Надежное проектирование и управление стабильными оптогенетическими генными цепями в клетках млекопитающих

Summary

Надежное управление светочувствительными клетками млекопитающих требует стандартизации оптогенетических методов. Для достижения этой цели в этом исследовании излагается конвейер построения генной цепи, клеточной инженерии, работы оптогенетического оборудования и проверочных анализов для стандартизации изучения экспрессии генов, индуцированной светом, с использованием оптогенетической генной схемы с отрицательной обратной связью в качестве тематического исследования.

Abstract

Надежный контроль экспрессии генов в клетках млекопитающих требует инструментов с высоким изменением складки, низким уровнем шума и определенными функциями передачи ввода-вывода, независимо от используемого метода. Для достижения этой цели оптогенетические системы экспрессии генов за последнее десятилетие привлекли большое внимание для пространственно-височного контроля уровня белка в клетках млекопитающих. Однако большинство существующих схем, контролирующих экспрессию генов, индуцированных светом, различаются по архитектуре, экспрессируются из плазмид и используют переменное оптогенетическое оборудование, что создает необходимость изучения характеристик и стандартизации оптогенетических компонентов в стабильных клеточных линиях. Здесь исследование предоставляет экспериментальный конвейер надежного построения генной цепи, интеграции и характеристики для контроля экспрессии генов, индуцируемой светом, в клетках млекопитающих, используя в качестве примера оптогенетическую схему с отрицательной обратной связью. Протоколы также иллюстрируют, как стандартизация оптогенетического оборудования и режимов освещения может надежно выявить особенности генной цепи, такие как шум экспрессии генов и величина экспрессии белка. Наконец, эта статья может быть полезна для лабораторий, незнакомых с оптогенетикой, которые хотят принять такую технологию. Описанный здесь конвейер должен применяться к другим оптогенетическим схемам в клетках млекопитающих, что позволяет более надежно, подробно характеризовать и контролировать экспрессию генов на транскрипционном, протеомном и, в конечном счете, фенотипическом уровне в клетках млекопитающих.

Introduction

Подобно другим инженерным дисциплинам, синтетическая биология направлена на стандартизацию протоколов, позволяя использовать инструменты с высоковоспроизводимыми функциями для изучения вопросов, относящихся к биологическим ^{системам1,2}. Одной из областей в синтетической биологии, где было построено много систем управления, является область регуляции экспрессии ^{генов3,4}. Контроль экспрессии генов может быть нацелен как на уровни белка, так и на изменчивость (шум или коэффициент вариации, CV = σ/μ, измеренный как стандартное отклонение от среднего), которые являются важнейшими клеточными характеристиками из-за их роли в физиологических и патологических клеточных состояниях5,6,7,8. Многие синтетические системы, которые могут контролировать уровень белка и шум4,9,10,11,12, были разработаны, создавая возможности для стандартизации протоколов между инструментами.

Одним из новых инструментов, которые могут контролировать генные сети, которые недавно появились, является оптогенетика, позволяющая использовать свет для контроля экспрессии генов13,14,15,16,17. Подобно своим химическим предшественникам, оптогенетические генные цепи могут быть введены в любой тип клеток, начиная от бактерий и заканчивая млекопитающими, что позволяет экспрессировать любой интересующий ^ген18,19. Однако из-за быстрого создания новых оптогенетических инструментов появилось много систем, которые различаются по архитектуре генетических схем, механизму экспрессии (например, плазмидная и вирусная интеграция) и светоснабжающему контрольному оборудованию11,16,20,21,22,23,24,25 . Таким образом, это оставляет место для стандартизации оптогенетических особенностей, таких как построение и оптимизация генной цепи, метод использования системы (например, интеграция против переходной экспрессии), экспериментальные инструменты, используемые для индукции, и анализ результатов.

Чтобы добиться прогресса в стандартизации оптогенетических протоколов в клетках млекопитающих, этот протокол описывает экспериментальный конвейер для разработки оптогенетических систем в клетках млекопитающих с использованием генной схемы отрицательной обратной связи (NF), интегрированной в клетки HEK293 (клеточная линия эмбриональной почки человека) в качестве примера. NF является идеальной системой для демонстрации стандартизации, поскольку она очень ^{распространена} в ^{природе26,27,28}, что позволяет настраивать уровни белка и минимизировать шум. Короче говоря, NF позволяет точно контролировать экспрессию генов с помощью репрессора, уменьшая свою собственную экспрессию достаточно быстро, тем самым ограничивая любое изменение от устойчивого состояния. Устойчивое состояние может быть изменено индуктором, который инактивирует или устраняет репрессор, чтобы обеспечить большую выработку белка до тех пор, пока не будет достигнуто новое устойчивое состояние для каждой концентрации индуктора. Недавно была создана спроектированная оптогенетическая система NF, которая может производить широкодинамический ответ экспрессии генов, поддерживать низкий уровень шума и реагировать на световые стимулы, что позволяет контролировать пространственную экспрессию ^генов11. Эти инструменты, известные как светоиндуцируемые тюнеры (LITers), были вдохновлены более ранними системами, которые позволяли контролировать экспрессию генов в живых клетках4,10,29,30 и были стабильно интегрированы в клеточные линии человека для обеспечения долгосрочного контроля экспрессии генов.

Здесь, используя LITer в качестве примера, описан протокол для создания светочувствительных генных цепей, индуцирующих экспрессию генов с помощью light Plate Apparatus (LPA, оптогенетическое индукционное оборудование)³¹, и анализа реакций инженерных, оптогенетически контролируемых клеточных линий на пользовательские световые стимулы. Этот протокол позволяет пользователям использовать инструменты LITer для любого функционального гена, который они хотят исследовать. Он также может быть адаптирован для других оптогенетических систем с различными схемными архитектурами (например, положительная обратная связь, отрицательное регулирование и т. Д.) Путем интеграции методов и оптогенетического оборудования, описанных ниже. Подобно другим протоколам синтетической биологии, видеозаписи и оптогенетические протоколы, изложенные здесь, могут применяться в одноклеточных исследованиях в различных областях, включая, но не ограничиваясь биологией рака, эмбриональным развитием и дифференцировкой тканей.

Protocol

1. Проектирование генных схем

1. Выберите генетические компоненты для объединения в одну генную цепь/плазмиду (например, мотивы последовательности интеграции ДНК ^{млекопитающих32}, светочувствительные ^{элементы33} или функциональные ^гены34).
2. Используя любое программное обеспечение для генной инженерии и/или молекулярного клонирования, храните последовательности ДНК для последующего использования и ссылки, аннотируйте каждую последовательность и исследуйте все необходимые признаки (например, кодоны START, регуляторные или переведенные последовательности)³⁵.
3. Разрабатывайте или принимайте детали в соответствии с общей конструкцией генной ^схемы36. Например, для оптогенетических репрессоров, как в ^LITers11, объединяют последовательность генов, кодирующих домен, способный к легкоиндуцируемой ^{деградации37,38} или инактивации способности репрессора к связыванию ^ДНК39, рядом с геном репрессора и в кадре (например, TetR)⁴.
   1. Для оптогенетических активаторов обеспечьте наличие активаторного ^{домена40} , который способствует экспрессии генов при связывании ДНК, вызванной ^{светом41}. Для отрицательной или положительной ауторегуляции обеспечьте наличие регуляторного сайта связывания в промоторе гена-регулятора или вверх по течению от него (например, сайтов tetO в или выше по течению промотора, экспрессирующего TetR)⁴².
4. Разработайте праймеры для амплификации последовательности ДНК или секвенирования плазмиды с использованием программного обеспечения молекулярного клонирования для каждой генной цепи.
5. Проверяйте праймеры вычислительно для построения плазмид с помощью встроенных пирур программного обеспечения для молекулярного клонирования (например, выравнивание последовательностей).
6. Закажите олигонуклеотидные грунтовки от производителя. Плазмиды, построенные и использованные в этой работе, можно найти в оригинальном несущем ^{материале11} вместе с разработанными и используемыми грунтовками.
7. Разбавить грунтовки до концентрации запаса 100 мМ в двухдистиллированной воде (_ddH2O).
8. Разбавить запас грунтовок 100 мМ до концентрации 10 мМ для ПЦР.
9. Готовят смесь ПЦР с 1 мкл прямого праймера, 1 мкл обратного праймера, 1 мкл шаблонной ДНК до общей массы 0,5-500 нг для генома или 0,5 пг-5 нг для плазмидной или вирусной ДНК, 12,5 мкл ДНК-полимеразы 2x мастер-микса (или объема, удовлетворяющего коэффициенту разбавления производителя) и 9,5 мкл _ddH2O для общего объема реакции 25 мкл.
10. Инкубируйте смесь ПЦР в термоциклере при соответствующих настройках в зависимости от выбранного ^{фермента43}. Предлагаемые циклы реакции включают:
    Шаг 1: Один цикл начальной стадии денатурации 30 с при 95 °C.
    Шаг 2: 40 циклов по 5 с стадии денатурации при 98 °C.
    Этап 3: Один цикл из 30 с стадии отжига при 65 °C (определяется грунтовками, разработанными ранее).
    Шаг 4: Один цикл 1 мин расширения при 72 °C (~1 килобаз (кб) длины фрагмента шаблона).
    Шаг 5: Один цикл удлинения на 2 минуты при 72 °C.
    Удерживайте реакцию при 4 °C до тех пор, пока она не будет проверена с помощью гелевого электрофореза. Этот протокол будет варьироваться в зависимости от используемых реагентов (например, полимеразы и буферов).
11. Повторите шаг 1.9, чтобы амплифицировать все фрагменты, которые будут использоваться в реакции сборки ДНК, необходимой для связывания линейных продуктов ПЦР в один круговой вектор ДНК.
12. Запустите продукты ПЦР на 1% агарозном геле с последующей очисткой полос нужной длины.
13. Подготовьте мастер-микс для реакции сборки ДНК (таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере материнский вектор разбивается на два фрагмента для повышения эффективности этапов ПЦР, не вызывая существенных изменений в общем результате сборки.
14. Инкубируют главную смесь реакции сборки ДНК в термоциклере при 50 °C в течение 1 ч (если иное не указано в протоколе реагента сборки ДНК) и сохраняют реакцию при 4 °C для использования продукта реакции для бактериальной трансформации.
15. Настройте бактериальную трансформацию (химическую или электропорационную) с использованием компетентных клеток E. coli (Escherichia coli) и соответствующего протокола бактериальной трансформации. После трансформации используйте бактериальные агаровые пластины Лурия-Бертани (LB), содержащие выбранный маркер бактериального отбора (например, ампициллин), чтобы покрыть смесь трансформации. Инкубировать пластины при 37 °C в течение ^ночи44.
16. Проверьте тарелки на следующий день. Чтобы привить колонии, отбирают отдельные колонии из пластин и повторно суспендируют их в жидком бульоне LB с соответствующим маркером бактериального отбора в культуральных пробирках. Инкубировать в шейкерном инкубаторе при 37 °C, 300 об/мин в течение ночи.
17. Выполните протокол плазмидного препарата для извлечения плазмидной ДНК из бактериальной культуры.
18. Проверьте схему в два этапа. Во-первых, выполните тестовое пищеварение с использованием ферментов рестрикции в качестве грубой проверки, чтобы увидеть, был ли получен приблизительный плазмидный продукт. Во-вторых, если тестовое сбраживание пройдено/подтверждено, отправьте плазмиду в установку секвенирования Сэнгера (или процесс с использованием доступного оборудования) для получения точной последовательности ДНК, чтобы сравнить ее позже с ожидаемой последовательностью в программном обеспечении для проектирования.
    1. Чтобы выполнить тестовое пищеварение, выберите по крайней мере два фермента рестрикции, которые производят, по крайней мере, два фрагмента, на основе используемого программного обеспечения молекулярного клонирования. После того, как ферменты выбраны, подготовьте тестовые образцы, добавив 1 мкл каждого фермента, 5 мкл генерируемой ДНК и 13 мкл воды с соответствующими солями и буферами в зависимости от используемых ферментов. Инкубируют реакцию при 37 °C в течение 1 ч, или, как предлагает производитель фермента. Запустите тест продуктов пищеварения на 1% агарозном геле и определите, являются ли полосы правильными.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если полосы правильные, переходите к секвенированию.
    2. Для выполнения секвенирования генерируйте праймеры на основе ДНК, хранящейся в программном обеспечении, так что области отжига праймеров находятся на расстоянии около 500 bp (пары оснований) друг от друга и покрывают интересующий фрагмент (компонент генной цепи) или полную плазмиду. Разбавить праймеры чистой водой без нуклеазы (_NF-H2O) до концентрации 10 мМ. Подготовьте образцы секвенирования, добавив 1 мкл 10 нг/мкл ДНК, 1 мкл праймера и 8 мкл _NF-H2O в пробирку объемом 0,2 мл. Повторите это для каждой грунтовки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Когда образцы подготовлены, сдайте их на установку секвенирования и сравните результаты с последовательностью плазмид с помощью программного обеспечения для молекулярного клонирования.
19. На этом этапе генерируют приблизительно 100-1000 нг/мкл образца ДНК для интеграции плазмид, содержащих генные цепи, в соответствующую клеточную линию.

2. Проектирование стабильных клеточных линий

1. Закажите клеточную линию млекопитающих, предназначенную для быстрой генерации стабильных подлиний, которые обеспечивают высокоуровневую экспрессию интересующего белка из вектора экспрессии млекопитающих. Тип ячейки и простота проектирования клеточных линий могут варьироваться в зависимости от того, что пользователи предпочитают или стремятся достичь.
   1. Например, если пользователи предпочитают проектирование клеточных линий с минимальными промежуточными этапами, упорядочивайте клетки, содержащие один стабильный сайт интеграции (например, FRT), в транскрипционно активном геномном локусе. Если предпочтение отдается более тонкой клеточной инженерии, создайте сайты интеграции в предпочтительных местах с помощью инструментов генной инженерии, таких как CRISPR / Cas9.
2. Выращивайте клетки в 5% _CO2 в увлажненном воздухе при 37 °C. Отрегулируйте условия роста по мере необходимости для типа клеток.
3. Трансфектируйте генные цепи, разработанные выше, в желаемые клетки, полученные на предыдущих этапах, чтобы начать стабильный процесс генерации клеточной линии. Для этого используют липосомную ^смесь45 генной цепи ДНК с соответствующей рекомбиназой (например, Flp-рекомбиназы для рекомбинации Flp-FRT) или с помощью других методов, таких как электропорация.
4. Через два дня после трансфекции расщепляют клетки до 25% конфюляции.
5. Через шесть часов после расщепления клеток начинают отбор антибиотиков путем обмена среды на свежую среду, содержащую 50 мкг/мл антибиотика гигромицина (или другого антибиотического агента, соответствующего гену устойчивости к антибиотикам млекопитающих, выбранному во время плазмидного строительства).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество генов устойчивости млекопитающих к антибиотикам, используемых в построении генных цепей, каждый из которых имеет различную кривую уничтожения. Поэтому, какой бы ген устойчивости млекопитающих к антибиотикам ни был выбран для построения схемы, в интересующих клетках должна быть изучена правильная кривая уничтожения. Этот шаг гарантирует, что клетки, содержащие полезную нагрузку генной цепи, обогащены, в то время как клетки, не имеющие системы, будут убиты.
6. Дайте клеткам расти в средах отбора антибиотиков, переходите на свежие среды каждые 2-3 дня, пока пластина или колба не будет иметь несколько десятков очагов. Проходите адгезивные культуры, когда они находятся в фазе бревна, прежде чем они достигнут слияния.
7. Как только будет достаточно много очагов, трипсинизируют клетки 1 мл 0,25% трипсина, 0,1% ЭДТА в сбалансированном растворе соли Хэнка (HBSS) без кальция, магния и бикарбоната натрия в течение нескольких минут. Нейтрализируйте трипсин свежими средами и передайте все клетки в свежий контейнер.
8. Как только клетки в свежем контейнере станут на 80%-100% сливающимися, заморозьте их в смеси 45% старой среды, 45% свежей среды и 10% DMSO. Перенесите оставшиеся клетки в стерильную трубку и выполните одноклеточную сортировку для выделения моноклональных клеток в 96-луночную пластину.
9. Примерно через 2-3 недели после моноклональной сортировки скважины в пределах 96-луночной плиты должны иметь очаги. Когда примерно 50%-60% сливаются, расщепляют клетки на 12-луночную пластину.
10. Как только 12-луночная пластина станет на 80%-100% сливающейся, расщепленной на культуру ткани, обработанную колбой Т-25. Как только клетки в колбе Т-25 становятся на 80%-100% сливающимися, клетки замораживаются и сохраняют проход для характеристики и тестирования моноклональных клеточных линий.
    1. Охарактеризуйте моноклональные клеточные линии с помощью микроскопии и анализов проточной цитометрии, чтобы сообщить о профилях экспрессии генов на основе индуцированной продукции флуоресцентного репортера. Проверка функционального производства белка с помощью флуоресцентной маркировки антител и иммунофлуоресцентного анализа. Протестируйте индукцию экспрессии генов на транскрипционном уровне с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Проверка генетической последовательности и точности интеграции с помощью локального и полногеномного секвенирования клонов.

3. Индукционные анализы легких пластинчатых аппаратов

1. Построить LPA ^{устройство31,46} для использования для световой индукции инженерных ячеек. Короче говоря, несколько широких шагов имеют решающее значение для создания LPA для использования для контроля экспрессии генов. К ним относятся 3D-печать компонентов LPA-фрейма, конструкция печатной платы, программирование схемы с помощью программатора микроконтроллера, сборка компонентов в окончательный LPA, программирование карты памяти с помощью программного обеспечения IRIS и калибровка готового устройства. Для более подробного объяснения обратитесь к приведенным выше ссылкам.
   1. Печать 3D-деталей, как описано в Gerhardt et al. (2016 и 2019)^31,46.
   2. Соберите печатную плату, как описано в Gerhardt et al. (2016 и 2019)^31,46.
   3. Добавьте прошивку в собранную схему LPA с помощью программы микроконтроллера, как описано в Gerhardt et al. (2016 and 2019)^31,46.
   4. Объедините 3D-печатные детали и собранную печатную плату, как описано в Gerhardt et al. (2016 and 2019)^31,46. Это включает в себя монтажную пластину, печатную плату, прокладку светодиодов (светодиодов), адаптер пластины, пластинчатую пластину, 24-луночную пластину, крышку пластины, крепежные болты, а также гайки крыла и компоненты штабелирования, как показано на снятом видео и рисунке 2.
   5. Для программирования карты памяти и калибровки устройства выполните действия, описанные ниже.
2. Используйте программное обеспечение IRIS, доступное на веб-сайте Tabor ^Lab47 , чтобы запрограммировать SD-карту для устройства Light Plate (LPA)³¹ и изучить соответствующие условия освещения, необходимые для начала оптогенетического эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение IRIS представляет собой веб-приложение для программирования оптогенетического электронного оборудования, известное как LPA, разработанное Tabor Lab. Программное обеспечение позволяет программировать относительные значения IRIS, которые управляют отдельными светодиодами (светодиодами) в каждой скважине оборудования LPA.
3. Выберите раскрывающийся список LPA (4 x 6), а затем щелкните соответствующий подход к освещению (Steady-state, Dynamic, Advanced).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой рукописи все анализы будут сосредоточены на стационарных примерах. Тем не менее, расширенные примеры настройки могут быть использованы для длительности импульсов и режимов рабочего цикла.
4. Выберите, будут ли освещаться верхние или нижние светодиоды, введя значения в ячейки, соответствующие колодцам пластины. Для LPA, использованных в этой работе, во всех экспериментах использовались синие светодиоды, размещенные в верхнем положении. Каждый светодиод, однажды запрограммированный, может обеспечить непрерывное воздействие света с постоянной интенсивностью света. Программное обеспечение IRIS позволяет запрограммировать 4096 уровней интенсивности.
5. После выбора расположения светодиодов введите значения интенсивности для желаемого экспериментального контура. Например, введите 8 различных интенсивностей света (или длительности импульсов, или рабочих циклов) с тремя техническими репликами на пластину (таблица 2). G.s. относится к единицам оттенков серого - значениям измерения уровня интенсивности света, используемым для программирования LPA в программном обеспечении IRIS.
   1. При разработке экспериментальных файлов IRIS учитывайте краевые эффекты от соседних скважин на устройстве LPA, световую токсичность от увеличения интенсивности воздействия синего света и определение желаемого типа дозы-отклика (например, монотонный или немонотонный).
   2. Если пользователи программируют ячейки в LPA в порядке возрастания / убывания определенного параметра освещения (например, интенсивности), скважины могут производить краевые эффекты перекрестных помех света или даже тепла, которые могут влиять на соседние скважины. Это может непреднамеренно повлиять на результат измеренных результатов после завершения экспериментов. Чтобы облегчить эту проблему, пользователи могут реализовать матрицу рандомизации в программном обеспечении IRIS для скремблирования местоположений скважин, сводя к минимуму граничные эффекты. Пример описан в репрезентативных результатах ниже (рисунок 4A-B).
   3. Кроме того, было обнаружено, что более высокая интенсивность синего света препятствует клеточному росту и ^{жизнеспособности48}. Поэтому для смягчения световой токсичности важно создать кривую интенсивности света, длительности импульса или реакции рабочего цикла в зависимости от исследуемой модальности.
      1. Например, программа 8 значений интенсивности света с тремя репликами на 24-луночную пластину, с диапазоном от отсутствия света до максимальной интенсивности LPA. Затем запустите эти образцы на проточном цитометре с затвором SSC-FSC или живым пятном, таким как йодид пропидия, чтобы количественно оценить выживаемость популяционных клеток (живые клетки по сравнению с общими событиями, включая мертвые клетки / клеточный мусор) при каждом световом значении.
      2. Затем определите идеальную величину выживаемости популяции для экспериментальной установки, поскольку любой стимул может отрицательно повлиять на пролиферацию, экспрессию генов или выживаемость (например, установка 80% выживаемости клеток в качестве соответствующего компромисса). Например, в этой работе после калибровки интенсивность не превышала 3000 г.с. единиц (~3/4 максимальной интенсивности прибора LPA). Пример этого описан в репрезентативных результатах ниже.
   4. В дополнение к ограничению значений освещенности из-за токсичности пользователи могут пожелать ограничить значения света для характеристики конкретной части дозы-реакции, такой как диапазон монотонной реакции.
      1. Чтобы достичь этого, первоначально сканируйте широкий диапазон интенсивности света, длительности импульса или рабочих циклов в зависимости от модальности, анализируемой при определении желаемой дозы-ответа (таблица 2), чтобы сузить интересующий режим освещения, например, где экспрессия генов положительно коррелирует с увеличением значений света для монотонной дозы-ответа.
      2. Чтобы определить диапазон освещения, представляющий интерес, запрограммируйте один LPA с 24 скважинами различной интенсивности / длительности импульса / рабочим циклом / и т. Д. Или более скважинами (например, 48, 72, 96 и т. Д.) В зависимости от того, откалиброваны ли несколько LPA для получения эквивалентных количеств света и продолжения работы клеточной культуры или анализов, описанных ниже. Поэтому начинают характеристику оптогенетической системы с широким диапазоном доз световых раздражителей для определения диапазона интервала, дающего желаемую экспрессию гена, и впоследствии проводят эксперименты в этом уточненном диапазоне доз.
      3. Например, в этой работе однажды 3000 г.с. единиц определяли в качестве порога интенсивности токсичного света; этот порог использовался в качестве верхней границы света для анализов, описанных ниже (например, иммунофлуоресценция).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные выше этапы не зависят от оптической калибровки LPA и относятся к калибровке на молекулярном уровне для каждой оптогенной системы.
6. После того, как соответствующие значения интенсивности света запрограммированы в IRIS, вставьте карту памяти с розеткой USB 3.0 в LPA для загрузки и передачи файлов.
7. Если калибровка LPA ^{завершена31}, приступают к работе клеточной культуры для начала светоиндукционного анализа. Если калибровка не была выполнена, откалибруйте LPA с помощью метода анализа изображений (шаги 3.7.1-3.7.3) после программирования LPA с помощью программатора микроконтроллера.
   1. Кратко запрограммируйте LPA на тот же уровень IRIS, который описан Gerhardt et al. (2016)³¹.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для калибровки LPA был запрограммирован на значение 2000 г.с.
   2. После того, как устройство запрограммировано с помощью карты памяти и нажата кнопка сброса (физическая кнопка на LPA), получите изображение всего устройства (например, гелевого тепловизора станции, сканера и т. Д.). Для калибровки получите два изображения с устройством, повернутым на 180°.
   3. Затем используйте программное обеспечение с открытым исходным кодом, разработанное Gerhardt et al. (2016)³¹ , чтобы показать изменчивость интенсивности светодиодов на пластине LPA и рассчитать значения компенсации светодиодов, чтобы сделать интенсивность равной в скважинах. Пример этого описан в представленных ниже результатах (рисунок 3). Как только эта калибровка будет завершена, приступайте к работе клеточной культуры для начала анализа световой индукции.
8. Получите колбы сконструированных моноклональных клеток из предыдущего раздела, чтобы исследовать влияние световой индукции на экспрессию генов.
9. Извлеките старый носитель из колбы.
10. Добавьте в клетки 1 мл трипсина и инкубируйте в течение 5 мин.
11. Через 5 мин нейтрализуют трипсин, добавив 4 мл дульбекко-модифицированной среды Eagle's (DMEM или другой желаемой среды), дополненной необходимыми химическими веществами (в этой работе использовали 50 мкг/мл гигромицина, 1% раствор пенициллина/стрептомицина, 10% фетальную бычью сыворотку, FBS).
12. Добавьте ~75 000 ячеек на скважину в 24-луночную черную пластину общим объемом 500 мкл. Количество посеянных клеток может варьироваться в зависимости от продолжительности желаемого эксперимента и используемого типа клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, обратите внимание, что плотность посева клеток влияет на поддержание культуры и, возможно, на продолжительность эксперимента. Начиная с меньшего количества клеток в лунке, вы обеспечиваете более длительные промежутки времени, прежде чем культура достигнет слияния. Кроме того, тип оптогенетических компонентов, интегрированных в генные схемы, представляющие интерес, будет влиять на то, когда экспрессия генов достигнет устойчивого состояния и, следовательно, повлияет на продолжительность экспериментов. Другими факторами, которые могут быть рассмотрены, являются специфические для клеточной линии темпы роста, состав среды и условные эффекты роста (т. Е. Свет).
13. После покрытия поместите клетки в увлажненный инкубатор с 5% _CO2 , чтобы они осели в течение 2-6 ч.
14. После инкубации перенесите клетки в вытяжку для культивирования тканей, снимите пластиковую крышку и добавьте полоску клейкой фольги в верхнюю часть пластины (рисунок 2D). Этот шаг обеспечивает минимальный перенос света между скважинами, так как верхняя и боковые стороны скважин покрыты, и свет теперь может проникать только со дна скважины, где размещен светодиод.
15. Поместите пластину в установленные 3D-части LPA. Затем накройте пластину 3D-печатной крышкой LPA, которая прилегает к винтам устройства на каждом углу.
16. Подключите устройство к источнику питания и нажмите кнопку сброса на устройстве LPA, чтобы убедиться, что применены обновленные параметры эксперимента LPA.
17. Инкубируйте клетки в экспериментальной системе в течение соответствующего количества времени, в зависимости от исходной плотности посева, скорости роста клеточной линии и условий роста. В этом примере клеточные линии индуцировались в течение 3 дней непрерывно, чтобы экспрессия генов достигла устойчивого состояния. Однако следует отметить, что многие оптогенетические системы (например, VVD) могут достигать стационарной экспрессии генов гораздо раньше (например, 24 ч), и поэтому время экспериментальной индукции может быть уменьшено или продлено по мере необходимости.
18. В конце эксперимента по световой индукции используйте образцы для любого из следующих четырех анализов для характеристики инженерных клеточных линий (разделы 4-7).

4. Флуоресцентная микроскопия светоиндуцированных инженерных клеток

1. Через 24-72 ч после индукции удалите клетки LPA из инкубатора и поместите их в тканевую культуральную вытяжку.
2. Снимите полоску фольги и оставьте пластину на 1-2 мин. Это предотвращает образование конденсата на пластиковой крышке, если поместить ее сразу на пластину.
3. После 1-2 мин сидения положите оригинальную пластиковую крышку обратно на тарелку.
4. Визуализируйте клетки с помощью соответствующего фазового контраста или флуоресцентного микроскопа.
5. В зависимости от прибора отрегулируйте время экспозиции, интенсивность источника света и коэффициент усиления для отображения инженерных ячеек. В этом эксперименте применялись следующие параметры: 50 мс для времени воздействия источника света FITC/GFP (зеленый флуоресцентный белок) и 1-5 мс для фазово-контрастного воздействия при 100% интенсивности для каждого.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что оптимальное время экспозиции, уровни усиления и интенсивность источника света часто выводятся эмпирически из опыта этой работы, чтобы свести к минимуму перенасыщение в флуоресцентном репортере, свести к минимуму повреждение клеток и захватить адекватные изображения для качественного и количественного анализа. При определении уровней каждого из этих параметров следует иметь в виду максимизацию соотношения сигнал/шум, минимизацию фототоксичности, минимизацию перенасыщенности флуоресцентных сигналов и увеличение способности усиливать слабые флуоресцентные сигналы.
   1. Оптимизировать эти параметры грубо ad hoc; однако предыдущие экспериментальные значения (например, интенсивность источника света, вызывающая перенасыщение флуоресцентного репортера) могут направлять будущие экспериментальные установки, когда это применимо. Например, настройки усиления, время экспозиции и начальные значения интенсивности света из одной цепи (LITer1.0) или экспериментальной установки (например, интенсивность света) могут использоваться в качестве отправной точки при переходе к аналогичной, но отличной генной цепи (LITer2.0)¹¹ или другой модальности освещения (например, световой рабочий цикл).
6. Оптимизируйте визуализацию пластин с помощью шаблона координат, запрограммированного в программном обеспечении для микроскопии, позволяя всему размеру пластины (например, 24 скважины) автоматизировать получение изображений из нескольких мест изображения на скважину.

5. Проточная цитометрия светоиндуцированных инженерных клеток

1. Через 24-72 ч после индукции удаляют клетки из LPA в инкубаторе или из микроскопа после визуализации и помещают их в тканевую культуральную вытяжку.
2. Если вы удалены непосредственно из LPA, снимите полоску фольги и дайте пластине постоять минуту или две.
3. Аспирировать среду из каждой скважины (всей плиты из 24 скважин, если используются все скважины).
4. Добавьте 100 мкл 0,25% трипсина в каждую лунку, накройте пластину пластиковой крышкой и поместите ее обратно в инкубатор.
5. Оставьте клетки нетронутыми в инкубаторе на 5 минут.
6. Через 5 мин снимите пластину и верните ее в вытяжку для культивирования тканей.
7. Нейтрализуют каждый трипсинизированный хорошо 400 мкл ДМЭМ.
8. Маркировка 5 мл полистирольной трубки круглого дна с клеточным сетчатым фильтром (или соответствующей проточной цитометрической трубкой, которая может быть отфильтрована для удаления больших скоплений клеток, не полностью трипсинизированных) с именем, соответствующим каждой скважине.
9. Используйте пипетку P1000 для пипетки содержимого каждой скважины вверх и вниз 6-8 раз, чтобы разбить комки клеток и создать одноклеточные образцы для проточной цитометрии49.
10. Перенесите все содержимое каждой лунки (~500 мкл) в маркированные пробирки с помощью сетчатого фильтра.
11. Подведите клетки к соответствующему проточному цитометрическому прибору с помощью лазеров правильных длин волн (может привести трубки с клетками на лед или вне его).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проточный цитометр, используемый в этой работе, был частью основного объекта, расположенного в университетской больнице.
12. Создайте затвор прямого и бокового рассеяния (FSC и SSC соответственно) для захвата отдельных ячеек соответствующего размера и зернистости, чтобы исключить мусор и клеточные сгустки в программном обеспечении проточной цитометрии.
13. Как только ворота установлены, захватите около 10 000 ячеек с соответствующими воротами. Отрегулируйте это число в зависимости от объема сотовых данных, которые ищут пользователи. Повторите для каждой трубки, содержащей клетки из эксперимента.
14. После завершения эксперимента импортируйте данные в доступное программное обеспечение для анализа данных проточной цитометрии.
15. Создайте затвор FSC-SSC (как и раньше во время сбора) и примените его к каждой партии экспериментальных данных. Эталонный колодец неиндуцированной клеточной популяции используется для создания этих ворот в этой рукописи, но существуют и другие метрики для создания затворов, такие как затворы на основе плотности.
16. С экспериментальными условиями, закрытыми затвором FSC-SSC, выводите данные проточной цитометрии в виде гистограмм или представляют другими способами для иллюстрации полученных паттернов экспрессии. В этом эксперименте флуоресценция была захвачена каналами GFP/FITC или PE/TexasRed.

6. Экстракция РНК и количественная ПЦР компонентов генной цепи

1. Через 24-72 ч после индукции удаляют клетки из LPA в инкубаторе или из микроскопа после визуализации и помещают их в тканевую культуральную вытяжку.
2. Если пластина удалена непосредственно из LPA, снимите полоску фольги и дайте пластине постоять минуту или две.
3. Аспирировать среду из каждой скважины (всей плиты из 24 скважин, если используются все скважины).
4. Приступайте к извлечению РНК из клеток с помощью соответствующего набора для экстракции РНК.
5. Как только экстракция РНК будет завершена, выполните реакцию обратной транскрипции каждого образца (таблица 3).
6. Далее выполняют количественную ПЦР каждого образца (таблица 4). Используйте ДНК-полимеразу и связанный с ней протокол для создания реакций ПЦР. Для этого шага создайте мультиплексированную реакцию с геном ведения хозяйства и геном, представляющим интерес, или создайте отдельные реакции. В этом примере были исследованы уровни GFP, KRAS и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH). После завершения эксперимента qRT-PCR приступайте к анализу с помощью доступного программного обеспечения, чтобы проиллюстрировать изменение складки генной цепи на уровне РНК.

7. Иммунофлуоресценция компонентов генной цепи

1. Используйте ледяную ванну или морозильную камеру для охлаждения метанола.
2. Через 24-72 ч после индукции удаляют клетки из LPA в инкубаторе или из микроскопа после визуализации и помещают их в тканевую культуральную вытяжку.
3. Если пластина удалена непосредственно из LPA, снимите полоску фольги и оставьте пластину на 1-2 мин.
4. Аспирировать среду из каждой скважины (всей плиты из 24 скважин, если используются все скважины).
5. Добавьте 100 мкл 0,25% трипсина в каждую лунку, накройте пластину пластиковой крышкой и поместите ее обратно в инкубатор.
6. Оставьте клетки нетронутыми в инкубаторе на 5 минут.
7. Через 5 мин снимите пластину и верните ее в вытяжку для культивирования тканей.
8. Нейтрализуют каждый трипсинизированный хорошо 400 мкл ДМЭМ.
9. Маркировка мини-центрифужных трубок с названиями, соответствующими каждой скважине.
10. Используйте пипетку P1000 и пипетку, содержимое каждой лунки вверх и вниз 6-8 раз, чтобы сломать комки клеток.
11. Перенесите все содержимое каждой лунки (~500 мкл) в маркированные пробирки.
12. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 400 х г.
13. По завершении выбросьте супернатант и переместите образцы в химический вытяжной шкаф.
14. Повторно суспендируют клетки (используйте пипетку P1000 и пипетку вверх и вниз 6-8 раз в каждой пробирке, чтобы разрушить сгустки клеток) в 750-1000 мкл 4% параформальдегида (разбавленного в фосфатно-буферном физиологическом растворе, PBS).
15. Дайте ячейкам постоять в течение 15 минут при комнатной температуре.
16. После инкубации добавляют 750-1000 мкл PBS. Пипетка вверх и вниз несколько раз.
17. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 400 х г.
18. По завершении выбросьте супернатант и переместите образцы в химический вытяжной шкаф.
19. Повторно суспендируйте клетки (используйте пипетку P1000 и пипетку вверх и вниз 6-8 раз в каждой трубке, чтобы разрушить сгустки клеток) в 750-1000 мкл ледяного метанола.
20. Дайте ячейкам постоять в течение 30 минут на льду или в морозильной камере при температуре -20 °C.
21. После инкубации добавляют 750-1000 мкл PBS. Пипетка вверх и вниз несколько раз.
22. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 400 х г.
23. По завершении выбросьте супернатант и переместите образцы в химический вытяжной шкаф.
24. В зависимости от типа используемых антител, модифицируйте протокол с этого момента. Выполните шаги 7.24.1-7.24.14 или 7.24.15-7.24.22.
    1. При использовании первичного и вторичного антитела повторно суспендируйте клетки с помощью пипетки P1000/P200 и пипетки вверх и вниз 6-8 раз в каждой пробирке, чтобы разрушить сгустки клеток в 100 мкл первичного антитела. В этом случае производили разведение 1:800 для стоковых антител, включая антитела KRAS или антитела ERK, и давали сидеть в течение 1 ч при комнатной температуре. Антитела разбавляли в инкубационном буфере, изготовленном из 1x PBS с 0,5 г BSA.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Определите точное разведение антитела эмпирически, создав стандартную кривую разведения антител по отношению к интересующему антигену.
    2. После добавления антител накройте трубки фольгой, чтобы предотвратить световое воздействие на меченые антитела.
    3. После инкубации добавляют 750-1000 мкл инкубационного буфера. Пипетка вверх и вниз несколько раз.
    4. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 400 х г.
    5. По завершении выбросьте супернатант и переместите образцы в химический вытяжной шкаф.
    6. Повторно суспендируйте клетки с помощью пипетки P1000/P200 и пипетки вверх и вниз 6-8 раз в каждой трубке, чтобы разрушить сгустки клеток в 100 мкл вторичного антитела. В этом случае клетки повторно суспендировали в 100 мкл вторичного антитела в разведении 1:800 для антител KRAS или 1:2000 для антитела ERK и давали посидеть в течение 30 мин при комнатной температуре. Подобно первичным антителам, разбавляют вторичные антитела в инкубационном буфере, как описано выше. Определить разбавления вторичных антител на основе эмпирических данных стандартной кривой.
    7. После добавления антител накройте трубки фольгой, чтобы предотвратить световое воздействие на меченые антитела.
    8. После инкубации добавляют 750-1000 мкл инкубационного буфера. Пипетка вверх и вниз несколько раз.
    9. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 400 х г.
    10. По завершении выбросьте супернатант и переместите образцы в химический вытяжной шкаф.
    11. Повторно суспендируйте клетки с помощью пипетки P1000 и пипетки вверх и вниз 6-8 раз в каждой трубке, чтобы сломать сгустки клеток в 500 мкл PBS.
    12. Перенесите все содержимое каждой трубки (~500 мкл) на маркированные пробирки с сетчатыми фильтрами.
    13. Доведите клетки до соответствующих инструментов проточной цитометрии с помощью лазеров правильных длин волн (можете привести трубки с клетками на лед или вне его).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что наличие нескольких контрольных элементов важно для прогресса с измерением проточной цитометрии и анализом экспрессии генов инженерных клеток. Например, наличие совершенно неокрашенных клеток, клеток, окрашенных только первичным антителом, и клеток, окрашенных только вторичным антителом, может быть полезно для сравнения результатов с фоновыми сигналами от антител.
    14. Затем приступайте к анализу, как описано в разделе 5.
    15. При использовании только первичного антитела повторно суспендируйте клетки с помощью пипетки P1000/P200 и пипетки вверх и вниз 6-8 раз в каждой пробирке, чтобы разрушить сгустки клеток в 100 мкл меченого первичного антитела. Определяют соответствующее разведение антител и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Определяют разведение антител по стандартной кривой эмпирически.
    16. После добавления антител накройте трубки фольгой, чтобы предотвратить световое воздействие на меченые антитела.
    17. После инкубации добавляют 750-1000 мкл инкубационного буфера. Пипетка вверх и вниз несколько раз.
    18. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 400 х г.
    19. Повторно суспендируйте клетки с помощью пипетки P1000 и пипетки вверх и вниз 6-8 раз в каждой трубке, чтобы сломать сгустки клеток в 500 мкл PBS.
    20. Перенесите все содержимое каждой трубки (~500 мкл) в маркированные пробирки с сетчатыми фильтрами.
    21. Доведите клетки до соответствующих инструментов проточной цитометрии с помощью лазеров правильных длин волн (можете привести трубки с клетками на лед или вне его).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что наличие нескольких контрольных элементов важно для прогресса с измерением проточной цитометрии и анализом экспрессии генов инженерных клеток. Наличие совершенно неокрашенных клеток и клеток, окрашенных только первичными антителами, полезно для сравнения результатов с фоновыми сигналами от антител.
    22. С этого момента приступайте к анализу, как описано в разделе 5.

Representative Results

Сборка генной цепи и генерация стабильной клеточной линии в рамках этой статьи были основаны на коммерческих, модифицированных клетках HEK-293, содержащих транскрипционно активный, один стабильный сайт FRT (рисунок 1). Генные цепи были построены в векторы, которые имели участки FRT внутри плазмиды, что позволило интегрировать Flp-FRT в геном клетки HEK-293. Этот подход не ограничивается клетками Flp-In, так как участки FRT могут быть добавлены к любой интересующей клеточной линии в любом месте генома с использованием технологии редактирования ДНК, такой как CRISPR / ^Cas950.

После того, как соответствующие клеточные линии были построены и проверены для правильной вставки, программное обеспечение LPA и IRIS было выбрано в качестве стандартизированного протокола для легкой индукции экспрессии ^{генов31,51}. Система LPA позволяет программировать 24 скважины для индукции клеток млекопитающих в нескольких экспериментальных условиях в зависимости от интенсивности света, длительности импульса и рабочего цикла (рисунок 2). В рамках этой статьи приоритеты были отданы пространственно равномерной интенсивности света, длительности импульса и рабочему циклу. Тем не менее, исследователи могут использовать программное обеспечение IRIS и LPA для более продвинутого программирования временных световых волн.

Важным аспектом LPA, который необходимо рассмотреть перед началом экспериментов, является оптическая калибровка, которая может быть выполнена для одного или нескольких устройств. Ранее описанный метод анализа ^{изображений31} , используемый для калибровки, требует изображения всего LPA с включенными всеми интересующими светодиодами, которые могут быть получены из различных ^{источников52}, включая гель-тепловизор. Здесь для получения изображений использовался компьютерный сканер (рисунок 3А). После получения изображения программное обеспечение с открытым исходным кодом, созданное Gerhardt et al. (2016)³¹ , использовалось для расчета значений компенсации для каждого светодиода, чтобы гарантировать, что каждый LPA излучает одинаковую интенсивность при заданном значении оттенков серого. Программное обеспечение вычитает фоновый сигнал, помещает изображение в двоичную категорию и вычисляет интенсивность пикселей (рисунок 3B). В результате калибровки было обнаружено минимальное изменение между светодиодами, с CV 0,04 между 96 скважинами (или 4 откалиброванными пластинами, рисунок 3C). Наконец, используя программное обеспечение для калибровки, продемонстрировали изменение светодиода по местоположению (рисунок 3D) и создали настройку оттенков серого (рисунок 3E), чтобы каждый светодиод был нормализован с одинаковой интенсивностью.

В дополнение к калибровке, другие важные аспекты использования LPA включают интеграцию нескольких элементов управления в экспериментальном конвейере, которые могут минимизировать системные ошибки, ограничивая смешанные переменные, такие как светотоксичные эффекты и конструктивные ограничения на основе экспериментальных материалов. Например, на рисунке 4 показаны две различные конфигурации для программирования различной интенсивности света в скважинах LPA. Первая подгруппа на рисунке 4А показывает восходящую организацию интенсивности света. Это может облегчить программирование и анализ данных, но может привести к краевым эффектам, когда нижний ряд LPA имеет самую высокую интенсивность света и потенциально может вызвать нежелательную тепловую и световую индукцию близлежащих скважин. Аналогичным образом, во второй подпанели рисунка 4A к программному обеспечению IRIS была применена матрица рандомизации, создающая различные интенсивности света в случайных положениях. Это может свести к минимуму системное влияние краевых эффектов. С помощью программного обеспечения IRIS создается дескремблированная матрица (рисунок 4B), которая затем может быть использована для определения экспериментальных условий после завершения эксперимента и во время анализа. Подобно рандомизации скважин, пользователи также должны знать о влиянии световой токсичности, которое может возникнуть (синий свет в рамках этой работы). На рисунке 4C показаны две различные интенсивности света, используемые для индукции генной цепи, с одним и тем же затвором FSC-SSC на основе неиндуцированной популяции инженерных клеток. Таким образом, пользователи должны выполнить дозу-реакцию на интересующую модальность освещения (например, импульс, рабочий цикл и т.д.) для определения воздействия световой токсичности, которое может возникнуть в верхней части экспозиции (рисунок 4D). Здесь повышение уровня синего света вызывало дозозависимый клеточный мусор, мертвые клетки и сгустки по сравнению с нестимулированными клетками. Таким образом, непрерывная интенсивность света была ограничена примерно 3/4 максимальной интенсивности LPA (~ 3000 г.с. единиц).

Как только было установлено надлежащее оборудование, экспрессия генов была индуцирована в инженерных генных схемах LITer с помощью флуоресцентной микроскопии (рисунок 5). Клетки индуцировались при различной длительности светового импульса на LPA, что давало легкую дозу-ответ экспрессии генов на популяционном уровне. Клетки в рамках этой работы были визуализированы для экспрессии GFP с использованием 50 мс для времени экспозиции источника света FITC / GFP и для визуализации яркого поля с использованием 1-5 мс для фазово-контрастного времени экспозиции. Учитывая надежность этого протокола клеточной линейной инженерии, вместо GFP можно использовать любой флуоресцентный маркер. Клетки могут быть индуцированы несколькими световыми режимами и производить большой диапазон ответов (рисунок 5). Последний полезен для дальнейшего контроля экспрессии функциональных генов (например, онкогена KRAS (G12V) в исходной ^{работе53}).

Сразу после флуоресцентной микроскопии клетки могут быть проанализированы в различных экспериментальных протоколах, включая проточную цитометрию, qRT-PCR и иммунофлуоресценцию. В этой работе проточная цитометрия была выполнена в качестве первой процедуры валидации и проводилась в соответствии с методами, описанными выше (рисунок 6). Подобно микроскопии, клетки были индуцированы при различных значениях длины импульса и показали дозу-реакцию экспрессии генов более чем четырехкратного изменения от неиндуцированных состояний на уровне популяции (рисунок 6A-B). Аналогичным образом, снижение шума экспрессии генов может быть показано путем сравнения различных значений интенсивности света (рисунок 6C-D) для системы LITer с системой положительной регуляции (без обратной связи), такой как VVD / ^LightOn54. При сравнении LITer с системой VVD отрицательная обратная связь достигает более чем пятикратного снижения шума экспрессии генов. Те же предварительно индуцированные клетки, изображенные на микроскопии, также могут быть проанализированы с помощью qRT-PCR (рисунок 7). Подобно проточной цитометрии, сконструированные клетки LITer могут экспрессировать уровни РНК дозочувствительным способом (более 10-кратной индукции из неиндуцированных состояний), что соответствует дозе-ответу уровней белка, количественно определяемых экспрессией GFP на проточной цитометрии. Упомянутые данные флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии могут быть откалиброваны с использованием нефлуоресцентных клеток, конститутивно экспрессирующих флуоресцентные ячейки, и флуоресцентных 6-8-пиковых валидационных шариков (например, FL1-канальные зеленые, флуоресцентные шарики). Каждый из этих компонентов может позволить нормализовать экспрессию генов в одном эксперименте. Тем не менее, эти факторы также могут позволить нормализовать схемы и инженерные клетки на различных экспериментальных пластинах, экспериментальных условиях и днях, чтобы обеспечить сравнение и стандартизацию данных экспрессии генов.

Наконец, генные схемы LITer могут быть спроектированы для экспрессии функциональных генов, таких как KRAS (G12V, рисунок 8). Универсальность этого конвейера позволяет пользователям использовать архитектуру LITer с клеточной инженерией для любого функционального гена, представляющего интерес, возможно, включая дополнительные архитектуры, такие как положительная обратная связь. LITer показал увеличение количества синего света, что привело к повышению уровня выхода генной цепи (уровни белка KRAS (G12V)) и, следовательно, уровни фосфорилированного ERK, оба из которых могут быть количественно определены с помощью иммунофлуоресцентных анализов.

Фрагмент	Пропорция	Размер (bp)	Массовая концентрация фрагмента ДНК (нг/мкл)	Молярная концентрация фрагмента ДНК (фмоль/мкл)	Объем (мкл)	Результирующая молярная масса ДНК (фмол)
Материнский вектор фрагмент 1	1	3414.00	18.20	8.63	4.09	35.29
Материнский вектор фрагмент 2	1	4642.00	18.10	6.31	5.59	35.29
Ген интереса	1	549.00	37.90	111.70	0.32	35.29
Итог					10.00	105.87

Таблица 1: Расчет мастер-смеси реакции сборки ДНК (этап 1.13). Колонки 2 и 3 основаны на размере собранных фрагментов ДНК и концентрации этих фрагментов после амплификации ПЦР и экстракции агарозного геля (этап 1.11). Нижняя ячейка ^4-й колонны (общий реакционный объем) может быть модифицирована; однако рекомендуется использовать указанный объем. Незатененные ячейки генерируются автоматически.

0	100	200	400	500	750
1500	3000	0	100	200	400
500	750	1500	3000	0	100
200	400	500	750	1500	3000

Таблица 2: IRIS-программирование интенсивности света (г.с.) для эксперимента по индукции света в 24-луночной пластине с тремя репликами (этап 3.4). Распределение интенсивностей света в диапазоне от 0 до 3000 г.с. G.s.-единицы оттенков серого. Это может быть рандомизировано программным обеспечением IRIS по мере необходимости.

	Пример 1	Пример 2	Пример 3
Объем мастер-микса обратной транскриптазы (мкл)	4.00	4.00	4.00
Объем шаблона РНК (1000 нг) (мкл)	2.00	3.00	4.00
Объем NF-H20 (мкл)	14.00	13.00	12.00
Общий объем (мкл)	20.00	20.00	20.00

Таблица 3: Расчет мастер-микса обратной транскрипции (этап 6.5). Рекомендуемый общий объем реакции составляет 20 мкл, а ее компонентами являются мастер-смесь ферментов обратной транскриптазы (здесь: 5x), шаблон РНК и вода без нуклеазы. В этом примере концентрации РНК образцов 1, 2 и 3 составляют 500, 333 и 250 нг/мкл соответственно.

	Пример 1	Пример 2	Образец 1 и 2 Мультиплексированный
Объем датчика GFP (мкл)	1	-----	1
Объем зонда GAPDH (мкл)	------	1	1
Объем ДНК-полимеразы Master Mix (мкл)	10	10	10
Объем кДНК (100 нг) (мкл)	2	2	2
Объем NF-H20 (мкл)	7	7	7
Общий объем (мкл)	20	20	20

Таблица 4: Количественный расчет мастер-микса ПЦР (этап 6.6). Рекомендуемый общий объем реакции составляет 20 мкл, а ее компонентами являются мастер-смесь ферментов ДНК-полимеразы (здесь: 2x), зонды GFP и / или GAPDH, кДНК (всего 100 нг) и вода без нуклеазы (_NF-H20).

Рисунок 1: Проектирование схем и проектирование ячеек. (A) Инструменты клеточной инженерии, включая синтетическую генную схему LITer с сайтами интеграции FRT, фермент рекомбиназы (Flp recombinaase) для интеграции схем, препарат, используемый для выбора соответствующих генетических клонов, и интересующую клеточную линию, используемую для создания желаемых оптогенетических клеточных линий млекопитающих. (B) Инженерные генетические системы могут быть интегрированы в конкретный FRT-сайт, содержащий локус в геноме человека. Эти геномные локусы могут затем экспрессировать специфическую устойчивость к антибиотикам или флуоресцентные репортерные гены для отбора правильно интегрированных генетических кассет. Интеграция генных цепей может быть инициирована с использованием рекомбиназ, которые распознают определенные участки в исходной генетической кассете. Это вводит новый ген селекции лекарственной устойчивости, который может обеспечить генерацию правильно спроектированных клеток с желаемой генной схемой. В нижней части панели B находится архитектура генной цепи для оптогенетической системы отрицательной обратной связи LITer2.0. Эта схема состоит из саморепрессирующегося белка TetR, слитого с легко-кислородно-чувствительным к напряжению доменом (LOV2), линкерной последовательностью P2A, которая обеспечивает мультицистронный транскрипт, и GFP. Когда применяется синий свет, последовательность TIP открывается из домена LOV2, ингибируя белок TetR и позволяя увеличить, дозочувствительную транскрипцию как TetR, так и репортера GFP. Ингибированный белок TetR не способен связываться и подавляться на операторском участке ДНК, тем самым увеличивая транскрипцию. Эта отрицательная обратная связь удерживает шум экспрессии генов на низком уровне и позволяет высокократно изменить экспрессию генов. FRT - мишень для распознавания флипов, HygR - устойчивость к гигромицину, LacZ - β-галактозидазы, ZeoR - резистентность к зеоцину, T - TetR, белок-репрессор тетрациклина, D2ir - промотор на основе ЦМВ с сайтами TwtO, LOV2 - это домен, чувствительный к напряжению света кислорода, TIP - ингибирующий тет-ингибирующий пептид, который ингибирует белок TetR. Эта цифра была изменена с Guinn and Balázsi (2020)⁵⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Экспериментальное программирование LPA. (A) Эксперименты могут быть запрограммированы с использованием инструментов, перечисленных на веб-сайте лаборатории ^Tabor47 с гибкостью для стационарного, динамического или расширенного программирования ^LPA31. Кроме того, электронные файлы могут быть сохранены для будущего использования для технических реплик или экспериментальной индукции альтернативных клеточных линий. (B) Устройство LPA с основными компонентами, просматриваемыми сверху и сбоку (C). (D) Изображения фольгированных пластин для размещения на LPA. LPA - световой пластинчатый аппарат, LED - светодиод. Элементы этого рисунка были изменены с Guinn (2019)¹¹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Калибровка аппарата световой пластины. (A) Репрезентативное изображение LPA для светодиодов, установленных на 2000 г.с. на основе программного обеспечения IRIS. (B) Изображение с панели (A) с вычитанием фона и порогом, используемым для бинаризации изображения для расчета интенсивности пикселей каждого светодиода. (C) Гистограмма интенсивности пикселей (определяемая анализом изображений MATLAB) 96 светодиодов (4 пластины LPA), установленных на одно и то же программное значение IRIS (например, 2000 г.с.). Красная линия представляет среднюю интенсивность пикселей светодиода, а CV на панели представляет коэффициент изменения для 96 скважин. (D) Тепловая карта, показывающая интенсивность светодиодного изображения LPA на панели (A), нормализованная до максимальной интенсивности светодиода. (E) Тепловая карта калибровочного значения, определенная для изображения LPA на панели (A), для создания равной интенсивности производства для каждого светодиода при программировании для LPA. LPA - световой аппарат, LED - светодиод, CV - коэффициент вариации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Рандомизация эффектов LPA и световой токсичности. (A) Репрезентативное изображение двух программируемых конфигураций светодиодов LPA, установленных от 25 до 4000 г.с, на основе программного обеспечения IRIS. Первая конфигурация с большей вероятностью допускает систематические ошибки, такие как краевые эффекты тепла и света ,например, нижний ряд LPA, влияющий на ^{2-й нижний} ряд). Второе изображение рандомизирует местоположение интенсивностей, тем самым сводя к минимуму систематические ошибки (смещения), вызванные краевыми эффектами. (B) Матрица, показывающая рандомизированное местоположение для интенсивности света в LPA, показанном на панели (A), которая может быть использована для определения зависящих от интенсивности результатов данного эксперимента. (C) Данные проточной цитометрии для двух различных интенсивностей света (1250 и 4000 г.с.) в течение 3 дней индукции при непрерывном освещении. Черные ворота основаны на неиндуцированных клетках. (D) Гистограмма, показывающая данные проточной цитометрии, такие как панель (C), но для широкого диапазона интенсивности света. LPA - Light Plate Apparatus, FSC - прямое рассеяние, SSC - боковое рассеяние, g.s. - значение интенсивности света, измеренное в оттенках серого. Клетки ^LITer11 имели дозочувствительное снижение выживаемости клеток, которое было статистически значимым с использованием теста ANOVA 1 с p-значением 0,0022. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Репрезентативная микроскопия изображений инженерных оптогенетических клеточных линий. Клетки были изображены на инвертированном микроскопе с камерой (14-битной) для получения фазового контраста и флуоресцентной визуализации. Ячейки подвергались воздействию в течение 5 мс для фазового контраста (панель A, репрезентативное изображение яркого поля) и 50 мс для получения GFP/FITC (панель B) при 100% интенсивности источника света. Клетки могут быть визуализированы в различные моменты времени в зависимости от желаемого стационарного получения или динамического отклика, что приводит к устойчивому состоянию. Клетки здесь представляют собой титрование длительности импульса с фиксированной интенсивностью (1000 г.с.) в диапазоне от отсутствия светового воздействия до 3 дней воздействия света. Единица измерения g.s представляет собой значение интенсивности света, измеренное в оттенках серого. Этот показатель был изменен с Guinn (2019)¹¹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Проточная цитометрия инженерных оптогенетических клеточных линий. Клетки были проанализированы на проточном цитометре BD LSRFortessa, в котором было собрано около 10 000 клеток в затворе SSC-FSC (боковое рассеяние-прямое рассеяние). Затем клетки были проанализированы с помощью программного обеспечения FCS Express. Гистограмма или точечные графики могут быть сгенерированы для количественной оценки экспрессии интересующего гена (например, GFP). (A) Инженерные ячейки, нанесенные на оси SSC-FSC для захвата в пределах черной линии. (B) Репрезентативные клетки LITer, индуцированные с различной продолжительностью световых импульсов при 1000 г.с. до 72 ч индукции, иллюстрирующие дозу-реакцию экспрессии генов. (C) Репрезентативные данные о соотношении доза-реакция для титрования интенсивности света, сравнивающие генную схему LITer (система на основе TIP) с системой VVD или ^LightOn40, которая представляет собой систему положительной регуляции без обратной связи. (D) Гистограмма, соответствующая системе VVD, иллюстрирующая более широкое распространение (и, следовательно, более высокий шум экспрессии генов) по сравнению с системой LITer. CV — коэффициент вариации, метрика шума экспрессии генов. FSC - прямое рассеяние, SSC - боковое рассеяние, FITC - флуоресцеин изотиоцианат, g.s. - значение интенсивности света, измеренное в оттенках серого. Этот показатель был изменен с Guinn (2019)¹¹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Количественная ПЦР в реальном времени инженерных оптогенетических клеточных линий. Репрезентативные данные, показывающие, что несколько уровней экспрессии генов могут быть индуцированы и количественно определены с использованием света в качестве стимула. Единица Rq представляет собой относительную количественную оценку изменения выражений fold-change по сравнению с контролем. Клетки ^LITer11 имели дозочувствительное увеличение экспрессии РНК, которое было статистически значимым с использованием ANOVA 1-хвостового теста с p-значением 0,0352 и 0,0477 для уровней GFP и KRAS соответственно. Этот показатель был изменен с Guinn (2019)¹¹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Иммунофлуоресценция инженерных оптогенетических клеточных линий. Репрезентативные данные, показывающие оценки уровня белка, основанные на иммунофлуоресценции. (A) Уровни белка KRAS(G12V) и (B) белковые уровни фосфорилированного ERK, которые генная схема LITer индуцирует в соответствии с увеличением количества света прямо или косвенно, соответственно. Данные, отображаемые в барах, являются средними значениями, полосы ошибок - стандартным отклонением (n = 3). A.u. - произвольные единицы, g.s. - значение интенсивности света, измеренное в оттенках серого. Клетки ^LITer11 имели дозочувствительное увеличение уровней белка, которое было статистически значимым с использованием ANOVA 1-хвостового теста с p-значением 2,79E-04 и 0,016 для уровней KRAS и фосфорилированного ERK соответственно. Этот показатель был изменен с Guinn (2019)¹¹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Читатели этой статьи могут получить представление о шагах, жизненно важных для характеристики оптогенетических генных цепей (а также других систем экспрессии генов), включая 1) проектирование, построение и валидацию генных схем; 2) клеточная инженерия для введения генных цепей в стабильные клеточные линии (например, рекомбинация Flp-FRT); 3) индукция инженерных ячеек с помощью световой платформы типа LPA; 4) начальная характеристика световых индукционных анализов с помощью флуоресцентной микроскопии; и 5) окончательная характеристика экспрессии генов с помощью различных анализов, включая проточную цитометрию, количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) или иммунофлуоресцентные анализы.

Кроме того, методы, описанные выше, являются высокомодульными для практически любой архитектуры генной цепи, экспрессирующей интересующие гены, с основными потенциальными модификациями протокола на этапе построения схемы и проведенными анализами. В случае построения генной цепи гибкость молекулярного клонирования позволяет обмениваться или совместно экспрессировать любой интересующий ген с помощью флуоресцентного маркера с незначительными изменениями в протоколах проектирования или сборки праймеров. Кроме того, в то время как процедуры, описанные здесь, сосредоточены в основном на проектировании генной схемы NF для точного (малошумного) контроля экспрессии генов, другие архитектуры, такие как положительная регуляция или положительная обратная связь (PF), могут быть реализованы для достижения различных функций, таких как высокое изменение или шум высокой экспрессии генов, ^{соответственно56,57} . Использование различных архитектур генных цепей (например, PF, NF и т. Д.) Может позволить исследователям исследовать различные биологические вопросы, такие как роль величин уровня белка и шума в лекарственной устойчивости или метастазировании58. Протоколы, перечисленные здесь, также сосредоточены на различных способах количественной оценки экспрессии генов, но любое количество функциональных анализов (например, подвижность клеток, заживление ран, пролиферация и т. Д.) Может быть добавлено после получения микроскопии практически без влияния на предыдущие методы. Это особенно актуально для одноклеточных исследований, где оптогенетика может использовать пространственно-временную индукцию для изучения поведения, такого как динамика пульсирующей ^{экспрессии59}.

Дополняя модульность метода, устранение неполадок является еще одной важной особенностью каждого основного протокола. Для построения схем основные различия заключаются в соответствующей конструкции праймера для конкретной схемы, в то время как более поздние методы, такие как сборка и амплификация плазмид путем роста бактерий, более стандартизированы и обычно включают в себя собственные обширные процедуры устранения неполадок. Клеточная инженерия может быть модифицирована с помощью кривых титрования лекарственного средства в зависимости от используемой клеточной линии. Кроме того, если используется коммерческая клеточная линия, руководства по поиску и устранению неисправностей можно получить непосредственно у производителя клеточной линии. Кроме того, непреднамеренные световые эффекты важны для количественной оценки на инженерных клеточных линиях. Например, из-за фототоксических эффектов света 470 нм должна быть создана кривая интенсивности света для исследования индукции смерти или повреждения в популяции. После тестирования различных значений освещенности пользователи могут создать затвор FSC-SSC или использовать такой метод, как окрашивание йодида пропидия, для количественной оценки мертвых / поврежденных клеток и, следовательно, служить инструментом для определения соответствующих световых диапазонов для экспериментального использования.

Для устранения неполадок LPA светодиоды могут создавать краевые эффекты перекрестных помех света и тепла с соседними колодцами. Например, скважины высокой интенсивности могут вызвать некоторую индукцию в соседних скважинах, если между скважинами имеется неправильное уплотнение или большой градиент тепла/света. Эти эффекты могут быть максимальными, если LPA запрограммирован в определенном порядке (например, по возрастанию/убыванию) светового параметра. Чтобы бороться с этим, программное обеспечение IRIS позволяет пользователям использовать матрицу рандомизации для рандомизации интенсивности скважины и, следовательно, снижения систематической ошибки. Для устранения неполадок аспектов флуоресцентной микроскопии основными параметрами, которые можно регулировать, время экспозиции, настройки усиления (управление чувствительностью камеры) и интенсивность источника света. Настройка этих параметров может обеспечить оптимальное получение изображения и идеальное соотношение сигнал/шум, а также избежать перенасыщения и фототоксичности.

Для устранения неполадок проточной цитометрии основными аспектами, которые можно регулировать, являются напряжения фотоумножителя трубки и клеточный затвор. Настройка этих параметров может обеспечить идеальное сравнение между экспериментальными условиями и контрольными образцами, правильное получение сигналов как для слабых, так и для сильных флуоресцентных сигналов и исключение клеточного мусора или нежелательных клеточных популяций. Следует отметить, что напряжения проточной цитометрии идеально поддерживаются постоянными во всех экспериментах, чтобы обеспечить надлежащее сравнение. Кроме того, для оптогенетических систем, требующих нескольких флуоресцентных выходов (например, FITC и PE), пользователи должны быть осведомлены о компенсации флуоресценции с учетом перекрестных помех между флуорофорами. В таких сценариях элементы управления имеют решающее значение для определения надлежащих флуоресцентных сигналов. Элементы управления, которые будут необходимы пользователям для выполнения, включают флуоресцентные шарики, окрашенные клетки с маркером, представляющим интерес, или клетки, конститутивно экспрессирующие белок флуоресценции, который может быть использован для создания компенсационной матрицы в интересующем программном обеспечении проточной цитометрии. Кроме того, независимо от того, используется ли один флуоресцентный маркер или несколько, все пользователи должны регулярно измерять флуоресцентные сигналы каждого маркера для нефлуоресцентных ячеек, которые дают автофлуоресцентные / фоновые сигналы. Устранение неполадок qRT-PCR включает в себя различные количества кДНК и конструкцию зонда, которые часто зависят от проекта. Наконец, для устранения неполадок иммунофлуоресценции концентрации антител являются самой большой переменной для количественной оценки анализа, что требует определения оптимальной концентрации.

Одним из аспектов устранения неполадок, который имеет отношение к большинству вышеуказанных методов, является эффект изоляции от использования герметичной пластины с ячейками, покрытыми фольгой. Этот метод может препятствовать газообмену углекислого газа, необходимому для правильного роста различных клеточных линий. Из предыдущего экспериментального опыта, это не было значительным препятствием для клеточного роста для 3-5-дневного эксперимента с использованием инженерных клеточных линий в этой рукописи, но может стать важным для других клеточных линий или экспериментальных длительностей. Чтобы решить эту проблему, одна адаптация, реализованная с герметичными пластинами, включает использование независимых от углекислого газа сред, которые не повлияли на рост клеток, используемых в этом исследовании. Следует отметить, что для других анализов или клеточных линий, где важен метаболизм, уровни pH и плотность клеток, могут потребоваться другие вмешательства, такие как более частое изменение среды или питательных веществ.

Пределы методов, описанных здесь, находятся в используемой генной схеме, точности оптогенетической технологии и интерфейсе LPA с другим оборудованием, таким как флуоресцентные микроскопы. Технология, описанная здесь, доступна, быстра в создании и проста в ^{проверке46} для популяций оптогенетически спроектированных клеток. Тем не менее, существуют определенные пространственные ограничения, такие как неспособность управлять отдельными клетками без модификаций установки индукции света, таких как использование цифровых зеркальных устройств (DMD), с недавно продемонстрированными преимуществами в живых ^{клетках60,61}. Кроме того, методы, описанные здесь, ограничены в отслеживании живых клеток во время оптогенетической стимуляции, что позволяет только собирать данные о конечной точке всего экспериментального временного хода.

Несмотря на эти ограничения, оптогенетические методы, описанные здесь, дополняют существующие технологии, такие как МДД, которые имеют гибкость для управления отдельными клетками в режиме реального времени, но ограничены количеством образцов, которые можно стимулировать. Кроме того, обсуждаемые здесь методы инженерии стабильных клеточных линий контрастируют с существующими методами синтетической биологии, которые часто характеризуют инженерные генетические системы с помощью переходных трансфекций. Переходные трансфекционные подходы по своей природе более шумные из-за большей вариации числа копий генных цепей среди клеток. Напротив, методы, представленные здесь, включают варианты моноклональных клеток, каждый из которых содержит одну копию генной цепи. Стабильные клеточные линии позволяют исследовать клеточные аспекты, такие как вариации экспрессии генов, влияние уровня белка на фенотипические ландшафты и одноклеточные методы с более высокой точностью, поскольку существует более высокая уверенность в том, что каждая клетка идентична своим соседям.

Работа здесь демонстрирует платформу для проектирования любой геномно интегрированной оптогенетической генной схемы, представляющей интерес, индуцируя такие системы надежными экспериментальными инструментами и характеризуя их различными экспрессиями генов и функциональными / фенотипическими анализами стандартизированным образом. Будущие усовершенствования этих протоколов могут включать интеграцию этих методов с отслеживанием живых клеток с использованием других оптогенетических технологий, таких как МДД, которые позволят пространственно-временно контролировать экспрессию генов и функциональные приложения на уровне одной клетки. Такие достижения позволят использовать свет для получения паттерна экспрессии генов, представляющего интерес для отдельных клеток, установить динамику транскрипции / трансляции, количественно оценить уровни белка и изучить их роль в различных биологических процессах, включая миграцию клеток, пролиферацию, метастазирование и дифференцировку.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes	Eppendorf	951010006	reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X	Thermo Fisher Scientific	MT25053CI	reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000020	tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000055	tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap	Corning	352235	reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V	Eppendorf	22628113	equipment for mammalian culture work
Agarose	Denville Scientific	GR140-500	reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates	VWR®	60941-126	tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9518-5G	reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365PR	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140010	reagent for growing bacteria
BD LSRAria	BD	656700	tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa	BD	649225	tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine	Government Scientific Source	SIGA4919-1G	reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC	Corning	353043	plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge	VWR	22628113	instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood	N/A	N/A	instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid	BD	353047	plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask	USA Scientific	CC7682-4825	container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fischer Scientific	BP231-100	reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide	Thermo Fisher Scientific	15-585-011	reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid	Corning	353072	container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express	De Novo Software:	N/A	software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL	Corning	35-010-CV	reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose	Thermo Fisher Scientific	11-965-092	reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL	Life Technologies	10687-010	reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix	Bio-Rad Laboratories	1708890	reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C	VWR	76210-392	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U74VC	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C	VWR	76359-220	equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg	Sigma-Aldrich	L3022-250G	reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000	Life Technologies	L3000008	reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019	MathWorks	N/A	software for analyzing experimental data
Methanol	Acros Organics	413775000	reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL	VWR	20170-333	plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
MultiTherm Shaker	Benchmark Scientific	H5000-HC	equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-NDL-US-CAN	equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix	NEB	M0492S	reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)	New England Biolabs (NEB)	C3019H	bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs (NEB)	E2621L	reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera	Nikon Instruments Inc.	N/A	instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements	Nikon Instruments Inc.	N/A	software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides	IDT	N/A	reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control	Panasonic	MCO-170AICUVHL-PA	instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade	Electron Microscopy Sciences	15710-S	reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)	Invitrogen	14190144	reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x	Fisher Scientific	15140-122	reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody	Cell Signaling Technology	4370S	primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody	Sigma-Aldrich	WH0003845M1	primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System	Eppendorf	A28137	equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App	Thermo Fisher Scientific	N/A	software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody	Cell Signaling Technology	8889S	secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody	Invitrogen	A11005	secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL	Olympus Plastics	12-102	reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System	Major Science	UVCI-1200	tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene	SnapGene	N/A	software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator	Tokai Hit	INU-TIZ	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444557	reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn	Life Technologies	4326317E	qPCR Probe
Thermocycler	Bio-Rad	1851148	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated	PerkinElmer	1450-605	plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm	VWR	14673-010	reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System	VWR	89032-290	equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293	Thermo Fisher Scientific	R75007	Engineered cell line with FRT site