Betrouwbare engineering en controle van stabiele optogenetische gencircuits in zoogdiercellen

Summary

Het betrouwbaar controleren van lichtgevoelige zoogdiercellen vereist de standaardisatie van optogenetische methoden. In de richting van dit doel schetst deze studie een pijplijn van gencircuitconstructie, celtechnologie, optogenetische apparatuur en verificatietests om de studie van door licht geïnduceerde genexpressie te standaardiseren met behulp van een negatief feedback optogenetisch gencircuit als casestudy.

Abstract

Betrouwbare genexpressiecontrole in zoogdiercellen vereist hulpmiddelen met een hoge vouwverandering, weinig ruis en bepaalde input-to-output overdrachtsfuncties, ongeacht de gebruikte methode. In de richting van dit doel hebben optogenetische genexpressiesystemen het afgelopen decennium veel aandacht gekregen voor spatiotemporale controle van eiwitniveaus in zoogdiercellen. De meeste bestaande circuits die lichtgeïnduceerde genexpressie regelen, variëren echter in architectuur, worden uitgedrukt uit plasmiden en maken gebruik van variabele optogenetische apparatuur, waardoor de noodzaak ontstaat om karakterisering en standaardisatie van optogenetische componenten in stabiele cellijnen te onderzoeken. Hier biedt de studie een experimentele pijplijn van betrouwbare gencircuitconstructie, integratie en karakterisering voor het beheersen van licht-induceerbare genexpressie in zoogdiercellen, met behulp van een negatieve feedback optogenetisch circuit als voorbeeld. De protocollen illustreren ook hoe het standaardiseren van optogenetische apparatuur en lichtregimes op betrouwbare wijze gencircuitkenmerken kan onthullen, zoals genexpressieruis en eiwitexpressiegrootheid. Ten slotte kan dit artikel van nut zijn voor laboratoria die niet bekend zijn met optogenetica en die dergelijke technologie willen toepassen. De hier beschreven pijplijn zou van toepassing moeten zijn op andere optogenetische circuits in zoogdiercellen, waardoor een betrouwbaardere, gedetailleerdere karakterisering en controle van genexpressie op transcriptioneel, proteomisch en uiteindelijk fenotypisch niveau in zoogdiercellen mogelijk is.

Introduction

Net als andere technische disciplines heeft synthetische biologie tot doel protocollen te standaardiseren, waardoor hulpmiddelen met zeer reproduceerbare functies kunnen worden gebruikt voor het verkennen van vragen die relevant zijn voor biologische ^systemen1,2. Een domein in de synthetische biologie waar veel controlesystemen zijn gebouwd, is het gebied van genexpressieregulatie3,4. Genexpressiecontrole kan zich richten op zowel eiwitniveaus als variabiliteit (ruis of variatiecoëfficiënt, CV = σ/μ, gemeten als de standaarddeviatie over het gemiddelde), die cruciale cellulaire kenmerken zijn vanwege hun rol in fysiologische en pathologische cellulaire toestanden5,6,7,8. Veel synthetische systemen die eiwitniveaus ^en ruis4,9,10,11,12 kunnen regelen, zijn ontworpen, waardoor mogelijkheden ontstaan om protocollen voor alle tools te standaardiseren.

Een nieuwe set hulpmiddelen die gennetwerken kunnen besturen die onlangs zijn ontstaan, is optogenetica, waardoor het gebruik van licht mogelijk is om genexpressie te regelen13,14,15,16,17. Net als hun chemische voorgangers kunnen optogenetische gencircuits in elk celtype worden geïntroduceerd, variërend van bacteriën tot zoogdieren, waardoor elk stroomafwaarts gen van belang ^{kan worden uitgedrukt18,19}. Vanwege de snelle generatie van nieuwe optogenetische hulpmiddelen zijn er echter veel systemen ontstaan die variëren in genetische circuitarchitectuur, expressiemechanisme (bijv. Plasmide-gebaseerde versus virale integratie) en lichtleverende controleapparatuur11,16,20,21,22,23,24,25 . Daarom laat dit ruimte voor standaardisatie van optogenetische kenmerken zoals gencircuitconstructie en -optimalisatie, methode van systeemgebruik (bijv. Integratie versus voorbijgaande expressie), experimentele hulpmiddelen die worden gebruikt voor inductie en analyse van resultaten.

Om vooruitgang te boeken bij het standaardiseren van optogenetische protocollen in zoogdiercellen, beschrijft dit protocol een experimentele pijplijn om optogenetische systemen in zoogdiercellen te engineeren met behulp van een negatief feedback (NF) gencircuit geïntegreerd in HEK293-cellen (menselijke embryonale niercellijn) als voorbeeld. NF is een ideaal systeem om standaardisatie aan te tonen, omdat het zeer overvloedig aanwezig is26,27,28 in de natuur, waardoor eiwitniveaus kunnen worden afgestemd en ruisminimalisatie kan optreden. Kortom, NF maakt nauwkeurige genexpressiecontrole mogelijk door een repressor die zijn eigen expressie voldoende snel vermindert, waardoor elke verandering weg van een steady state wordt beperkt. De steady state kan worden veranderd door een inductor die de repressor inactiveert of elimineert om meer eiwitproductie mogelijk te maken totdat een nieuwe steady state is bereikt voor elke inductorconcentratie. Onlangs is een ontwikkeld NF-optogenetisch systeem gecreëerd dat een breed-dynamische respons van genexpressie kan produceren, lage ruis kan behouden en kan reageren op lichtstimuli, waardoor het potentieel voor ruimtelijke ^{genexpressiecontrole11}. Deze hulpmiddelen, bekend als licht-induceerbare tuners (LITers), werden geïnspireerd door eerdere systemen die genexpressiecontrole in levende cellen mogelijk maakten4,10,29,30 en werden stabiel geïntegreerd in menselijke cellijnen om langdurige genexpressiecontrole te garanderen.

Hier, met behulp van de LITer als voorbeeld, wordt een protocol geschetst voor het creëren van lichtresponsieve gencircuits, het induceren van genexpressie met een Light Plate Apparatus (LPA, een optogenetische inductiehardware)³¹, en het analyseren van reacties van de gemanipuleerde, optogenetisch bestuurbare cellijnen op aangepaste lichtstimuli. Met dit protocol kunnen gebruikers de LITer-tools gebruiken voor elk functioneel gen dat ze willen verkennen. Het kan ook worden aangepast voor andere optogenetische systemen met verschillende circuitarchitecturen (bijv. Positieve feedback, negatieve regulatie, enz.) door de hieronder beschreven methoden en optogenetische apparatuur te integreren. Vergelijkbaar met andere synthetische biologieprotocollen, kunnen de video-opnames en optogenetische protocollen die hier worden beschreven, worden toegepast in eencellige studies op verschillende gebieden, waaronder maar niet beperkt tot kankerbiologie, embryonale ontwikkeling en weefseldifferentiatie.

Protocol

1. Ontwerp van gencircuits

1. Selecteer genetische componenten om te combineren tot een enkel gencircuit/plasmide (bijv. DNA-integratiesequentiemotieven ^{van zoogdieren32}, lichtgevoelige ^elementen33 of functionele ^genen34).
2. Gebruik genetische manipulatie en/of moleculaire kloonsoftware, sla de DNA-sequenties op voor later gebruik en referentie, annoteer elke sequentie en onderzoek alle noodzakelijke kenmerken (bijv. START-codons, regulerende of vertaalde sequenties)³⁵.
3. Ontwikkel of adopteer onderdelen volgens het algemene ontwerp van het ^gencircuit36. Als voorbeeld, voor optogenetische repressoren zoals in de ^LITers11, fuseer een gensequentie die codeert voor een domein dat in staat is tot lichtinduceerbare degradatie37,38 of inactivatie van het DNA-bindingsvermogen van een repressor39, grenzend aan en in het kader van het repressorgen (bijv. TetR)⁴.
   1. Zorg voor optogenetische activatoren voor de aanwezigheid van een ^{activatordomein40} dat genexpressie bevordert op lichtgeïnduceerde DNA-binding41. Zorg voor negatieve of positieve autoregulatie voor de aanwezigheid van een regulerende bindingsplaats in of vóór de promotor van het regulatorgen (bv. tetO-locaties in of vóór de TetR-expressiepromotor)⁴².
4. Ontwerp de primers voor DNA-sequentieversterking of sequencing van het plasmide met behulp van de moleculaire kloonsoftware voor elk gencircuit.
5. Valideer de primers computationeel voor plasmideconstructie door middel van de ingebouwde smeerwaren van moleculaire kloonsoftware (bijv. sequentie-uitlijning).
6. Bestel oligonucleotide primers bij de fabrikant. Plasmiden geconstrueerd en gebruikt in dit werk zijn te vinden in het originele ondersteunende ^materiaal11 samen met de primers ontworpen en gebruikt.
7. Verdun de primers tot een voorraadconcentratie van 100 mM in dubbel gedestilleerd water (_ddH2O).
8. Verdun de voorraad van 100 mM stockprimers tot een concentratie van 10 mM voor PCR.
9. Bereid het PCR-mengsel voor met 1 μL voorwaartse primer, 1 μL omgekeerde primer, 1 μL sjabloon-DNA tot een totale massa van 0,5-500 ng voor genomisch of 0,5 pg-5 ng voor plasmide of viraal DNA, 12,5 μL DNA-polymerase 2x mastermix (of het volume dat voldoet aan de verdunningsfactor van de fabrikant) en 9,5 μL _ddH2O voor een totaal reactievolume van 25 μL.
10. Incubeer het PCR-mengsel in een thermocycler op de juiste instellingen, afhankelijk van het gekozen ^enzym43. Voorgestelde reactiecycli omvatten:
    Stap 1: Eén cyclus van 30 s initiële denaturatiestap bij 95 °C.
    Stap 2: 40 cycli van 5 s denaturatiestap bij 98 °C.
    Stap 3: Eén cyclus van 30 s gloeistap bij 65 °C (bepaald door eerder ontworpen primers).
    Stap 4: Een cyclus van 1 minuut verlenging bij 72 °C (~1 kilobase (kb) template fragment lengte).
    Stap 5: Eén cyclus van een verlenging van 2 minuten bij 72 °C.
    Houd de reactie op 4 °C totdat deze kan worden getest via gel-elektroforese. Dit protocol zal variëren afhankelijk van de gebruikte reagentia (bijv. Polymerase en buffers).
11. Herhaal stap 1.9 om alle fragmenten te versterken die moeten worden gebruikt in een DNA-assemblagereactie die nodig is voor het koppelen van lineaire PCR-producten in een enkele circulaire DNA-vector.
12. Voer de PCR-producten uit op een 1% agarose-gel, gevolgd door het zuiveren van de banden van de gewenste lengte.
13. Bereid de mastermix voor op een DNA-assemblagereactie (tabel 1).
    OPMERKING: In dit voorbeeld wordt de moedervector in twee fragmenten gesplitst om de efficiëntie van de PCR-stappen te verhogen zonder significante veranderingen in het algehele assemblageresultaat te veroorzaken.
14. Incubeer het DNA-assemblagereactiemastermengsel in een thermocycler bij 50 °C gedurende 1 uur (tenzij anders gespecificeerd in het DNA-assemblagereagensprotocol) en bewaar de reactie bij 4 °C om het reactieproduct te gebruiken voor bacteriële transformatie.
15. Stel bacteriële transformatie (chemisch of elektroporatie) in met behulp van competente E. coli (Escherichia coli) cellen en het bijbehorende bacteriële transformatieprotocol. Gebruik na de transformatie de bacteriële Luria-Bertani (LB) agarplaten met de gekozen bacteriële selectiemarker (bijv. Ampicilline) om het transformatiemengsel te vergulden. Incubeer de platen 's nachts bij 37 °^C44.
16. Controleer de platen de volgende dag. Om de kolonies te enten, pluk je individuele kolonies van de platen en resuspend ze in een vloeibare LB-bouillon met de bijbehorende bacteriële selectiemarker in kweekbuizen. Incubeer in een schudderincubator bij 37 °C, 300 rpm 's nachts.
17. Voer plasmidepreparaatprotocol uit om het plasmide-DNA uit de bacteriecultuur te extraheren.
18. Valideer het circuit in twee stappen. Voer eerst een testvertering uit met behulp van restrictie-enzymen als een ruwe verificatie om te zien of het geschatte plasmideproduct is verkregen. Ten tweede, als de testvertering is geslaagd / bevestigd, dient u het plasmide in bij een Sanger-sequencingfaciliteit (of proces met behulp van de beschikbare apparatuur) om de precieze DNA-sequentie te verkrijgen om deze later te vergelijken met de verwachte sequentie in de ontwerpsoftware.
    1. Om de testvertering uit te voeren, selecteert u ten minste twee restrictie-enzymen die ten minste twee fragmenten produceren, op basis van de gebruikte moleculaire kloonsoftware. Zodra de enzymen zijn geselecteerd, bereidt u de testmonsters voor door 1 μL van elk enzym, 5 μL van het gegenereerde DNA en 13 μL water met geschikte zouten en buffers toe te voegen, afhankelijk van de gebruikte enzymen. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 1 uur, of zoals de enzymfabrikant suggereert. Voer de testverteringsproducten uit op een 1% agarose-gel en bepaal of de banden correct zijn.
       OPMERKING: Als de banden correct zijn, gaat u verder met sequencing.
    2. Om sequencing uit te voeren, genereert u primers op basis van het DNA dat in de software is opgeslagen, zodat de gloeigebieden van de primers ongeveer 500 bp (basenparen) uit elkaar liggen en het interessante fragment (gencircuitcomponent) of het volledige plasmide bedekken. Verdun de primers met zuiver nucleasevrij water (_NF-H2O) tot een concentratie van 10 mM. Bereid de sequencingmonsters voor door 1 μL 10 ng/μL DNA, 1 μL primer en 8 μL _NF-H2O toe te voegen aan een buis van 0,2 ml. Herhaal dit voor elke primer.
       OPMERKING: Wanneer monsters zijn voorbereid, geeft u ze af bij de sequencingfaciliteit en vergelijkt u de resultaten met plasmidesequentie met behulp van moleculaire kloonsoftware.
19. Genereer in deze stap ongeveer 100-1000 ng / μL DNA-monster voor het integreren van de plasmiden die gencircuits bevatten in de juiste cellijn.

2. Stabiele cellijn engineering

1. Bestel een zoogdiercellijn die is ontworpen voor het snel genereren van stabiele sublijnen die zorgen voor een expressie op hoog niveau van het eiwit van belang van een zoogdierexpressievector. Het celtype en het gemak van cellijntechniek kunnen variabel zijn, afhankelijk van wat de gebruikers verkiezen of willen bereiken.
   1. Als gebruikers bijvoorbeeld de voorkeur geven aan cellijntechniek met minimale tussenstappen, bestelt u de cellen die een enkele stabiele integratiesite bevatten (bijv. FRT) op een transcriptioneel actieve genomische locus. Als meer genuanceerde celtechnologie de voorkeur heeft, maak dan integratielocaties op voorkeurslocaties met behulp van genetische manipulatietools zoals CRISPR / Cas9.
2. Kweek cellen in 5% _CO2 in bevochtigde lucht bij 37 °C. Pas de groeiomstandigheden indien nodig aan voor het celtype.
3. Transfecteer de hierboven ontworpen gencircuits in de gewenste cellen die zijn verkregen uit de vorige stappen om een stabiel cellijngeneratieproces te starten. Gebruik hiervoor een liposoommengsel45 van het gencircuit-DNA met geschikte recombinase (bijvoorbeeld Flp-recombinase voor Flp-FRT-recombinatie) of via andere methoden zoals elektroporatie.
4. Twee dagen na transfectie, splits de cellen tot 25% confluency.
5. Zes uur na het splitsen van de cellen, begin met de selectie van antibiotica door de media uit te wisselen naar een vers medium met 50 μg / ml hygromycine-antibioticum (of een ander antibioticummiddel dat overeenkomt met het antibioticaresistentiegen van zoogdieren dat tijdens de plasmideconstructie is gekozen).
   OPMERKING: Er zijn verschillende antibioticaresistentiegenen van zoogdieren die worden gebruikt in de constructie van gencircuits, die elk een andere kill-curve hebben. Daarom, welk antibioticaresistentiegen voor zoogdieren ook wordt gekozen voor circuitconstructie, een goede kill-curve moet worden bestudeerd in de cellen van belang. Deze stap zorgt ervoor dat cellen die de lading van het gencircuit bevatten, worden verrijkt, terwijl cellen zonder het systeem worden gedood.
6. Laat de cellen groeien in de antibioticaselectiemedia, verander om de 2-3 dagen in verse media totdat de plaat of kolf enkele tientallen foci heeft. Passage-adherente culturen wanneer ze zich in de logfase bevinden voordat ze samenvloeiing bereiken.
7. Zodra er voldoende foci zijn, trypsiniseren de cellen met 1 ml 0,25% trypsine, 0,1% EDTA in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) zonder calcium, magnesium en natriumbicarbonaat gedurende enkele minuten. Neutraliseer de trypsine met verse media en geef alle cellen door aan een verse container.
8. Zodra de cellen in de verse container 80% -100% confluent zijn, vriest u ze in een mix van 45% oude media, 45% verse media en 10% DMSO. Breng de resterende cellen over naar een steriele buis en voer eencellige sortering uit om monoklonale cellen te isoleren in een 96-well plaat.
9. Ongeveer 2-3 weken na monoklonaal sorteren moeten putten in de 96-putplaat foci hebben. Wanneer ongeveer 50% -60% confluent, splits de cellen in een 12-well plaat.
10. Zodra de 12-well plaat 80%-100% confluent is, gesplitst in een met weefselkweek behandelde T-25 kolf. Zodra de cellen in de T-25-kolf 80% -100% confluent zijn, vriest u de cellen in en behoudt u een doorgang voor karakterisering en testen van monoklonale cellijnen.
    1. Karakteriseer de monoklonale cellijnen door microscopie en flowcytometrie-assays om genexpressieprofielen te rapporteren op basis van de geïnduceerde fluorescerende reporterproductie. Controleer de functionele eiwitproductie via fluorescerende antilichaametikettering en immunofluorescentietest. Test de genexpressie-inductie op transcriptioneel niveau via kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). Valideer de genetische sequentie en integratienauwkeurigheid via lokale en volledige genoomsequencing van de klonen.

3. Inductietests voor lichtplaatapparatuur

1. Bouw een ^{LPA-apparaat31,46} voor gebruik voor lichtinductie van gemanipuleerde cellen. Kortom, verschillende brede stappen zijn cruciaal voor het creëren van LPA om te gebruiken voor het beheersen van genexpressie. Deze omvatten 3D-printen van LPA-framecomponenten, printplaatconstructie, het programmeren van het circuit via microcontrollerprogrammeur, het assembleren van de componenten tot een definitieve LPA, het programmeren van de geheugenkaart via IRIS-software en het kalibreren van het voltooide apparaat. Voor een meer grondige uitleg, zie de bovenstaande referenties.
   1. Print de 3D-onderdelen zoals beschreven in Gerhardt et al. (2016 en 2019)^31,46.
   2. Monteer de printplaat zoals beschreven in Gerhardt et al. (2016 en 2019)^31,46.
   3. Voeg de firmware toe aan het geassembleerde LPA-circuit met behulp van microcontrollerprogrammeur zoals beschreven in Gerhardt et al. (2016 en 2019)^31,46.
   4. Combineer 3D-geprinte onderdelen en de geassembleerde printplaat zoals beschreven in Gerhardt et al. (2016 en 2019)^31,46. Dit omvat het nemen van de montageplaat, de printplaat, de LED-afstandhouder (light-emitting diodes), de plaatadapter, een 24-well plaat, een plaatdeksel, montagebouten en vleugelmoeren en stapelcomponenten zoals getoond in de gefilmde video en figuur 2.
   5. Volg de onderstaande stappen voor het programmeren en kalibreren van de geheugenkaart van het apparaat.
2. Gebruik de IRIS-software die beschikbaar is op de website van Tabor ^Lab47 om een SD-kaart voor het Light Plate Apparatus (LPA)³¹ te programmeren en de juiste lichtomstandigheden te onderzoeken die nodig zijn om een optogenetisch experiment te starten.
   OPMERKING: De IRIS-software is een webgebaseerde applicatie voor het programmeren van de optogenetische elektronische hardware, bekend als de LPA, ontwikkeld door het Tabor Lab. De software maakt het programmeren van relatieve IRIS-waarden mogelijk die de individuele lichtgevende diodes (LED's) in elke put van de LPA-hardware regelen.
3. Kies de vervolgkeuzelijst LPA (4 x 6), gevolgd door op de juiste verlichtingsaanpak te klikken (Steady-state, Dynamic, Advanced).
   OPMERKING: Voor dit manuscript zullen alle testen zich richten op de steady-state voorbeelden. De geavanceerde instellingsvoorbeelden kunnen echter worden gebruikt voor pulsduur en duty cycle-regimes.
4. Kies of de bovenste of onderste LED's worden verlicht door waarden in te voeren in de cellen die overeenkomen met de putjes van de plaat. Voor de LPA's die in dit werk werden gebruikt, werden in alle experimenten blauwe LED's gebruikt die op de bovenste positie waren geplaatst. Elke LED kan, eenmaal geprogrammeerd, continue lichtblootstelling bieden met een constante lichtintensiteit. De IRIS-software maakt 4096 intensiteitsniveaus mogelijk die kunnen worden geprogrammeerd.
5. Zodra de LED-locaties zijn gekozen, voert u intensiteitswaarden in voor het gewenste experimentele overzicht. Voer bijvoorbeeld 8 verschillende lichtintensiteiten (of pulsduur of duty cycles) in met drie technische replicaties per plaat (tabel 2). G.s. verwijst naar grijswaardeneenheden - de meetwaarden van het lichtintensiteitsniveau die worden gebruikt voor LPA-programmering in de IRIS-software.
   1. Houd bij het ontwerpen van IRIS experimentele bestanden rekening met randeffecten van aangrenzende putten op het LPA-apparaat, lichttoxiciteit door toenemende intensiteiten van blootstelling aan blauw licht en het bepalen van het gewenste type dosisrespons (bijv. Monotonisch versus niet-monotoon).
   2. Als gebruikers cellen in de LPA programmeren in oplopende / dalende volgorde van een bepaalde lichtparameter (bijvoorbeeld intensiteit), kunnen putten randeffecten van lichtoverspraak of zelfs warmte produceren die aangrenzende putten kunnen beïnvloeden. Dit kan onbedoeld de uitkomst van gemeten outputs beïnvloeden wanneer experimenten zijn voltooid. Om dit te verlichten, kunnen gebruikers een randomisatiematrix op de IRIS-software implementeren om putlocaties te versleutelen, waardoor randeffecten worden geminimaliseerd. Een voorbeeld wordt beschreven in de representatieve resultaten hieronder (figuur 4A-B).
   3. Bovendien is gebleken dat hogere intensiteiten van blauw licht de cellulaire groei en levensvatbaarheid ^verstoren48. Daarom is het, om de lichttoxiciteit te verminderen, belangrijk om een lichtintensiteit, pulsduur of duty cycle response curve te produceren, afhankelijk van de modaliteit die wordt onderzocht.
      1. Programmeer bijvoorbeeld 8 lichtintensiteitswaarden met drie replicaties per 24-well plaat, met een bereik van geen licht tot een maximale intensiteit van de LPA. Voer deze monsters vervolgens uit op een flowcytometer met een SSC-FSC-poort of een levende vlek zoals propidiumjodide om de overleving van de populatiecel (levende cellen in vergelijking met totale gebeurtenissen inclusief dode cellen / cellulair puin) bij elke lichtwaarde te kwantificeren.
      2. Bepaal vervolgens de ideale hoeveelheid populatieoverleving voor de experimentele opstelling, omdat elke stimulus de proliferatie, genexpressie of overleving nadelig kan beïnvloeden (bijvoorbeeld het instellen van 80% celoverleving als een geschikte afweging). Bijvoorbeeld, in dit werk, eenmaal gekalibreerd, was de intensiteit niet hoger dan 3000 g.s. eenheden (~ 3/4 de maximale intensiteit van het LPA-apparaat). Een voorbeeld hiervan wordt beschreven in de representatieve resultaten hieronder.
   4. Naast het beperken van lichtwaarden vanwege toxiciteit, kunnen gebruikers lichtwaarden beperken om een bepaald deel van de dosis-respons te karakteriseren, zoals het bereik van de monotone respons.
      1. Om dit te bereiken, scant u in eerste instantie een breed scala aan lichtintensiteiten, pulsduur of duty cycles, afhankelijk van de modaliteit die wordt geanalyseerd bij het bepalen van de gewenste dosis-respons (tabel 2) om het lichtregime van belang te beperken, bijvoorbeeld waar genexpressie positief correleert met toenemende lichtwaarden voor een monotone dosis-respons.
      2. Om het lichtbereik van belang te bepalen, programmeert u een enkele LPA met maximaal 24 putten van verschillende intensiteit / pulsduur / duty cycle / etc. of meer putten (bijv. 48, 72, 96, enz.), Afhankelijk van of meerdere LPA's zijn gekalibreerd om gelijkwaardige lichthoeveelheden te leveren en doorgaan met het celkweekwerk of de hieronder beschreven testen. Begin daarom met de karakterisering van een optogenetisch systeem met een breed dosisbereik van lichtstimuli om het bereikinterval te bepalen dat de gewenste genexpressie geeft en voer vervolgens experimenten uit in dat verfijnde dosisbereik.
      3. In dit werk werd bijvoorbeeld ooit 3000 g.s. eenheden bepaald als de drempel voor toxische lichtintensiteit; deze drempel werd gebruikt als de bovengrens van licht voor de hieronder beschreven testen (bijv. immunofluorescentie).
         OPMERKING: De bovenstaande stappen zijn onafhankelijk van de optische kalibratie van de LPA en verwijzen naar een kalibratie op moleculair niveau voor elk optogenetisch systeem.
6. Zodra de juiste lichtintensiteitswaarden in IRIS zijn geprogrammeerd, plaatst u een geheugenkaart met het USB 3.0-stopcontact in de LPA om de bestanden te downloaden en over te dragen.
7. Als de kalibratie van de LPA is ^voltooid31, ga dan verder met celkweekwerk voor het starten van een lichtinductietest. Als de kalibratie niet is uitgevoerd, kalibreert u de LPA met behulp van een beeldanalysemethode (stappen 3.7.1-3.7.3) zodra de LPA is geprogrammeerd met de microcontrollerprogrammeur.
   1. Programmeer de LPA kort om hetzelfde IRIS-niveau te hebben als beschreven door Gerhardt et al. (2016)³¹.
      OPMERKING: Voor kalibratie is de LPA geprogrammeerd om een waarde van 2000 g.s te hebben.
   2. Zodra het apparaat is geprogrammeerd met de geheugenkaart en de resetknop (fysieke knop op de LPA) is ingedrukt, krijgt u een afbeelding van het hele apparaat (bijv. gel station imager, scannerapparaat, enz.). Voor de kalibratie maakt u twee beelden met het apparaat 180° gedraaid.
   3. Gebruik vervolgens open-source software ontworpen door Gerhardt et al. (2016)³¹ om de variabiliteit in LED-intensiteit op de LPA-plaat te tonen en de LED-compensatiewaarden te berekenen om de intensiteit gelijk te maken over putten. Een voorbeeld hiervan wordt beschreven in de onderstaande resultaten (figuur 3). Zodra deze kalibratie is voltooid, gaat u verder met celkweekwerk voor het starten van een lichtinductietest.
8. Verkrijg kolven van gemanipuleerde monoklonale cellen uit de vorige sectie om lichtinductie-effecten op genexpressie te onderzoeken.
9. Verwijder de oude media uit de kolf.
10. Voeg 1 ml trypsine toe aan de cellen en incubeer gedurende 5 minuten.
11. Neutraliseer na 5 minuten trypsine door toevoeging van 4 ml Dulbecco-gemodificeerd Eagle's medium (DMEM of andere gewenste media) aangevuld met de nodige chemicaliën (dit werk gebruikte 50 μg / ml hygromycine, 1% penicilline / streptomycine-oplossing, 10% foetaal runderserum, FBS).
12. Voeg ~75.000 cellen per put toe in een zwarte plaat met 24 putten in een totaal volume van 500 μL. Het aantal gezaaide cellen kan variëren afhankelijk van de duur van het gewenste experiment en het gebruikte celtype.
    OPMERKING: Houd er bovendien rekening mee dat de celzaaidichtheid van invloed is op het cultuuronderhoud en mogelijk de duur van het experiment. Beginnen bij een lager aantal cellen per put zorgt voor een langere tijdsduur voordat de kweek samenvloeiing bereikt. Bovendien zal het type optogenetische componenten dat in de interessante gencircuits is geïntegreerd, van invloed zijn op wanneer genexpressie een stabiele toestand bereikt en daarom de duur van de experimenten beïnvloeden. Andere factoren die kunnen worden overwogen zijn cellijnspecifieke groeisnelheden, mediasamenstelling en voorwaardelijke groei-effecten (d.w.z. licht).
13. Plaats de cellen na het platen in een bevochtigde incubator met 5% _CO2 om ze 2-6 uur te laten bezinken.
14. Breng na de incubatie de cellen over naar een weefselkweekkap, verwijder het plastic deksel en voeg een kleeffoliestrip toe aan de bovenkant van de plaat (figuur 2D). Deze stap maakt minimale lichtoverdracht tussen putten mogelijk, omdat de bovenkant en de zijkanten van de putten zijn gecoat en het licht nu alleen kan binnenkomen vanaf de onderkant van de put waar de LED is geplaatst.
15. Plaats de plaat in de gemonteerde 3D-delen van de LPA. Bedek vervolgens de plaat met het 3D-geprinte LPA-deksel, dat over de apparaatschroeven op elke hoek past.
16. Sluit het apparaat aan op de voedingsbron en druk op de resetknop op het LPA-apparaat om ervoor te zorgen dat de bijgewerkte LPA-experimentinstellingen worden toegepast.
17. Incubeer de cellen in het experimentele systeem gedurende een geschikte hoeveelheid tijd, afhankelijk van de oorspronkelijke zaaidichtheid, cellijnspecifieke groeisnelheid en groeiomstandigheden. In dit voorbeeld werden de cellijnen gedurende 3 dagen continu geïnduceerd om genexpressie een steady state te laten bereiken. Er moet echter worden opgemerkt dat veel optogenetische systemen (bijv. VVD) veel eerder steady-state genexpressie kunnen bereiken (bijv. 24 uur), en daarom kunnen experimentele inductietijden indien nodig worden verminderd of verlengd.
18. Gebruik aan het einde van het lichtinductie-experiment de monsters voor een van de volgende vier testen om de gemanipuleerde cellijnen te karakteriseren (secties 4-7).

4. Fluorescentiemicroscopie van door licht geïnduceerde gemanipuleerde cellen

1. Verwijder 24-72 uur na inductie de cellen in de LPA uit de couveuse en plaats ze in een weefselkweekkap.
2. Verwijder de foliestrip en laat de plaat 1-2 min zitten. Dit voorkomt condensvorming op het plastic deksel, indien direct op de plaat geplaatst.
3. Na 1-2 minuten zitten, doe het originele plastic deksel terug op het bord.
4. Stel de cellen in beeld met de juiste fasecontrast- of fluorescentiemicroscoop.
5. Afhankelijk van het instrument past u de belichtingstijd, lichtbronintensiteit en versterking aan voor het weergeven van gemanipuleerde cellen. In dit experiment werden de volgende parameters toegepast: 50 ms voor FITC/GFP (groen fluorescerend eiwit) blootstellingstijd van de lichtbron en 1-5 ms voor fasecontrastblootstellingstijd bij 100% intensiteit voor elk.
   OPMERKING: Opgemerkt moet worden dat optimale belichtingstijden, versterkingsniveaus en lichtbronintensiteiten vaak empirisch worden afgeleid uit de ervaring van dit werk om oververzadiging in de fluorescentieverslaggever te minimaliseren, cellulaire schade te minimaliseren en voldoende beelden vast te leggen voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse. Bij het bepalen van de niveaus van elk van deze parameters, omvatten de aspecten om in gedachten te houden het maximaliseren van signaal-ruisverhoudingen, het minimaliseren van fototoxiciteit, het minimaliseren van oververzadiging van fluorescentiesignalen en het vergroten van het vermogen om zwakke fluorescentiesignalen te versterken.
   1. Optimaliseer deze parameters grof ad-hoc; eerdere experimentele waarden (bijv. lichtbronintensiteit die oververzadiging van fluorescentiereporter veroorzaakt) kunnen echter toekomstige experimentele instellingen sturen, indien van toepassing. De versterkingsinstellingen, belichtingstijden en beginwaarden van de lichtintensiteit van één circuit (LITer1.0) of experimentele opstelling (bijv. Lichtintensiteit) kunnen bijvoorbeeld als uitgangspunt worden gebruikt bij het verplaatsen naar een vergelijkbaar maar ander gencircuit (LITer2.0)¹¹ of een andere lichtmodaliteit (bijv. Lichte duty cycle).
6. Stroomlijn plaatbeeldvorming door een coördinaatsjabloon die in de microscopiesoftware is geprogrammeerd, waardoor de volledige plaatgrootte (bijv. 24 putten) geautomatiseerde beeldacquisitie van meerdere beeldlocaties per put kan hebben.

5. Flowcytometrie van lichtgeïnduceerde gemanipuleerde cellen

1. Verwijder 24-72 uur na inductie de cellen uit de LPA in de couveuse of uit de microscoop na beeldvorming en plaats ze in de weefselkweekkap.
2. Als u rechtstreeks uit de LPA wordt verwijderd, verwijdert u de foliestrip en laat u de plaat een minuut of twee zitten.
3. Zuig de media uit elke put (van de hele 24-putplaat als alle putten worden gebruikt).
4. Voeg 100 μL van 0,25% trypsine toe aan elk putje, bedek de plaat met een plastic deksel en plaats deze terug in de incubator.
5. Laat de cellen 5 min ongestoord in de couveuse.
6. Verwijder na 5 minuten de plaat en breng deze terug naar de weefselkweekkap.
7. Neutraliseer elke trypsine goed met 400 μL DMEM.
8. Label een 5 ml polystyreen buis met ronde bodem met celzeef (of geschikte flowcytometriebuis die kan worden gefilterd om grote klonten cellen te verwijderen die niet volledig trypsine zijn) met een naam die overeenkomt met elke put.
9. Gebruik een P1000-pipet om de inhoud van elke put 6-8 keer op en neer te pipetten om celklonten te breken en eencellige monsters te maken voor ^{flowcytometrie49}.
10. Breng de volledige inhoud van elke put (~ 500 μL) over naar de gelabelde buizen met de zeef.
11. Breng cellen naar het juiste flowcytometrie-instrument met lasers van de juiste golflengten (kan buizen met cellen op of van ijs brengen).
    OPMERKING: De flowcytometer die in dit werk werd gebruikt, maakte deel uit van een kernfaciliteit in het universitair ziekenhuis.
12. Maak een voorwaartse en zijwaartse scatterpoort (respectievelijk FSC en SSC) om de afzonderlijke cellen van de juiste grootte en granulariteit vast te leggen om puin en cellulaire klonten op de flowcytometriesoftware uit te sluiten.
13. Zodra de poort is ingesteld, vangt u ongeveer 10.000 cellen met de juiste poort. Pas dit aantal aan afhankelijk van de hoeveelheid mobiele data die de gebruikers zoeken. Herhaal dit voor elke buis die de cellen uit het experiment bevat.
14. Zodra het experiment is voltooid, importeert u de gegevens naar de beschikbare flowcytometriegegevenssoftware voor analyse.
15. Maak een FSC-SSC-poort (zoals eerder tijdens de acquisitie) en pas deze toe op elke batch experimentele gegevens. Een referentieput van de niet-geïnduceerde celpopulatie wordt gebruikt voor het maken van deze poort in dit manuscript, maar er bestaan andere metrieken voor poortcreatie, zoals op dichtheid gebaseerde poorten.
16. Met de experimentele omstandigheden omheind met een FSC-SSC-poort, plot de flowcytometriegegevens als histogrammen of vertegenwoordig op andere manieren om de verkregen expressiepatronen te illustreren. In dit experiment werd de fluorescentie vastgelegd door de GFP / FITC- of PE / TexasRed-kanalen.

6. RNA-extractie en kwantitatieve PCR van gencircuitcomponenten

1. Verwijder 24-72 uur na inductie de cellen uit de LPA in de couveuse of uit de microscoop na beeldvorming en plaats ze in de weefselkweekkap.
2. Indien rechtstreeks uit de LPA verwijderd, verwijdert u de foliestrip en laat u de plaat een minuut of twee zitten.
3. Zuig de media uit elke put (van de hele 24-putplaat als alle putten worden gebruikt).
4. Ga verder met het extraheren van RNA uit de cellen met behulp van de juiste RNA-extractiekit.
5. Zodra de RNA-extractie is voltooid, voert u een omgekeerde transcriptiereactie van elk monster uit (tabel 3).
6. Voer verder kwantitatieve PCR uit van elk monster (tabel 4). Gebruik een DNA-polymerase en het bijbehorende protocol om PCR-reacties in te stellen. Stel voor deze stap een gemultiplexte reactie in met een huishoudgen en een interessant gen, of creëer afzonderlijke reacties. In dit voorbeeld werden GFP-, KRAS- en glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) -niveaus onderzocht. Na het voltooien van het qRT-PCR-experiment, gaat u verder met de analyse via beschikbare software om de verandering van gencircuitplooien op RNA-niveau te illustreren.

7. Immunofluorescentie van gencircuitcomponenten

1. Gebruik een ijsbad of vriezer om methanol af te koelen.
2. Verwijder 24-72 uur na inductie de cellen uit de LPA in de couveuse of uit de microscoop na beeldvorming en plaats ze in de weefselkweekkap.
3. Indien rechtstreeks uit de LPA verwijderd, verwijdert u de foliestrip en laat u de plaat 1-2 minuten zitten.
4. Zuig de media uit elke put (van de hele 24-putplaat als alle putten worden gebruikt).
5. Voeg 100 μL van 0,25% trypsine toe aan elk putje, bedek de plaat met een plastic deksel en plaats deze terug in de incubator.
6. Laat de cellen 5 min ongestoord in de couveuse.
7. Verwijder na 5 minuten de plaat en breng deze terug naar de weefselkweekkap.
8. Neutraliseer elke trypsine goed met 400 μL DMEM.
9. Label mini-centrifugebuizen met namen die overeenkomen met elke put.
10. Gebruik een P1000-pipet en pipetteer de inhoud van elk putje 6-8 keer op en neer om de celklonten te breken.
11. Breng de volledige inhoud van elke put (~ 500 μL) over naar de gelabelde buizen.
12. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g.
13. Als u klaar bent, gooit u het bovennatuurdier weg en verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast.
14. Resuspend de cellen (gebruik een P1000-pipet en pipet 6-8 keer op en neer in elke buis om celklonten te breken) in 750-1000 μL 4% paraformaldehyde (verdund in fosfaat-gebufferde zoutoplossing, PBS).
15. Laat de cellen 15 minuten op kamertemperatuur zitten.
16. Voeg na de incubatie 750-1000 μL PBS toe. Pipetteer meerdere keren op en neer.
17. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g.
18. Als u klaar bent, gooit u het bovennatuurdier weg en verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast.
19. Resuspend de cellen (gebruik een P1000 pipet en pipet 6-8 keer op en neer in elke buis om celklonten te breken) in 750-1000 μL ijskoude methanol.
20. Laat de cellen 30 minuten op ijs of in een vriezer van -20 °C zitten.
21. Voeg na de incubatie 750-1000 μL PBS toe. Pipetteer meerdere keren op en neer.
22. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g.
23. Als u klaar bent, gooit u het bovennatuurdier weg en verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast.
24. Afhankelijk van het type antilichamen dat wordt gebruikt, wijzigt u het protocol vanaf dit punt. Volg de stappen 7.24.1-7.24.14 of 7.24.15-7.24.22.
    1. Als u een primair en secundair antilichaam gebruikt, resuspendeert u de cellen met een P1000/P200-pipet en pipet 6-8 keer in elke buis op en neer om celklonten in 100 μL primair antilichaam te breken. In dit geval werd een verdunning van 1:800 voor stockantistoffen gemaakt, waaronder KRAS-antilichaam of ERK-antilichaam, en mocht deze gedurende 1 uur bij kamertemperatuur zitten. Antilichamen werden verdund in een incubatiebuffer gemaakt van 1x PBS met 0,5 g BSA.
       OPMERKING: Bepaal de exacte verdunning van het antilichaam empirisch door een standaardcurve van antilichaamverdunningen versus het antigeen van belang te maken.
    2. Na het toevoegen van antilichamen, bedek de buisjes met een folie om lichteffecten op gelabelde antilichamen te voorkomen.
    3. Voeg na incubatie 750-1000 μL van de incubatiebuffer toe. Pipetteer meerdere keren op en neer.
    4. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g.
    5. Als u klaar bent, gooit u het bovennatuurdier weg en verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast.
    6. Resuspend de cellen met behulp van een P1000 / P200 pipet en pipet op en neer 6-8 keer in elke buis om celklonten in 100 μL secundair antilichaam te breken. In dit geval werden cellen geresuspendeerd in 100 μL secundair antilichaam bij een verdunning van 1:800 voor KRAS-antilichaam of 1:2000 voor ERK-antilichaam en 30 minuten bij kamertemperatuur laten zitten. Verdun, net als bij primaire antilichamen, de secundaire antilichamen in de incubatiebuffer zoals hierboven beschreven. Bepaal de verdunningen van de secundaire antilichamen op basis van de empirische bevindingen van een standaardcurve.
    7. Na het toevoegen van antilichamen, bedek de buisjes met een folie om lichteffecten op de gelabelde antilichamen te voorkomen.
    8. Voeg na de incubatie 750-1000 μL van de incubatiebuffer toe. Pipetteer meerdere keren op en neer.
    9. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g.
    10. Als u klaar bent, gooit u het bovennatuurdier weg en verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast.
    11. Resuspend de cellen met behulp van een P1000 pipet en pipet 6-8 keer op en neer in elke buis om celklonten in 500 μL PBS te breken.
    12. Breng de volledige inhoud van elke buis (~ 500 μL) over naar de gelabelde buizen met zeven.
    13. Breng de cellen naar geschikte flowcytometrie-instrumenten met lasers van de juiste golflengten (kan buizen met cellen op of van ijs brengen).
        OPMERKING: Opgemerkt moet worden dat het hebben van verschillende controles belangrijk is voor de voortgang met flowcytometriemeting en analyse van gemanipuleerde celgenexpressie. Het hebben van volledig onbevlekte cellen, cellen gekleurd met primair antilichaam alleen en cellen gekleurd met secundair antilichaam alleen kan nuttig zijn voor het vergelijken van resultaten met achtergrondsignalen van antilichamen.
    14. Ga vervolgens verder met de analyse zoals beschreven in sectie 5.
    15. Als u alleen een primair antilichaam gebruikt, resuspendeert u de cellen met behulp van een P1000 / P200-pipet en pipetteer 6-8 keer op en neer in elke buis om celklonten te breken in 100 μL gelabeld primair antilichaam. Bepaal de juiste antilichaamverdunning en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Bepaal empirisch de antilichaamverdunning uit de standaardcurve.
    16. Na het toevoegen van antilichamen, bedek de buisjes met een folie om lichteffecten op gelabelde antilichamen te voorkomen.
    17. Voeg na incubatie 750-1000 μL van de incubatiebuffer toe. Pipetteer meerdere keren op en neer.
    18. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g.
    19. Resuspend de cellen met behulp van een P1000 pipet en pipet 6-8 keer op en neer in elke buis om celklonten in 500 μL PBS te breken.
    20. Breng de volledige inhoud van elke buis (~ 500 μL) over naar gelabelde buizen met zeven.
    21. Breng de cellen naar geschikte flowcytometrie-instrumenten met lasers van de juiste golflengten (kan buizen met cellen op of van ijs brengen).
        OPMERKING: Opgemerkt moet worden dat het hebben van verschillende controles belangrijk is voor de voortgang met flowcytometriemeting en analyse van gemanipuleerde celgenexpressie. Het hebben van volledig onbevlekte cellen en cellen gekleurd met primair antilichaam alleen zijn nuttig voor het vergelijken van resultaten met achtergrondsignalen van antilichamen.
    22. Ga vanaf dit punt verder met de analyse zoals beschreven in rubriek 5.

Representative Results

Gencircuitassemblage en stabiele cellijngeneratie in dit artikel waren gebaseerd op commerciële, gemodificeerde HEK-293-cellen die een transcriptioneel actieve, enkele stabiele FRT-site bevatten (figuur 1). De gencircuits werden geconstrueerd in vectoren met FRT-locaties in het plasmide, waardoor de Flp-FRT-integratie in het HEK-293-celgenoom mogelijk was. Deze aanpak is niet beperkt tot Flp-In-cellen, omdat FRT-sites overal in het genoom aan elke gewenste cellijn kunnen worden toegevoegd met behulp van DNA-bewerkingstechnologie zoals CRISPR / ^Cas950.

Zodra de juiste cellijnen waren geconstrueerd en gevalideerd voor de juiste insertie, werden de LPA- en IRIS-software gekozen als een gestandaardiseerd protocol voor lichtinductie van ^{genexpressie31,51}. Met het LPA-systeem kunnen 24 putten worden geprogrammeerd voor inductie van zoogdiercellen in meerdere experimentele omstandigheden, afhankelijk van de lichtintensiteit, pulsduur en duty cycle (figuur 2). In dit artikel werd prioriteit gegeven aan ruimtelijk uniforme lichtintensiteit, pulsduur en duty cycle. Onderzoekers kunnen echter de IRIS-software en de LPA gebruiken voor een meer geavanceerde programmering van temporele lichtgolfpatronen.

Een cruciaal aspect van de LPA dat moet worden aangepakt voordat met experimenten wordt begonnen, is de optische kalibratie die kan worden uitgevoerd voor enkele of meerdere apparaten. De eerder beschreven ^{beeldanalysemethode31} die wordt gebruikt voor kalibratie vereist een afbeelding van de volledige LPA met alle LED's van belang ingeschakeld, die kunnen worden verkregen uit verschillende ^bronnen52, waaronder een gel imager. Hier werd een computerscanner gebruikt voor beeldacquisitie (figuur 3A). Zodra het beeld was verkregen, werd de open-source software gemaakt door Gerhardt et al. (2016)³¹ gebruikt om compensatiewaarden voor elke LED te berekenen om ervoor te zorgen dat elke LPA dezelfde intensiteit uitzendt bij een bepaalde grijswaardenwaarde. De software trekt het achtergrondsignaal af, brengt de afbeelding in een binaire categorie en berekent de pixelintensiteit (figuur 3B). Uit de kalibratie bleek een minimale variatie tussen de LED's, met een CV van 0,04 tussen 96 putten (of 4 gekalibreerde platen, figuur 3C). Ten slotte demonstreerde het gebruik van de kalibratiesoftware de LED-variatie per locatie (figuur 3D) en creëerde een grijswaardenaanpassing (figuur 3E) zodat elke LED wordt genormaliseerd tot dezelfde intensiteit.

Naast kalibratie omvatten andere belangrijke aspecten van het gebruik van de LPA de integratie van verschillende controles in de experimentele pijplijn die systemische fouten kunnen minimaliseren door verstorende variabelen zoals lichttoxiciteitseffecten en ontwerpbeperkingen op basis van experimentele materialen te beperken. Figuur 4 illustreert bijvoorbeeld twee verschillende configuraties voor het programmeren van verschillende lichtintensiteiten in de LPA-putten. Het eerste subpaneel van figuur 4A toont een oplopende organisatie van de lichtintensiteit. Dit kan zorgen voor het gemak van programmeren en data-analyse, maar kan randeffecten produceren waarbij de onderste rij van de LPA de hoogste lichtintensiteit heeft en mogelijk ongewenste warmte en lichtinductie van nabijgelegen putten kan veroorzaken. Evenzo is in het tweede subpaneel van figuur 4A een randomisatiematrix toegepast op de IRIS-software, waardoor verschillende lichtintensiteiten in willekeurige posities zijn ontstaan. Dit kan systemische invloeden van randeffecten minimaliseren. Met de IRIS-software wordt een ontcijferde matrix (figuur 4B) gemaakt, die vervolgens kan worden gebruikt om de experimentele omstandigheden na voltooiing van het experiment en tijdens de analyse te bepalen. Net als bij de randomisatie van putten, moeten gebruikers zich ook bewust zijn van lichttoxiciteitseffecten die kunnen optreden (blauw licht binnen dit werk). In figuur 4C worden twee verschillende lichtintensiteiten getoond die worden gebruikt voor gencircuitinductie met dezelfde FSC-SSC-poort op basis van de niet-geïnduceerde populatie van gemanipuleerde cellen. Als zodanig moeten gebruikers een dosis-respons uitvoeren op de lichtmodaliteit van belang (bijv. puls, duty cycle, enz.) om lichttoxiciteitseffecten te bepalen die kunnen optreden aan de bovenkant van de blootstelling (figuur 4D). Hier veroorzaakten toenemende blauwlichtniveaus dosisafhankelijk cellulair puin, dode cellen en klonten in vergelijking met niet-gestimuleerde cellen. Als zodanig was de continue lichtintensiteit beperkt tot ongeveer 3/4 van de maximale LPA-intensiteit (~ 3000 g.s. eenheden).

Zodra de juiste apparatuur was opgezet, werd genexpressie geïnduceerd in gemanipuleerde LITer-gencircuits via fluorescentiemicroscopie (figuur 5). Cellen werden geïnduceerd bij verschillende lichtpulsduur op de LPA, wat een lichte dosis-respons van genexpressie op populatieniveau gaf. Cellen binnen dit werk werden afgebeeld voor GFP-expressie met behulp van 50 ms voor FITC / GFP-belichtingstijd van lichtbronnen en voor heldere veldbeeldvorming met behulp van 1-5 ms voor fasecontrastbelichtingstijd. Gezien de robuustheid van dit cellijn-engineeringprotocol kan elke fluorescentiemarker worden gebruikt in plaats van GFP. De cellen kunnen worden geïnduceerd met meerdere lichtregimes en produceren een groot scala aan reacties (figuur 5). Dit laatste is gunstig bij het verder beheersen van de expressie van functionele genen (bijv. KRAS (G12V) oncogen in het oorspronkelijke ^werk53).

Onmiddellijk na fluorescentiemicroscopie konden cellen worden geanalyseerd in verschillende experimentele protocollen, waaronder flowcytometrie, qRT-PCR en immunofluorescentie. In dit werk werd flowcytometrie uitgevoerd als een eerste validatieprocedure en uitgevoerd volgens de hierboven beschreven methoden (figuur 6). Net als bij microscopie werden cellen geïnduceerd bij verschillende pulslengtewaarden en vertoonden ze een dosis-respons van genexpressie van meer dan viervoudige verandering van niet-geïnduceerde toestanden op populatieniveau (figuur 6A-B). Op dezelfde manier kan ruisonderdrukking van genexpressie worden aangetoond door verschillende lichtintensiteitswaarden (figuur 6C-D) voor het LITer-systeem te vergelijken met een positief regulatiesysteem (geen feedback) zoals de VVD/^LightOn54. Bij vergelijking van de LITer met het VVD-systeem bereikt negatieve feedback meer dan vijfvoudige genexpressieruisreductie. Dezelfde vooraf geïnduceerde cellen die op microscopie zijn afgebeeld, konden ook worden geanalyseerd via qRT-PCR (figuur 7). Net als bij flowcytometrie konden de gemanipuleerde LITer-cellen RNA-niveaus tot expressie brengen op een dosisresponsieve manier (meer dan 10-voudige inductie van niet-geïnduceerde toestanden), overeenkomend met de dosis-respons van eiwitniveaus gekwantificeerd door GFP-expressie op flowcytometrie. De genoemde fluorescentiemicroscopie en flowcytometriegegevens kunnen worden gekalibreerd met behulp van niet-fluorescerende cellen, constitutief tot expressie brengende fluorescerende cellen en fluorescerende 6-8-piek validatieparels (bijv. FL1-kanaals groene, fluorescerende kralen). Elk van deze componenten kan de normalisatie van genexpressie in een enkel experiment mogelijk maken. Deze factoren kunnen echter ook normalisatie van circuits en gemanipuleerde cellen over verschillende experimentele platen, experimentele omstandigheden en dagen mogelijk maken om vergelijking en standaardisatie van genexpressiegegevens mogelijk te maken.

Ten slotte kunnen de LITer-gencircuits worden ontworpen om functionele genen tot expressie te brengen, zoals de KRAS (G12V, figuur 8). De veelzijdigheid van deze pijplijn stelt gebruikers in staat om de LITer-architectuur met celengineering te gebruiken voor elk functioneel gen van belang, mogelijk met aanvullende architecturen zoals positieve feedback. De LITer toonde toenemende hoeveelheden blauw licht die resulteerden in verhoogde niveaus van de gencircuitoutput (KRAS (G12V) eiwitniveaus) en bijgevolg gefosforyleerde ERK-niveaus, die beide kunnen worden gekwantificeerd via immunofluorescentietests.

Stuk	Verhouding	Grootte (bp)	Gewichtsconcentratie van DNA-fragmenten (ng/μL)	DNA fragment molaire concentratie (fmol/μL)	Volume (μL)	Resulterende DNA-molaire massa (fmol)
Moeder Vector fragment 1	1	3414.00	18.20	8.63	4.09	35.29
Moeder Vector fragment 2	1	4642.00	18.10	6.31	5.59	35.29
Gen van belang	1	549.00	37.90	111.70	0.32	35.29
Totaal					10.00	105.87

Tabel 1: Berekening van de DNA-assemblagereactiemastermix (stap 1.13). Kolommen 2 & 3 zijn gebaseerd op de grootte van de geassembleerde DNA-fragmenten en de concentratie van deze fragmenten na PCR-amplificatie en agarosegelextractie (stap 1.11). De onderste cel van de ^4e kolom (totaal reactievolume) kan worden gewijzigd; het aangegeven volume wordt echter aanbevolen. Onbeschaduwde cellen worden automatisch gegenereerd.

0	100	200	400	500	750
1500	3000	0	100	200	400
500	750	1500	3000	0	100
200	400	500	750	1500	3000

Tabel 2: IRIS-programmering van lichtintensiteiten (g.s.) voor lichtinductie-experiment in een 24-putplaat met drie replicaties (stap 3.4). Verdeling van lichtintensiteiten variërend van 0 tot 3000 g.s. G.s.-grijswaardeneenheden. Dit kan naar behoefte worden gerandomiseerd door de IRIS-software.

	Voorbeeld 1	Voorbeeld 2	Voorbeeld 3
Reverse Transcriptase Master Mix Volume (μL)	4.00	4.00	4.00
RNA Template (1000 ng) Volume (μL)	2.00	3.00	4.00
NF-H20 Volume (μL)	14.00	13.00	12.00
Totaal volume (μl)	20.00	20.00	20.00

Tabel 3: Berekening van de reverse transcriptiemastermix (stap 6.5). Het door de reactie aanbevolen totale volume is 20 μL en de componenten zijn de reverse transcriptase enzym master mix (hier: 5x), RNA-sjabloon en nucleasevrij water. In dit voorbeeld zijn de RNA-concentraties van monsters 1, 2 en 3 respectievelijk 500, 333 en 250 ng / μL.

	Voorbeeld 1	Voorbeeld 2	Voorbeeld 1 & 2 multiplexed
GFP-sondevolume (μL)	1	-----	1
GAPDH Sonde Volume (μL)	------	1	1
DNA polymerase Master Mix Volume (μL)	10	10	10
cDNA (100 ng) volume (μL)	2	2	2
NF-H20 Volume (μL)	7	7	7
Totaal volume (μl)	20	20	20

Tabel 4: Berekening van de kwantitatieve PCR-mastermix (stap 6.6). Het aanbevolen totale volume van de reactie is 20 μL en de componenten zijn de DNA polymerase enzym master mix (hier: 2x), GFP en/of GAPDH probes, cDNA (100 ng totaal) en nuclease vrij water (_NF-H20).

Figuur 1: Circuitontwerp en celtechniek. (A) Celtechnologie-instrumenten, waaronder LITer synthetisch gencircuit met FRT-integratieplaatsen, recombinase-enzym (Flp-recombinase) voor circuitintegratie, geneesmiddel dat wordt gebruikt voor de selectie van geschikte genetische klonen en cellijn van belang die wordt gebruikt voor het creëren van gewenste optogenetische cellijnen van zoogdieren. (B) Gemanipuleerde genetische systemen kunnen worden geïntegreerd op een specifieke FRT-locatie die locus in het menselijk genoom bevat. Deze genomische loci kunnen vervolgens specifieke antibioticaresistentie of fluorescerende reportergenen tot expressie brengen voor de selectie van goed geïntegreerde genetische cassettes. Gencircuitintegratie kan worden geïnitieerd met behulp van recombinases die specifieke plaatsen in de oorspronkelijke genetische cassette herkennen. Dit introduceert een nieuw medicijnresistentieselectiegen dat kan zorgen voor het genereren van correct gemanipuleerde cellen met het gewenste gencircuit. Onderaan paneel B staat de gencircuitarchitectuur voor het optogenetische negatieve feedbacksysteem, LITer2.0. Dit circuit bestaat uit een zelfrepresserend TetR-eiwit gefuseerd met een Light-oxygen-voltage-sensing domain (LOV2), een linkersequentie P2A die een multicistronisch transcript mogelijk maakt, en GFP. Wanneer blauw licht wordt toegepast, opent de TIP-sequentie zich vanuit het LOV2-domein, waardoor het TetR-eiwit wordt geremd en een verhoogde, dosisresponsieve transcriptie van zowel TetR als de GFP-reporter mogelijk is. Het geremde TetR-eiwit is niet in staat om te binden en te onderdrukken op de DNA-operatorplaats, waardoor de transcriptie toeneemt. Deze negatieve feedback houdt de genexpressieruis laag en maakt een hoogvoudige verandering van genexpressie mogelijk. FRT - flip recognition target, HygR - hygromycin resistance, LacZ - β-galactosidase, ZeoR - zeocin resistance, T - TetR, tetracycline repressor protein, D2ir is een CMV-gebaseerde promotor met TwtO sites, LOV2 is Light-oxygen-voltage-sensing domain, TIP is tet-inhibiting peptide which inhibits the TetR protein. Dit cijfer is aangepast van Guinn en Balázsi (2020)⁵⁵. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: LPA experimenteel programmeren. (A) Experimenten kunnen worden geprogrammeerd met behulp van de tools die worden vermeld op de tabor lab ^website47 met flexibiliteit voor steady-state, dynamische of geavanceerde LPA-programmering31. Bovendien kunnen elektronische bestanden worden opgeslagen voor toekomstig gebruik voor technische replicaties of experimentele inductie van alternatieve cellijnen. (B) LPA-apparaat met de belangrijkste componenten gezien vanaf de boven- en zijkant (C). (D) Afbeeldingen van met folie verzegelde platen die zich op LPA bevinden. LPA - Light Plate Apparatus, LED - light-emitting diode. Elementen van deze figuur zijn aangepast van Guinn (2019)¹¹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Kalibratie van het lichtplaatapparaat. (A) Representatief beeld van LPA voor LED's ingesteld op 2000 g.s. op basis van IRIS-software. (B) Afbeelding van paneel (A) met achtergrond afgetrokken en drempel gebruikt om de afbeelding te binariseren om de pixelintensiteit van elke LED te berekenen. (C) Histogram van pixelintensiteiten (bepaald door MATLAB-beeldanalyse) van 96 LED's (4 LPA-platen) ingesteld op dezelfde IRIS-softwarewaarde (bijv. 2000 g.s.). De rode lijn vertegenwoordigt de gemiddelde LED-pixelintensiteit en CV in het paneel vertegenwoordigt de variatiecoëfficiënt voor de 96 putten. (D) Heatmap met de LED-intensiteiten van het LPA-beeld in paneel (A) genormaliseerd tot de maximale intensiteits-LED. (E) Kalibratiewaarde heatmap bepaald voor het LPA-beeld in paneel (A) om een productie met gelijke intensiteit te creëren voor elke LED wanneer deze voor de LPA is geprogrammeerd. LPA - Light Plate Apparatus, LED - light-emitting diode, CV - variatiecoëfficiënt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Randomisatie van LPA en lichttoxiciteitseffecten. (A) Representatief beeld van twee programmeerbare LPA LED-configuraties ingesteld van 25 tot 4000 g.s, gebaseerd op de IRIS-software. De eerste configuratie laat eerder systematische fouten zoals randeffecten van warmte en licht over (bijvoorbeeld de onderste rij van de LPA die de ^2e laagste rij beïnvloedt). De tweede afbeelding randomiseert de locatie van intensiteiten, waardoor systematische fout (bias) veroorzaakt door randeffecten wordt geminimaliseerd. (B) Matrix met randomisatielocatie voor lichtintensiteiten in de LPA weergegeven in paneel (A), die kan worden gebruikt om de intensiteitsafhankelijke resultaten van een bepaald experiment te bepalen. (C) Flowcytometriegegevens voor twee verschillende lichtintensiteiten (1250 en 4000 g.s.) gedurende 3 dagen inductie bij continue verlichting. De zwarte poort is gebaseerd op niet-geïnduceerde cellen. (D) Staafdiagram met flowcytometriegegevens zoals paneel (C) maar voor een breed scala aan lichtintensiteiten. LPA - Light Plate Apparatus, FSC - forward scatter, SSC - side scatter, g.s. - lichtintensiteitswaarde gemeten in grijswaarden. ^{LITer-cellen11} hadden een dosisresponsieve afname van de celoverleving die statistisch significant was met behulp van ANOVA 1-tailed test met een p-waarde van 0,0022. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Representatieve microscopiebeelden van gemanipuleerde optogenetische cellijnen. Cellen werden afgebeeld op een omgekeerde microscoop met een camera (14-bit) voor het verkrijgen van fasecontrast en fluorescentiebeeldvorming. Cellen werden gedurende 5 ms blootgesteld voor fasecontrast (paneel A, representatief helderveldbeeld) en 50 ms voor GFP / FITC-acquisitie (paneel B) bij 100% lichtbronintensiteit. Cellen kunnen op verschillende tijdstippen in beeld worden gebracht, afhankelijk van de gewenste steady-state acquisitie of dynamische respons, wat leidt tot een steady state. Cellen vertegenwoordigen hier een titratie van de pulsduur met een vaste intensiteit (1000 g.s.), variërend van geen blootstelling aan licht tot 3 dagen blootstelling aan licht. De eenheid g.s vertegenwoordigt een lichtintensiteitswaarde gemeten in grijswaarden. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Guinn (2019)¹¹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Flowcytometrie van gemanipuleerde optogenetische cellijnen. Cellen werden geanalyseerd op een BD LSRFortessa flowcytometer, met ongeveer 10.000 cellen verzameld binnen een SSC-FSC (side scatter-forward scatter) poort. De cellen werden vervolgens geanalyseerd met de FCS Express-software. Histogram- of scatterplots kunnen worden gegenereerd om de expressie van het gen van belang (bijv. GFP) te kwantificeren. (A) Gemanipuleerde cellen uitgezet op SSC-FSC-assen voor gating binnen de zwarte lijn. (B) Representatieve LITer-cellen geïnduceerd met variërende duur van lichtpulsen bij 1000 g.s. tot 72 uur inductie, wat de dosis-respons van genexpressie illustreert. (C) Representatieve dosis-responsgegevens voor lichtintensiteittitratie waarbij het LITer-gencircuit (TIP-gebaseerd systeem) wordt vergeleken met VVD- of LightOn-systeem40, een positief regulatiesysteem zonder feedback. (D) Histogram dat overeenkomt met het VVD-systeem en dat een bredere verspreiding (en dus hogere genexpressieruis) illustreert in vergelijking met het LITer-systeem. CV is de variatiecoëfficiënt, een metriek voor genexpressieruis. FSC - forward scatter, SSC - side scatter, FITC - fluoresceïne isothiocyanaat, g.s. - lichtintensiteitswaarde gemeten in grijstinten. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Guinn (2019)¹¹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Kwantitatieve real-time PCR van gemanipuleerde optogenetische cellijnen. Representatieve gegevens die aantonen dat meerdere genexpressieniveaus kunnen worden geïnduceerd en gekwantificeerd met behulp van licht als stimulus. De eenheid Rq vertegenwoordigt een relatieve kwantificering van de expressievouwverandering in vergelijking met controle. ^{LITer-cellen11} hadden een dosisresponsieve toename van RNA-expressie die statistisch significant was met behulp van ANOVA 1-tailed test met een p-waarde van respectievelijk 0,0352 en 0,0477 voor GFP- en KRAS-niveaus. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Guinn (2019)¹¹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Immunofluorescentie van gemanipuleerde optogenetische cellijnen. Representatieve gegevens met schattingen van het eiwitniveau op basis van immunofluorescentie. (A) Eiwitniveaus van KRAS(G12V) en (B) eiwitgehalten van gefosforyleerd-ERK, die het LITer-gencircuit induceert volgens respectievelijk toenemende lichthoeveelheden direct en indirect. Gegevens weergegeven in balken zijn gemiddelde waarden, foutbalken zijn standaarddeviatie (n = 3). A.u. - willekeurige eenheden, g.s. - lichtintensiteitswaarde gemeten in grijswaarden. ^{LITer-cellen11} hadden een dosisresponsieve toename van eiwitniveaus die statistisch significant was met behulp van ANOVA 1-tailed test met een p-waarde van respectievelijk 2,79E-04 en 0,016 voor KRAS- en gefosforyleerde ERK-niveaus. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Guinn (2019)¹¹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Lezers van dit artikel kunnen inzicht krijgen in de stappen die van vitaal belang zijn voor het karakteriseren van optogenetische gencircuits (evenals andere genexpressiesystemen), waaronder 1) ontwerp, constructie en validatie van gencircuits; 2) celtechnologie voor het introduceren van gencircuits in stabiele cellijnen (bijv. Flp-FRT-recombinatie); 3) inductie van de gemanipuleerde cellen met een op licht gebaseerd platform zoals de LPA; 4) initiële karakterisering van lichtinductietests via fluorescentiemicroscopie; en 5) uiteindelijke genexpressiekarakterisering met een verscheidenheid aan assays, waaronder flowcytometrie, kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) of immunofluorescentietests.

Bovendien zijn de hierboven beschreven methoden zeer modulair voor in wezen elke gencircuitarchitectuur die genen van belang tot expressie brengt, met de belangrijkste potentiële protocolwijzigingen bij de circuitconstructiestap en de uitgevoerde testen. In het geval van gencircuitconstructie maakt de flexibiliteit van moleculair klonen het mogelijk om elk interessant gen uit te wisselen of samen tot expressie te brengen met een fluorescentiemarker met kleine wijzigingen in het ontwerp van de primer of assemblageprotocollen. Bovendien, terwijl de hier beschreven procedures zich voornamelijk richten op een NF-gencircuitontwerp voor nauwkeurige (ruisarme) genexpressiecontrole, kunnen andere architecturen zoals positieve regulatie of positieve feedback (PF) worden geïmplementeerd om verschillende kenmerken te bereiken, zoals hoogplooiverandering of hoge genexpressieruis, ^{respectievelijk56,57} . Met behulp van een verscheidenheid aan gencircuitarchitecturen (bijv. PF, NF, enz.) kunnen onderzoekers verschillende biologische vragen onderzoeken, zoals de rol die eiwitniveaugrootheden en ruis spelen bij medicijnresistentie of ^metastase58. De hier genoemde protocollen richten zich ook op verschillende manieren van genexpressiekwantificering, maar een willekeurig aantal functionele assays (bijv. Celmotiliteit, wondgenezing, proliferatie, enz.) kan worden toegevoegd na microscopie-acquisitie met weinig tot geen effect op de voorgaande methoden. Dit is vooral relevant voor eencellige studies waar optogenetica spatiotemporale inductie kan gebruiken om gedrag zoals pulsatiele expressiedynamica te ^bestuderen59.

Als aanvulling op de modulariteit van de methode is probleemoplossing een ander belangrijk kenmerk van elk hoofdprotocol. Voor circuitconstructie liggen de belangrijkste verschillen in het juiste circuitspecifieke primerontwerp, terwijl latere methoden zoals assemblage en plasmideversterking via bacteriegroei meer gestandaardiseerd zijn en meestal hun eigen uitgebreide probleemoplossingsprocedures omvatten. Celtechnologie kan worden gewijzigd met titratiecurven van geneesmiddelen, afhankelijk van de gebruikte cellijn. Bovendien, als een commerciële cellijn wordt gebruikt, kunnen handleidingen voor probleemoplossing rechtstreeks bij de fabrikant van de cellijn worden verkregen. Ook zijn onbedoelde lichteffecten belangrijk om te kwantificeren op de gemanipuleerde cellijnen. Vanwege de fototoxische effecten van 470 nm licht moet bijvoorbeeld een lichtintensiteitscurve worden gemaakt om de inductie van dood of schade in een populatie te onderzoeken. Zodra een verscheidenheid aan lichtwaarden is getest, kunnen gebruikers een FSC-SSC-poort maken of een methode zoals propidiumjodidekleuring gebruiken om dode / beschadigde cellen te kwantificeren en daarom dienen als een hulpmiddel om geschikte lichtbereiken te bepalen om experimenteel te gebruiken.

Voor LPA-probleemoplossing kunnen LED's randeffecten van licht en warmteoverspraak met aangrenzende putten produceren. Putten met een hoge intensiteit kunnen bijvoorbeeld enige inductie in aangrenzende putten veroorzaken als er een onjuiste afdichting of een grote warmte / lichtgradiënt tussen putten is. Deze effecten kunnen maximaal zijn als de LPA is geprogrammeerd in een bepaalde volgorde (bijvoorbeeld oplopend/dalend) van een lichtparameter. Om dit tegen te gaan, stelt de IRIS-software gebruikers in staat om een randomisatiematrix te gebruiken om de putintensiteiten te randomiseren en zo systematische fouten te verminderen. Voor het oplossen van problemen met aspecten van fluorescentiemicroscopie zijn belichtingstijd, versterkingsinstellingen (het regelen van cameragevoeligheid) en lichtbronintensiteit de belangrijkste parameters die kunnen worden aangepast. Het afstemmen van deze parameters kan zorgen voor een optimale beeldproductie en ideale signaal-ruisverhoudingen, evenals het voorkomen van oververzadiging en fototoxiciteit.

Voor het oplossen van problemen met flowcytometrie zijn fotomultiplicatorbuisspanningen en cellulaire gating de belangrijkste aspecten die kunnen worden aangepast. Het afstemmen van deze parameters kan ideale vergelijkingen tussen experimentele omstandigheden en controlemonsters, goede signaalacquisitie voor zowel zwakke als sterke fluorescentiesignalen en uitsluiting van cellulair puin of ongewenste celpopulaties mogelijk maken. Opgemerkt moet worden dat flowcytometriespanningen idealiter constant worden gehouden in experimenten om goede vergelijkingen mogelijk te maken. Bovendien moeten gebruikers voor optogenetische systemen die meerdere fluorescentie-uitgangen vereisen (bijv. FITC en PE), zich bewust zijn van fluorescentiecompensatie gegeven kruisverwijzing tussen fluoroforen. In dergelijke scenario's zijn controles cruciaal voor het bepalen van de juiste fluorescentiesignalen. Controles die nodig zijn voor gebruikers om uit te voeren, omvatten fluorescerende kralen, gekleurde cellen met de marker van belang, of cellen die constitutief het fluorescentie-eiwit tot expressie brengen dat kan worden gebruikt voor het maken van een compensatiematrix in de betreffende flowcytometriesoftware. Bovendien moeten alle gebruikers, ongeacht of ze één fluorescentiemarker of meer gebruiken, routinematig fluorescentiesignalen van elke marker meten voor niet-fluorescerende cellen, die autofluorescentie/ achtergrondsignalen opleveren. qRT-PCR-probleemoplossing omvat variërende cDNA-hoeveelheden en probe-ontwerp, die vaak projectspecifiek zijn. Ten slotte zijn antilichaamconcentraties voor het oplossen van problemen met immunofluorescentie de grootste variabele voor kwantificering van assays, waardoor optimale concentratiebepaling noodzakelijk is.

Een aspect van probleemoplossing dat relevant is voor de meeste van de bovenstaande methoden is het isolatie-effect van het gebruik van een verzegelde plaat met cellen bedekt met folie. Deze methode kan de uitwisseling van koolstofdioxidegas belemmeren die nodig is voor de juiste groei van verschillende cellijnen. Uit eerdere experimentele ervaring was dit geen significante belemmering voor cellulaire groei voor een experiment van 3-5 dagen met behulp van de gemanipuleerde cellijnen in dit manuscript, maar kan het belangrijk worden voor andere cellijnen of experimentele duur. Om dit probleem aan te pakken, omvat een aanpassing die is geïmplementeerd met de verzegelde platen het gebruik van koolstofdioxide-onafhankelijke media, die de groei van cellen die in deze studie worden gebruikt, niet hebben beïnvloed. Het moet worden opgemerkt voor andere assays of cellijnen waar metabolisme, pH-niveaus en celdichtheden belangrijk zijn, andere interventies kunnen nodig zijn, zoals het vaker veranderen van media of voedingsstoffen.

De grenzen van de hier beschreven methoden liggen in het gebruikte gencircuit, de precisie van de optogenetische technologie en de LPA-interface met andere apparatuur zoals fluorescentiemicroscopen. De hier beschreven technologie is betaalbaar, snel te bouwen en gemakkelijk te ^valideren46 voor populaties van optogenetisch gemanipuleerde cellen. Er zijn echter bepaalde ruimtelijke beperkingen, zoals het onvermogen om afzonderlijke cellen te besturen zonder wijzigingen in de lichtinductie-opstelling, zoals het gebruik van digitale spiegelapparaten (DMD's), met onlangs aangetoonde voordelen in levende ^cellen60,61. Bovendien zijn de hier beschreven methoden beperkt in het volgen van levende cellen tijdens optogenetische stimulatie, waardoor alleen de eindpuntgegevensverzameling van het volledige experimentele tijdsverloop mogelijk is.

Ondanks deze limieten zijn de hier beschreven optogenetische methoden complementair aan de bestaande technologie zoals de DMD's, die de flexibiliteit hebben om afzonderlijke cellen in realtime te besturen, maar worden beperkt door het aantal monsters dat men kan stimuleren. Bovendien contrasteren de hier besproken stabiele cellijntechnologiemethoden met bestaande synthetische biologiemethoden die vaak gemanipuleerde genetische systemen karakteriseren via voorbijgaande transfecties. Transiënte transfectiebenaderingen zijn inherent luidruchtiger vanwege de grotere variatie in het aantal kopieën van het gencircuit tussen cellen. De hier gepresenteerde methoden omvatten daarentegen monoklonale celvarianten, die elk één gencircuitkopie bevatten. Stabiele cellijnen maken het mogelijk om cellulaire aspecten zoals genexpressievariatie, eiwitniveau-effecten op fenotypische landschappen en eencellige methoden met fijnere precisie te verkennen, omdat er meer vertrouwen is dat elke cel identiek is aan zijn buren.

Het werk hier demonstreert een platform voor het ontwerpen van elk genomisch geïntegreerd optogenetisch gencircuit van belang, het induceren van dergelijke systemen met betrouwbare experimentele hulpmiddelen en het karakteriseren ervan met een verscheidenheid aan genexpressie en functionele / fenotypische assays op een gestandaardiseerde manier. Toekomstige verbeteringen van deze protocollen kunnen de integratie van deze methoden met live-cell tracking omvatten met behulp van andere optogenetische technologieën zoals de DMD's, die spatiotemporale controle van genexpressie en functionele toepassingen op het niveau van één cel mogelijk maken. Dergelijke vooruitgang zal lichtgebruik mogelijk maken om het genexpressiepatroon van belang in afzonderlijke cellen te produceren, transcriptie / translatiedynamiek vast te stellen, eiwitniveaus te kwantificeren en hun rol in diverse biologische processen te bestuderen, waaronder celmigratie, proliferatie, metastase en differentiatie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes	Eppendorf	951010006	reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X	Thermo Fisher Scientific	MT25053CI	reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000020	tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000055	tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap	Corning	352235	reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V	Eppendorf	22628113	equipment for mammalian culture work
Agarose	Denville Scientific	GR140-500	reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates	VWR®	60941-126	tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9518-5G	reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365PR	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140010	reagent for growing bacteria
BD LSRAria	BD	656700	tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa	BD	649225	tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine	Government Scientific Source	SIGA4919-1G	reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC	Corning	353043	plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge	VWR	22628113	instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood	N/A	N/A	instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid	BD	353047	plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask	USA Scientific	CC7682-4825	container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fischer Scientific	BP231-100	reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide	Thermo Fisher Scientific	15-585-011	reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid	Corning	353072	container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express	De Novo Software:	N/A	software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL	Corning	35-010-CV	reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose	Thermo Fisher Scientific	11-965-092	reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL	Life Technologies	10687-010	reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix	Bio-Rad Laboratories	1708890	reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C	VWR	76210-392	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U74VC	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C	VWR	76359-220	equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg	Sigma-Aldrich	L3022-250G	reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000	Life Technologies	L3000008	reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019	MathWorks	N/A	software for analyzing experimental data
Methanol	Acros Organics	413775000	reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL	VWR	20170-333	plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
MultiTherm Shaker	Benchmark Scientific	H5000-HC	equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-NDL-US-CAN	equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix	NEB	M0492S	reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)	New England Biolabs (NEB)	C3019H	bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs (NEB)	E2621L	reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera	Nikon Instruments Inc.	N/A	instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements	Nikon Instruments Inc.	N/A	software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides	IDT	N/A	reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control	Panasonic	MCO-170AICUVHL-PA	instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade	Electron Microscopy Sciences	15710-S	reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)	Invitrogen	14190144	reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x	Fisher Scientific	15140-122	reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody	Cell Signaling Technology	4370S	primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody	Sigma-Aldrich	WH0003845M1	primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System	Eppendorf	A28137	equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App	Thermo Fisher Scientific	N/A	software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody	Cell Signaling Technology	8889S	secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody	Invitrogen	A11005	secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL	Olympus Plastics	12-102	reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System	Major Science	UVCI-1200	tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene	SnapGene	N/A	software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator	Tokai Hit	INU-TIZ	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444557	reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn	Life Technologies	4326317E	qPCR Probe
Thermocycler	Bio-Rad	1851148	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated	PerkinElmer	1450-605	plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm	VWR	14673-010	reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System	VWR	89032-290	equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293	Thermo Fisher Scientific	R75007	Engineered cell line with FRT site