在哺乳动物细胞中可靠地构建与调控稳定的光遗传学基因回路

摘要

可靠地控制光响应性哺乳动物细胞需要对光遗传学方法进行标准化。为实现这一目标，本研究以负反馈光遗传学基因回路为案例，提出了一套标准化研究光诱导基因表达的流程，包括基因回路构建、细胞工程、光遗传学设备操作以及验证性检测方法。

摘要

在哺乳动物细胞中实现可靠的基因表达调控需要具备高倍数变化、低噪声以及明确输入-输出传递函数的工具，而不论所采用的具体方法如何。为此，光遗传学基因表达系统在过去十年中受到广泛关注，因其能够对哺乳动物细胞中的蛋白质水平实现时空精确控制。然而，目前大多数控制光诱导基因表达的现有回路在结构上各不相同，通常由质粒表达，并使用各异的光遗传设备，因此有必要在稳定细胞系中探索光遗传组件的表征与标准化。本文提供了一套用于构建、整合和表征哺乳动物细胞中光诱导基因表达回路的实验流程，并以负反馈光遗传回路作为实例进行说明。该实验方案还展示了如何通过标准化光遗传设备和光照条件，可靠地揭示基因回路的特性，例如基因表达噪声和蛋白质表达水平。最后，本研究可能对尚未熟悉光遗传学技术但希望引入该技术的实验室具有参考价值。此处描述的实验流程可推广至其他哺乳动物细胞中的光遗传回路，有助于在转录组、蛋白质组乃至最终的表型水平上，实现对基因表达更可靠、更精细的表征与控制。

引言

与其他工程学科类似，合成生物学旨在标准化实验方案，从而利用具有高度可重复功能的工具来探索与生物系统相关的问题^1,2。在合成生物学中，基因表达调控是已构建多种控制系统的领域之一^3,4。基因表达控制可同时针对蛋白质水平及其变异性（噪声或变异系数，CV = σ/µ，定义为标准差与均值之比），这两者是细胞的重要特征，因其在细胞生理与病理状态中发挥关键作用^5,6,7,8。目前已开发出多种能够调控蛋白质水平和噪声的合成系统^4,9,10,11,12，为在不同工具间实现方案的标准化提供了可能。

最近出现的一类可用于控制基因网络的新工具是光遗传学，它能够利用光来控制基因表达^{13,14,15,16,17}。与化学方法类似，光遗传学基因回路可被导入从细菌到哺乳动物的任何细胞类型中，从而实现对任意下游目标基因的表达调控^18,19。然而，由于新型光遗传学工具不断快速涌现，已发展出多种系统，这些系统在基因回路结构、表达机制（例如基于质粒或病毒整合）、以及光照控制设备等方面存在差异^{11,16,20,21,22,23,24,25}。因此，光遗传学在基因回路构建与优化、系统使用方法（例如整合表达与瞬时表达）、诱导所用实验工具以及结果分析等方面，仍有待实现标准化。

为了推进哺乳动物细胞中光遗传学实验方案的标准化，本方案以将负反馈（NF）基因回路整合到HEK293细胞（人胚胎肾细胞系）中为例，描述了一套用于在哺乳动物细胞中构建光遗传学系统的实验流程。负反馈是一种理想的标准化示范系统，因其在自然界中广泛存在^26,27,28，可实现蛋白水平的调节并降低噪声。简而言之，负反馈通过阻遏蛋白快速抑制自身表达，从而精确控制基因表达，限制系统偏离稳态的程度。通过添加诱导剂使阻遏蛋白失活或降解，可改变系统的稳态，从而允许产生更多蛋白，直至针对每一诱导剂浓度达到新的稳态。最近开发出一种工程化的光遗传负反馈系统，能够实现宽动态范围的基因表达响应，维持低噪声水平，并响应光刺激，因而具备实现空间特异性基因表达调控的潜力¹¹。这类工具被称为光诱导调节器（LITers），其设计灵感来源于早期可在活细胞中实现基因表达调控的系统^4,10,29,30，并已稳定整合至人类细胞系中，以确保长期的基因表达调控能力。

本文以 LITer 为例，概述了一种构建光响应基因回路的方案，利用光板装置（LPA，一种光遗传学诱导硬件）³¹ 诱导基因表达，并分析经基因工程改造、可光控的细胞系对定制光刺激的响应。该方案使用户能够利用 LITer 工具研究任何功能基因。此外，通过整合下述方法和光遗传学设备，该方案也可适用于具有不同回路结构（例如正反馈、负调控等）的其他光遗传学系统。与其他合成生物学方案类似，此处所述的视频记录和光遗传学操作流程可应用于多个领域的单细胞研究，包括但不限于癌症生物学、胚胎发育和组织分化。

方案

1. 基因线路设计

1. 选择要组合到单个基因回路/质粒中的遗传元件（例如，哺乳动物DNA整合序列基序）³²光响应元件³³或功能基因³⁴).
2. 使用任何基因工程和/或分子克隆软件，保存DNA序列以供后续使用和参考，对每条序列进行注释，并分析所有必要的特征（例如起始密码子、调控序列或翻译序列）³⁵.
3. 根据整体基因线路设计开发或采用相应元件³⁶例如，对于光遗传学抑制因子（如 LITers 中的情况）¹¹，融合一个编码具有光诱导降解能力结构域的基因序列^37,38 或抑制阻遏蛋白的DNA结合能力³⁹，位于阻遏蛋白基因（如 TetR）的邻近位置且处于其阅读框内⁴.
   1. 对于光遗传学激活因子，需确保存在激活结构域⁴⁰ 在光诱导的DNA结合后促进基因表达⁴¹对于负向或正向自调控，需确保调控因子基因的启动子内部或上游存在调控结合位点（例如，在表达 TetR 的启动子内部或上游存在 tetO 位点）。⁴².
4. 使用分子克隆软件为每个基因回路设计用于质粒DNA序列扩增或测序的引物。
5. 通过分子克隆软件内置功能（如序列比对）对质粒构建所用引物进行计算机验证。
6. 向厂商订购寡核苷酸引物。本研究所构建和使用的质粒可参见原始补充材料¹¹ 以及设计和使用的引物。
7. 将引物用双蒸水（ddH₂O）稀释至100 mM的储存浓度₂O)
8. 将100 mM的引物母液稀释至10 mM浓度用于PCR。
9. 将1 µL正向引物、1 µL反向引物、1 µL模板DNA（基因组DNA用量为0.5–500 ng，质粒或病毒DNA用量为0.5 pg–5 ng）、12.5 µL DNA聚合酶2x预混液（或根据生产商推荐的稀释比例确定体积）以及9.5 µL ddH₂O混合配制PCR反应体系₂总体积为25 µL。
10. 孵育PCR反应体系 在热循环仪中，根据所选酶的特性设置适当的反应条件⁴³建议的反应循环包括：
    第一步：95 °C 预变性 30 秒，1 个循环。
    步骤2：98 °C变性5秒，共40个循环。
    步骤3：在65 °C下退火30秒，进行1个循环（退火温度由先前设计的引物确定）。
    步骤4：在72 °C下延伸1分钟，进行1个循环（约1千碱基对（kb）模板片段长度）。
    步骤5：72 °C延伸2分钟，进行1个循环。
    将反应物置于 4 °C 保存，直至可通过凝胶电泳进行检测。该方案的具体步骤可能因所用试剂（如聚合酶和缓冲液）的不同而有所差异。
11. 重复步骤1.9，以扩增所有用于DNA组装反应的片段，这些片段需连接线性PCR产物形成一个完整的环状DNA载体。
12. 在1%琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物，随后纯化目标长度的条带。
13. 准备DNA组装反应的主混合液（表1).
    注意：在此示例中，母体载体被分为两个片段，以提高PCR步骤的效率，同时不会对整体组装结果造成显著影响。
14. 将DNA组装反应主混合液在PCR仪中于50 °C孵育1小时（除非DNA组装试剂说明书另有规定），随后将反应产物置于4 °C保存，用于后续细菌转化。
15. 使用感受态细胞进行细菌转化（化学法或电穿孔法） 大肠杆菌 (大肠杆菌) 细胞及相应的细菌转化方案。转化后，使用含有选定细菌筛选标记（如氨苄青霉素）的细菌Luria-Bertani (LB) 琼脂平板涂布转化混合物，于37 °C过夜培养。⁴⁴.
16. 第二天检查平板。为接种菌落，从平板上挑取单个菌落，重悬于含有相应细菌筛选标记的液体LB培养基中，置于培养管内。在37 °C、300 rpm条件下于摇床培养箱中过夜培养。
17. 按照质粒制备方案从细菌培养物中提取质粒DNA。
18. 通过两个步骤验证电路。首先，使用限制性内切酶进行测试性酶切，作为粗略验证，以确认是否获得了预期大小的质粒产物。其次，如果测试酶切结果通过/确认无误，将质粒送至桑格测序机构（或使用现有设备自行完成）以获得精确的DNA序列，随后与设计软件中的预期序列进行比对。
    1. 为进行测试性消化，根据所使用的分子克隆软件，选择至少两种能够产生至少两个片段的限制性内切酶。选定酶后，通过加入1 µL每种酶、5 µL制备的DNA以及13 µL水（根据所用酶加入适当的盐溶液和缓冲液）来制备测试样品。将反应体系在37 °C孵育1小时，或按照酶生产商的建议进行孵育。将测试消化产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，检测条带是否正确。
       注意：如果条带正确，则进行测序。
    2. 为了进行测序，根据软件中存储的DNA序列设计引物，使引物的退火区域相距约500 bp（碱基对），并覆盖目标片段（基因线路元件）或整个质粒。使用无核酸酶的纯水（NF-H₂O）稀释引物。₂O）至10 mM浓度。通过加入1 µL 10 ng/µL DNA、1 µL引物和8 µL无核酸酶水（NF-H）制备测序样品。₂将每个引物分别加入0.2 mL离心管中。对每个引物重复此步骤。
       注意：样品制备完成后，将其送至测序机构，并使用分子克隆软件将测序结果与质粒序列进行比对。
19. 在此步骤中，制备浓度约为100–1000 ng/µL的DNA样品，用于将含有基因回路的质粒整合到相应的细胞系中。

2. 稳定细胞系构建

1. 订购一种用于快速生成稳定亚克隆细胞系的哺乳动物细胞系，以确保目标蛋白在哺乳动物表达载体中的高水平表达。细胞类型 以及细胞系构建的难易程度可根据用户偏好或研究目标而有所不同。
   1. 例如，若用户希望以最少的中间步骤完成细胞系构建，可订购在基因组转录活跃位点处含有单个稳定整合位点（如FRT位点）的细胞系。若需要更精细的细胞工程操作，可使用CRISPR/Cas9等基因编辑工具在特定位置创建整合位点。
2. 在37 °C、含5% CO₂的湿润空气中培养细胞。根据具体细胞类型调整培养条件。
3. 将上述设计的基因回路转染至前一步骤获得的目标细胞中，以启动稳定细胞系的构建过程。可通过脂质体混合物⁴⁵将基因回路DNA与适当的重组酶（例如，用于Flp-FRT重组的Flp重组酶）共同导入，或采用电穿孔等其他方法进行转染。
4. 转染后两天，将细胞按25%汇合度进行传代。
5. 细胞传代6小时后，更换为含有50 µg/mL潮霉素抗生素（或与质粒构建过程中选用的哺乳动物抗生素抗性基因相对应的其他抗生素）的新鲜培养基，开始抗生素筛选。
   注意：在基因回路构建中可使用多种不同的哺乳动物抗生素抗性基因，每种抗性基因对应的杀灭曲线均不相同。因此，无论选择何种哺乳动物抗生素抗性基因用于回路构建，均应在目标细胞中预先测定其合适的杀灭曲线。此步骤可富集含有基因回路载荷的细胞，同时清除未成功整合系统的细胞。
6. 使细胞在含抗生素的筛选培养基中生长，每2–3天更换一次新鲜培养基，直至培养皿或培养瓶中出现数十个克隆灶。贴壁细胞在对数生长期、尚未达到完全汇合前即应进行传代。
7. 当克隆灶数量足够时，使用不含钙、镁和碳酸氢钠的Hank's平衡盐溶液（HBSS）配制的0.25%胰蛋白酶和0.1% EDTA溶液处理细胞数分钟，进行胰酶消化。用新鲜培养基中和胰酶活性后，将全部细胞转移至新的培养容器中。
8. 当新容器中的细胞达到80%–100%汇合度时，使用45%旧培养基、45%新鲜培养基和10% DMSO的混合液将细胞冻存。同时将剩余细胞转移至无菌管中，进行单细胞分选，将单克隆细胞分离至96孔板中。
9. 单细胞分选后约2–3周，96孔板中各孔应出现克隆灶。当细胞汇合度达到约50%–60%时，将细胞传代至12孔板中。
10. 当12孔板中的细胞达到80%–100%汇合度时，进一步传代至T-25组织培养处理的培养瓶中。待T-25培养瓶中的细胞达到80%–100%汇合度后，冻存细胞，并保留一个传代细胞用于后续单克隆细胞系的表征与功能检测。
    1. 通过显微镜观察和流式细胞术分析对单克隆细胞系进行表征，基于诱导型荧光报告蛋白的表达情况报告基因表达谱。通过荧光标记抗体染色和免疫荧光实验验证功能蛋白的表达。利用定量实时PCR（qRT-PCR）检测转录水平的基因表达诱导情况。通过克隆的局部基因组测序和全基因组测序验证遗传序列及整合位点的准确性。

3. 光板装置诱导实验

1. 构建一个LPA设备^31,46，用于对工程化细胞进行光诱导。简而言之，创建可用于控制基因表达的LPA需经历若干关键步骤，包括3D打印LPA框架组件、电路板制作、通过微控制器编程器对电路进行编程、将各组件组装成最终的LPA设备、通过IRIS软件对存储卡进行编程，以及对完成的设备进行校准。如需更详细的说明，请参考上述文献。
   1. 按照Gerhardt等人（2016年和2019年）所述方法^31,46打印3D部件。
   2. 按照Gerhardt等人（2016年和2019年）所述方法^31,46组装电路板。
   3. 使用微控制器编程器，按照Gerhardt等人（2016年和2019年）所述方法^31,46向组装好的LPA电路中添加固件。
   4. 按照Gerhardt等人（2016年和2019年）所述方法^31,46将3D打印部件与组装好的电路板组合。此步骤包括取安装板、电路板、LED（发光二极管）间隔件、板适配器、24孔板、板盖、安装螺栓和翼形螺母，并按视频演示和图2所示方式堆叠各组件。
   5. 关于存储卡的编程与设备校准，请遵循下文所述步骤。
2. 使用Tabor实验室网站上提供的IRIS软件⁴⁷对光板装置（LPA）³¹的SD卡进行编程，并探索启动光遗传学实验所需的适当光照条件。
   注：IRIS软件是一款基于网络的应用程序，用于对Tabor实验室开发的光遗传电子硬件（即LPA）进行编程。该软件允许编程相对IRIS值，以控制LPA硬件中每个孔内的独立发光二极管（LED）。
3. 选择LPA（4 × 6）下拉选项，然后点击适当的照明模式（稳态、动态或高级）。
   注：在本研究中，所有实验均聚焦于稳态示例。然而，高级设置可用于脉冲持续时间和占空比调控。
4. 通过在对应于孔位的单元格中输入数值，选择顶部或底部LED是否被点亮。在本研究使用的LPA中，所有实验均采用位于顶部位置的蓝色LED。每个LED在编程后均可提供具有恒定光强的连续光照。IRIS软件支持4096个可编程的强度等级。
5. 选定LED位置后，根据所需的实验设计输入强度值。例如，在一个24孔板中设置8种不同的光强（或脉冲持续时间或占空比），每种条件设三个技术重复（表2）。G.s.表示灰度单位——即在IRIS软件中用于LPA编程的光强测量值。
   1. 设计IRIS实验文件时，需考虑LPA设备中相邻孔之间的边缘效应、蓝光强度增加可能引起的光毒性，以及所需剂量-反应类型（如单调型与非单调型）。
   2. 若用户按特定光参数（如强度）的升序或降序在LPA中排列细胞，则孔之间可能产生光串扰甚至热的边缘效应，从而影响相邻孔。这可能在实验结束时无意中影响测量结果。为缓解此问题，用户可在IRIS软件中使用随机化矩阵打乱孔位分布，以最小化边缘效应。代表性结果部分提供了示例（图4A-B）。
   3. 此外，已有研究发现较高强度的蓝光会干扰细胞生长和存活能力⁴⁸。因此，为减轻光毒性，应根据所研究的调控模式，生成光强、脉冲持续时间或占空比的响应曲线。
      1. 例如，在一个24孔板中编程8个光强值，每个条件设三个重复，光强范围从无光到LPA的最大强度。随后，使用流式细胞仪结合SSC-FSC门控或碘化丙啶等活细胞染色方法，量化在每种光强下细胞群体的存活率（活细胞数占总事件数，包括死细胞和细胞碎片的比例）。
      2. 然后，确定实验设置中理想的群体存活水平，因为任何刺激都可能对增殖、基因表达或存活产生不利影响（例如，将80%的细胞存活率设定为可接受的折中值）。例如，在本研究中，校准后光强未超过3000 g.s.单位（约为LPA设备最大强度的3/4）。该示例见下文的 代表性结果部分。
   4. 除了因毒性限制光强外，用户可能希望进一步限制光强范围，以表征剂量-反应曲线的特定部分，例如单调响应区间。
      1. 为实现这一点，最初应扫描较宽范围的光强、脉冲持续时间或占空比（取决于所分析的调控模式），以确定所需的剂量-反应关系（表2），从而聚焦于感兴趣的光调控区间，例如基因表达随光强增加而正相关上升的单调剂量-反应区间。
      2. 为确定感兴趣的光强范围，可在一个LPA上编程最多24个不同强度/脉冲持续时间/占空比等的孔，或更多孔（如48、72、96等），前提是多个LPA已校准至提供等效光照量，然后继续进行下述细胞培养或实验操作。因此，建议首先以较宽的光刺激剂量范围对光遗传系统进行表征，以确定产生理想基因表达的区间，随后在该优化后的剂量范围内开展实验。
      3. 例如，在本研究中，一旦确定3000 g.s.单位为毒性光强阈值，则将该阈值作为后续实验（如免疫荧光）的光强上限。
         注：上述步骤独立于LPA的光学校准，指的是针对每种光遗传系统的分子水平校准。
6. 在IRIS中完成适当的光强值编程后，将带有USB 3.0接口的存储卡插入LPA，以下载并传输文件。
7. 若LPA已完成校准³¹，则继续进行细胞培养以启动光诱导实验。若尚未校准，则在使用微控制器编程器完成LPA编程后，采用图像分析法（步骤3.7.1–3.7.3）进行校准。
   1. 简要地，按照Gerhardt等人（2016年）所述方法³¹对LPA进行编程，使其具有相同的IRIS水平。
      注：在校准过程中，LPA被编程为2000 g.s.的值。
   2. 当设备通过存储卡完成编程并按下复位按钮（LPA上的物理按钮）后，获取整个设备的图像（如凝胶成像系统、扫描仪等）。为校准目的，获取设备旋转180°后的两张图像。
   3. 然后，使用Gerhardt等人（2016年）开发的开源软件³¹分析LPA板上LED强度的变异性，并计算LED补偿值，使各孔间的光强保持一致。该过程示例见下文代表性结果部分（图3）。完成此校准后，继续进行细胞培养以启动光诱导实验。
8. 从上一步骤获取工程化单克隆细胞培养瓶，用于研究光诱导对基因表达的影响。
9. 从培养瓶中移除旧培养基。
10. 向细胞中加入1 mL胰蛋白酶，孵育5分钟。
11. 5分钟后，加入4 mL含必要添加剂的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM或其他所需培养基）以中和胰蛋白酶（本研究使用50 µg/mL潮霉素、1%青霉素/链霉素溶液、10%胎牛血清FBS）。
12. 在24孔黑色板中，每孔接种约75,000个细胞，总体积为500 µL。接种细胞数量可根据实验持续时间和所用细胞类型而调整。
    注：此外，需注意细胞接种密度会影响培养维持状态及实验可能持续的时间。每孔起始细胞数较低可确保在培养达到汇合前有更长的实验时间。此外，整合到目标基因回路中的光遗传组件类型将影响基因表达达到稳态的时间，从而影响实验持续时间。其他需考虑的因素包括细胞系特异性的生长速率、培养基成分和条件性生长效应（如光照）。
13. 接种后，将细胞置于含5% CO₂ 的湿润培养箱中，静置2–6小时使其贴壁。
14. 孵育结束后，将细胞转移至组织培养超净台，移除塑料盖，并在板顶部贴上一层粘性铝箔条（图2D）。此步骤可最大限度减少孔间光传递，因为孔的顶部和侧面已被覆盖，光只能从底部进入，而LED正位于底部。
15. 将板放入LPA的匹配3D部件中，然后用3D打印的LPA盖板覆盖，盖板可固定在设备四个角的螺丝上。
16. 将设备连接至电源，并按下LPA设备上的复位按钮，以确保更新后的LPA实验设置生效。
17. 根据初始接种密度、细胞系特异性生长速度和生长条件，在实验系统中孵育细胞适当时间。在本示例中，细胞连续诱导3天，以使基因表达达到稳态。但需注意，许多光遗传系统（如VVD）可能更早达到稳态基因表达（例如24小时），因此可根据需要缩短或延长实验诱导时间。
18. 光诱导实验结束后，可使用样本进行以下四种检测之一，以表征工程化细胞系（见第4–7节）。

4. 光诱导工程细胞的荧光显微镜观察

1. 诱导后24-72小时，将LPA中的细胞从培养箱中取出，并置于组织培养超净台中。
2. 移除铝箔条，让培养板静置1-2分钟。此举可防止将塑料盖立即盖上时在盖子内表面形成冷凝水。
3. 静置1-2分钟后，将原来的塑料盖重新盖回培养板上。
4. 使用适当的相差显微镜或荧光显微镜对细胞进行成像。
5. 根据所用仪器的不同，调整曝光时间、光源强度和增益，以清晰显示工程化细胞。本实验中采用以下参数：FITC/GFP（绿色荧光蛋白）通道的曝光时间为50 ms，相差成像的曝光时间为1-5 ms，光源强度均为100%。
   注意：应注意到，最佳曝光时间、增益水平和光源强度通常需通过本实验经验经验性确定，以尽量减少荧光报告信号的过饱和、降低细胞损伤，并获取适用于定性和定量分析的足够质量图像。在确定这些参数的设定值时，需考虑的关键因素包括最大化信噪比、最小化光毒性、避免荧光信号过饱和，以及增强对微弱荧光信号的放大能力。
   1. 可大致根据实际情况临时优化这些参数；然而，在适用的情况下，先前实验获得的数值（例如导致荧光报告信号过饱和的光源强度）可为后续实验设置提供参考。例如，某一基因回路（LITer1.0）或实验条件（如光源强度）所获得的增益设置、曝光时间和光源强度的初始值，可作为转向类似但不同的基因回路（LITer2.0）¹¹或不同光照模式（如光照占空比）时的起始参考值。
6. 通过显微镜软件中预设的坐标模板，实现培养板成像的流程化，从而对整块培养板（例如24孔）进行自动化图像采集，每孔可在多个指定位置自动获取图像。

5. 光诱导工程细胞的流式细胞术分析

1. 诱导后24-72小时，从培养箱中的LPA上或成像后的显微镜下取出细胞，并将其转移至组织培养超净台中。
2. 若直接从LPA上取下，请先移除铝箔条，让培养板静置一至两分钟。
3. 吸除每个孔中的培养基（若使用了全部孔，则为整个24孔板的所有孔）。
4. 向每个孔中加入100 µL的0.25%胰蛋白酶，用塑料盖盖好培养板，然后放回培养箱中。
5. 在培养箱中静置5分钟，期间不要扰动细胞。
6. 5分钟后，取出培养板并将其放回组织培养超净台中。
7. 用400 µL DMEM中和每个经胰蛋白酶消化的孔。
8. 用与各孔对应的名称标记一个带有细胞筛网的5 mL聚苯乙烯圆底管（或可过滤的合适流式细胞术管，以去除未完全消化的细胞团块）。
9. 使用P1000移液器将每个孔中的内容物上下吹打6-8次，以打散细胞团块，制备适用于流式细胞术的单细胞悬液⁴⁹。
10. 将每个孔的全部内容物（约500 µL）转移至相应标记并带有筛网的试管中。
11. 将细胞样本送至配备合适激光波长的流式细胞仪进行检测（可将细胞管置于冰上或非冰上运输）。
    注：本研究所使用的流式细胞仪位于大学医院的核心设施中。
12. 在流式细胞术软件中设置前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）门控，以筛选出具有合适大小和粒度的单个细胞，排除碎片和细胞团块。
13. 门控设定后，采集约10,000个位于该门控内的细胞。根据用户所需细胞数据量调整此数目。对实验中每个含细胞的试管重复此步骤。
14. 实验完成后，将数据导入可用的流式细胞术数据分析软件进行分析。
15. 创建FSC-SSC门控（与采集时相同），并将其应用于每批实验数据。本文中使用未诱导细胞群体的参考孔来设定此门控，但也可采用其他门控策略，如基于密度的门控方法。
16. 在使用FSC-SSC门控对实验条件进行圈选后，以直方图形式绘制流式细胞术数据，或采用其他方式展示所获得的表达模式。本实验中，荧光信号由GFP/FITC或PE/TexasRed通道采集。

6. 基因线路组分的RNA提取与定量PCR

1. 诱导后24-72小时，将细胞从培养箱中的LPA上或成像后的显微镜下取出，并转移至组织培养超净台中。
2. 若直接从LPA上取出，请先移除铝箔条，让培养板静置一到两分钟。
3. 吸除每个孔中的培养基（若使用了全部孔，则为整个24孔板的所有孔）。
4. 使用相应的RNA提取试剂盒，开始从细胞中提取RNA。
5. 完成RNA提取后，对每个样本进行逆转录反应（表3）。
6. 随后对每个样本进行定量PCR分析（表4）。使用DNA聚合酶及相关操作流程配制PCR反应体系。在此步骤中，可设置包含内参基因和目的基因的多重反应，或分别建立独立反应。本示例中检测了GFP、KRAS以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的表达水平。完成qRT-PCR实验后，利用可用软件进行数据分析，以展示基因回路在RNA水平上的表达倍数变化。

7. 基因线路组分的免疫荧光染色

1. 使用冰浴或冷冻箱冷却甲醇。
2. 诱导后24-72小时，将细胞从培养箱中的LPA中取出，或在成像后从显微镜下取出，并置于细胞培养超净台中。
3. 若直接从LPA中取出，需先移除铝箔条，让培养板静置1-2分钟。
4. 吸除每个孔中的培养基（若所有孔均被使用，则吸除整个24孔板的培养基）。
5. 向每个孔中加入100 µL的0.25%胰蛋白酶，用塑料盖盖好培养板，再放回培养箱中。
6. 在培养箱中静置5分钟，期间不要扰动细胞。
7. 5分钟后，取出培养板并返回至细胞培养超净台。
8. 用400 µL DMEM中和每个经胰蛋白酶处理的孔。
9. 用与各孔对应的名称标记微型离心管。
10. 使用P1000移液器，将每个孔中的液体上下吹打6-8次，以打散细胞团块。
11. 将每个孔的全部内容物（约500 µL）转移至已标记的离心管中。
12. 以400 × g离心5分钟。
13. 离心完成后，弃去上清液，并将样品转移至化学通风橱中。
14. 用P1000移液器将细胞重悬于750-1000 µL的4%多聚甲醛（溶于磷酸盐缓冲液PBS中）中，每个管上下吹打6-8次以打散细胞团块。
15. 室温静置15分钟。
16. 孵育结束后，加入750-1000 µL PBS，上下吹打数次。
17. 以400 × g离心5分钟。
18. 离心完成后，弃去上清液，并将样品转移至化学通风橱中。
19. 用P1000移液器将细胞重悬于750-1000 µL预冷的甲醇中，每个管上下吹打6-8次以打散细胞团块。
20. 将细胞置于冰上或-20 °C冰箱中静置30分钟。
21. 孵育结束后，加入750-1000 µL PBS，上下吹打数次。
22. 以400 × g离心5分钟。
23. 离心完成后，弃去上清液，并将样品转移至化学通风橱中。
24. 根据所用抗体类型，从此步骤起调整实验方案。请执行步骤7.24.1-7.24.14或7.24.15-7.24.22之一。
    1. 若使用一抗和二抗，用P1000/P200移液器将细胞在100 µL一抗溶液中重悬，每个管上下吹打6-8次以打散细胞团块。本实验中，将原液抗体稀释至1:800，包括KRAS抗体或ERK抗体，室温孵育1小时。抗体使用含0.5 g BSA的1× PBS配制的孵育缓冲液进行稀释。
       注：通过建立抗体稀释梯度与目标抗原的标准曲线，经验性确定抗体的最佳稀释比例。
    2. 加入抗体后，用铝箔覆盖离心管，避免标记抗体受光照影响。
    3. 孵育结束后，加入750-1000 µL孵育缓冲液，上下吹打数次。
    4. 以400 × g离心5分钟。
    5. 离心完成后，弃去上清液，并将样品转移至化学通风橱中。
    6. 用P1000/P200移液器将细胞在100 µL二抗溶液中重悬，每个管上下吹打6-8次以打散细胞团块。本实验中，细胞在100 µL二抗中重悬，KRAS抗体稀释比例为1:800，ERK抗体为1:2000，室温孵育30分钟。二抗的稀释方式与一抗相同，使用上述孵育缓冲液。二抗的稀释比例应根据标准曲线的实验结果经验性确定。
    7. 加入抗体后，用铝箔覆盖离心管，避免标记抗体受光照影响。
    8. 孵育结束后，加入750-1000 µL孵育缓冲液，上下吹打数次。
    9. 以400 × g离心5分钟。
    10. 离心完成后，弃去上清液，并将样品转移至化学通风橱中。
    11. 用P1000移液器将细胞在500 µL PBS中重悬，每个管上下吹打6-8次以打散细胞团块。
    12. 将每个管的全部内容物（约500 µL）转移至带有滤网的已标记离心管中。
    13. 将细胞样品送至配备合适波长激光器的流式细胞仪进行检测（可将样品管置于冰上或不加冰运输）。
        注：需注意，进行流式细胞术检测和分析工程化细胞基因表达时，设置多个对照组至关重要。例如，完全未染色的细胞、仅用一抗染色的细胞以及仅用二抗染色的细胞，可用于与抗体背景信号进行比较。
    14. 随后，按照第5节所述进行分析。
    15. 若仅使用一抗，用P1000/P200移液器将细胞在100 µL标记的一抗溶液中重悬，每个管上下吹打6-8次以打散细胞团块。确定合适的一抗稀释比例，并在室温孵育1小时。抗体稀释比例应根据标准曲线实验结果经验性确定。
    16. 加入抗体后，用铝箔覆盖离心管，避免标记抗体受光照影响。
    17. 孵育结束后，加入750-1000 µL孵育缓冲液，上下吹打数次。
    18. 以400 × g离心5分钟。
    19. 用P1000移液器将细胞在500 µL PBS中重悬，每个管上下吹打6-8次以打散细胞团块。
    20. 将每个管的全部内容物（约500 µL）转移至带有滤网的已标记离心管中。
    21. 将细胞样品送至配备合适波长激光器的流式细胞仪进行检测（可将样品管置于冰上或不加冰运输）。
        注：需注意，进行流式细胞术检测和分析工程化细胞基因表达时，设置多个对照组至关重要。完全未染色的细胞以及仅用一抗染色的细胞，可用于与抗体背景信号进行比较。
    22. 此后，按照第5节所述进行分析。

结果

本文中的基因回路组装和稳定细胞系的构建基于商业化的、经过改造的HEK-293细胞，这些细胞含有一个转录活性的、单拷贝稳定FRT位点（图1）。基因回路被构建到含有FRT位点的载体中，从而可通过Flp-FRT系统整合至HEK-293细胞基因组中。该方法不仅限于Flp-In细胞，还可利用CRISPR/Cas9⁵⁰等DNA编辑技术，将FRT位点插入任何目标细胞系基因组中的特定位置。

在构建并验证细胞系的正确插入后，选择LPA和IRIS软件作为光诱导基因表达的标准实验方案^31,51。LPA系统可对24孔板进行编程，以在多种实验条件下根据光照强度、脉冲持续时间和占空比对哺乳动物细胞进行诱导（图2）。本文中优先采用空间上均匀的光照强度、脉冲持续时间和占空比。然而，研究人员可结合使用IRIS软件与LPA系统，实现更复...

讨论

本文读者可深入了解表征光遗传学基因回路（以及其他基因表达系统）的关键步骤，包括：1）基因回路的设计、构建与验证；2）细胞工程，将基因回路导入稳定细胞系（例如 Flp-FRT 重组）；3）利用基于光的平台（如 LPA）对工程化细胞进行诱导；4）通过荧光显微镜初步表征光诱导实验；以及 5）采用多种检测方法进行最终的基因表达表征，包括流式细胞术、定量实时 PCR（qRT-PCR）或免疫荧光检测。

此外，上述方法对于表达目的基因的任何基因线路架构均具有高度模块化特性，主要的潜在方案修改 集中在线路构建步骤以及所进行的检测方法上。在基因线路构建方面，分子克隆的灵活性允许通过轻微调整引物设计或组装方案，即可实现目的基因的替换或与荧光标记共表达。此外，尽管本文所述流程主要聚焦于负反馈（NF）基因线路设计，以实现精确（低噪声）的基因表达调控，但也可采用其他架构，例如正向调控或正反馈（PF），分别实现高倍变化或高基因表达噪声等不同特性^56,57。利用多种基因线路架构（例如 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL PCR管	Eppendorf	951010006	用于进行PCR的试剂
0.25% 胰蛋白酶 EDTA 1X	赛默飞世尔科技	MT25053CI	用于细胞解离的试剂 &哺乳动物细胞的扩增与收获
0.5-10 μL 可调体积移液器	Eppendorf	3123000020	用于移液反应的工具
100-1000 μ可调体积移液器	Eppendorf	3123000039	用于移液反应的工具
20-200 μL 可调体积移液器	Eppendorf	3123000055	用于移液反应的工具
2-20 μL 可调体积移液器	Eppendorf	3123000039	用于移液反应的工具
5 mL 聚苯乙烯圆底管配细胞滤网帽	康宁	352235	流式细胞术试剂
5702R 离心机，配备 4 × 100 转子、15 和 50 mL 适配器，120 V	Eppendorf	22628113	哺乳动物细胞培养实验设备
琼脂糖	德文特科学	GR140-500	凝胶电泳试剂
适用于96孔板的铝箔封膜	VWR®	60941-126	用于光照诱导实验中覆盖培养皿的工具
氨苄青霉素	Sigma Aldrich	A9518-5G	用于筛选含正确质粒细菌的试剂
模拟旋涡混合器	赛默飞世尔科技	02215365PR	用于进行PCR、转化或凝胶回收反应的工具
Bacto 脱水琼脂	Fisher Scientific	DF0140010	用于培养细菌的试剂
BD LSRAria	BD	656700	用于将基因工程细胞系分选为单克隆群体的工具
BD LSRFortessa	BD	649225	用于表征基因工程细胞系的工具
BSA，牛血清白蛋白	政府科学来源	SIGA4919-1G	免疫荧光孵育缓冲液试剂
12孔细胞培养板，透明，平底，带盖，聚苯乙烯，无热原，标准组织培养处理	康宁	353043	用于培养单克隆细胞的培养板
离心	VWR	22628113	哺乳动物细胞培养仪器
化学通风橱	N/A	N/A	用于进行免疫荧光反应的仪器
24孔平底带盖透明细胞培养板	BD	353047	用于培养单克隆细胞的培养板
CytoOne T25 带滤膜瓶盖组织培养瓶	USA Scientific	CC7682-4825	用于培养哺乳动物细胞的容器
二甲基亚砜（DMSO）	Fischer Scientific	BP231-100	用于冷冻保存基因工程哺乳动物细胞的试剂
溴化乙锭	赛默飞世尔科技	15-585-011	凝胶电泳试剂
Falcon 96 孔透明平底 TC 处理细胞培养微孔板（带盖）	康宁	353072	用于培养经分选的单克隆细胞的容器
FCS Express	De Novo 软件	N/A	用于表征流式细胞术数据的软件
胎牛血清，常规型，USDA，500 mL	康宁	35-010-CV	哺乳动物细胞培养试剂
Fisherbrand 带透明盖培养皿 - 带凸起环缘；100 × 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	用于培养细菌的设备
Gibco DMEM，高糖	赛默飞世尔科技	11-965-092	用于培养哺乳动物细胞的试剂
Hs00932330_m1 KRAS 亚型 a Taqman 基因表达检测	Life Technologies	4331182	qPCR 探针
潮霉素B（50 mg/mL），20 mL	Life Technologies	10687-010	用于筛选正确整合基因线路的细胞的试剂
iScript 逆转录超级混合液	伯乐生命科学公司	1708890	用于将RNA转为cDNA的试剂
实验室冰箱 -20 °C	VWR	76210-392	储存实验试剂的设备
实验室超低温冰箱 -80 °C	松下	MDF-U74VC	用于储存实验试剂的设备
实验室冰箱 +4 °C	VWR	76359-220	储存实验试剂的设备
LB肉汤（Lennox），1 kg	Sigma-Aldrich	L3022-250G	用于培养细菌的试剂
LIPOFECTAMINE 3000	Life Technologies	L3000008	用于将基因回路转染至哺乳动物细胞的试剂
MATLAB 2019	MathWorks	N/A	用于分析实验数据的软件
甲醇	Acros Organics	413775000	免疫荧光反应试剂
微量离心管，聚丙烯材质，1.7 mL	VWR	20170-333	塑料器皿容器
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman基因表达检测	Life Technologies	4331182	qPCR 探针
MultiTherm 摇床	Benchmark Scientific	H5000-HC	细菌转化设备
NanoDrop Lite 分光光度计	赛默飞世尔科技	中国台湾-中国台湾-美国-加拿大	用于DNA/RNA浓度测定的设备
NEB Q5 高保真 DNA 聚合酶 2x 预混液	NEB	M0492S	基因回路片段PCR用试剂
NEB10-beta 感受态大肠杆菌（高效）	New England Biolabs (NEB)	C3019H	用于扩增目标基因线路的细菌细胞
NEBuilder HiFi DNA组装预混液	New England Biolabs (NEB)	E2621L	用于连接基因线路片段的试剂
尼康Eclipse Ti-E倒置显微镜配备DS-Qi2相机	尼康仪器公司	N/A	用于定量基因表达的仪器
NIS-Elements	尼康仪器公司	N/A	用于表征荧光显微镜数据的软件
寡核苷酸	IDT	N/A	用于基因线路元件PCR的试剂
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ 系列 CO2 带有紫外线和H的培养箱2O2 对照	Panasonic	MCO-170AICUVHL-PA	用于培养哺乳动物细胞的仪器
16% 电子显微镜级多聚甲醛	电子显微镜科学公司	15710-S	试剂
PBS，德氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）（1×）	Invitrogen	14190144	哺乳动物细胞培养试剂，IF孵育缓冲液试剂
青霉素-链霉素（10,000 U/mL），100倍浓缩液	Fisher Scientific	15140-122	哺乳动物细胞培养试剂
一抗ERK抗体	细胞信号技术公司	4370S	免疫荧光用一抗 ERK
一抗KRAS	Sigma-Aldrich	WH0003845M1	免疫荧光用一抗 KRAS
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（250）	Qiagen	27106	基因回路质粒纯化试剂盒
QIAquick 凝胶回收试剂盒（50）	Qiagen	28704	用于纯化基因线路片段的试剂盒
QuantStudio 3 实时荧光定量 PCR 系统	Eppendorf	A28137	qRT-PCR 仪器
相对定量分析应用程序	赛默飞世尔科技	N/A	用于定量RNA/cDNA扩增的软件
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	用于提取基因工程哺乳动物细胞RNA的试剂盒
二抗ERK抗体	细胞信号技术公司	8889S	免疫荧光用二抗ERK抗体
二抗KRAS抗体	Invitrogen	A11005	免疫荧光用二抗KRAS抗体
5.0 mL 血清移液管	奥林巴斯塑料	12-102	用于建立多种化学反应的试剂
SmartView Pro 成像系统	主要科学	UVCI-1200	用于成像正确PCR条带的工具
SnapGene Viewer（免费）或 SnapGene	SnapGene	N/A	软件DNA序列设计与分析
台式培养箱	东海日立	INU-TIZ	用于进行PCR、转化或凝胶回收反应的工具
TaqMan Fast Advanced Master Mix	赛默飞世尔科技	4444557	基因回路片段PCR用试剂
TaqMan 人 GAPD（GAPDH）内参对照（VIC/MGB 探针），引物限量，2500 次反应	Life Technologies	4326317E	qPCR 探针
PCR仪	伯乐（Bio-Rad）	1851148	用于进行PCR、转化或凝胶回收反应的工具
VisiPlate-24 黑色，黑色24孔微孔板，透明底，无菌且经组织培养处理	PerkinElmer	1450-605	用于光诱导实验的培养板
VWR 一次性巴斯德吸管，玻璃制，硼硅酸盐玻璃吸管，短尖端，容量 = 2 mL，总长度 = 14.6 cm	VWR	14673-010	哺乳动物细胞培养试剂
VWR Mini Horizontal 电泳系统，Mini10 凝胶系统	VWR	89032-290	DNA凝胶电泳设备
Flp-In 293	赛默飞世尔科技	R75007	带有FRT位点的工程化细胞系