknik til ethvert funktionelt gen af interesse, muligvis inkorporere yderligere arkitekturer såsom positiv feedback. LITer viste stigende mængder blåt lys, der resulterede i øgede niveauer af genkredsløbsproduktionen (KRAS (G12V) proteinniveauer) og følgelig fosforylerede ERK-niveauer, som begge kan kvantificeres via immunofluorescensassays.

Fragment Forhold Størrelse (bp) DNA-fragmentets vægtkoncentration (ng/μL) DNA-fragment molær koncentration (fmol / μL) Volumen (μL) Resulterende DNA-molær masse (fmol)
Modervektor fragment 1 1 3414.00 18.20 8.63 4.09 35.29
Modervektor fragment 2 1 4642.00 18.10 6.31 5.59 35.29
Gen af interesse 1 549.00 37.90 111.70 0.32 35.29
Total 10.00 105.87

Tabel 1: Beregning af DNA-samlingsreaktionsmasterblanding (trin 1.13). Kolonne 2 & 3 er baseret på størrelsen af de samlede DNA-fragmenter og koncentrationen af disse fragmenter efter PCR-amplifikation og agarosegelekstraktion (trin 1.11). Den nederste celle i 4. kolonne (total reaktionsvolumen) kan ændres; Det angivne volumen anbefales dog. Uskyggede celler genereres automatisk.

0 100 200 400 500 750
1500 3000 0 100 200 400
500 750 1500 3000 0 100
200 400 500 750 1500 3000

Tabel 2: IRIS-programmering af lysintensiteter (g.s.) til lysinduktionseksperiment i en 24-brønds plade med tre replikater (trin 3.4). Fordeling af lysintensiteter fra 0 til 3000 g.s. G.s.-gråtoneenheder. Dette kan randomiseres af IRIS-softwaren efter behov.

Eksempel 1 Eksempel 2 Eksempel 3
Reverse Transcriptase Master Mix Volume (μL) 4.00 4.00 4.00
RNA-skabelon (1000 ng) volumen (μL) 2.00 3.00 4.00
NF-H20 volumen (μL) 14.00 13.00 12.00
Samlet volumen (μL) 20.00 20.00 20.00

Tabel 3: Beregning af omvendt transkriptionsmastermix (trin 6.5). Det reaktionsanbefalede samlede volumen er 20 μL, og dets komponenter er den omvendte transkriptaseenzymmasterblanding (her: 5x), RNA-skabelon og nukleasefrit vand. I dette eksempel er RNA-koncentrationerne af prøver 1, 2 og 3 henholdsvis 500, 333 og 250 ng / μL.

Eksempel 1 Eksempel 2 Prøve 1 & 2 Multiplexed
GFP-sondevolumen (μL) 1 ----- 1
GAPDH-sondevolumen (μL) ------ 1 1
DNA-polymerase Master Mix Volume (μL) 10 10 10
cDNA (100 ng) volumen (μL) 2 2 2
NF-H20 volumen (μL) 7 7 7
Samlet volumen (μL) 20 20 20

Tabel 4: Kvantitativ PCR-mastermixberegning (trin 6.6). Det reaktionsanbefalede totalvolumen er 20 μL, og dets komponenter er DNA-polymeraseenzymmasterblandingen (her: 2x), GFP- og / eller GAPDH-sonder, cDNA (100 ng i alt) og nukleasefrit vand (NF-H20).

Figure 1
Figur 1: Kredsløbsdesign og celleteknik. (A) Celletekniske værktøjer, herunder LITer syntetisk genkredsløb med FRT-integrationssteder, rekombinaseenzym (Flp-rekombinase) til kredsløbsintegration, lægemiddel, der anvendes til udvælgelse af passende genetiske kloner, og cellelinje af interesse, der anvendes til at skabe ønskede optogenetiske pattedyrcellelinjer. B) Konstruerede genetiske systemer kan integreres på et specifikt FRT-sted, der indeholder locus i det menneskelige genom. Disse genomiske loci kan derefter udtrykke specifik antibiotikaresistens eller fluorescerende reportergener til udvælgelse af korrekt integrerede genetiske kassetter. Genkredsløbsintegration kan initieres ved brug af rekombinaser, der genkender specifikke steder inden for den oprindelige genetiske kassette. Dette introducerer et nyt lægemiddelresistensselektionsgen, som kan sikre generering af korrekt konstruerede celler med det ønskede genkredsløb. Nederst på panel B er genkredsløbsarkitekturen for det optogenetiske negative feedbacksystem, LITer2.0. Dette kredsløb består af et selvpressende TetR-protein smeltet sammen med et lys-ilt-spændingsfølende domæne (LOV2), en linkersekvens P2A, der muliggør en multicistronisk transkription, og GFP. Når der påføres blåt lys, åbnes TIP-sekvensen fra LOV2-domænet, hvilket hæmmer TetR-proteinet og tillader øget, dosisresponsiv transkription af både TetR og GFP-reporteren. Det hæmmede TetR-protein er ikke i stand til at binde og undertrykke på DNA-operatørstedet, hvilket øger transkriptionen. Denne negative feedback holder genekspressionsstøjen lav og tillader en høj fold ændring af genekspression. FRT - flipgenkendelsesmål, HygR - hygromycinresistens, LacZ - β-galactosidase, ZeoR - zeocinresistens, T - TetR, tetracyclinpressorprotein, D2ir er en CMV-baseret promotor med TwtO-steder, LOV2 er Lys-ilt-spændingsfølende domæne, TIP er tethæmmende peptid, der hæmmer TetR-proteinet. Dette tal er ændret fra Guinn og Balázsi (2020)55. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: LPA eksperimentel programmering. (A) Eksperimenter kan programmeres ved hjælp af de værktøjer, der er anført på Tabor-laboratoriets websted47 med fleksibilitet til steady-state, dynamisk eller avanceret LPA-programmering31. Desuden kan elektroniske filer gemmes til fremtidig brug til tekniske replikater eller eksperimentel induktion af alternative cellelinjer. B) LPA-anordning med hovedkomponenter set fra toppen og siden (C). (D) Billeder af folieforseglede plader, der skal befinde sig på LPA. LPA - Light Plate Apparatus, LED - lysemitterende diode. Elementer af denne figur er blevet ændret fra Guinn (2019) 11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kalibrering af lyspladeapparatet. (A) Repræsentativt billede af LPA for lysdioder indstillet til 2000 g.s. baseret på IRIS-software. (B) Billede fra panel (A) med baggrund fratrukket og tærskel, der bruges til at binarisere billedet for at beregne pixelintensiteten for hver LED. (C) Histogram over pixelintensiteter (bestemt ved MATLAB-billedanalyse) på 96 lysdioder (4 LPA-plader), der er indstillet til den samme IRIS-softwareværdi (f.eks. 2000 g.s.). Den røde linje repræsenterer gennemsnitlig LED-pixelintensitet, og CV i panelet repræsenterer variationskoefficienten for de 96 brønde. (D) Heatmap, der viser LED-intensiteterne for LPA-billedet i panel (A) normaliseret til den maksimale intensitets-LED. (E) Varmekort over kalibreringsværdi bestemt for LPA-billedet i panel (A) for at skabe en lige intensitetsproduktion for hver LED, når den er programmeret til LPA. LPA - Light Plate Apparatus, LED - lysemitterende diode, CV - variationskoefficient. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Randomisering af LPA- og lystoksicitetseffekter. (A) Repræsentativt billede af to programmerbare LPA LED-konfigurationer indstillet fra 25 til 4000 g.s, baseret på IRIS-softwaren. Den første konfiguration er mere tilbøjelig til at tillade systematiske fejl såsom kanteffekter af varme og lys at krydse over (f.eks. den nederste række i LPA' side, der påvirker den 2. laveste række). Det andet billede randomiserer placeringen af intensiteter og minimerer derfor systematisk fejl (bias) forårsaget af kanteffekter. (B) Matrix, der viser randomiseringsplacering for lysintensiteter i LPA vist i panel (A), som kan bruges til at bestemme de intensitetsafhængige resultater af et givet eksperiment. (C) Flowcytometridata for to forskellige lysintensiteter (1250 og 4000 g.s.) i 3 dages induktion ved kontinuerlig belysning. Den sorte port er baseret på uinducerede celler. (D) Søjlediagram, der viser flowcytometridata såsom panel (C), men for en lang række lysintensiteter. LPA - Light Plate Apparatus, FSC - forward scatter, SSC - side scatter, g.s. - lysintensitetsværdi målt i gråtoner. LITer-celler11 havde et dosisresponsivt fald i celleoverlevelsen, der var statistisk signifikant ved anvendelse af ANOVA 1-halet test med en p-værdi på 0,0022. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative mikroskopibilleder af konstruerede optogenetiske cellelinjer. Celler blev afbildet på et omvendt mikroskop med et kamera (14-bit) til erhvervelse af fasekontrast og fluorescensbilleddannelse. Celler blev eksponeret for 5 ms for fasekontrast (panel A, repræsentativt lysfeltbillede) og 50 ms for GFP / FITC-erhvervelse (panel B) ved 100% lyskildeintensitet. Celler kan afbildes på forskellige tidspunkter afhængigt af ønsket steady-state erhvervelse eller dynamisk respons, hvilket fører til en stabil tilstand. Celler repræsenterer her en pulsvarighedstitrering ved fast intensitet (1000 g.s.), der spænder fra ingen lyseksponering til 3 dages lyseksponering. Enheden g.s repræsenterer en lysintensitetsværdi målt i gråtoner. Dette tal er ændret fra Guinn (2019)11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Flowcytometri af konstruerede optogenetiske cellelinjer. Celler blev analyseret på et BD LSRFortessa flowcytometer, med ca. 10.000 celler indsamlet inden for en SSC-FSC (side scatter-forward scatter) port. Cellerne blev derefter analyseret med FCS Express-softwaren. Histogram- eller scatter-plots kan genereres for at kvantificere ekspressionen af genet af interesse (f.eks. GFP). (A) Konstruerede celler afbildet på SSC-FSC-akser til gating inden for den sorte linje. (B) Repræsentative LITer-celler induceret med varierende varighed af lysimpulser ved 1000 g.s. op til 72 timers induktion, hvilket illustrerer dosis-respons af genekspression. (C) Repræsentative dosis-respons-data for lysintensitetstitrering, der sammenligner LITer-genkredsløbet (TIP-baseret system) versus VVD- eller LightOn-system40, som er et positivt reguleringssystem uden feedback. D) Histogram svarende til VVD-systemet, der illustrerer en bredere fordeling (og dermed højere genekspressionsstøj) sammenlignet med LITer-systemet. CV er variationskoefficienten, en metrik for genekspressionsstøj. FSC - fremadgående scatter, SSC - side scatter, FITC - fluorescein isothiocyanat, g.s. - lysintensitetsværdi målt i gråtoner. Dette tal er ændret fra Guinn (2019)11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Kvantitativ PCR i realtid af konstruerede optogenetiske cellelinjer. Repræsentative data, der viser, at flere genekspressionsniveauer kan induceres og kvantificeres ved hjælp af lys som stimulus. Enheden Rq repræsenterer relativ kvantificering af ekspressionsfold-ændring sammenlignet med kontrol. LITer-celler11 havde en dosisresponsiv stigning i RNA-ekspression, der var statistisk signifikant ved anvendelse af ANOVA 1-halet test med en p-værdi på henholdsvis 0,0352 og 0,0477 for GFP- og KRAS-niveauer. Dette tal er ændret fra Guinn (2019)11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Immunofluorescens af konstruerede optogenetiske cellelinjer. Repræsentative data, der viser estimater på proteinniveau baseret på immunofluorescens. (A) Proteinniveauer af KRAS(G12V) og (B) proteinniveauer af phosphoryleret-ERK, som LITer-genkredsløbet inducerer i henhold til henholdsvis stigende lysmængder direkte og indirekte. Data vist i søjler er middelværdier, fejllinjer er standardafvigelse (n = 3). A.u. - vilkårlige enheder, g.s. - lysintensitetsværdi målt i gråtoner. LITer-celler11 havde en dosisresponsiv stigning i proteinniveauer, der var statistisk signifikant ved anvendelse af ANOVA 1-tailed test med en p-værdi på henholdsvis 2,79E-04 og 0,016 for KRAS- og phosphoryleret-ERK-niveauer. Dette tal er ændret fra Guinn (2019)11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Læsere af denne artikel kan få indsigt i de trin, der er afgørende for at karakterisere optogenetiske genkredsløb (såvel som andre genekspressionssystemer), herunder 1) genkredsløbsdesign, konstruktion og validering; 2) celleteknik til introduktion af genkredsløb i stabile cellelinjer (f.eks. Flp-FRT-rekombination); 3) induktion af de konstruerede celler med en lysbaseret platform såsom LPA; 4) indledende karakterisering af lysinduktionsassays via fluorescensmikroskopi; og 5) endelig genekspressionskarakterisering med en række assays, herunder flowcytometri, kvantitativ real-time PCR (qRT-PCR) eller immunofluorescensassays.

Derudover er de ovenfor skitserede metoder meget modulære for stort set enhver genkredsløbsarkitektur, der udtrykker gener af interesse, med de vigtigste potentielle protokolændringer på kredsløbskonstruktionstrinnet og de udførte assays. I tilfælde af genkredsløbskonstruktion gør fleksibiliteten ved molekylær kloning det muligt at udveksle eller udtrykke ethvert gen af interesse med en fluorescensmarkør med mindre ændringer af primerdesign eller samlingsprotokoller. Derudover, mens de procedurer, der er skitseret her, hovedsagelig fokuserer på et NF-genkredsløbsdesign til præcis (støjsvag) genekspressionskontrol, kan andre arkitekturer såsom positiv regulering eller positiv feedback (PF) implementeres for at opnå forskellige funktioner såsom henholdsvis højfoldsændring eller høj genekspressionsstøj56,57 . Ved hjælp af en række genkredsløbsarkitekturer (f.eks. PF, NF osv.) kan forskere undersøge forskellige biologiske spørgsmål såsom de roller, proteinniveaustørrelser og støj spiller i lægemiddelresistens eller metastase58. De protokoller, der er anført her, fokuserer også på forskellige måder at kvantificere genekspression på, men ethvert antal funktionelle assays (f.eks. Cellemotilitet, sårheling, proliferation osv.) kan tilføjes efter mikroskopiopsamling med ringe eller ingen effekt på de foregående metoder. Dette er især relevant for enkeltcellestudier, hvor optogenetik kan bruge spatiotemporal induktion til at studere adfærd såsom pulserende ekspressionsdynamik59.

Som supplement til metodemodularitet er fejlfinding et andet vigtigt træk ved hver hovedprotokol. Til kredsløbskonstruktion ligger de største forskelle i det passende kredsløbsspecifikke primerdesign, mens senere metoder som samling og plasmidforstærkning via bakterievækst er mere standardiserede og typisk inkluderer deres egne omfattende fejlfindingsprocedurer. Celleteknik kan ændres med lægemiddeltitreringskurver afhængigt af den anvendte cellelinje. Derudover, hvis der anvendes en kommerciel cellelinje, kan fejlfindingsvejledninger fås direkte fra cellelinjeproducenten. Også utilsigtede lyseffekter er vigtige at kvantificere på de konstruerede cellelinjer. For eksempel på grund af de fototoksiske virkninger af 470 nm lys, bør der oprettes en lysintensitetskurve for at undersøge induktion af død eller skade i en befolkning. Når en række lysværdier er testet, kan brugerne oprette en FSC-SSC-port eller bruge en metode som propidiumiodidfarvning til at kvantificere døde / beskadigede celler og derfor tjene som et værktøj til at bestemme passende lysområder, der skal bruges eksperimentelt.

Til LPA-fejlfinding kan lysdioder producere kanteffekter af lys og varme crosstalk med tilstødende brønde. For eksempel kan højintensitetsbrønde forårsage en vis induktion i tilstødende brønde, hvis der er en forkert tætning eller en stor varme/ lysgradient mellem brønde. Disse effekter kan være maksimale, hvis LPA'en er programmeret i en bestemt rækkefølge (f.eks. stigende/faldende) af en lysparameter. For at bekæmpe dette giver IRIS-softwaren brugerne mulighed for at anvende en randomiseringsmatrix til at randomisere brøndintensiteterne og derfor reducere systematisk fejl. Til fejlfinding af aspekter af fluorescensmikroskopi er eksponeringstid, forstærkningsindstillinger (styring af kamerafølsomhed) og lyskildeintensitet de vigtigste parametre, der kan justeres. Tuning af disse parametre kan give mulighed for optimal billedproduktion og ideelle signal-støj-forhold samt undgå overmætning og fototoksicitet.

Til fejlfinding af flowcytometri er fotomultiplikatorrørspændinger og cellulær gating de vigtigste aspekter, der kan justeres. Tuning af disse parametre kan muliggøre ideelle sammenligninger mellem eksperimentelle forhold og kontrolprøver, korrekt signaloptagelse for både svage eller stærke fluorescenssignaler og udelukkelse af cellulært affald eller uønskede cellepopulationer. Det skal bemærkes, at flowcytometrispændinger ideelt set holdes konstante på tværs af eksperimenter for at muliggøre korrekte sammenligninger. For optogenetiske systemer, der kræver flere fluorescensudgange (f.eks. FITC og PE), skal brugerne desuden være opmærksomme på fluorescenskompensation givet krydstale mellem fluoroforer. I sådanne scenarier er kontroller afgørende for at bestemme korrekte fluorescenssignaler. Kontroller, der vil være nødvendige for brugerne at udføre, omfatter fluorescerende perler, farvede celler med interessemarkøren eller celler, der konstitutivt udtrykker fluorescensproteinet, der kan bruges til at skabe en kompensationsmatrix i flowcytometrisoftwaren af interesse. Derudover, uanset om der anvendes en fluorescensmarkør eller mere, bør alle brugere rutinemæssigt måle fluorescenssignaler for hver markør for ikke-fluorescerende celler, som giver autofluorescens/baggrundssignaler. qRT-PCR-fejlfinding omfatter varierende cDNA-mængder og sondedesign, som ofte er projektspecifikke. Endelig er antistofkoncentrationer til fejlfinding af immunofluorescens den største variabel til analysekvantificering, hvilket nødvendiggør optimal koncentrationsbestemmelse.

Et fejlfindingsaspekt, der er relevant for de fleste af ovenstående metoder, er isolationseffekten ved at bruge en forseglet plade med celler dækket af folie. Denne metode kan hindre den kuldioxidgasudveksling, der er nødvendig for en korrekt vækst af forskellige cellelinjer. Fra tidligere eksperimentel erfaring var dette ikke en signifikant hindring for cellulær vækst i et 3-5 dages eksperiment ved hjælp af de konstruerede cellelinjer i dette manuskript, men kan blive vigtigt for andre cellelinjer eller eksperimentelle varigheder. For at imødegå denne bekymring omfatter en tilpasning, der er implementeret med de forseglede plader, anvendelse af kuldioxiduafhængige medier, som ikke har påvirket væksten af celler, der anvendes i denne undersøgelse. Det skal bemærkes for andre assays eller cellelinjer, hvor metabolisme, pH-niveauer og celletætheder er vigtige, andre interventioner kan være nødvendige, såsom at ændre medier eller næringsstoffer oftere.

Grænserne for de metoder, der er skitseret her, ligger i det anvendte genkredsløb, den optogenetiske teknologipræcision og LPA-interface med andet udstyr såsom fluorescensmikroskoper. Den teknologi, der beskrives her, er overkommelig, hurtig at bygge og let at validere46 for populationer af optogenetisk konstruerede celler. Der er dog visse rumlige begrænsninger, såsom manglende evne til at kontrollere enkeltceller uden ændringer i lysinduktionsopsætningen, såsom brug af digitale spejlenheder (DMD'er), med nyligt demonstrerede fordele i levende celler60,61. Desuden er de metoder, der er skitseret her, begrænset i levende cellesporing under optogenetisk stimulering, hvilket kun tillader slutpunktsdataindsamling af hele det eksperimentelle tidsforløb.

På trods af disse grænser supplerer de optogenetiske metoder, der er skitseret her, den eksisterende teknologi såsom DMD'erne, som har fleksibilitet til at kontrollere enkeltceller i realtid, men er begrænset af antallet af prøver, man kan stimulere. Desuden kontrasterer de stabile cellelinjetekniske metoder, der diskuteres her, eksisterende syntetiske biologiske metoder, som ofte karakteriserer konstruerede genetiske systemer via forbigående transfektioner. Forbigående transfektionsmetoder er i sagens natur mere støjende på grund af den større variation i genkredsløbets kopinummer blandt celler. I modsætning hertil involverer de metoder, der præsenteres her, monoklonale cellevarianter, der hver indeholder en genkredsløbskopi. Stabile cellelinjer gør det muligt at udforske cellulære aspekter såsom genekspressionsvariation, proteinniveaueffekter på fænotypiske landskaber og enkeltcellemetoder med finere præcision, da der er større tillid til, at hver celle er identisk med sine naboer.

Arbejdet her demonstrerer en platform for at designe ethvert genomisk integreret optogenetisk genkredsløb af interesse, inducere sådanne systemer med pålidelige eksperimentelle værktøjer og karakterisere dem med en række genekspression og funktionelle / fænotypiske assays på en standardiseret måde. Fremtidige forbedringer af disse protokoller kan omfatte integration af disse metoder med levende cellesporing ved hjælp af andre optogenetiske teknologier såsom DMD'erne, hvilket vil muliggøre spatiotemporal kontrol af genekspression og funktionelle anvendelser på enkeltcelleniveau. Sådanne fremskridt vil gøre det muligt for lysudnyttelse at producere genekspressionsmønsteret af interesse for enkeltceller, etablere transkriptions- / oversættelsesdynamik, kvantificere proteinniveauer og studere deres rolle i forskellige biologiske processer, herunder cellemigration, proliferation, metastase og differentiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Balázsi lab for kommentarer og forslag, Dr. Karl P. Gerhardt og Dr. Jeffrey J. Tabor for at hjælpe os med at konstruere den første LPA, og Dr. Wilfried Weber for at dele LOV2-degron plasmiderne. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [R35 GM122561 og T32 GM008444]; Laufer Center for Fysisk og Kvantitativ Biologi; og et National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship. Finansiering af open access-afgift: NIH [R35 GM122561].

Forfatterbidrag: M.T.G. og G.B. udtænkte projektet. M.T.G., D.C. og L.G. udførte eksperimenterne. M.T.G., D.C., L.G. og G.B. analyserede dataene og udarbejdede manuskriptet. G.B. og M.T.G. førte tilsyn med projektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes Eppendorf 951010006 reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X Thermo Fisher Scientific MT25053CI reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000020 tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000055 tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap Corning 352235 reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V Eppendorf 22628113 equipment for mammalian culture work
Agarose Denville Scientific GR140-500 reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates VWR® 60941-126 tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin Sigma Aldrich A9518-5G reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer Thermo Fisher Scientific 02215365PR tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140010 reagent for growing bacteria
BD LSRAria BD 656700 tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa BD 649225 tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine Government Scientific Source SIGA4919-1G reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC Corning 353043 plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge VWR 22628113 instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood N/A N/A instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid BD 353047 plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask USA Scientific CC7682-4825 container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fischer Scientific BP231-100 reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15-585-011 reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid Corning 353072 container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express De Novo Software: N/A software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL Corning 35-010-CV reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose Thermo Fisher Scientific 11-965-092 reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL Life Technologies 10687-010 reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad Laboratories 1708890 reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C VWR 76210-392 equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C Panasonic MDF-U74VC equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C VWR 76359-220 equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg Sigma-Aldrich L3022-250G reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000 Life Technologies L3000008 reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019 MathWorks N/A software for analyzing experimental data
Methanol Acros Organics 413775000 reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL VWR 20170-333 plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
MultiTherm Shaker Benchmark Scientific H5000-HC equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-NDL-US-CAN equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix NEB M0492S reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs (NEB) C3019H bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs (NEB) E2621L reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera Nikon Instruments Inc. N/A instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements Nikon Instruments Inc. N/A software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides IDT N/A reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control Panasonic MCO-170AICUVHL-PA instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade Electron Microscopy Sciences 15710-S reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) Invitrogen 14190144 reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x Fisher Scientific 15140-122 reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody Cell Signaling Technology 4370S primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody Sigma-Aldrich WH0003845M1 primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Eppendorf A28137 equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App Thermo Fisher Scientific N/A software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody Cell Signaling Technology 8889S secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody Invitrogen A11005 secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL Olympus Plastics 12-102 reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System Major Science UVCI-1200 tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene SnapGene N/A software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator Tokai Hit INU-TIZ tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557 reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn Life Technologies 4326317E qPCR Probe
Thermocycler Bio-Rad 1851148 tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated PerkinElmer 1450-605 plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm VWR 14673-010 reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System VWR 89032-290 equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293 Thermo Fisher Scientific R75007 Engineered cell line with FRT site

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822 (2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247 (2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670 (2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), New York, N.Y. 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18 (2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131 (2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521 (2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547 (2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314 (2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111 (2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887 (2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128 (2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591 (2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , Stockton Press. New York. (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. TaborLab IRIS. TaborLab IRIS Software. , Available from: http://taborlab.github.io/Iris/index.html (2021).
  48. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849 (2017).
  49. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  50. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  51. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
  52. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  53. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436 (2020).
  54. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  55. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , Ann Arbor. Ph.D (2020).
  56. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766 (2019).
  57. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  58. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726 (2020).
  59. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  60. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  61. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355 (2020).

Tags

Bioengineering Udgave 173 optogenetik genekspressionskontrol syntetisk biologi negativ feedback genkredsløb
Pålideligt at konstruere og kontrollere stabile optogenetiske genkredsløb i pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., … More

Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (173), e62109, doi:10.3791/62109 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter