Zuverlässige Entwicklung und Kontrolle stabiler optogenetischer Genschaltkreise in Säugetierzellen

Summary

Die zuverlässige Kontrolle lichtempfindlicher Säugetierzellen erfordert die Standardisierung optogenetischer Methoden. Um dieses Ziel zu erreichen, skizziert diese Studie eine Pipeline von Genschaltkreiskonstruktion, Zelltechnik, optogenetischem Gerätebetrieb und Verifikationsassays, um die Untersuchung der lichtinduzierten Genexpression unter Verwendung eines optogenetischen Genschaltkreises mit negativer Rückkopplung als Fallstudie zu standardisieren.

Abstract

Eine zuverlässige Genexpressionskontrolle in Säugetierzellen erfordert Werkzeuge mit hoher Faltenänderung, geringem Rauschen und bestimmten Input-to-Output-Transferfunktionen, unabhängig von der verwendeten Methode. Um dieses Ziel zu erreichen, haben optogenetische Genexpressionssysteme in den letzten zehn Jahren viel Aufmerksamkeit für die raumzeitliche Kontrolle des Proteinspiegels in Säugetierzellen gewonnen. Die meisten bestehenden Schaltkreise, die die lichtinduzierte Genexpression steuern, variieren jedoch in der Architektur, werden von Plasmiden exprimiert und verwenden variable optogenetische Ausrüstung, was die Notwendigkeit schafft, die Charakterisierung und Standardisierung optogenetischer Komponenten in stabilen Zelllinien zu erforschen. Hier bietet die Studie eine experimentelle Pipeline zuverlässiger Genschaltungskonstruktion, -integration und -charakterisierung zur Kontrolle der lichtinduzierbaren Genexpression in Säugetierzellen, wobei ein optogenetischer Schaltkreis mit negativer Rückkopplung als Fallbeispiel verwendet wird. Die Protokolle veranschaulichen auch, wie die Standardisierung optogenetischer Geräte und Lichtregime Genschaltungsmerkmale wie Genexpressionsrauschen und Proteinexpressionsgröße zuverlässig aufdecken kann. Schließlich kann dieses Papier für Laboratorien von Nutzen sein, die mit Optogenetik nicht vertraut sind und eine solche Technologie anwenden möchten. Die hier beschriebene Pipeline sollte für andere optogenetische Schaltkreise in Säugetierzellen gelten, was eine zuverlässigere, detailliertere Charakterisierung und Kontrolle der Genexpression auf transkriptioneller, proteomischer und letztendlich phänotypischer Ebene in Säugetierzellen ermöglicht.

Introduction

Ähnlich wie andere Ingenieurdisziplinen zielt die synthetische Biologie darauf ab, Protokolle zu standardisieren, so dass Werkzeuge mit hochgradig reproduzierbaren Funktionen zur Untersuchung von Fragen verwendet werden können, die für biologische Systeme relevant ^sind1,2. Ein Bereich in der synthetischen Biologie, in dem viele Kontrollsysteme aufgebaut wurden, ist der Bereich der ^{Genexpressionsregulation3,4}. Die Genexpressionskontrolle kann sowohl auf Proteinspiegel als auch auf Variabilität (Rauschen oder Variationskoeffizient, CV = σ/μ, gemessen als Standardabweichung vom Mittelwert) abzielen, die aufgrund ihrer Rolle in physiologischen und pathologischen Zellzuständen entscheidende zelluläre Merkmale ^sind5,6,7,8. Viele synthetische Systeme, die den Proteingehalt und das Rauschen4,9,10,11,12 kontrollieren können^, wurden entwickelt^, um Möglichkeiten zur Standardisierung von Protokollen über Werkzeuge hinweg zu schaffen.

Eine neuartige Reihe von Werkzeugen, die Gennetzwerke kontrollieren können, die kürzlich entstanden sind, ist die Optogenetik, die die Verwendung von Licht zur Kontrolle der Genexpression ermöglicht13,14,15,16,17. Ähnlich wie ihre chemischen Vorgänger können optogenetische Genschaltkreise in jeden Zelltyp eingeführt werden, von Bakterien bis hin zu Säugetieren, was die Expression jedes nachgeschalteten Gens von Interesse ^{ermöglicht18,19.} Aufgrund der schnellen Generierung neuartiger optogenetischer Werkzeuge sind jedoch viele Systeme entstanden, die sich in der genetischen Schaltungsarchitektur, dem Expressionsmechanismus (z. B. plasmidbasierte vs. virale Integration) und der lichtversorgenden Kontrollausrüstung unterscheiden11,16,20,21,22,23,24,25 . Daher bleibt Raum für die Standardisierung optogenetischer Merkmale wie Genschaltungsaufbau und -optimierung, Methode der Systemnutzung (z. B. Integration vs. transiente Expression), experimentelle Werkzeuge für die Induktion und Analyse der Ergebnisse.

Um Fortschritte bei der Standardisierung optogenetischer Protokolle in Säugetierzellen zu erzielen, beschreibt dieses Protokoll eine experimentelle Pipeline zur Entwicklung optogenetischer Systeme in Säugetierzellen am Beispiel eines in HEK293-Zellen integrierten Genschaltkreises mit negativem Feedback (NF), der in HEK293-Zellen (humane embryonale Nierenzelllinie) integriert ist. NF ist ein ideales System, um Standardisierung zu demonstrieren, da es in der Natur reichlich vorhanden ^ist26,27,28, so dass der Proteingehalt abgestimmt und eine Geräuschminimierung erfolgen kann. Kurz gesagt, NF ermöglicht eine präzise Genexprimationskontrolle durch einen Repressor, der seine eigene Expression ausreichend schnell reduziert, wodurch jede Veränderung weg von einem stationären Zustand begrenzt wird. Der stationäre Zustand kann durch einen Induktor verändert werden, der den Repressor inaktiviert oder eliminiert, um eine höhere Proteinproduktion zu ermöglichen, bis für jede Induktorkonzentration ein neuer stationärer Zustand erreicht wird. Vor kurzem wurde ein technisch entwickeltes optogenetisches NF-System entwickelt, das eine breitdynamische Reaktion der Genexpression erzeugen, ein geringes Rauschen aufrechterhalten und auf Lichtreize reagieren kann, was das Potenzial für eine räumliche Genexpressionskontrolle ^{ermöglicht11.} Diese Werkzeuge, die als lichtinduzierbare Tuner (LITer) bekannt sind, wurden von früheren Systemen inspiriert, die die Genexpressionskontrolle in lebenden Zellen ermöglichten4,10,29,30 und stabil in menschliche Zelllinien integriert wurden^, um eine langfristige Genexpressionskontrolle zu gewährleisten.

Hier wird am Beispiel des LITers ein Protokoll zur Schaffung lichtreaktionsfähiger Genschaltkreise, zur Induktion der Genexpression mit einem Light Plate Apparatus (LPA, einer optogenetischen Induktionshardware⁾³¹ und zur Analyse der Reaktionen der manipulierten, optogenetisch kontrollierbaren Zelllinien auf kundenspezifische Lichtreize skizziert. Dieses Protokoll ermöglicht es Benutzern, die LITer-Tools für jedes funktionelle Gen zu verwenden, das sie erforschen möchten. Es kann auch für andere optogenetische Systeme mit unterschiedlichen Schaltungsarchitekturen (z. B. positives Feedback, negative Regulation usw.) angepasst werden, indem die unten beschriebenen Methoden und optogenetischen Geräte integriert werden. Ähnlich wie bei anderen Protokollen der synthetischen Biologie können die hier beschriebenen Videoaufzeichnungen und optogenetischen Protokolle in Einzelzellstudien in verschiedenen Bereichen angewendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Krebsbiologie, Embryonalentwicklung und Gewebedifferenzierung.

Protocol

1. Design von Genschaltkreisen

1. Wählen Sie genetische Komponenten aus, die zu einem einzigen Genschaltkreis/Plasmid kombiniert werden sollen (z. B. Sequenzmotive der DNA-Integration von Säugetieren32, lichtempfindliche ^Elemente33 oder funktionelle ^Gene34).
2. Speichern Sie die DNA-Sequenzen zur späteren Verwendung und Referenz mit gentechnischer und/oder molekularer Klonierungssoftware, kommentieren Sie jede Sequenz und untersuchen Sie alle erforderlichen Merkmale (z. B. START-Codons, regulatorische oder übersetzte Sequenzen⁾³⁵.
3. Entwickeln oder übernehmen Sie Teile entsprechend dem gesamten ^{Genschaltungsdesign36.} Beispiel: Bei optogenetischen Repressoren wie bei den ^LITern11 wird eine Gensequenz verschmolzen, die für eine Domäne kodiert, die zum lichtinduzierbaren Abbau37,38 oder zur Inaktivierung der DNA-Bindungsfähigkeit eines Repressors39 neben und im Rahmen des Repressor-Gens (z. B. TetR) fähig ^ist4.
   1. Stellen Sie bei optogenetischen Aktivatoren sicher, dass eine Aktivatordomäne40 vorhanden ist^, die die Genexpression bei lichtinduzierter DNA-Bindung ^fördert41. Stellen Sie bei negativer oder positiver Autoregulation sicher, dass eine regulatorisch bindende Stelle im oder vor dem Promotor des Regulatorgens vorhanden ist (z. B. tetO-Stellen im oder oberhalb des TetR-exprimierenden Promotors⁾⁴².
4. Entwerfen Sie die Primer für die DNA-Sequenzamplifikation oder Sequenzierung des Plasmids mit der molekularen Klonierungssoftware für jeden Genschaltkreis.
5. Validieren Sie die Primer rechnerisch für die Plasmidkonstruktion durch die integrierten Festmahle der molekularen Klonierungssoftware (z. B. Sequenzausrichtung).
6. Oligonukleotid-Primer beim Hersteller bestellen. Plasmide, die in dieser Arbeit konstruiert und verwendet werden, finden sich im ursprünglichen ^{Trägermaterial11} zusammen mit den entworfenen und verwendeten Primern.
7. Verdünnen Sie die Primer auf 100 mM Stammkonzentration in doppelt destilliertem Wasser (_ddH2O).
8. Verdünnen Sie den Bestand von 100 mM Stammprimern auf eine Konzentration von 10 mM für die PCR.
9. Bereiten Sie die PCR-Mischung mit 1 μL Vorwärtsprimer, 1 μL Reverse-Primer, 1 μL Template-DNA auf eine Gesamtmasse von 0,5-500 ng für genomische oder 0,5 pg-5 ng für Plasmid- oder virale DNA, 12,5 μL DNA-Polymerase 2x Master-Mix (oder das Volumen, das den Verdünnungsfaktor des Herstellers erfüllt) und 9,5 μL _ddH2O für ein Gesamtreaktionsvolumen von 25 μL vor.
10. Inkubieren Sie die PCR-Mischung in einem Thermocycler in geeigneten Einstellungen, abhängig vom gewählten ^Enzym43. Zu den vorgeschlagenen Reaktionszyklen gehören:
    Schritt 1: Ein Zyklus von 30 s anfänglichem Denaturierungsschritt bei 95 °C.
    Schritt 2: 40 Zyklen à 5 s Denaturierungsschritt bei 98 °C.
    Schritt 3: Ein Zyklus von 30 s Glühschritt bei 65 °C (bestimmt durch zuvor entworfene Primer).
    Schritt 4: Ein Zyklus von 1 min Verlängerung bei 72 °C (~1 Kilobase (kb) Vorlagenfragmentlänge).
    Schritt 5: Ein Zyklus einer 2-minütigen Verlängerung bei 72 °C.
    Halten Sie die Reaktion bei 4 °C, bis sie mittels Gelelektrophorese getestet werden kann. Dieses Protokoll variiert je nach den verwendeten Reagenzien (z. B. Polymerase und Puffer).
11. Wiederholen Sie Schritt 1.9, um alle Fragmente zu amplifizieren, die in einer DNA-Montagereaktion verwendet werden sollen, die für die Verknüpfung linearer PCR-Produkte zu einem einzigen zirkulären DNA-Vektor erforderlich ist.
12. Führen Sie die PCR-Produkte auf einem 1% igen Agarosegel aus, gefolgt von der Reinigung der Banden der gewünschten Länge.
13. Bereiten Sie das Master-Mix für eine DNA-Assemblierungsreaktion vor (Tabelle 1).
    HINWEIS: In diesem Beispiel wird der Muttervektor in zwei Fragmente aufgeteilt, um die Effizienz der PCR-Schritte zu erhöhen, ohne signifikante Änderungen am Gesamtergebnis der Montage zu verursachen.
14. Inkubieren Sie die DNA-Montagereaktions-Mastermischung in einem Thermocycler bei 50 °C für 1 h (sofern im DNA-Assemblierungsreagenz-Protokoll nicht anders angegeben) und lagern Sie die Reaktion bei 4 °C, um das Reaktionsprodukt für die bakterielle Transformation zu verwenden.
15. Richten Sie die bakterielle Transformation (chemische oder Elektroporation) unter Verwendung kompetenter E. coli-Zellen (Escherichia coli) und des entsprechenden bakteriellen Transformationsprotokolls ein. Verwenden Sie nach der Transformation die bakteriellen Luria-Bertani (LB) -Agarplatten, die den gewählten bakteriellen Selektionsmarker (z. B. Ampicillin) enthalten, um die Transformationsmischung zu platten. Die Platten über Nacht bei 37 °C ^inkubieren44.
16. Überprüfen Sie die Platten am nächsten Tag. Um die Kolonien zu impfen, pflücken Sie einzelne Kolonien aus den Platten und suspendieren Sie sie in einer flüssigen LB-Brühe mit dem entsprechenden bakteriellen Selektionsmarker in Kulturröhrchen. Inkubieren Sie in einem Shaker-Inkubator bei 37 ° C, 300 U / min über Nacht.
17. Führen Sie ein Plasmidpräparationsprotokoll durch, um die Plasmid-DNA aus der Bakterienkultur zu extrahieren.
18. Überprüfen Sie die Schaltung in zwei Schritten. Führen Sie zunächst einen Testaufschluss mit Restriktionsenzymen als grobe Überprüfung durch, um zu sehen, ob das ungefähre Plasmidprodukt erhalten wurde. Zweitens, wenn der Testaufschluss bestanden / bestätigt wird, senden Sie das Plasmid an eine Sanger-Sequenzierungsanlage (oder einen Prozess mit der verfügbaren Ausrüstung), um die genaue DNA-Sequenz zu erhalten, um sie später mit der erwarteten Sequenz in der Designsoftware zu vergleichen.
    1. Um den Testaufschluss durchzuführen, wählen Sie mindestens zwei Restriktionsenzyme aus, die mindestens zwei Fragmente produzieren, basierend auf der verwendeten molekularen Klonierungssoftware. Sobald die Enzyme ausgewählt sind, bereiten Sie die Testproben vor, indem Sie 1 μL jedes Enzyms, 5 μL der erzeugten DNA und 13 μL Wasser mit geeigneten Salzen und Puffern hinzufügen, abhängig von den verwendeten Enzymen. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 °C für 1 h, oder wie der Enzymhersteller vorschlägt. Führen Sie die Testaufschlussprodukte auf einem 1% igen Agarosegel durch und stellen Sie fest, ob die Banden korrekt sind.
       HINWEIS: Wenn die Bänder korrekt sind, fahren Sie mit der Sequenzierung fort.
    2. Um die Sequenzierung durchzuführen, erzeugen Sie Primer basierend auf der in der Software gespeicherten DNA, so dass die Glühbereiche der Primer etwa 500 bp (Basenpaare) voneinander entfernt sind und das interessierende Fragment (Genschaltkreiskomponente) oder das vollständige Plasmid abdecken. Verdünnen Sie die Primer mit reinem nukleasefreiem Wasser (_NF-H2O) auf 10 mM Konzentration. Bereiten Sie die Sequenzierungsproben vor, indem Sie 1 μL 10 ng/μL DNA, 1 μL Primer und 8 μL _NF-H2O zu einer 0,2 ml Röhre hinzufügen. Wiederholen Sie dies für jede Grundierung.
       HINWEIS: Wenn die Proben vorbereitet sind, geben Sie sie in der Sequenzierungsanlage ab und vergleichen Sie die Ergebnisse mit der Plasmidsequenz unter Verwendung einer molekularen Klonierungssoftware.
19. Erzeugen Sie in diesem Schritt etwa 100-1000 ng / μL DNA-Probe zur Integration der plasmidhaltigen Genschaltkreise in die entsprechende Zelllinie.

2. Stabiles Zelllinien-Engineering

1. Bestellen Sie eine Säugetierzelllinie, die für die schnelle Erzeugung stabiler Unterlinien entwickelt wurde, die eine hohe Expression des interessierenden Proteins aus einem Expressionsvektor für Säugetiere gewährleisten. Der Zelltyp und die Leichtigkeit des Zelllinien-Engineerings können variabel sein, je nachdem, was die Benutzer bevorzugen oder erreichen wollen.
   1. Wenn Benutzer beispielsweise Zelllinien-Engineering mit minimalen Zwischenschritten bevorzugen, ordnen Sie die Zellen, die eine einzige stabile Integrationsstelle (z. B. FRT) enthalten, an einem transkriptionell aktiven genomischen Locus. Wenn ein nuancierteres Zell-Engineering bevorzugt wird, erstellen Sie Integrationszentren an bevorzugten Standorten mit gentechnischen Tools wie CRISPR/Cas9.
2. Züchten Sie Zellen in 5_{% CO2} in befeuchteter Luft bei 37 °C. Passen Sie die Wachstumsbedingungen nach Bedarf für den Zelltyp an.
3. Transfizieren Sie die oben entworfenen Genschaltkreise in den gewünschten Zellen, die aus den vorherigen Schritten erhalten wurden, um einen stabilen Zelllinien-Generationsprozess zu beginnen. Um dies zu erreichen, verwenden Sie eine ^{Liposomenmischung45} des Genkreislaufs DNA mit geeigneter Rekombinase (z. B. Flp-Rekombinase für Flp-FRT-Rekombination) oder durch andere Methoden wie Elektroporation.
4. Zwei Tage nach der Transfektion teilen Sie die Zellen auf 25% Konfluenz.
5. Beginnen Sie sechs Stunden nach der Spaltung der Zellen mit der Antibiotikaauswahl, indem Sie das Medium gegen ein frisches Medium austauschen, das 50 μg/ml Hygromycin-Antibiotikum enthält (oder ein anderes antibiotisches Mittel, das dem während der Plasmidkonstruktion gewählten Antibiotikaresistenzgen für Säugetiere entspricht).
   HINWEIS: Es gibt eine Vielzahl von Antibiotikaresistenzgenen für Säugetiere, die bei der Konstruktion von Genschaltkreisen verwendet werden, von denen jedes eine andere Abtötungskurve aufweist. Unabhängig davon, welches Antibiotikaresistenzgen für Säugetiere für die Schaltungskonstruktion ausgewählt wird, sollte daher eine geeignete Abtötungskurve in den interessierenden Zellen untersucht werden. Dieser Schritt stellt sicher, dass Zellen, die die Nutzlast des Genkreislaufs enthalten, angereichert werden, während Zellen ohne System abgetötet werden.
6. Lassen Sie die Zellen in den antibiotischen Selektionsmedien wachsen, wechseln Sie alle 2-3 Tage zu frischen Medien, bis die Platte oder der Kolben einige Dutzend Herde hat. Passage adhärente Kulturen, wenn sie sich in der Log-Phase befinden, bevor sie den Zusammenfluss erreichen.
7. Sobald genügend Herde vorhanden sind, trypsinisieren Sie die Zellen mit 1 ml 0,25% Trypsin, 0,1% EDTA in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) ohne Kalzium, Magnesium und Natriumbicarbonat für mehrere Minuten. Neutralisieren Sie das Trypsin mit frischen Medien und geben Sie alle Zellen in einen frischen Behälter.
8. Sobald die Zellen im frischen Behälter zu 80% -100% konfluent sind, frieren Sie sie in einer Mischung aus 45% alten Medien, 45% frischen Medien und 10% DMSO ein. Übertragen Sie die verbleibenden Zellen in ein steriles Röhrchen und führen Sie eine Einzelzellsortierung durch, um monoklonale Zellen in eine 96-Well-Platte zu isolieren.
9. Etwa 2-3 Wochen nach der monoklonalen Sortierung sollten Vertiefungen innerhalb der 96-Well-Platte Herde aufweisen. Wenn etwa 50% -60% zusammenfließen, teilen Sie die Zellen in eine 12-Well-Platte.
10. Sobald die 12-Well-Platte zu 80% -100% konfluent ist, teilen Sie sie in einen mit Gewebekulturen behandelten T-25-Kolben auf. Sobald die Zellen im T-25-Kolben zu 80% -100% konfluent sind, frieren Sie die Zellen ein und behalten Sie eine Passage zur Charakterisierung und Prüfung monoklonaler Zelllinien bei.
    1. Charakterisieren Sie die monoklonalen Zelllinien durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie-Assays, um Genexpressionsprofile basierend auf der induzierten fluoreszierenden Reporterproduktion zu melden. Verifizieren Sie die funktionelle Proteinproduktion durch fluoreszierende Antikörpermarkierung und Immunfluoreszenz-Assay. Testen Sie die Genexpressionsinduktion auf transkriptionaler Ebene mittels quantitativer real-time PCR (qRT-PCR). Validieren Sie die genetische Sequenz- und Integrationsgenauigkeit durch lokale und gesamte Genomsequenzierung der Klone.

3. Induktionstests für Leichtplattengeräte

1. Konstruieren Sie ein ^{LPA-Gerät31,46} für die Lichtinduktion von technischen Zellen. Kurz gesagt, mehrere allgemeine Schritte sind entscheidend für die Schaffung von LPA, das zur Kontrolle der Genexpression verwendet wird. Dazu gehören der 3D-Druck von LPA-Rahmenkomponenten, die Leiterplattenkonstruktion, die Programmierung der Schaltung über den Mikrocontroller-Programmierer, die Montage der Komponenten zu einem endgültigen LPA, die Programmierung der Speicherkarte über die IRIS-Software und die Kalibrierung des fertigen Geräts. Eine ausführlichere Erläuterung finden Sie in den obigen Referenzen.
   1. Drucken Sie die 3D-Teile wie in Gerhardt et al. (2016 und 2019) ^31,46 beschrieben.
   2. Bestücken Sie die Leiterplatte wie in Gerhardt et al. (2016 und 2019) ^31,46 beschrieben.
   3. Fügen Sie die Firmware mit dem Mikrocontroller-Programmierer zur montierten LPA-Schaltung hinzu, wie in Gerhardt et al. (2016 und 2019) ^31,46 beschrieben.
   4. Kombinieren Sie 3D-gedruckte Teile und die bestückte Leiterplatte, wie in Gerhardt et al. (2016 und 2019) ^31,46 beschrieben. Dazu gehören die Aufnahme der Montageplatte, der Leiterplatte, des LED-Abstandshalters (Light Emitting Diodes), des Plattenadapters, einer 24-Well-Platte, eines Plattendeckels, von Befestigungsschrauben sowie von Flügelmuttern und Stapelkomponenten, wie im gefilmten Video und in Abbildung 2 gezeigt.
   5. Führen Sie für die Speicherkartenprogrammierung und Kalibrierung des Geräts die unten beschriebenen Schritte aus.
2. Verwenden Sie die auf der Website von Tabor ^{Lab47 verfügbare IRIS-Software,} um eine SD-Karte für den Light Plate Apparatus (LPA)³¹ zu programmieren und geeignete Lichtbedingungen zu untersuchen, die für den Beginn eines optogenetischen Experiments erforderlich sind.
   HINWEIS: Die IRIS-Software ist eine webbasierte Anwendung zur Programmierung der optogenetischen elektronischen Hardware, bekannt als LPA, die vom Tabor Lab entwickelt wurde. Die Software ermöglicht die Programmierung relativer IRIS-Werte, die die einzelnen Leuchtdioden (LEDs) in jeder Vertiefung der LPA-Hardware steuern.
3. Wählen Sie die Dropdown-Option LPA (4 x 6) und klicken Sie anschließend auf den entsprechenden Beleuchtungsansatz (Steady-State, Dynamic, Advanced).
   HINWEIS: Für dieses Manuskript konzentrieren sich alle Assays auf die stationären Beispiele. Die fortgeschrittenen Einstellungsbeispiele können jedoch für Impulsdauern und Tastverhältnisregime verwendet werden.
4. Wählen Sie, ob die oberen oder unteren LEDs beleuchtet werden sollen, indem Sie Werte in die Zellen eingeben, die den Vertiefungen der Platte entsprechen. Für die LPAs, die bei dieser Arbeit verwendet wurden, wurden in allen Experimenten blaue LEDs verwendet, die in der oberen Position platziert waren. Jede einmal programmierte LED kann eine kontinuierliche Lichtexposition mit einer konstanten Lichtintensität bieten. Die IRIS-Software ermöglicht 4096 Intensitätsstufen, die programmiert werden können.
5. Sobald die LED-Positionen ausgewählt sind, geben Sie Intensitätswerte für die gewünschte experimentelle Kontur ein. Geben Sie beispielsweise 8 verschiedene Lichtintensitäten (oder Pulsdauern oder Tastverhältnisse) mit drei technischen Replikaten pro Platte ein (Tabelle 2). G.s. bezieht sich auf Graustufeneinheiten - die Messwerte für die Lichtintensität, die für die LPA-Programmierung in der IRIS-Software verwendet werden.
   1. Beachten Sie beim Entwerfen von IRIS-Versuchsdateien die Randeffekte benachbarter Vertiefungen auf dem LPA-Gerät, die Lichttoxizität durch zunehmende Intensitäten der Blaulichtexposition und die Bestimmung der Art der gewünschten Dosis-Wirkungs-Beziehung (z. B. monoton vs. nicht-monoton).
   2. Wenn Benutzer Zellen im LPA in aufsteigender / absteigender Reihenfolge eines bestimmten Lichtparameters (z. B. Intensität) programmieren, können Bohrlöcher Kanteneffekte von Lichtübersprechen oder sogar Wärme erzeugen, die benachbarte Vertiefungen beeinflussen können. Dies kann versehentlich das Ergebnis der gemessenen Ergebnisse beeinflussen, wenn die Experimente abgeschlossen sind. Um dies zu verringern, können Benutzer eine Randomisierungsmatrix in der IRIS-Software implementieren, um Bohrlochpositionen zu verschlüsseln und Randeffekte zu minimieren. Ein Beispiel wird in den folgenden repräsentativen Ergebnissen beschrieben (Abbildung 4A-B).
   3. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass höhere Intensitäten des blauen Lichts das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit ^{beeinträchtigen48.} Um die Lichttoxizität zu verringern, ist es daher wichtig, je nach untersuchter Modalität eine Lichtintensität, Pulsdauer oder Tastverhältnis-Antwortkurve zu erzeugen.
      1. Programmieren Sie beispielsweise 8 Lichtintensitätswerte mit drei Replikaten pro 24-Well-Platte mit einem Bereich von keinem Licht bis zu einer maximalen Intensität des LPA. Lassen Sie diese Proben dann auf einem Durchflusszytometer mit einem SSC-FSC-Gate oder einem lebenden Fleck wie Propidiumiodid laufen, um das Überleben der Populationszellen (lebende Zellen im Vergleich zu Gesamtereignissen einschließlich toter Zellen / zellulärer Trümmer) bei jedem Lichtwert zu quantifizieren.
      2. Bestimmen Sie dann die ideale Menge des Populationsüberlebens für den Versuchsaufbau, da jeder Reiz die Proliferation, die Genexpression oder das Überleben beeinträchtigen kann (z. B. 80% des Zellüberlebens als geeigneten Kompromiss). Zum Beispiel überschritt die Intensität in dieser Arbeit nach der Kalibrierung nicht 3000 g.s. Einheiten (~ 3/4 die maximale Intensität des LPA-Geräts). Ein Beispiel hierfür finden Sie in den folgenden repräsentativen Ergebnissen.
   4. Zusätzlich zur Einschränkung der Lichtwerte aufgrund der Toxizität können Benutzer die Lichtwerte einschränken, um einen bestimmten Teil der Dosis-Wirkungs-Beziehung zu charakterisieren, z. B. den Bereich der monotonen Reaktion.
      1. Um dies zu erreichen, scannen Sie zunächst einen breiten Bereich von Lichtintensitäten, Pulsdauern oder Tastverhältnissen, abhängig von der Modalität, die bei der Bestimmung der gewünschten Dosis-Wirkungs-Beziehung analysiert wird (Tabelle 2), um das interessierende Lichtregime einzugrenzen, z. B. wenn die Genexpression positiv mit steigenden Lichtwerten für eine monotone Dosis-Wirkungs-Beziehung korreliert.
      2. Um den interessierenden Lichtbereich zu bestimmen, programmieren Sie einen einzelnen LPA mit bis zu 24 Wells unterschiedlicher Intensität / Pulsdauer / Tastverhältnis / etc. oder mehr Wells (z. B. 48, 72, 96 usw.), je nachdem, ob mehrere LPAs kalibriert sind, um äquivalente Lichtmengen zu liefern, und fahren Sie mit den unten beschriebenen Zellkulturarbeiten oder Assays fort. Beginnen Sie daher mit der Charakterisierung eines optogenetischen Systems mit einem breiten Dosisbereich von Lichtreizen, um das Bereichsintervall zu bestimmen, das die gewünschte Genexpression ergibt, und führen Sie anschließend Experimente in diesem verfeinerten Dosisbereich durch.
      3. Zum Beispiel wurden in dieser Arbeit einmal 3000 g.s. Einheiten als Schwellenwert für toxische Lichtintensität bestimmt; Dieser Schwellenwert wurde als obere Lichtgrenze für die unten beschriebenen Assays verwendet (z. B. Immunfluoreszenz).
         HINWEIS: Die obigen Schritte sind unabhängig von der optischen Kalibrierung des LPA und beziehen sich auf eine Kalibrierung auf molekularer Ebene für jedes optogenetische System.
6. Sobald die entsprechenden Lichtintensitätswerte in IRIS programmiert sind, stecken Sie eine Speicherkarte mit der USB 3.0-Steckdose in den LPA, um die Dateien herunterzuladen und zu übertragen.
7. Wenn die Kalibrierung des LPA abgeschlossen ^ist31, fahren Sie mit der Zellkulturarbeit zur Einleitung des Lichtinduktionstests fort. Wenn die Kalibrierung nicht durchgeführt wurde, kalibrieren Sie die LPA mit einer Bildanalysemethode (Schritte 3.7.1-3.7.3), sobald die LPA mit dem Mikrocontroller-Programmiergerät programmiert wurde.
   1. Programmieren Sie die LPA kurz, um den gleichen IRIS-Pegel zu haben, wie von Gerhardt et al. (2016) ³¹ beschrieben.
      HINWEIS: Für die Kalibrierung wurde der LPA so programmiert, dass er einen Wert von 2000 g.s hat.
   2. Sobald das Gerät mit der Speicherkarte programmiert und die Reset-Taste (physische Taste am LPA) gedrückt wird, erfassen Sie ein Bild des gesamten Geräts (z. B. Gelstation-Imager, Scannergerät usw.). Erfassen Sie für die Kalibrierung zwei Bilder, bei denen das Gerät um 180° gedreht ist.
   3. Verwenden Sie dann eine Open-Source-Software, die von Gerhardt et al. (2016) ³¹ entwickelt wurde, um die Variabilität der LED-Intensität auf der LPA-Platte anzuzeigen und die LED-Kompensationswerte zu berechnen, um die Intensität über Wells hinweg gleich zu machen. Ein Beispiel hierfür wird in den unten dargestellten Ergebnissen beschrieben (Abbildung 3). Sobald diese Kalibrierung abgeschlossen ist, fahren Sie mit den Zellkulturarbeiten fort, um einen Lichtinduktionsassay einzuleiten.
8. Erhalten Sie Flaschen mit künstlich hergestellten monoklonalen Zellen aus dem vorherigen Abschnitt, um die Auswirkungen der Lichtinduktion auf die Genexpression zu untersuchen.
9. Entfernen Sie die alten Medien aus dem Kolben.
10. Fügen Sie 1 ml Trypsin zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie für 5 min.
11. Nach 5 min Trypsin neutralisieren, indem 4 ml Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM oder andere gewünschte Medien) mit den notwendigen Chemikalien versetzt werden (diese Arbeit verwendete 50 μg / ml Hygromycin, 1% Penicillin / Streptomycinlösung, 10% fetales Rinderserum, FBS).
12. Fügen Sie ~ 75.000 Zellen pro Vertiefung in einer 24-Well-Black-Platte in einem Gesamtvolumen von 500 μL hinzu. Die Anzahl der gesäten Zellen kann je nach Dauer des gewünschten Experiments und verwendetem Zelltyp variieren.
    HINWEIS: Beachten Sie außerdem, dass die Zellaussaatdichte die Kulturerhaltung und möglicherweise die Dauer des Experiments beeinflusst. Mit einer geringeren Anzahl von Zellen pro Well zu beginnen, sorgt für längere Zeit, bevor die Kultur zum Zusammenfluss kommt. Darüber hinaus beeinflusst die Art der optogenetischen Komponenten, die in die interessierenden Genschaltkreise integriert sind, wann die Genexpression einen stabilen Zustand erreicht und somit die Dauer der Experimente beeinflusst. Andere Faktoren, die in Betracht gezogen werden können, sind zelllinienspezifische Wachstumsraten, Medienzusammensetzung und bedingte Wachstumseffekte (z. B. Licht).
13. Nach der Beschichtung legen Sie die Zellen in einen befeuchteten Inkubator mit 5_{% CO2,} damit sie sich für 2-6 h einsetzen können.
14. Übertragen Sie die Zellen nach der Inkubation auf eine Gewebekulturhaube, entfernen Sie den Kunststoffdeckel und fügen Sie oben auf der Platte einen Klebefolienstreifen hinzu (Abbildung 2D). Dieser Schritt ermöglicht eine minimale Lichtübertragung zwischen den Bohrlöchern, da die Oberseite und die Seiten der Bohrlöcher beschichtet sind und das Licht jetzt nur noch von der Unterseite des Brunnens eindringen kann, wo die LED platziert ist.
15. Platzieren Sie die Platte in den montierten 3D-Teilen des LPA. Decken Sie dann die Platte mit dem 3D-gedruckten LPA-Deckel ab, der an jeder Ecke über die Geräteschrauben passt.
16. Schließen Sie das Gerät an die Stromquelle an und drücken Sie die Reset-Taste am LPA-Gerät, um sicherzustellen, dass die aktualisierten LPA-Experimenteinstellungen angewendet werden.
17. Inkubieren Sie die Zellen innerhalb des experimentellen Systems für eine angemessene Zeitspanne, abhängig von der ursprünglichen Aussaatdichte, der zelllinienspezifischen Wachstumsgeschwindigkeit und den Wachstumsbedingungen. In diesem Beispiel wurden die Zelllinien für 3 Tage kontinuierlich induziert, damit die Genexpression einen stabilen Zustand erreicht. Es sollte jedoch beachtet werden, dass viele optogenetische Systeme (z. B. VVD) die stationäre Genexpression viel früher erreichen können (z. B. 24 h), und daher können experimentelle Induktionszeiten nach Bedarf reduziert oder verlängert werden.
18. Verwenden Sie am Ende des Lichtinduktionsexperiments die Proben für einen der folgenden vier Assays, um die künstlichen Zelllinien zu charakterisieren (Abschnitte 4-7).

4. Fluoreszenzmikroskopie von lichtinduzierten künstlichen Zellen

1. 24-72 h nach der Induktion entfernen Sie die Zellen im LPA aus dem Inkubator und legen sie in eine Gewebekulturhaube.
2. Entfernen Sie den Folienstreifen und lassen Sie die Platte 1-2 min stehen. Dies verhindert, dass sich Kondenswasser auf dem Kunststoffdeckel bildet, wenn es sofort auf die Platte gelegt wird.
3. Nach 1-2 Minuten Sitzen den originalen Kunststoffdeckel wieder auf den Teller legen.
4. Bilden Sie die Zellen mit dem entsprechenden Phasenkontrast- oder Fluoreszenzmikroskop ab.
5. Passen Sie je nach Instrument die Belichtungszeit, die Intensität der Lichtquelle und die Verstärkung für die Anzeige von technischen Zellen an. In diesem Experiment wurden die folgenden Parameter angewendet: 50 ms für die Belichtungszeit der FITC/GFP-Lichtquelle (grün fluoreszierendes Protein) und 1-5 ms für die Phasenkontrast-Belichtungszeit bei jeweils 100% Intensität.
   HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass optimale Belichtungszeiten, Verstärkungspegel und Lichtquellenintensitäten oft empirisch aus den Erfahrungen dieser Arbeit abgeleitet werden, um die Übersättigung im Fluoreszenzreporter zu minimieren, Zellschäden zu minimieren und angemessene Bilder für qualitative und quantitative Analysen aufzunehmen. Bei der Bestimmung der Pegel jedes dieser Parameter sind die Maximierung des Signal-Rausch-Verhältnisses, die Minimierung der Phototoxizität, die Minimierung der Übersättigung von Fluoreszenzsignalen und die Erhöhung der Fähigkeit, schwache Fluoreszenzsignale zu verstärken, zu beachten.
   1. Optimieren Sie diese Parameter grob ad-hoc; Frühere experimentelle Werte (z. B. Lichtquellenintensität, die eine Übersättigung des Fluoreszenzreporters verursacht) können jedoch gegebenenfalls zukünftige experimentelle Einstellungen bestimmen. Beispielsweise können die Verstärkungseinstellungen, Belichtungszeiten und Anfangswerte der Lichtintensität von einem Schaltkreis (LITer1.0) oder experimentellen Aufbau (z. B. Lichtintensität) als Ausgangspunkt verwendet werden, wenn Sie sich zu einem ähnlichen, aber anderen Genkreislauf (LITer2.0)¹¹ oder einer anderen Lichtmodalität (z. B. Lichteinschaltzyklus) bewegen.
6. Optimieren Sie die Plattenbildgebung durch eine Koordinatenvorlage, die in die Mikroskopiesoftware programmiert ist, sodass die gesamte Plattengröße (z. B. 24 Vertiefungen) eine automatisierte Bilderfassung von mehreren Bildpositionen pro Bohrloch ermöglicht.

5. Durchflusszytometrie von lichtinduzierten künstlichen Zellen

1. 24-72 h nach der Induktion die Zellen aus dem LPA im Inkubator oder aus dem Mikroskop nach der Bildgebung entfernen und in die Gewebekulturhaube legen.
2. Wenn Sie direkt aus dem LPA entfernt werden, entfernen Sie den Folienstreifen und lassen Sie die Platte ein oder zwei Minuten ruhen.
3. Saugen Sie die Medien aus jedem Bohrloch (von der gesamten 24-Well-Platte, wenn alle Wells verwendet werden) ab.
4. Fügen Sie 100 μL 0,25% Trypsin zu jeder Vertiefung hinzu, bedecken Sie die Platte mit einem Kunststoffdeckel und legen Sie sie wieder in den Inkubator.
5. Lassen Sie die Zellen 5 Minuten lang ungestört im Inkubator.
6. Entfernen Sie nach 5 Minuten die Platte und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube zurück.
7. Neutralisieren Sie jeden trypsinisierten Brunnen mit 400 μL DMEM.
8. Beschriften Sie ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit Zellsieb (oder einem geeigneten Durchflusszytometrieröhrchen, das gefiltert werden kann, um große Klumpen von Zellen zu entfernen, die nicht vollständig trypsinisiert sind) mit einem Namen, der jeder Vertiefung entspricht.
9. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um den Inhalt jedes Vertiefungs 6-8 Mal nach oben und unten zu pipettieren, um Zellklumpen zu brechen und einzellige Proben für die Durchflusszytometrie49 zu erstellen^.
10. Übertragen Sie den gesamten Inhalt jeder Vertiefung (~ 500 μL) mit dem Sieb auf die markierten Röhrchen.
11. Bringen Sie Zellen mit Lasern der richtigen Wellenlängen zum entsprechenden Durchflusszytometrie-Instrument (können Röhren mit Zellen auf oder außerhalb des Eises bringen).
    HINWEIS: Das bei dieser Arbeit verwendete Durchflusszytometer war Teil einer Kerneinrichtung am Universitätsklinikum.
12. Erstellen Sie ein Vorwärts- und Seitenstreutor (FSC bzw. SSC), um die einzelnen Zellen der entsprechenden Größe und Granularität zu erfassen, um Ablagerungen und Zellklumpen in der Durchflusszytometriesoftware auszuschließen.
13. Sobald das Tor gesetzt ist, erfassen Sie ungefähr 10.000 Zellen mit dem entsprechenden Tor. Passen Sie diese Zahl abhängig von der Menge an Mobilfunkdaten an, die die Benutzer suchen. Wiederholen Sie dies für jede Röhre, die die Zellen aus dem Experiment enthält.
14. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, importieren Sie die Daten zur Analyse in die verfügbare Durchflusszytometrie-Datensoftware.
15. Erstellen Sie ein FSC-SSC-Gate (wie zuvor während der Erfassung) und wenden Sie es auf jeden Batch experimenteller Daten an. Eine Referenzquelle der uninduzierten Zellpopulation wird verwendet, um dieses Gate in diesem Manuskript zu erstellen, aber es existieren andere Metriken für die Gate-Erstellung, wie z.B. dichtebasierte Gates.
16. Wenn die experimentellen Bedingungen mit einem FSC-SSC-Gatter versehen sind, können Sie die Durchflusszytometriedaten als Histogramme darstellen oder auf andere Weise darstellen, um die erhaltenen Expressionsmuster zu veranschaulichen. In diesem Experiment wurde die Fluoreszenz von den GFP / FITC- oder PE / TexasRed-Kanälen erfasst.

6. RNA-Extraktion und quantitative PCR von Genschaltkreiskomponenten

1. 24-72 h nach der Induktion die Zellen aus dem LPA im Inkubator oder aus dem Mikroskop nach der Bildgebung entfernen und in die Gewebekulturhaube legen.
2. Wenn Sie direkt aus dem LPA entfernt werden, entfernen Sie den Folienstreifen und lassen Sie die Platte ein oder zwei Minuten ruhen.
3. Saugen Sie die Medien aus jedem Bohrloch (von der gesamten 24-Well-Platte, wenn alle Wells verwendet werden) ab.
4. Fahren Sie fort, RNA aus den Zellen mit dem entsprechenden RNA-Extraktionskit zu extrahieren.
5. Sobald die RNA-Extraktion abgeschlossen ist, führen Sie eine umgekehrte Transkriptionsreaktion jeder Probe durch (Tabelle 3).
6. Führen Sie außerdem eine quantitative PCR jeder Probe durch (Tabelle 4). Verwenden Sie eine DNA-Polymerase und ein zugehöriges Protokoll, um PCR-Reaktionen einzurichten. Richten Sie für diesen Schritt eine gemultiplexte Reaktion mit einem Housekeeping-Gen und einem Gen von Interesse ein oder erstellen Sie separate Reaktionen. In diesem Beispiel wurden GFP-, KRAS- und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-Spiegel untersucht. Nach Abschluss des qRT-PCR-Experiments fahren Sie mit der Analyse über die verfügbare Software fort, um die Veränderung der Genschaltkreisfaltung auf RNA-Ebene zu veranschaulichen.

7. Immunfluoreszenz von Genkreiskomponenten

1. Verwenden Sie ein Eisbad oder einen Gefrierschrank, um Methanol abzukühlen.
2. 24-72 h nach der Induktion die Zellen aus dem LPA im Inkubator oder aus dem Mikroskop nach der Bildgebung entfernen und in die Gewebekulturhaube legen.
3. Wenn Sie direkt aus dem LPA entfernt werden, entfernen Sie den Folienstreifen und lassen Sie die Platte 1-2 Minuten ruhen.
4. Saugen Sie die Medien aus jedem Bohrloch (von der gesamten 24-Well-Platte, wenn alle Wells verwendet werden) ab.
5. Fügen Sie 100 μL 0,25% Trypsin zu jeder Vertiefung hinzu, bedecken Sie die Platte mit einem Kunststoffdeckel und legen Sie sie wieder in den Inkubator.
6. Lassen Sie die Zellen 5 Minuten lang ungestört im Inkubator.
7. Entfernen Sie nach 5 Minuten die Platte und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube zurück.
8. Neutralisieren Sie jeden trypsinisierten Brunnen mit 400 μL DMEM.
9. Etikettieren Sie Minizentrifugenröhrchen mit Namen, die jeder Vertiefung entsprechen.
10. Verwenden Sie eine P1000-Pipette und pipettieren Sie den Inhalt jedes Brunnens 6-8 Mal nach oben und unten, um die Zellklumpen zu brechen.
11. Übertragen Sie den gesamten Inhalt jeder Vertiefung (~ 500 μL) auf die markierten Röhrchen.
12. Zentrifen Sie die Zellen für 5 min bei 400 x g.
13. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Überstand und bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug.
14. Resuspendieren Sie die Zellen (verwenden Sie eine P1000-Pipette und eine Pipette 6-8 Mal in jeder Röhre auf und ab, um Zellklumpen zu brechen) in 750-1000 μL 4% Paraformaldehyd (verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, PBS).
15. Lassen Sie die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur sitzen.
16. Nach der Inkubation 750-1000 μL PBS hinzufügen. Pipette mehrmals auf und ab.
17. Zentrifen Sie die Zellen für 5 min bei 400 x g.
18. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Überstand und bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug.
19. Resuspendieren Sie die Zellen (verwenden Sie eine P1000-Pipette und pipettieren Sie 6-8 Mal in jeder Röhre auf und ab, um Zellklumpen zu brechen) in 750-1000 μL eiskaltem Methanol.
20. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten auf Eis oder in einem -20 °C Gefrierschrank sitzen.
21. Nach der Inkubation 750-1000 μL PBS hinzufügen. Pipette mehrmals auf und ab.
22. Zentrifen Sie die Zellen für 5 min bei 400 x g.
23. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Überstand und bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug.
24. Abhängig von der Art der verwendeten Antikörper ändern Sie das Protokoll ab diesem Zeitpunkt. Führen Sie die Schritte 7.24.1-7.24.14 oder 7.24.15-7.24.22 aus.
    1. Wenn Sie einen primären und sekundären Antikörper verwenden, resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000 / P200-Pipette und pipettieren Sie 6-8 Mal in jedem Röhrchen auf und ab, um Zellklumpen in 100 μL primärem Antikörper zu brechen. In diesem Fall wurde eine Verdünnung von 1:800 für Stammantikörper vorgenommen, einschließlich KRAS-Antikörper oder ERK-Antikörper, und durfte 1 h bei Raumtemperatur sitzen. Antikörper wurden in einem Inkubationspuffer aus 1x PBS mit 0,5 g BSA verdünnt.
       HINWEIS: Bestimmen Sie die genaue Verdünnung des Antikörpers empirisch, indem Sie eine Standardkurve von Antikörperverdünnungen im Vergleich zum Antigen von Interesse erstellen.
    2. Nach Zugabe von Antikörpern die Röhrchen mit einer Folie bedecken, um Lichteffekte auf markierte Antikörper zu verhindern.
    3. Nach der Inkubation 750-1000 μL des Inkubationspuffers hinzufügen. Pipette mehrmals auf und ab.
    4. Zentrifen Sie die Zellen für 5 min bei 400 x g.
    5. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Überstand und bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug.
    6. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000 / P200-Pipette und pipettieren Sie 6-8 Mal in jedem Röhrchen auf und ab, um Zellklumpen in 100 μL sekundärem Antikörper zu brechen. In diesem Fall wurden die Zellen in einem 100 μL Sekundärantikörper bei einer Verdünnung von 1:800 für KRAS-Antikörper oder 1:2000 für ERK-Antikörper resuspendiert und 30 min bei Raumtemperatur sitzen gelassen. Ähnlich wie bei primären Antikörpern verdünnen Sie die sekundären Antikörper im Inkubationspuffer wie oben beschrieben. Bestimmen Sie die Verdünnungen der sekundären Antikörper basierend auf den empirischen Befunden einer Standardkurve.
    7. Nach der Zugabe von Antikörpern die Röhrchen mit einer Folie bedecken, um Lichteffekte auf die markierten Antikörper zu verhindern.
    8. Nach der Inkubation 750-1000 μL des Inkubationspuffers hinzufügen. Pipette mehrmals auf und ab.
    9. Zentrifen Sie die Zellen für 5 min bei 400 x g.
    10. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Überstand und bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug.
    11. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000-Pipette und pipettieren Sie 6-8 Mal in jeder Röhre auf und ab, um Zellklumpen in 500 μL PBS zu brechen.
    12. Übertragen Sie den gesamten Inhalt jedes Röhrchens (~ 500 μL) mit Sieben auf die markierten Röhrchen.
    13. Bringen Sie die Zellen zu geeigneten Durchflusszytometrie-Instrumenten mit Lasern der richtigen Wellenlängen (können Röhren mit Zellen auf oder außerhalb des Eises bringen).
        HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass mehrere Kontrollen wichtig sind, um mit der Durchflusszytometriemessung und der Analyse der manipulierten Zellgenexpression fortzufahren. Zum Beispiel können völlig unbefärbte Zellen, Zellen, die nur mit primären Antikörpern gefärbt sind, und Zellen, die mit sekundären Antikörpern allein gefärbt sind, nützlich sein, um die Ergebnisse mit Hintergrundsignalen von Antikörpern zu vergleichen.
    14. Fahren Sie als Nächstes mit der Analyse fort, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
    15. Wenn Sie nur einen primären Antikörper verwenden, resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000 / P200-Pipette und pipettieren Sie 6-8 Mal in jedem Röhrchen auf und ab, um Zellklumpen in 100 μL markiertem primären Antikörper zu brechen. Bestimmen Sie die geeignete Antikörperverdünnung und inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur. Bestimmen Sie empirisch die Antikörperverdünnung aus der Standardkurve.
    16. Nach Zugabe von Antikörpern die Röhrchen mit einer Folie bedecken, um Lichteffekte auf markierte Antikörper zu verhindern.
    17. Nach der Inkubation 750-1000 μL des Inkubationspuffers hinzufügen. Pipette mehrmals auf und ab.
    18. Zentrifen Sie die Zellen für 5 min bei 400 x g.
    19. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000-Pipette und pipettieren Sie 6-8 Mal in jeder Röhre auf und ab, um Zellklumpen in 500 μL PBS zu brechen.
    20. Übertragen Sie den gesamten Inhalt jedes Röhrchens (~ 500 μL) auf markierte Röhrchen mit Sieben.
    21. Bringen Sie die Zellen zu geeigneten Durchflusszytometrie-Instrumenten mit Lasern der richtigen Wellenlängen (können Röhren mit Zellen auf oder außerhalb des Eises bringen).
        HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass mehrere Kontrollen wichtig sind, um mit der Durchflusszytometriemessung und der Analyse der manipulierten Zellgenexpression fortzufahren. Vollständig unbefärbte Zellen und Zellen, die nur mit primären Antikörpern gefärbt sind, sind nützlich, um die Ergebnisse mit Hintergrundsignalen von Antikörpern zu vergleichen.
    22. Fahren Sie von diesem Punkt aus mit der Analyse fort, wie in Abschnitt 5 beschrieben.

Representative Results

Der Aufbau von Genschaltkreisen und die stabile Zellliniengenerierung in diesem Artikel basierten auf kommerziellen, modifizierten HEK-293-Zellen, die eine transkriptionell aktive, einzelne stabile FRT-Stelle enthielten (Abbildung 1). Die Genschaltkreise wurden zu Vektoren konstruiert, die FRT-Stellen innerhalb des Plasmids hatten, was die Flp-FRT-Integration in das HEK-293-Zellgenom ermöglichte. Dieser Ansatz ist nicht auf Flp-In-Zellen beschränkt, da FRT-Stellen mit DNA-Editing-Technologie wie CRISPR / ^Cas950 zu jeder Zelllinie von Interesse überall im Genom hinzugefügt werden können.

Nachdem geeignete Zelllinien für die korrekte Insertion konstruiert und validiert wurden, wurden die LPA- und IRIS-Software als standardisiertes Protokoll für die Lichtinduktion der Genexpression ^{ausgewählt31,51.} Das LPA-System ermöglicht die Programmierung von 24-Wells für die Induktion von Säugetierzellen unter mehreren experimentellen Bedingungen, abhängig von der Lichtintensität, der Pulsdauer und dem Tastverhältnis (Abbildung 2). In diesem Artikel wurden räumlich gleichmäßige Lichtintensität, Pulsdauer und Tastverhältnis priorisiert. Forscher können jedoch die IRIS-Software und das LPA für eine fortgeschrittenere Programmierung von zeitlichen Lichtwellenmustern verwenden.

Ein entscheidender Aspekt des LPA, der vor Beginn der Experimente angesprochen werden muss, ist die optische Kalibrierung, die für einzelne oder mehrere Geräte durchgeführt werden kann. Die zuvor beschriebene ^{Bildanalysemethode31} , die für die Kalibrierung verwendet wird, erfordert ein Bild des gesamten LPA mit eingeschalteten LEDs, das aus einer Vielzahl von ^Quellen52, einschließlich eines Gel-Imagers, aufgenommen werden kann. Hier wurde ein Computerscanner zur Bildaufnahme eingesetzt (Abbildung 3A). Nach der Aufnahme des Bildes wurde die von Gerhardt et al. (2016) ³¹ entwickelte Open-Source-Software verwendet, um Kompensationswerte für jede LED zu berechnen, um sicherzustellen, dass jeder LPA bei einem bestimmten Graustufenwert die gleiche Intensität emittiert. Die Software subtrahiert das Hintergrundsignal, schwenkt das Bild in eine binäre Kategorie und berechnet die Pixelintensität (Abbildung 3B). Aus der Kalibrierung ergab sich eine minimale Abweichung zwischen den LEDs mit einem CV von 0,04 zwischen 96 Wells (oder 4 kalibrierten Platten, Abbildung 3C). Schließlich demonstrierte die Verwendung der Kalibrierungssoftware die LED-Variation nach Position (Abbildung 3D) und erstellte eine Graustufenanpassung (Abbildung 3E), so dass jede LED auf die gleiche Intensität normalisiert wird.

Neben der Kalibrierung gehören zu den weiteren wichtigen Aspekten der Verwendung des LPA die Integration mehrerer Kontrollen in die experimentelle Pipeline, die systemische Fehler minimieren können, indem Störvariablen wie Lichttoxizitätseffekte und Designbeschränkungen auf der Grundlage experimenteller Materialien begrenzt werden. Abbildung 4 zeigt beispielsweise zwei verschiedene Konfigurationen für die Programmierung unterschiedlicher Lichtintensitäten in den LPA-Bohrungen. Das erste Unterfeld von Abbildung 4A zeigt eine aufsteigende Organisation der Lichtintensität. Dies kann die Programmierung und Datenanalyse erleichtern, kann jedoch zu Kanteneffekten führen, bei denen die untere Reihe des LPA die höchste Lichtintensität aufweist und möglicherweise unerwünschte Wärme- und Lichtinduktion von nahe gelegenen Bohrlöchern verursachen kann. In ähnlicher Weise wurde im zweiten Unterfeld von Abbildung 4A eine Randomisierungsmatrix auf die IRIS-Software angewendet, die verschiedene Lichtintensitäten an zufälligen Positionen erzeugt. Dadurch können systemische Einflüsse von Kanteneffekten minimiert werden. Mit der IRIS-Software wird eine entschlüsselte Matrix (Abbildung 4B) erstellt, mit der dann die experimentellen Bedingungen nach Abschluss des Experiments und während der Analyse bestimmt werden können. Ähnlich wie bei der Randomisierung von Bohrlöchern sollten sich die Benutzer auch der Lichttoxizitätseffekte bewusst sein, die auftreten können (blaues Licht innerhalb dieser Arbeit). In Abbildung 4C sind zwei verschiedene Lichtintensitäten, die für die Induktion von Genschaltkreisen verwendet werden, mit demselben FSC-SSC-Gate basierend auf der uninduzierten Population von künstlichen Zellen dargestellt. Daher sollten Anwender eine Dosis-Wirkungs-Beziehung nach der interessierenden Lichtmodalität (z. B. Puls, Tastverhältnis usw.) durchführen, um Lichttoxizitätseffekte zu bestimmen, die am oberen Ende der Exposition auftreten können (Abbildung 4D). Hier verursachten steigende Blaulichtwerte dosisabhängige Zelltrümmer, tote Zellen und Klumpen im Vergleich zu nicht stimulierten Zellen. Daher war die kontinuierliche Lichtintensität auf etwa 3/4 der maximalen LPA-Intensität (~ 3000 g.s. Einheiten) beschränkt.

Sobald die richtige Ausrüstung eingerichtet war, wurde die Genexpression in technisch hergestellten LITer-Genschaltkreisen über die Fluoreszenzmikroskopie induziert (Abbildung 5). Die Zellen wurden bei unterschiedlichen Lichtpulsdauern auf dem LPA induziert, was zu einer leichten Dosis-Wirkungs-Beziehung der Genexpression auf Populationsebene führte. Die Zellen in dieser Arbeit wurden für die GFP-Expression mit 50 ms für die Belichtungszeit der FITC/GFP-Lichtquelle und für die Hellfeldbildgebung mit 1-5 ms für die Phasenkontrast-Belichtungszeit abgebildet. Angesichts der Robustheit dieses Zelllinien-Engineering-Protokolls könnte anstelle von GFP jeder Fluoreszenzmarker verwendet werden. Die Zellen können mit mehreren Lichtregimen induziert werden und erzeugen eine große Bandbreite an Reaktionen (Abbildung 5). Letzteres ist vorteilhaft bei der weiteren Kontrolle der Expression funktioneller Gene (z. B. KRAS-Onkogen (G12V) in der ursprünglichen ^Arbeit53).

Unmittelbar nach der Fluoreszenzmikroskopie konnten Zellen in einer Vielzahl von experimentellen Protokollen analysiert werden, einschließlich Durchflusszytometrie, qRT-PCR und Immunfluoreszenz. In dieser Arbeit wurde die Durchflusszytometrie als erstes Validierungsverfahren durchgeführt und nach den oben beschriebenen Methoden durchgeführt (Abbildung 6). Ähnlich wie bei der Mikroskopie wurden Zellen bei unterschiedlichen Pulslängenwerten induziert und zeigten eine Dosis-Wirkungs-Beziehung der Genexpression von mehr als vierfacher Veränderung aus uninduzierten Zuständen auf Populationsebene (Abbildung 6A-B). In ähnlicher Weise kann die Rauschunterdrückung der Genexpression durch den Vergleich verschiedener Lichtintensitätswerte (Abbildung 6C-D) für das LITer-System mit einem positiv regulierenden System (keine Rückkopplung) wie dem VVD/^LightOn54 gezeigt werden. Vergleicht man den LITer mit dem VVD-System, erreicht negatives Feedback eine über fünffache Genexpressionsrauschunterdrückung. Die gleichen präinduzierten Zellen, die mikroskopisch aufgenommen wurden, konnten auch über die qRT-PCR analysiert werden (Abbildung 7). Ähnlich wie bei der Durchflusszytometrie konnten die technisch hergestellten LITer-Zellen RNA-Spiegel in einer dosisabhängigen Weise exprimieren (über 10-fache Induktion aus nicht induzierten Zuständen), die der Dosis-Wirkungs-Beziehung der Proteinspiegel entspricht, die durch GFP-Expression in der Durchflusszytometrie quantifiziert wird. Die erwähnten Fluoreszenzmikroskopie- und Durchflusszytometriedaten können mit nicht-fluoreszierenden Zellen, konstitutiv exprimierenden fluoreszierenden Zellen und fluoreszierenden 6-8-Peak-Validierungsperlen (z. B. FL1-Kanal-grüne, fluoreszierende Perlen) kalibriert werden. Jede dieser Komponenten kann die Normalisierung der Genexpression in einem einzigen Experiment ermöglichen. Diese Faktoren können jedoch auch die Normalisierung von Schaltkreisen und künstlichen Zellen über verschiedene experimentelle Platten, experimentelle Bedingungen und Tage hinweg ermöglichen, um den Vergleich und die Standardisierung von Genexpressionsdaten zu ermöglichen.

Schließlich können die LITer-Genschaltkreise so konstruiert werden, dass sie funktionelle Gene wie das KRAS exprimieren (G12V, Abbildung 8). Die Vielseitigkeit dieser Pipeline ermöglicht es Benutzern, die LITer-Architektur mit Cell Engineering für jedes funktionelle Gen von Interesse zu nutzen, möglicherweise mit zusätzlichen Architekturen wie positivem Feedback. Der LITer zeigte zunehmende Mengen an blauem Licht, was zu erhöhten Spiegeln der Genkreisleistung (KRAS-(G12V) Protein-Spiegel führte) und folglich zu phosphorylierten ERK-Spiegeln, die beide über Immunfluoreszenz-Assays quantifiziert werden können.

Fragment	Verhältnis	Größe (bp)	Konzentration des DNA-Fragmentgewichts (ng/μL)	Molare Konzentration von DNA-Fragmenten (fmol/μL)	Volumen (μL)	Resultierende DNA-Molmasse (fmol)
Mother Vector Fragment 1	1	3414.00	18.20	8.63	4.09	35.29
Mother Vector Fragment 2	1	4642.00	18.10	6.31	5.59	35.29
Gen von Interesse	1	549.00	37.90	111.70	0.32	35.29
Gesamt					10.00	105.87

Tabelle 1: Berechnung des DNA-Assembly-Reaktions-Master-Mix (Schritt 1.13). Die Säulen 2 und 3 basieren auf der Größe der zusammengesetzten DNA-Fragmente und der Konzentration dieser Fragmente nach PCR-Amplifikation und Agarosegelextraktion (Schritt 1.11). Die untere Zelle der 4^. Spalte (Gesamtreaktionsvolumen) kann modifiziert werden; Es wird jedoch die angegebene Lautstärke empfohlen. Nicht schattierte Zellen werden automatisch generiert.

0	100	200	400	500	750
1500	3000	0	100	200	400
500	750	1500	3000	0	100
200	400	500	750	1500	3000

Tabelle 2: IRIS-Programmierung von Lichtintensitäten (g.s.) für Lichtinduktionsexperimente in einer 24-Well-Platte mit drei Replikaten (Schritt 3.4). Verteilung der Lichtintensitäten von 0 bis 3000 g.s. G.s.-Graustufeneinheiten. Dies kann von der IRIS-Software nach Bedarf randomisiert werden.

	Beispiel 1	Beispiel 2	Beispiel 3
Reverse Transcriptase Master Mix Volume (μL)	4.00	4.00	4.00
RNA-Schablone (1000 ng) Volumen (μL)	2.00	3.00	4.00
NF-H20 Volumen (μL)	14.00	13.00	12.00
Gesamtvolumen (μL)	20.00	20.00	20.00

Tabelle 3: Berechnung des Reverse-Transkriptionsmaster-Mixes (Schritt 6.5). Das von der Reaktion empfohlene Gesamtvolumen beträgt 20 μL, und seine Komponenten sind der Reverse-Transkriptase-Enzym-Master-Mix (hier: 5x), RNA-Template und nukleasefreies Wasser. In diesem Beispiel betragen die RNA-Konzentrationen der Proben 1, 2 und 3 500, 333 bzw. 250 ng/μL.

	Beispiel 1	Beispiel 2	Beispiel 1 & 2 Multiplexed
GFP-Sondenvolumen (μL)	1	-----	1
GAPDH-Sondenvolumen (μL)	------	1	1
DNA-Polymerase-Master-Mix-Volumen (μL)	10	10	10
cDNA (100 ng) Volumen (μL)	2	2	2
NF-H20 Volumen (μL)	7	7	7
Gesamtvolumen (μL)	20	20	20

Tabelle 4: Quantitative PCR-Master-Mix-Berechnung (Schritt 6.6). Das von der Reaktion empfohlene Gesamtvolumen beträgt 20 μL und seine Komponenten sind der DNA-Polymerase-Enzym-Mastermix (hier: 2x), GFP- und / oder GAPDH-Sonden, cDNA (insgesamt 100 ng) und nukleasefreies Wasser (_NF-H20).

Abbildung 1: Schaltungsdesign und Zelltechnik. (A) Zell-Engineering-Werkzeuge, einschließlich des synthetischen LITer-Genschaltkreises mit FRT-Integrationsstellen, des Rekombinase-Enzyms (Flp-Rekombinase) für die Schaltkreisintegration, des Arzneimittels zur Auswahl geeigneter genetischer Klone und der Zelllinie von Interesse, die zur Herstellung der gewünschten optogenetischen Zelllinien für Säugetiere verwendet wird. (B) Technisch hergestellte genetische Systeme können an einem bestimmten FRT-Standort integriert werden, der einen Locus innerhalb des menschlichen Genoms enthält. Diese genomischen Loci können dann spezifische Antibiotikaresistenz- oder fluoreszierende Reportergene für die Selektion von richtig integrierten genetischen Kassetten exprimieren. Die Integration von Genschaltkreisen kann mit Hilfe von Rekombinasen eingeleitet werden, die bestimmte Stellen innerhalb der ursprünglichen genetischen Kassette erkennen. Damit wird ein neuartiges Wirkstoffresistenz-Selektionsgen eingeführt, das die Erzeugung korrekt konstruierter Zellen mit dem gewünschten Genschaltkreis sicherstellen kann. Am unteren Rand von Panel B befindet sich die Genschaltungsarchitektur für das optogenetische negative Rückkopplungssystem LITer2.0. Diese Schaltung besteht aus einem selbstunterdrückenden TetR-Protein, das mit einer Light-Oxygen-Voltage-Sensing-Domäne (LOV2) verschmolzen ist, einer Linker-Sequenz P2A, die ein multicistronisches Transkript ermöglicht, und GFP. Wenn blaues Licht angewendet wird, öffnet sich die TIP-Sequenz aus der LOV2-Domäne, hemmt das TetR-Protein und ermöglicht eine erhöhte, dosisabhängige Transkription sowohl von TetR als auch vom GFP-Reporter. Das gehemmte TetR-Protein ist nicht in der Lage, an der DNA-Operatorstelle zu binden und zu unterdrücken, wodurch die Transkription erhöht wird. Dieses negative Feedback hält das Genexpressionsrauschen niedrig und ermöglicht eine hochfalte Veränderung der Genexpression. FRT - Flip-Erkennungsziel, HygR - Hygromycin-Resistenz, LacZ - β-Galactosidase, ZeoR - Zeocin-Resistenz, T - TetR, Tetracyclin-Repressor-Protein, D2ir ist ein CMV-basierter Promotor mit TwtO-Stellen, LOV2 ist Licht-Sauerstoff-Spannungs-Sensing-Domäne, TIP ist ein tet-inhibitierendes Peptid, das das TetR-Protein hemmt. Diese Zahl wurde von Guinn und Balázsi (2020) ⁵⁵ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Experimentelle LPA-Programmierung. (A) Experimente können mit den auf der Tabor Lab ^Website47 aufgeführten Tools programmiert werden, mit Flexibilität für stationäre, dynamische oder erweiterte LPA-Programmierung31. Darüber hinaus können elektronische Dateien für die zukünftige Verwendung für technische Replikate oder experimentelle Induktion alternativer Zelllinien gespeichert werden. (B) LPA-Gerät mit Hauptkomponenten von oben und von der Seite betrachtet (C). (D) Bilder von folienversiegelten Platten, die sich auf LPA befinden. LPA - Light Plate Apparatus, LED - Leuchtdiode. Elemente dieser Figur wurden von Guinn (2019) ¹¹ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Kalibrierung der Lichtplattenvorrichtung . (A) Repräsentatives Bild von LPA für LEDs, die auf 2000 g.s. eingestellt sind, basierend auf IRIS-Software. (B) Bild aus Bedienfeld (A) mit subtrahiertem Hintergrund und Schwellenwert, der zum Binarisieren des Bildes verwendet wird, um die Pixelintensität jeder LED zu berechnen. (C) Histogramm der Pixelintensitäten (bestimmt durch MATLAB-Bildanalyse) von 96 LEDs (4 LPA-Platten), die auf den gleichen IRIS-Softwarewert (z. B. 2000 g.s.) eingestellt sind. Die rote Linie stellt die mittlere LED-Pixelintensität dar, und CV im Panel stellt den Variationskoeffizienten für die 96 Vertiefungen dar. (D) Heatmap mit den LED-Intensitäten des LPA-Bildes in Panel (A) normalisiert auf die maximale Intensität der LED. (E) Kalibrierwert-Heatmap, die für das LPA-Bild in Panel (A) bestimmt wurde, um eine gleichmäßige Intensitätsproduktion für jede LED zu erzeugen, wenn sie für den LPA programmiert ist. LPA - Light Plate Apparatus, LED - Leuchtdiode, CV - Variationskoeffizient. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Randomisierung von LPA- und Lichttoxizitätseffekten . (A) Repräsentatives Bild von zwei programmierbaren LPA-LED-Konfigurationen, die auf der IRIS-Software von 25 bis 4000 g.s eingestellt sind. Die erste Konfiguration lässt systematische Fehler wie Randeffekte von Wärme und Licht eher übergehen (z. B. wirkt sich die untere Reihe des LPA auf die 2^. unterste Reihe aus). Das zweite Bild randomisiert die Position der Intensitäten und minimiert so den systematischen Fehler (Bias), der durch Kanteneffekte verursacht wird. (B) Matrix, die die Randomisierungsposition für Lichtintensitäten in der in Panel (A) gezeigten LPA zeigt, die verwendet werden kann, um die intensitätsabhängigen Ergebnisse eines gegebenen Experiments zu bestimmen. (C) Durchflusszytometriedaten für zwei verschiedene Lichtintensitäten (1250 und 4000 g.s.) für 3 Tage Induktion bei kontinuierlicher Beleuchtung. Das schwarze Tor basiert auf uninduzierten Zellen. (D) Balkendiagramm mit Durchflusszytometriedaten wie Panel (C), jedoch für einen breiten Bereich von Lichtintensitäten. LPA - Light Plate Apparatus, FSC - Vorwärtsstreuung, SSC - Seitenstreuung, g.s. - Lichtintensitätswert gemessen in Graustufen. LITer-Zellen11 hatten eine dosisabhängige Abnahme des Zellüberlebens^, die unter Verwendung des ANOVA-1-Tailed-Tests mit einem p-Wert von 0,0022 statistisch signifikant war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Repräsentative mikroskopische Aufnahmen von manipulierten optogenetischen Zelllinien. Die Zellen wurden auf einem inversen Mikroskop mit einer Kamera (14-Bit) zur Erfassung von Phasenkontrast und Fluoreszenzbildgebung aufgenommen. Die Zellen wurden für 5 ms für den Phasenkontrast (Panel A, repräsentatives Hellfeldbild) und 50 ms für die GFP/FITC-Erfassung (Panel B) bei 100% Lichtquellenintensität belichtet. Zellen können zu verschiedenen Zeitpunkten abgebildet werden, abhängig von der gewünschten stationären Erfassung oder der dynamischen Reaktion, was zu einem stationären Zustand führt. Zellen stellen hier eine Titration mit Pulsdauer bei fester Intensität (1000 g.s.) dar, die von keiner Lichteinwirkung bis zu 3 Tagen Lichteinwirkung reicht. Die Einheit g.s stellt einen in Graustufen gemessenen Lichtintensitätswert dar. Diese Zahl wurde gegenüber Guinn (2019)¹¹ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Durchflusszytometrie von technisch hergestellten optogenetischen Zelllinien. Die Zellen wurden auf einem BD LSRFortessa-Durchflusszytometer analysiert, wobei etwa 10.000 Zellen in einem SSC-FSC-Gate (Side Scatter-Forward Scatter) gesammelt wurden. Die Zellen wurden dann mit der FCS Express-Software analysiert. Histogramm- oder Streudiagramme könnten generiert werden, um die Expression des interessierenden Gens (z. B. GFP) zu quantifizieren. (A) Technisch hergestellte Zellen, die auf SSC-FSC-Achsen für das Gating innerhalb der schwarzen Linie aufgetragen werden. (B) Repräsentative LITer-Zellen, die mit unterschiedlicher Dauer von Lichtimpulsen bei 1000 g.s. bis zu 72 h Induktion induziert werden, um die Dosis-Wirkungs-Beziehung der Genexpression zu veranschaulichen. (C) Repräsentative Dosis-Wirkungs-Daten für die Titration der Lichtintensität im Vergleich des LITer-Genschaltkreises (TIP-basiertes System) mit VVD oder LightOn ^System40, einem positiven Regulationssystem ohne Rückkopplung. (D) Histogramm, das dem VVD-System entspricht und eine breitere Verteilung (und damit ein höheres Genexpressionsrauschen) im Vergleich zum LITer-System veranschaulicht. CV ist der Variationskoeffizient, eine Metrik für Genexpressionsrauschen. FSC - Vorwärtsstreuung, SSC - Seitenstreuung, FITC - Fluoresceinisothiocyanat, g.s. - Lichtintensitätswert gemessen in Graustufen. Diese Zahl wurde gegenüber Guinn (2019)¹¹ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Quantitative real-time PCR von manipulierten optogenetischen Zelllinien. Repräsentative Daten, die zeigen, dass mehrere Genexpressionsniveaus mit Licht als Stimulus induziert und quantifiziert werden können. Die Einheit Rq stellt die relative Quantifizierung der Expressionsfaltenänderung im Vergleich zur Steuerung dar. LITer-Zellen11 hatten einen dosisabhängigen Anstieg der RNA-Expression, der unter Verwendung des ANOVA-1-Tailed-Tests mit einem p-Wert von 0,0352 bzw. ^0,0477 für GFP- bzw. KRAS-Spiegel statistisch signifikant war. Diese Zahl wurde gegenüber Guinn (2019)¹¹ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Immunfluoreszenz von technisch hergestellten optogenetischen Zelllinien. Repräsentative Daten, die Schätzungen auf Proteinebene basierend auf Immunfluoreszenz zeigen. (A) Proteingehalte von KRAS(G12V) und (B) Proteingehalte von phosphoryliertem ERK, die der LITer-Genkreislauf entsprechend steigender Lichtmengen direkt bzw. indirekt induziert. Die in Balken angezeigten Daten sind Mittelwerte, Fehlerbalken sind Standardabweichungen (n = 3). A.u. - beliebige Einheiten, g.s. - Lichtintensitätswert gemessen in Graustufen. LITer-Zellen11 wiesen einen dosisabhängigen Anstieg der Proteinspiegel auf, der unter Verwendung des ANOVA-1-Tailed-Tests mit einem p-Wert von 2,79E-04 bzw. ^0,016 für KRAS- bzw. phosphorylierte ERK-Spiegel statistisch signifikant war. Diese Zahl wurde gegenüber Guinn (2019)¹¹ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Die Leser dieses Artikels können einen Einblick in die Schritte erhalten, die für die Charakterisierung optogenetischer Genschaltkreise (sowie anderer Genexpressionssysteme) von entscheidender Bedeutung sind, einschließlich 1) Design, Konstruktion und Validierung von Genschaltkreisen; 2) Zell-Engineering zur Einführung von Genschaltkreisen in stabile Zelllinien (z. B. Flp-FRT-Rekombination); 3) Induktion der technischen Zellen mit einer lichtbasierten Plattform wie der LPA; 4) Erstcharakterisierung von Lichtinduktionsassays mittels Fluoreszenzmikroskopie; und 5) endgültige Genexpressionscharakterisierung mit einer Vielzahl von Assays, einschließlich Durchflusszytometrie, quantitativer Real-Time-PCR (qRT-PCR) oder Immunfluoreszenz-Assays.

Darüber hinaus sind die oben beschriebenen Methoden für praktisch jede Genschaltungsarchitektur, die Gene von Interesse ausdrückt, hochgradig modular, wobei die wichtigsten potenziellen Protokolländerungen beim Schaltungskonstruktionsschritt und den durchgeführten Assays durchgeführt werden. Im Falle der Konstruktion von Genschaltkreisen ermöglicht die Flexibilität der molekularen Klonierung den Austausch oder die gemeinsame Expression jedes interessierenden Gens mit einem Fluoreszenzmarker mit geringfügigen Modifikationen des Primer-Designs oder der Montageprotokolle. Während sich die hier beschriebenen Verfahren hauptsächlich auf ein NF-Genschaltungsdesign für eine präzise (rauscharme) Genexpressionskontrolle konzentrieren, können andere Architekturen wie positive Regulation oder positives Feedback (PF) implementiert werden, um verschiedene Merkmale wie High-Fold-Change oder High-Genexpression-Rauschen zu ^{erreichen56,57} . Die Verwendung einer Vielzahl von Genschaltungsarchitekturen (z. B. PF, NF usw.) kann es Forschern ermöglichen, verschiedene biologische Fragen zu untersuchen, wie z. B. die Rolle von Proteinniveaugrößen und Rauschen bei der Arzneimittelresistenz oder ^{Metastasierung58.} Die hier aufgeführten Protokolle konzentrieren sich auch auf verschiedene Möglichkeiten der Genexpressionsquantifizierung, aber eine beliebige Anzahl von funktionellen Assays (z. B. Zellmotilität, Wundheilung, Proliferation usw.) kann nach der Mikroskopieerfassung hinzugefügt werden, ohne dass dies auf die vorhergehenden Methoden einwirkt. Dies ist besonders relevant für Einzelzellstudien, bei denen die Optogenetik die raumzeitliche Induktion nutzen kann, um Verhaltensweisen wie die pulsierende ^{Expressionsdynamik zu untersuchen59}.

Ergänzend zur Modularität der Methode ist die Fehlerbehebung ein weiteres wichtiges Merkmal jedes Hauptprotokolls. Für den Schaltungsaufbau liegen die Hauptunterschiede im geeigneten schaltungsspezifischen Primer-Design, während spätere Methoden wie Montage und Plasmidverstärkung durch Bakterienwachstum standardisierter sind und typischerweise eigene umfangreiche Fehlerbehebungsverfahren beinhalten. Das Zell-Engineering kann je nach verwendeter Zelllinie mit Wirkstofftitrationskurven modifiziert werden. Wenn eine kommerzielle Zelllinie verwendet wird, können außerdem Anleitungen zur Fehlerbehebung direkt vom Hersteller der Zelllinie angefordert werden. Auch unbeabsichtigte Lichteffekte sind wichtig, um die künstlichen Zelllinien zu quantifizieren. Zum Beispiel sollte aufgrund der phototoxischen Wirkungen von 470 nm Licht eine Lichtintensitätskurve erstellt werden, um die Induktion von Tod oder Schaden in einer Population zu untersuchen. Sobald eine Vielzahl von Lichtwerten getestet wurden, können Benutzer ein FSC-SSC-Gate erstellen oder eine Methode wie die Propidiumjodid-Färbung verwenden, um tote / beschädigte Zellen zu quantifizieren, und daher als Werkzeug zur Bestimmung geeigneter Lichtbereiche dienen, die experimentell verwendet werden können.

Für die LPA-Fehlersuche können LEDs Kanteneffekte von Licht und Wärmeübersprechen mit benachbarten Bohrlöchern erzeugen. Zum Beispiel können hochintensive Bohrungen eine gewisse Induktion in benachbarten Bohrlöchern verursachen, wenn eine unsachgemäße Abdichtung oder ein großer Wärme- / Lichtgradient zwischen den Bohrlöchern vorhanden ist. Diese Effekte können maximal sein, wenn der LPA in einer bestimmten Reihenfolge (z. B. aufsteigend/absteigend) eines Lichtparameters programmiert wird. Um dies zu bekämpfen, ermöglicht die IRIS-Software den Benutzern, eine Randomisierungsmatrix zu verwenden, um die Bohrlochintensitäten zu randomisieren und somit systematische Fehler zu reduzieren. Für die Fehlerbehebung bei Aspekten der Fluoreszenzmikroskopie sind Belichtungszeit, Verstärkungseinstellungen (Steuerung der Kameraempfindlichkeit) und Lichtquellenintensität die wichtigsten Parameter, die eingestellt werden können. Die Abstimmung dieser Parameter kann eine optimale Bilderzeugung und ein ideales Signal-Rausch-Verhältnis ermöglichen sowie Übersättigung und Phototoxizität vermeiden.

Für die Fehlerbehebung in der Durchflusszytometrie sind Photomultiplierröhrenspannungen und zelluläres Gating die Hauptaspekte, die eingestellt werden können. Die Abstimmung dieser Parameter kann ideale Vergleiche zwischen experimentellen Bedingungen und Kontrollproben, eine ordnungsgemäße Signalerfassung für schwache oder starke Fluoreszenzsignale und den Ausschluss von Zelltrümmern oder unerwünschten Zellpopulationen ermöglichen. Es sollte beachtet werden, dass Durchflusszytometriespannungen idealerweise über Experimente hinweg konstant gehalten werden, um richtige Vergleiche zu ermöglichen. Darüber hinaus müssen Benutzer für optogenetische Systeme, die mehrere Fluoreszenzausgänge erfordern (z. B. FITC und PE), die Fluoreszenzkompensation bei Übersprechen zwischen Fluorophoren kennen. In solchen Szenarien sind Kontrollen entscheidend für die Bestimmung der richtigen Fluoreszenzsignale. Zu den Kontrollen, die für Benutzer erforderlich sind, gehören fluoreszierende Perlen, gefärbte Zellen mit dem Marker von Interesse oder Zellen, die das Fluoreszenzprotein konstitutiv exprimieren, das zur Erstellung einer Kompensationsmatrix in der interessierenden Durchflusszytometrie-Software verwendet werden kann. Unabhängig davon, ob sie einen Fluoreszenzmarker oder mehr verwenden, sollten alle Benutzer routinemäßig die Fluoreszenzsignale jedes Markers für nicht-fluoreszierende Zellen messen, die Autofluoreszenz- / Hintergrundsignale liefern. Die qRT-PCR-Fehlerbehebung umfasst unterschiedliche cDNA-Mengen und Sondendesigns, die oft projektspezifisch sind. Schließlich sind für die Immunfluoreszenz-Fehlerbehebung die Antikörperkonzentrationen die größte Variable für die Assay-Quantifizierung, was eine optimale Konzentrationsbestimmung erfordert.

Ein Aspekt der Fehlerbehebung, der für die meisten der oben genannten Methoden relevant ist, ist der Isolationseffekt der Verwendung einer versiegelten Platte mit Zellen, die mit Folie bedeckt sind. Diese Methode kann den Kohlendioxid-Gasaustausch behindern, der für das ordnungsgemäße Wachstum verschiedener Zelllinien erforderlich ist. Aus früheren experimentellen Erfahrungen war dies kein wesentliches Hindernis für das Zellwachstum für ein 3-5-tägiges Experiment mit den manipulierten Zelllinien in diesem Manuskript, kann aber für andere Zelllinien oder experimentelle Dauer wichtig werden. Um dieses Problem auszuräumen, umfasst eine Anpassung, die mit den versiegelten Platten durchgeführt wird, die Verwendung von kohlendioxidunabhängigen Medien, die das Wachstum der in dieser Studie verwendeten Zellen nicht beeinflusst haben. Es sollte für andere Assays oder Zelllinien beachtet werden, bei denen Stoffwechsel, pH-Wert und Zelldichte wichtig sind, andere Interventionen können erforderlich sein, z. B. der häufigere Wechsel von Medien oder Nährstoffen.

Die Grenzen der hier skizzierten Methoden liegen im verwendeten Genschaltkreis, der optogenetischen Präzision und der LPA-Schnittstelle zu anderen Geräten wie Fluoreszenzmikroskopen. Die hier beschriebene Technologie ist erschwinglich, schnell aufzubauen und einfach zu ^validieren46 für Populationen von optogentechnisch veränderten Zellen. Es gibt jedoch bestimmte räumliche Einschränkungen, wie z.B. die Unfähigkeit, einzelne Zellen ohne Modifikationen am Lichtinduktionsaufbau zu steuern, wie z.B. die Verwendung von digitalen Spiegelgeräten (DMDs), mit kürzlich nachgewiesenen Vorteilen in lebenden ^Zellen60,61. Darüber hinaus sind die hier beschriebenen Methoden im Lebendzell-Tracking während der optogenetischen Stimulation begrenzt, so dass nur die Endpunktdatenerfassung des gesamten experimentellen Zeitverlaufs möglich ist.

Trotz dieser Grenzen ergänzen die hier beschriebenen optogenetischen Methoden die bestehende Technologie wie die DMDs, die die Flexibilität haben, einzelne Zellen in Echtzeit zu steuern, aber durch die Anzahl der Proben, die man stimulieren kann, begrenzt sind. Darüber hinaus stehen die hier diskutierten Methoden des Stable Cell Line Engineering im Gegensatz zu bestehenden Methoden der synthetischen Biologie, die oft manipulierte genetische Systeme durch vorübergehende Transfektionen charakterisieren. Transiente Transfektionsansätze sind aufgrund der größeren Variation der Genkreiskopienzahl zwischen den Zellen von Natur aus lauter. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei den hier vorgestellten Methoden um monoklonale Zellvarianten, die jeweils eine Genschaltkreiskopie enthalten. Stabile Zelllinien ermöglichen die Erforschung zellulärer Aspekte wie Genexpressionsvariation, Effekte auf Proteinebene auf phänotypische Landschaften und Einzelzellmethoden mit feinerer Präzision, da eine höhere Sicherheit besteht, dass jede Zelle mit ihren Nachbarn identisch ist.

Die Arbeit hier zeigt eine Plattform für den Entwurf eines jeden genomisch integrierten optogenetischen Genschaltkreises von Interesse, der Induktion solcher Systeme mit zuverlässigen experimentellen Werkzeugen und der Charakterisierung mit einer Vielzahl von Genexpression und funktionellen / phänotypischen Assays in standardisierter Weise. Zukünftige Verbesserungen dieser Protokolle könnten die Integration dieser Methoden mit der Verfolgung lebender Zellen unter Verwendung anderer optogenetischer Technologien wie der DMDs umfassen, die eine raumzeitliche Kontrolle der Genexpression und funktioneller Anwendungen auf Einzelzellebene ermöglichen. Solche Fortschritte werden es ermöglichen, Licht zu nutzen, um das Genexpressionsmuster von Interesse in einzelnen Zellen zu erzeugen, Transkriptions- / Translationsdynamik zu etablieren, Proteinspiegel zu quantifizieren und ihre Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen zu untersuchen, einschließlich Zellmigration, Proliferation, Metastasierung und Differenzierung.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes	Eppendorf	951010006	reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X	Thermo Fisher Scientific	MT25053CI	reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000020	tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000055	tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap	Corning	352235	reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V	Eppendorf	22628113	equipment for mammalian culture work
Agarose	Denville Scientific	GR140-500	reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates	VWR®	60941-126	tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9518-5G	reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365PR	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140010	reagent for growing bacteria
BD LSRAria	BD	656700	tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa	BD	649225	tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine	Government Scientific Source	SIGA4919-1G	reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC	Corning	353043	plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge	VWR	22628113	instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood	N/A	N/A	instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid	BD	353047	plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask	USA Scientific	CC7682-4825	container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fischer Scientific	BP231-100	reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide	Thermo Fisher Scientific	15-585-011	reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid	Corning	353072	container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express	De Novo Software:	N/A	software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL	Corning	35-010-CV	reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose	Thermo Fisher Scientific	11-965-092	reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL	Life Technologies	10687-010	reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix	Bio-Rad Laboratories	1708890	reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C	VWR	76210-392	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U74VC	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C	VWR	76359-220	equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg	Sigma-Aldrich	L3022-250G	reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000	Life Technologies	L3000008	reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019	MathWorks	N/A	software for analyzing experimental data
Methanol	Acros Organics	413775000	reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL	VWR	20170-333	plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
MultiTherm Shaker	Benchmark Scientific	H5000-HC	equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-NDL-US-CAN	equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix	NEB	M0492S	reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)	New England Biolabs (NEB)	C3019H	bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs (NEB)	E2621L	reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera	Nikon Instruments Inc.	N/A	instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements	Nikon Instruments Inc.	N/A	software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides	IDT	N/A	reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control	Panasonic	MCO-170AICUVHL-PA	instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade	Electron Microscopy Sciences	15710-S	reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)	Invitrogen	14190144	reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x	Fisher Scientific	15140-122	reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody	Cell Signaling Technology	4370S	primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody	Sigma-Aldrich	WH0003845M1	primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System	Eppendorf	A28137	equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App	Thermo Fisher Scientific	N/A	software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody	Cell Signaling Technology	8889S	secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody	Invitrogen	A11005	secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL	Olympus Plastics	12-102	reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System	Major Science	UVCI-1200	tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene	SnapGene	N/A	software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator	Tokai Hit	INU-TIZ	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444557	reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn	Life Technologies	4326317E	qPCR Probe
Thermocycler	Bio-Rad	1851148	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated	PerkinElmer	1450-605	plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm	VWR	14673-010	reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System	VWR	89032-290	equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293	Thermo Fisher Scientific	R75007	Engineered cell line with FRT site