Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tillförlitligt konstruera och kontrollera stabila optogenetiska genkretsar i däggdjursceller

Published: July 6, 2021 doi: 10.3791/62109
Automatic Translation
1,2,3, *2, *2, 1,2
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program
* These authors contributed equally

Summary

Att på ett tillförlitligt sätt kontrollera ljuskänsliga däggdjursceller kräver standardisering av optogenetiska metoder. Mot detta mål beskriver denna studie en pipeline av genkrets konstruktion, cellteknik, optogenetic utrustning drift och verifiering analyser för att standardisera studien av ljusinducerade genuttryck med hjälp av en negativ-feedback optogenetic genkrets som en fallstudie.

Abstract

Tillförlitlig genuttryckskontroll i däggdjursceller kräver verktyg med hög vikförändring, lågt brus och bestämda överföringsfunktioner från ingång till utgång, oavsett vilken metod som används. Mot detta mål har optogenetiska genuttryckssystem fått mycket uppmärksamhet under det senaste decenniet för spatiotemporal kontroll av proteinnivåer i däggdjursceller. De flesta befintliga kretsar som styr ljusinducerade genuttryck varierar dock i arkitektur, uttrycks från plasmider och använder variabel optogenetisk utrustning, vilket skapar ett behov av att utforska karakterisering och standardisering av optogenetiska komponenter i stabila cellinjer. Här ger studien en experimentell pipeline av tillförlitlig genkretskonstruktion, integration och karakterisering för att kontrollera ljusinducerbart genuttryck i däggdjursceller, med hjälp av en negativ feedback optogenetisk krets som ett exempel. Protokollen illustrerar också hur standardisering av optogenetisk utrustning och ljusregimer på ett tillförlitligt sätt kan avslöja genkretsfunktioner som genuttrycksljud och proteinuttrycksstorlek. Slutligen kan detta dokument vara till nytta för laboratorier som inte känner till optogenetik och som vill använda sådan teknik. Pipelinen som beskrivs här bör gälla för andra optogenetiska kretsar i däggdjursceller, vilket möjliggör mer tillförlitlig, detaljerad karakterisering och kontroll av genuttryck på transkriptionell, proteomisk och i slutändan fenotypisk nivå i däggdjursceller.

Introduction

I likhet med andra tekniska discipliner syftar syntetisk biologi till att standardisera protokoll, så att verktyg med mycket reproducerbara funktioner kan användas för att utforska frågor som är relevanta för biologiska system1,2. En domän inom syntetisk biologi där många styrsystem har byggts är området genuttrycksreglering3,4. Genuttryckskontroll kan rikta in sig på både proteinnivåer och variabilitet (brus eller variationskoefficient, CV = σ/μ, mätt som standardavvikelsen över medelvärdet), som är avgörande cellulära egenskaper på grund av deras roller i fysiologiska och patologiska cellulära tillstånd5,6,7,8. Många syntetiska system som kan kontrollera proteinnivåer och brus4,9,10,11,12 har konstruerats, vilket skapar möjligheter att standardisera protokoll över verktyg.

En ny uppsättning verktyg som kan kontrollera gennätverk som nyligen har uppstått är optogenetik, vilket möjliggör användning av ljus för att kontrollera genuttryck13,14,15,16,17. I likhet med sina kemiska föregångare kan optogenetiska genkretsar införas i alla celltyper, allt från bakterier till däggdjur, vilket möjliggör uttryck för någon nedströmsgen av intresse18,19. På grund av den snabba genereringen av nya optogenetiska verktyg har dock många system uppstått som varierar i genetisk kretsarkitektur, uttrycksmekanism (t.ex. plasmidbaserad kontra viral integration) och ljusförsörjningskontrollutrustning11,16,20,21,22,23,24,25 . Därför lämnar detta utrymme för standardisering av optogenetiska funktioner som genkretskonstruktion och optimering, metod för systemutnyttjande (t.ex. integration kontra transienta uttryck), experimentella verktyg som används för induktion och analys av resultat.

För att göra framsteg med att standardisera optogenetiska protokoll i däggdjursceller beskriver detta protokoll en experimentell pipeline för att konstruera optogenetiska system i däggdjursceller med hjälp av en negativ feedback (NF) genkrets integrerad i HEK293-celler (mänsklig embryonal njurcelllinje) som ett exempel. NF är ett idealiskt system för att demonstrera standardisering eftersom det är mycket rikligt26,27,28 i naturen, vilket gör att proteinnivåer kan justeras och ljudminimering uppstå. Kort sagt, NF möjliggör exakt genuttryckskontroll genom en undertryckare som minskar sitt eget uttryck tillräckligt snabbt, vilket begränsar alla förändringar bort från ett stabilt tillstånd. Steady state kan ändras av en inducerare som inaktiverar eller eliminerar tryckpressorn för att möjliggöra mer proteinproduktion tills ett nytt stabilt tillstånd uppnås för varje inducerarkoncentration. Nyligen skapades ett konstruerat NF optogenetiskt system som kan producera ett brett dynamiskt svar av genuttryck, upprätthålla lågt brus och svara på ljusstimuli som möjliggör potentialen för rumslig genuttryckskontroll11. Dessa verktyg, så kallade ljusinducerbara tuners (LITers), inspirerades av tidigare system som tillät genuttryckskontroll i levande celler4,10,29,30 och var stabilt integrerade i mänskliga cellinjer för att säkerställa långsiktig genuttryckskontroll.

Här, med LITer som exempel, beskrivs ett protokoll för att skapa ljuskänsliga genkretsar, inducera genuttryck med en ljusplattaapparat (LPA, en optogenetisk induktionsmaskinvara)31 och analysera svaren från de konstruerade, optogenetiskt kontrollerbara cellinjerna till anpassade ljusstimuli. Detta protokoll tillåter användare att använda LITer-verktygen för alla funktionella gener de vill utforska. Det kan också anpassas för andra optogenetiska system med olika kretsarkitekturer (t.ex. positiv feedback, negativ reglering etc.) genom att integrera de metoder och optogenetisk utrustning som beskrivs nedan. I likhet med andra syntetiska biologi protokoll, videoinspelningar och optogenetic protokoll beskrivs här kan tillämpas i encellsstudier i olika områden, inklusive men inte begränsat till cancerbiologi, embryonal utveckling och vävnad differentiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Genkretsdesign

  1. Välj genetiska komponenter att kombinera till en enda genkrets/plasmid (t.ex. dna-integrationssekvensmotiv för däggdjur32, ljuskänsliga element33 eller funktionella gener34).
  2. Använd någon genteknik och/eller molekylär kloningsprogramvara, lagra DNA-sekvenserna för senare användning och referens, kommentera varje sekvens och undersöka alla nödvändiga funktioner (t.ex. START-kodoner, reglerande eller översatta sekvenser)35.
  3. Utveckla eller anta delar enligt den övergripande genkretsens design36. För optogenetiska repressorer som i LITers11, smälta till exempel samman en gensekvenskodning för en domän som kan för ljusinducerbar nedbrytning37,38 eller inaktivering av en undertryckares DNA-bindningsförmåga39, intill och inom ramen för tryckelsegenen (t.ex. TetR)4.
    1. För optogenetiska aktivatorer, se till att det finns en aktivatordomän40 som främjar genuttryck vid ljusinducerad DNA-bindning41. För negativ eller positiv autoreglering, se till att det finns ett bindande ställe i eller uppströms regulatorgenens promotor (t.ex. tetO-platser i eller uppströms TetR-uttryckspromotorn)42.
  4. Designa primers för DNA-sekvensförstärkning eller sekvensering av plasmiden med hjälp av den molekylära kloningsprogramvaran för varje genkrets.
  5. Validera primersna beräkningsmässigt för plasmidkonstruktion genom de inbyggda festmåltiderna för molekylär kloningsprogramvara (t.ex. sekvensjustering).
  6. Beställ oligonukleotidprimrar från tillverkaren. Plasmider konstruerade och använda i detta arbete finns i det ursprungliga stödmaterialet11 tillsammans med primers som är utformade och använda.
  7. Späd primersna till 100 mM lagerkoncentration i dubbeldestillerat vatten (ddH2O).
  8. Späd ut beståndet av 100 mM stockprimrar till 10 mM koncentration för PCR.
  9. Förbered PCR-blandningen med 1 μL framåtprimer, 1 μL omvänd primer, 1 μL mall-DNA till en total massa på 0,5-500 ng för genomisk eller 0,5 pg-5 ng för plasmid eller viralt DNA, 12,5 μL DNA-polymeras 2x huvudblandning (eller den volym som tillfredsställer tillverkarens utspädningsfaktor) och 9, μL
  10. Inkubera PCR-blandningen i en termocykel vid lämpliga inställningar beroende på vilket enzym som valts43. Föreslagna reaktionscykler inkluderar:
    Steg 1: En cykel med 30 s första denatureringssteg vid 95 °C.
    Steg 2: 40 cykler av 5 s denatureringssteg vid 98 °C.
    Steg 3: En cykel med 30 s glödgningssteg vid 65 °C (bestäms av primers som utformats tidigare).
    Steg 4: En cykel på 1 min förlängning vid 72 °C (~1 kilobas (kb) mallfragmentlängd).
    Steg 5: En cykel av en 2 min förlängning vid 72 °C.
    Håll reaktionen vid 4 °C tills den kan testas via gelelektrofores. Detta protokoll varierar beroende på vilka reagenser som används (t.ex. polymeras och buffertar).
  11. Upprepa steg 1.9 för att förstärka alla fragment som ska användas i en DNA-sammansättningsreaktion som krävs för att länka linjära PCR-produkter till en enda cirkulär DNA-vektor.
  12. Kör PCR-produkterna på en 1% agarose gel följt av att rena banden av önskad längd.
  13. Förbered huvudblandningen för en DNA-sammansättningsreaktion (tabell 1).
    OBS: I det här exemplet är modervektorn uppdelad i två fragment för att öka effektiviteten i PCR-stegen utan att orsaka betydande ändringar i det övergripande monteringsresultatet.
  14. Inkubera DNA-sammansättningsreaktionsblandningen i en termocykel vid 50 °C i 1 h (om inte annat anges i DNA-sammansättningsreagensprotokollet) och förvara reaktionen vid 4 °C för att använda reaktionsprodukten för bakteriell omvandling.
  15. Ställ in bakteriell omvandling (kemisk eller elektroporation) med hjälp av kompetenta E. coli -celler (Escherichia coli) och motsvarande bakterieomvandlingsprotokoll. Efter omvandlingen, använd bakteriella Luria-Bertani (LB) agarplattor som innehåller den valda bakteriella urvalsmarkören (t.ex. Ampicillin) för att plätera omvandlingsblandningen. Inkubera plattorna vid 37 °C över natten44.
  16. Kontrollera plattorna följande dag. För att vaccinera kolonierna, plocka enskilda kolonier från plattorna och återanvända dem i en flytande LB-buljong med motsvarande bakterievalsmarkör i odlingsrör. Inkubera i en shakerinkubator vid 37 °C, 300 rpm över natten.
  17. Utför plasmidpreparatprotokoll för att extrahera plasmid-DNA från bakteriekulturen.
  18. Validera kretsen i två steg. Utför först en teströtning med restriktionsenzymer som en grov verifiering för att se om den ungefärliga plasmidprodukten erhölls. För det andra, om teströtningen godkänns/bekräftas, skicka in plasmiden till en Sanger-sekvenseringsanläggning (eller process med hjälp av den tillgängliga utrustningen) för att erhålla den exakta DNA-sekvensen för att jämföra den senare med den förväntade sekvensen i designprogramvaran.
    1. För att utföra teströtning väljer du minst två restriktionsenzymer som producerar minst två fragment, baserat på den molekylära kloningsprogramvaran som används. När enzymer har valts ut bereder du testproverna genom att tillsätta 1 μL av varje enzym, 5 μL av det genererade DNA:t och 13 μL vatten med lämpliga salter och buffertar beroende på vilka enzymer som används. Inkubera reaktionen vid 37 °C i 1 timme, eller som enzymtillverkaren föreslår. Kör teströtningsprodukterna på en 1% agarose gel och bestäm om banden är korrekta.
      OBS: Om banden är korrekta, fortsätt till sekvensering.
    2. För att utföra sekvensering, generera primers baserat på det DNA som lagras i programvaran så att glödgningsregionerna i primers är ca 500 bp (baspar) ifrån varandra och täcker fragmentet av intresse (genkretskomponent) eller hela plasmiden. Späd primersna med rent nukleasfritt vatten (NF-H2O) till 10 mM koncentration. Förbered sekvenseringsproverna genom att tillsätta 1 μL 10 ng/μL DNA, 1 μL primer och 8 μL NF-H2O till ett 0,2 mL-rör. Upprepa detta för varje primer.
      OBS: När prover bereds, lämna dem vid sekvenseringsanläggningen och jämför resultaten med plasmidsekvensen med hjälp av molekylär kloningsprogramvara.
  19. Generera i detta steg cirka 100-1000 ng/μL DNA-prov för att integrera plasmiderna som innehåller genkretsar i lämplig cellinje.

2. Stabil mobillinjeteknik

  1. Beställ en däggdjurscelllinje utformad för snabb generering av stabila underlinjer som säkerställer högnivåuttryck av proteinet av intresse från en däggdjursuttrycksvektor. Celltypen och enkelheten i celllinjetekniken kan variera beroende på vad användarna föredrar eller strävar efter att uppnå.
    1. Om användare till exempel föredrar celllinjeteknik med minimala mellanliggande steg, beställ cellerna som innehåller en enda stabil integrationsplats (t.ex. FRT) vid en transkriptionellt aktiv genomisk locus. Om mer nyanserad cellteknik föredras skapar du integrationsplatser på önskade platser med hjälp av genteknikverktyg som CRISPR/Cas9.
  2. Odla celler i 5% CO2 i fuktad luft vid 37 °C. Justera tillväxtförhållandena efter behov för celltypen.
  3. Transfektera genkretsarna som är utformade ovan i önskade celler som erhållits från föregående steg för att påbörja en stabil celllinjegenereringsprocess. För att uppnå detta, använd en liposomblandning45 av genkretsens DNA med lämplig rekombinas (till exempel Flp-rekombinas för Flp-FRT-rekombination) eller genom andra metoder som elektroporation.
  4. Två dagar efter transfektion, dela cellerna till 25% confluency.
  5. Sex timmar efter uppdelningen av cellerna, börja antibiotika val genom att byta media till ett nytt medium som innehåller 50 μg/ml hygromycin antibiotikum (eller ett annat antibiotikum medel som motsvarar däggdjurs antibiotikaresistens genen som valts under plasmid konstruktion).
    OBS: Det finns en mängd olika däggdjursantibiotiska resistensgener som används i genkretskonstruktion, som var och en har en annan dödskurva. Därför, oavsett vilken däggdjursantibiotisk resistensgen som väljs för kretskonstruktion, bör en korrekt döda kurva studeras i de celler som är av intresse. Detta steg säkerställer att celler som innehåller genkretsens nyttolast berikas medan de utan systemet dödas.
  6. Låt cellerna växa i antibiotikavalsmediet, byt till färska medier var 2-3 dagar tills plattan eller kolven har några dussin högborgar. Passageföljande kulturer när de är i loggfasen innan de når sammanflöde.
  7. När det finns tillräckligt många högborgar, trypsinize cellerna med 1 ml 0,25% trypsin, 0,1% EDTA i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) utan kalcium, magnesium och natriumbikarbonat i flera minuter. Neutralisera trypsin med färska medier och skicka alla celler till en ny behållare.
  8. När cellerna i den färska behållaren är 80-100% konfluent, frys dem ner i en blandning av 45% gamla medier, 45% färska medier och 10% DMSO. Överför de återstående cellerna till ett sterilt rör och utför encellssortering för att isolera monoklonala celler till en 96-välplatta.
  9. Cirka 2-3 veckor efter monoklonal sortering, brunnar inom 96-brunnsplattan bör ha högborgar. När cirka 50%-60% konfluent, dela cellerna i en 12-brunnsplatta.
  10. När 12-brunnsplattan är 80-100% sammanflöde, uppdelad i en vävnadskulturbehandlad T-25-kolv. När cellerna i T-25-kolven är 80-100% sammanflöde, frys cellerna och upprätthålla en passage för karakterisering och testning av monoklonala cellinjer.
    1. Karakterisera de monoklonala cellinjerna genom mikroskopi och flöde cytometri analyser för att rapportera genuttryck profiler baserat på inducerad fluorescerande reporter produktion. Verifiera funktionell proteinproduktion via fluorescerande antikroppsmärkning och immunofluorescensanalys. Testa genuttrycksinduktion på transkriptionsnivå via kvantitativ PCR i realtid (qRT-PCR). Validera den genetiska sekvensen och integrationsnoggrannheten via lokal och helgenomsekvensering av klonerna.

3. Induktionsanalyser för ljusplåtsapparater

  1. Konstruera en LPA-enhet31,46 som ska användas för ljusinduktion av konstruerade celler. Kortfattat är flera breda steg avgörande för att skapa LPA att använda för att kontrollera genuttryck. Dessa inkluderar 3D-utskrift AV LPA-ramkomponenter, kretskortskonstruktion, programmering av kretsen via mikrokontrollerprogrammerare, montering av komponenterna i en slutlig LPA, programmering av minneskortet via IRIS-programvara och kalibrering av den färdiga enheten. För en mer ingående förklaring, se ovanstående referenser.
    1. Skriv ut 3D-delarna enligt Gerhardt et al. (2016 och 2019)31,46.
    2. Montera kretskortet enligt gerhardt et al. (2016 och 2019)31,46.
    3. Lägg till firmware till den monterade LPA-kretsen med hjälp av mikrokontrollerprogrammerare enligt gerhardt et al. (2016 och 2019)31,46.
    4. Kombinera 3D-printade delar och det monterade kretskortet enligt Gerhardt m.fl. (2016 och 2019)31,46. Detta inkluderar att ta monteringsplattan, kretskortet, LED-utrymmet (ljusdioder), plattadaptern, en 24-välplatta, ett plåtlock, monteringsbultar och vingmuttrar och staplingskomponenter som visas i den filmade videon och figur 2.
    5. För programmering av minneskort och kalibrering av enheten följer du stegen nedan.
  2. Använd IRIS-programvaran som finns tillgänglig på Tabor Labs webbplats47 för att programmera ett SD-kort för Light Plate Apparatus (LPA)31 och utforska lämpliga ljusförhållanden som behövs för att påbörja ett optogenetiskt experiment.
    OBS: IRIS-programvaran är en webbaserad applikation för programmering av den optogenetiska elektroniska hårdvaran, känd som LPA, utvecklad av Tabor Lab. Programvaran möjliggör programmering av relativa IRIS-värden som styr de enskilda lysdioderna (LED) i varje brunn i LPA-hårdvaran.
  3. Välj listrutan LPA (4 x 6) följt av att klicka på lämplig belysningsmetod (Steady-state, Dynamic, Advanced).
    OBS: För detta manuskript kommer alla analyser att fokusera på steady-state-exemplen. De avancerade inställningsexempel kan dock användas för pulslängder och arbetscykelregimer.
  4. Välj om de övre eller nedre lysdioderna ska belysas genom att ange värden i cellerna som motsvarar plattans brunnar. För de LPA som användes i detta arbete användes blå lysdioder placerade i topppositionen i alla experiment. Varje lysdiod, när den har programmerats, kan ge kontinuerlig ljusexponering med konstant ljusintensitet. IRIS-programvaran möjliggör 4096 intensitetsnivåer som kan programmeras.
  5. När LED-platserna har valts anger du intensitetsvärden för önskad experimentell disposition. Ange till exempel 8 olika ljusintensiteter (eller pulsvaraktighet eller arbetscykler) med tre tekniska replikat per platta (tabell 2). G.s. avser gråskalaenheter - de mätvärden för ljusintensitetsnivå som används för LPA-programmering i IRIS-programvaran.
    1. När du utformar IRIS-experimentella filer, tänk på kanteffekter från angränsande brunnar på LPA-enheten, ljustoxicitet från ökande intensitet av exponering för blått ljus och bestämma vilken typ av dosrespons som önskas (t.ex. monoton kontra icke-monoton).
    2. Om användare programmerar celler i LPA i stigande/fallande ordning av en viss ljusparameter (t.ex. intensitet), kan brunnar ge kanteffekter av ljuskorstalk eller till och med värme som kan påverka intilliggande brunnar. Detta kan oavsiktligt påverka resultatet av uppmätta utdata när experimenten är klara. För att lindra detta kan användare implementera en randomiseringsmatris på IRIS-programvaran för att förvränga brunnsplatser, vilket minimerar kanteffekter. Ett exempel beskrivs i de representativa resultaten nedan (figur 4A-B).
    3. Dessutom har högre intensiteter av blått ljus visat sig störa cellulär tillväxt och livskraft48. För att minska ljustoxiciteten är det därför viktigt att producera en ljusintensitet, pulslängd eller arbetscykelresponskurva beroende på vilken modalitet som undersöks.
      1. Till exempel program 8 ljusintensitetsvärden med tre replikat per 24-brunnsplatta, med ett intervall från inget ljus till en maximal intensitet för LPA. Kör sedan dessa prover på en flödescytometer med en SSC-FSC-grind eller en levande fläck som propidiumjodid för att kvantifiera populationscellens överlevnad (levande celler jämfört med totala händelser inklusive döda celler / cellulärt skräp) vid varje ljusvärde.
      2. Bestäm sedan den ideala mängden populationsöverlevnad för den experimentella installationen, eftersom eventuella stimulanser kan påverka spridning, genuttryck eller överlevnad negativt (t.ex. ställa in 80% cellöverlevnad som en lämplig kompromiss). I detta arbete, när den har kalibrerats, översteg intensiteten till exempel inte 3000 g.s. enheter (~ 3/4 LPA-enhetens maximala intensitet). Ett exempel på detta beskrivs i de representativa resultaten nedan.
    4. Förutom att begränsa ljusvärdena på grund av toxicitet kan användare vilja begränsa ljusvärdena för att karakterisera en viss del av dosresponsen, såsom intervallet för det monotona svaret.
      1. För att uppnå detta ska du inledningsvis skanna ett brett spektrum av ljusintensiteter, pulsvaraktighet eller arbetscykler beroende på hur modaliteten som analyseras vid bestämning av önskat dossvar (tabell 2) för att begränsa den ljusregim som är av intresse, t.ex.
      2. För att bestämma ljusområdet av intresse, programmera en enda LPA med upp till 24 brunnar med olika intensitet / pulsvaraktighet / arbetscykel / etc. eller fler brunnar (t.ex. 48, 72, 96, etc.) beroende på om flera LPA är kalibrerade för att leverera motsvarande ljusmängder och fortsätta med cellodlingsarbetet eller analyserna som beskrivs nedan. Börja därför karakterisering av ett optogenetiskt system med ett brett dosintervall av lätta stimuli för att bestämma det intervallintervall som ger önskat genuttryck och därefter utföra experiment i det raffinerade dosintervallet.
      3. Till exempel i detta arbete fastställdes en gång 3000 g.s. enheter som tröskelvärdet för giftig ljusintensitet; Detta tröskelvärde användes som övre ljusgräns för analyser som beskrivs nedan (t.ex. immunofluorescens).
        OBS: Stegen ovan är oberoende av den optiska kalibreringen av LPA och hänvisar till en kalibrering på molekylär nivå för varje optogenetiskt system.
  6. När lämpliga ljusintensitetsvärden har programmerats i IRIS sätter du in ett minneskort med USB 3.0-uttaget i LPA för att ladda ner och överföra filerna.
  7. Om kalibreringen av LPA är fullständig31, fortsätt till cellodlingsarbete för inledande av ljusinduktionsanalys. Om kalibreringen inte har gjorts kalibrerar du LPA med hjälp av en bildanalysmetod (steg 3.7.1-3.7.3) när LPA är programmerad med mikrokontrollerprogrammeraren.
    1. Programmera kortfattat LPA att ha samma IRIS-nivå som beskrivs av Gerhardt et al. (2016)31.
      OBS: För kalibrering var LPA programmerad att ha ett värde på 2000 g.s.
    2. När enheten är programmerad med minneskortet och återställningsknappen (den fysiska knappen på LPA) trycks in, skaffa en bild av hela enheten (t.ex. gelstationsbildare, skannerenhet etc.). För kalibreringen, skaffa två bilder med enheten roterad med 180°.
    3. Använd sedan programvara med öppen källkod designad av Gerhardt et al. (2016)31 för att visa variationen i LED-intensitet på LPA-plattan och beräkna LED-kompensationsvärdena för att göra intensiteten lika mellan brunnar. Ett exempel på detta beskrivs i de representerade resultaten nedan (figur 3). När kalibreringen är klar, fortsätt till cellodlingsarbete för initiering av ljusinduktionsanalys.
  8. Få flaskor av konstruerade monoklonala celler från föregående avsnitt för att undersöka ljusinduktionseffekter på genuttryck.
  9. Ta bort de gamla medierna från kolven.
  10. Tillsätt 1 ml trypsin i cellerna och inkubera i 5 min.
  11. Efter 5 min neutralisera trypsin genom att tillsätta 4 ml Dulbecco-modifierat Eagles medium (DMEM eller andra önskade medier) kompletterat med nödvändiga kemikalier (detta arbete används 50 μg/ml hygromycin, 1% penicillin/streptomycinlösning, 10% fetalt bovint serum, FBS).
  12. Tillsätt ~75 000 celler per brunn i en 24-väl svart platta i en total volym på 500 μL. Antalet sådda celler kan variera beroende på hur länge experimentet är önskvärt och vilken celltyp som används.
    Observera: Observera dessutom att cellutsädetätheten påverkar odlingsunderhållet och potentiellt experimentets varaktighet. Att börja vid ett lägre antal celler per brunn säkerställer längre tidslängder innan kulturen når sammanflöde. Dessutom kommer den typ av optogenetiska komponenter som är integrerade i de olika genkretsarna att påverka när genuttrycket når ett stabilt tillstånd och därmed påverka experimentens varaktighet. Andra faktorer som kan beaktas är celllinjespecifika tillväxthastigheter, mediesammansättning och villkorliga tillväxteffekter (dvs. ljus).
  13. Efter plätering, placera cellerna i en fuktad inkubator med 5% CO2 så att de kan nöja sig med 2-6 h.
  14. Efter inkubationen överför du cellerna till en vävnadsodlingshuv, tar bort plastlocket och lägger till en självhäftande folieremsa på toppen av plattan (figur 2D). Detta steg möjliggör minimal ljusöverföring mellan brunnar, eftersom toppen och sidorna av brunnarna är belagda, och ljuset kan nu bara komma in från botten av brunnen där lysdioden är placerad.
  15. Placera plattan i de monterade 3D-delarna av LPA. Täck sedan plattan med det 3D-utskrivna LPA-locket, som passar över enhetens skruvar i varje hörn.
  16. Anslut enheten till strömkällan och tryck på återställningsknappen på LPA-enheten för att säkerställa att de uppdaterade LPA-experimentinställningarna tillämpas.
  17. Inkubera cellerna i det experimentella systemet under en lämplig tid, beroende på den ursprungliga såddtätheten, celllinjespecifik tillväxthastighet och tillväxtförhållanden. I det här exemplet inducerades cellinjerna i 3 dagar kontinuerligt för genuttryck att nå ett stabilt tillstånd. Det bör dock noteras att många optogenetiska system (t.ex. VVD) kan nå steady-state genuttryck mycket tidigare (t.ex. 24 h), och därför kan experimentella induktionstider minskas eller förlängas efter behov.
  18. I slutet av ljusinduktionsexperimentet, använd proverna för någon av följande fyra analyser för att karakterisera de konstruerade cellinjerna (avsnitten 4-7).

4. Fluorescensmikroskopi av ljusinducerade konstruerade celler

  1. 24-72 h efter induktion, ta bort cellerna i LPA från inkubatorn och placera dem i en vävnadskulturhuv.
  2. Ta bort folieremsan och låt plattan sitta i 1-2 min. Detta förhindrar att kondens bildas på plastlocket, om det omedelbart placeras på plattan.
  3. Efter 1-2 minuters sittande, sätt tillbaka det ursprungliga plastlocket på plattan.
  4. Föreställ cellerna med lämplig faskontrast eller fluorescensmikroskop.
  5. Beroende på instrument justerar du exponeringstiden, ljuskällans intensitet och förstärkning för visning av konstruerade celler. I detta experiment tillämpades följande parametrar: 50 ms för FITC/GFP (grönt fluorescerande protein) ljuskälla exponeringstid och 1-5 ms för faskontrast exponeringstid vid 100% intensitet för varje.
    OBS: Det bör noteras att optimala exponeringstider, förstärkningsnivåer och ljuskällans intensiteter ofta härleds empiriskt från erfarenheten av detta arbete för att minimera övermättnad i fluorescensreportern, minimera cellulära skador och fånga lämpliga bilder för kvalitativ och kvantitativ analys. Vid fastställandet av nivåerna för var och en av dessa parametrar inkluderar de aspekter som ska beaktas att maximera signal-till-brus-förhållanden, minimera fototoxicitet, minimera övermättnad av fluorescenssignaler och öka förmågan att förstärka svaga fluorescenssignaler.
    1. Optimera dessa parametrar grovt ad hoc; Tidigare experimentella värden (t.ex. ljuskällans intensitet som orsakar övermättnad av fluorescensreporter) kan dock vägleda framtida experimentella miljöer när så är tillämpligt. Till exempel kan förstärkningsinställningarna, exponeringstiderna och ljusintensitetens initialvärden från en krets (LITer1.0) eller experimentell installation (t.ex. ljusintensitet) användas som utgångspunkt när du flyttar till en liknande men annorlunda genkrets (LITer2.0)11 eller en annan ljusmodalitet (t.ex. lätt arbetscykel).
  6. Effektivisera plåtavbildning med hjälp av en koordinatmall programmerad i mikroskopiprogramvaran så att hela plåtstorleken (t.ex. 24 brunnar) kan ha automatiserat bildförvärv från flera bildplatser per brunn.

5. Flödescytometri av ljusinducerade konstruerade celler

  1. 24-72 h efter induktion, ta bort cellerna från LPA i inkubatorn eller från mikroskopet efter avbildning och placera dem i vävnadsodlingshuven.
  2. Om du tar bort direkt från LPA, ta bort folieremsan och låt plattan sitta i en minut eller två.
  3. Aspirera media från varje brunn (av hela 24-brunnsplattan om alla brunnar används).
  4. Tillsätt 100 μL 0,25% trypsin till varje brunn, täck plattan med ett plastlock och placera den tillbaka i inkubatorn.
  5. Lämna cellerna ostörta i inkubatorn i 5 min.
  6. Efter 5 min, ta bort plattan och sätt tillbaka den till vävnadsodlingshuven.
  7. Neutralisera varje trypsinized brunn med 400 μL DMEM.
  8. Märk ett 5 ml polystyrenrör med cellsil (eller lämpligt flödescytometrirör som kan filtreras för att avlägsna stora klumpar av celler som inte är helt trypsiniserade) med ett namn som motsvarar varje brunn.
  9. Använd en P1000-pipett för att pipettera innehållet i varje brunn upp och ner 6-8 gånger för att bryta cellklumpar och skapa encelliga prover för flödescytometri49.
  10. Överför hela innehållet i varje brunn (~500 μL) till de märkta rören med silen.
  11. Föra celler till lämpligt flödescytometriinstrument med lasrar med rätt våglängder (kan föra rör med celler på eller utanför is).
    OBS: Flödescytometern som användes i detta arbete var en del av en kärnanläggning belägen på universitetssjukhuset.
  12. Skapa en framåt- och sidospridningsport (FSC respektive SSC) för att fånga de enskilda cellerna av lämplig storlek och granularitet för att utesluta skräp och cellulära klumpar på flödescytometriprogramvaran.
  13. När porten är inställd, fånga cirka 10 000 celler med lämplig grind. Justera det här numret beroende på hur mycket mobildata användarna söker. Upprepa för varje rör som innehåller cellerna från experimentet.
  14. När experimentet är klart importerar du data till den tillgängliga programvaran för flödescytometridata för analys.
  15. Skapa en FSC-SSC-port (som tidigare under förvärvet) och tillämpa den på varje batch med experimentella data. En referensbrunn för den oinducerade cellpopulationen används för att skapa denna port i detta manuskript, men det finns andra mätvärden för att skapa portar, till exempel densitetsbaserade portar.
  16. Med de experimentella förhållandena gated med en FSC-SSC gate, plotta flödet cytometri data som histogram eller representera på andra sätt för att illustrera de erhållna uttrycksmönstren. I detta experiment fångades fluorescensen av GFP/FITC eller PE/TexasRed kanaler.

6. RNA-extraktion och kvantitativ PCR av genkretskomponenter

  1. 24-72 h efter induktion, ta bort cellerna från LPA i inkubatorn eller från mikroskopet efter avbildning och placera dem i vävnadsodlingshuven.
  2. Om du tar bort direkt från LPA, ta bort folieremsan och låt plattan sitta i en minut eller två.
  3. Aspirera media från varje brunn (av hela 24-brunnsplattan om alla brunnar används).
  4. Fortsätt att extrahera RNA från cellerna med hjälp av lämplig RNA-extraktionssats.
  5. När RNA-extraktionen är klar utför du en omvänd transkriptionsreaktion av varje prov (tabell 3).
  6. Utför vidare kvantitativ PCR för varje prov (tabell 4). Använd ett DNA-polymeras och tillhörande protokoll för att ställa in PCR-reaktioner. För detta steg, ställa in en multiplexerad reaktion med en hushållningsgen och en gen av intresse, eller skapa separata reaktioner. I det här exemplet undersöktes nivåerna GFP, KRAS och glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH). Efter att ha slutfört qRT-PCR-experimentet, fortsätt med analysen via tillgänglig programvara för att illustrera genkrets vikningsförändring på RNA-nivå.

7. Immunofluorescens av genkretskomponenter

  1. Använd ett isbad eller frys för att kyla ner metanol.
  2. 24-72 h efter induktion, ta bort cellerna från LPA i inkubatorn eller från mikroskopet efter avbildning och placera dem i vävnadsodlingshuven.
  3. Om du tar bort direkt från LPA, ta bort folieremsan och låt plattan sitta i 1-2 min.
  4. Aspirera media från varje brunn (av hela 24-brunnsplattan om alla brunnar används).
  5. Tillsätt 100 μL 0,25% trypsin till varje brunn, täck plattan med ett plastlock och placera den tillbaka i inkubatorn.
  6. Lämna cellerna ostörta i inkubatorn i 5 min.
  7. Efter 5 min, ta bort plattan och sätt tillbaka den till vävnadsodlingshuven.
  8. Neutralisera varje trypsinized brunn med 400 μL DMEM.
  9. Märk minicentrifugerrör med namn som motsvarar varje brunn.
  10. Använd en P1000-pipett och pipettera innehållet i varje brunn upp och ner 6-8 gånger för att bryta cellklumparna.
  11. Överför hela innehållet i varje brunn (~500 μL) till de märkta rören.
  12. Centrifugera cellerna i 5 min vid 400 x g.
  13. När det är klart, kassera supernatanten och flytta proverna till en kemisk rökhuv.
  14. Återanvänd cellerna (använd en P1000 pipetter och pipetter upp och ner 6-8 gånger i varje rör för att bryta cellklumpar) i 750-1000 μL 4% paraformaldehyd (utspädd i fosfatbuffrad saltlösning, PBS).
  15. Låt cellerna sitta i 15 minuter vid rumstemperatur.
  16. Tillsätt 750-1000 μL PBS efter inkubationen. Pipett upp och ner flera gånger.
  17. Centrifugera cellerna i 5 min vid 400 x g.
  18. När det är klart, kassera supernatanten och flytta proverna till en kemisk rökhuv.
  19. Återanvänd cellerna (använd en P1000 pipetter och pipett upp och ner 6-8 gånger i varje rör för att bryta cellklumpar) i 750-1000 μL iskall metanol.
  20. Låt cellerna sitta i 30 minuter på is eller i en frys på -20 °C.
  21. Tillsätt 750-1000 μL PBS efter inkubationen. Pipett upp och ner flera gånger.
  22. Centrifugera cellerna i 5 min vid 400 x g.
  23. När det är klart, kassera supernatanten och flytta proverna till en kemisk rökhuv.
  24. Beroende på vilken typ av antikroppar som används, ändra protokollet från denna punkt och framåt. Följ antingen stegen 7.24.1-7.24.14 eller 7.24.15-7.24.22.
    1. Om du använder en primär och sekundär antikropp, återanvänd cellerna med en P1000/P200 pipetter och pipetter upp och ner 6-8 gånger i varje rör för att bryta cellklumpar i 100 μL primär antikropp. I detta fall gjordes en utspädning på 1:800 för lagerantikroppar, inklusive KRAS-antikroppar eller ERK-antikroppar, och tilläts sitta i 1 h vid rumstemperatur. Antikroppar späddes ut i en inkubationsbuffert tillverkad av 1x PBS med 0, 5 g BSA.
      OBS: Bestäm den exakta utspädningen av antikroppen empiriskt genom att skapa en standardkurva av antikroppsutspädningar kontra antigenet av intresse.
    2. Efter tillsats av antikroppar, täck rören med en folie för att förhindra ljuseffekter på märkta antikroppar.
    3. Tillsätt 750-1000 μL inkubationsbufferten efter inkubation. Pipett upp och ner flera gånger.
    4. Centrifugera cellerna i 5 min vid 400 x g.
    5. När det är klart, kassera supernatanten och flytta proverna till en kemisk rökhuv.
    6. Återanvänd cellerna med hjälp av en P1000/P200-pipett och pipett upp och ner 6-8 gånger i varje rör för att bryta cellklumpar i 100 μL sekundär antikropp. I detta fall återanvändes cellerna i 100 μL sekundär antikropp vid en utspädning av 1:800 för KRAS antikropp eller 1:2000 för ERK antikroppar och tillåtet att sitta i 30 min vid rumstemperatur. I likhet med primära antikroppar späd de sekundära antikropparna i inkubationsbufferten enligt beskrivningen ovan. Bestäm utspädningarna av de sekundära antikropparna baserat på de empiriska resultaten av en standardkurva.
    7. Efter tillsats av antikroppar, täck rören med en folie för att förhindra ljuseffekter på de märkta antikropparna.
    8. Tillsätt 750-1000 μL av inkubationsbufferten efter inkubationen. Pipett upp och ner flera gånger.
    9. Centrifugera cellerna i 5 min vid 400 x g.
    10. När det är klart, kassera supernatanten och flytta proverna till en kemisk rökhuv.
    11. Återanvänd cellerna med hjälp av en P1000 pipetter och pipetter upp och ner 6-8 gånger i varje rör för att bryta cellklumpar i 500 μL PBS.
    12. Överför hela innehållet i varje rör (~500 μL) till de märkta rören med silar.
    13. För cellerna till lämpliga flödescytometriinstrument med lasrar med rätt våglängder (kan föra rör med celler på eller utanför is).
      OBS: Det bör noteras att det är viktigt att ha flera kontroller för att gå vidare med flöde cytometri mätning och analys av konstruerade cell gen uttryck. Till exempel, att ha helt oförstörda celler, celler färgade med enbart primära antikroppar och celler färgade med enbart sekundära antikroppar kan vara användbara för att jämföra resultat med bakgrundssignaler från antikroppar.
    14. Fortsätt sedan med analysen enligt beskrivningen i avsnitt 5.
    15. Om du endast använder en primär antikropp ska cellerna återanvändas med hjälp av en P1000/P200-pipett och pipett upp och ner 6-8 gånger i varje rör för att bryta cellklumparna i 100 μL märkt primär antikropp. Bestäm lämplig antikroppsutspädning och inkubera i 1 h vid rumstemperatur. Bestäm antikroppsutspädningen från standardkurvan empiriskt.
    16. Efter tillsats av antikroppar, täck rören med en folie för att förhindra ljuseffekter på märkta antikroppar.
    17. Tillsätt 750-1000 μL inkubationsbufferten efter inkubation. Pipett upp och ner flera gånger.
    18. Centrifugera cellerna i 5 min vid 400 x g.
    19. Återanvänd cellerna med hjälp av en P1000 pipetter och pipetter upp och ner 6-8 gånger i varje rör för att bryta cellklumpar i 500 μL PBS.
    20. Överför hela innehållet i varje rör (~500 μL) till märkta rör med silar.
    21. För cellerna till lämpliga flödescytometriinstrument med lasrar med rätt våglängder (kan föra rör med celler på eller utanför is).
      OBS: Det bör noteras att det är viktigt att ha flera kontroller för att gå vidare med flöde cytometri mätning och analys av konstruerade cell gen uttryck. Att ha helt oförstörda celler och celler färgade med enbart primära antikroppar är användbara för att jämföra resultat med bakgrundssignaler från antikroppar.
    22. Fortsätt från och med nu med analysen enligt beskrivningen i avsnitt 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Genkretsmontering och stabil cellinjegenerering i denna artikel baserades på kommersiella, modifierade HEK-293 celler som innehåller en transkriptionellt aktiv, enda stabil FRT-plats (figur 1). Genkretsarna konstruerades till vektorer som hade FRT-platser inom plasmiden, vilket möjliggör Flp-FRT-integrationen i HEK-293-cellsgenomet. Detta tillvägagångssätt är inte begränsat till Flp-In-celler, eftersom FRT-webbplatser kan läggas till i alla cellinjer av intresse var som helst i genomet med hjälp av DNA-redigeringsteknik som CRISPR / Cas950.

När lämpliga cellinjer konstruerades och validerades för korrekt insättning valdes LPA och IRIS programvara som ett standardiserat protokoll för ljusinduktion av genuttryck31,51. LPA-systemet gör det möjligt att programmera 24-brunnar för induktion av däggdjursceller under flera experimentella förhållanden beroende på ljusintensitet, pulsens varaktighet och arbetscykel (figur 2). I den här artikeln prioriterades rumsligt enhetlig ljusintensitet, puls varaktighet och arbetscykel. Forskare kan dock använda IRIS-programvaran och LPA för mer avancerad programmering av temporala ljusvågmönster.

En avgörande aspekt av LPA som ska åtgärdas innan experiment påbörjas är den optiska kalibrering som kan utföras för en eller flera enheter. Den tidigare beskrivna bildanalysmetoden31 som används för kalibrering kräver en bild av hela LPA med alla lysdioder av intresse påslagna, som kan förvärvas från en mängd olika källor52, inklusive en gelbildare. Här användes en datorskanner för bildförvärv (bild 3A). När bilden förvärvades användes programvaran med öppen källkod som skapats av Gerhardt et al. (2016)31 för att beräkna kompensationsvärden för varje lysdiod för att säkerställa att varje LPA avger samma intensitet vid ett givet gråskalevärde. Programvaran subtraherar bakgrundssignalen, trösklar bilden till en binär kategori och beräknar pixelintensiteten (bild 3B). Från kalibreringen hittades en minimal variation bland lysdioderna, med ett CV på 0,04 mellan 96 brunnar (eller 4 plattor kalibrerade, figur 3C). Slutligen visade kalibreringsprogramvaran LED-variationen efter plats (bild 3D) och skapade en gråskalejustering (figur 3E) så att varje lysdiod normaliseras till samma intensitet.

Förutom kalibrering är andra viktiga aspekter av användningen av LPA att integrera flera kontroller i den experimentella rörledningen som kan minimera systemfel genom att begränsa förvirrande variabler som ljustoxicitetseffekter och designbegränsningar baserade på experimentella material. Figur 4 illustrerar till exempel två olika konfigurationer för programmering av olika ljusintensiteter i LPA-brunnarna. Den första underpanelen i figur 4A visar en stigande organisation av ljusintensitet. Detta kan underlätta programmering och dataanalys men kan ge kanteffekter där lpa-systemets nedre rad har den högsta ljusintensiteten och potentiellt kan orsaka oönskad värme och ljusinduktion av närliggande brunnar. På samma sätt har en randomiseringsmatris tillämpats på IRIS-programvaran i den andra underpanelen i figur 4A, vilket skapar olika ljusintensiteter i slumpmässiga positioner. Detta kan minimera systemiska influenser av kanteffekter. En descrambled matris (figur 4B) skapas med IRIS-programvaran, som sedan kan användas för att bestämma de experimentella förhållandena efter avslutad experimentet och under analysen. I likhet med randomiseringen av brunnar bör användare också vara medvetna om lätta toxicitetseffekter som kan uppstå (blått ljus inom detta arbete). I figur 4C visas två olika ljusintensiteter som används för genkretsinduktion med samma FSC-SSC-port baserat på den oinducerade populationen av konstruerade celler. Som sådan bör användarna utföra ett dossvar på ljusmodaliteten (t.ex. puls, arbetscykel osv.) för att fastställa ljustoxicitetseffekter som kan uppstå vid den höga exponeringens höga ände (figur 4D). Här orsakade ökande blå ljusnivåer dosberoende cellulära skräp, döda celler och klumpar jämfört med icke-stimulerade celler. Som sådan begränsades den kontinuerliga ljusintensiteten till cirka 3/4 av den maximala LPA-intensiteten (~ 3000 g.s. enheter).

När rätt utrustning inrättades inducerades genuttryck sedan i konstruerade LITer-genkretsar via fluorescensmikroskopi (figur 5). Cellerna inducerades vid olika ljuspulslängder på LPA, vilket gav en lätt dosrespons av genuttryck på populationsnivå. Celler i detta arbete avbildades för GFP uttryck med 50 ms för FITC/GFP ljuskälla exponeringstid och för ljusfält imaging med 1-5 ms för fas-kontrast exponering tid. Med tanke på robustheten i detta protokoll för linjeteknik kan alla fluorescensmarkörer användas i stället för GFP. Cellerna kan induceras med flera ljusregimer och producera ett stort antal svar (figur 5). Det senare är fördelaktigt för att ytterligare kontrollera uttrycket av funktionella gener (t.ex. KRAS (G12V) onkogen i det ursprungliga verket53).

Omedelbart efter fluorescensmikroskopi kunde celler analyseras i en mängd olika experimentella protokoll, inklusive flöde cytometri, qRT-PCR och immunofluorescens. I detta arbete utfördes flödescytometri som ett första valideringsförfarande och utfördes enligt de metoder som beskrivs ovan (figur 6). I likhet med mikroskopi inducerades celler vid olika pulslängdsvärden och visade en dosrespons av genuttryck av över fyrfaldig förändring från oinducerade tillstånd på befolkningsnivå (figur 6A-B). På samma sätt kan brusreducering av genuttryck visas genom att jämföra olika ljusintensitetsvärden (figur 6C-D) för LITer-systemet jämfört med ett positivt regleringssystem (ingen återkoppling) som VVD/LightOn54. När liter jämförs med VVD-systemet uppnår negativ feedback över femfaldig brusreducering av genuttryck. Samma förinducerade celler avbildade på mikroskopi kan också analyseras via qRT-PCR (figur 7). I likhet med flödescytometri kan de konstruerade LITer-cellerna uttrycka RNA-nivåer på ett dosresponsivt sätt (över 10-faldig induktion från oinducerade tillstånd), som matchar dosresponsen av proteinnivåer kvantifierade av GFP-uttryck på flödescytometri. De nämnda fluorescensmikroskopi- och flödescytometridata kan kalibreras med icke-fluorescerande celler, konstituerande uttryckslysrörsceller och fluorescerande 6-8-toppvalideringspärlor (t.ex. FL1-kanalsgröna, fluorescerande pärlor). Var och en av dessa komponenter kan möjliggöra normalisering av genuttryck i ett enda experiment. Dessa faktorer kan dock också möjliggöra normalisering av kretsar och konstruerade celler över olika experimentella plattor, experimentella villkor och dagar för att möjliggöra jämförelse och standardisering av genuttrycksdata.

Slutligen kan LITer-genkretsarna konstrueras för att uttrycka funktionella gener, såsom KRAS (G12V, figur 8). Mångsidigheten hos denna pipeline gör det möjligt för användare att använda LITer-arkitekturen med cellteknik för alla funktionella gener av intresse, eventuellt med ytterligare arkitekturer som positiv feedback. LITer visade ökande mängder blått ljus som resulterade i ökade nivåer av genkretsproduktionen (KRAS (G12V) proteinnivåer) och följaktligen fosforylerade ERK-nivåer, som båda kan kvantifieras via immunofluorescensanalyser.

Fragment Förhållande Storlek (bp) VIKTKONCENTRATION I DNA-fragment (ng/μL) DNA-fragment molarkoncentration (fmol/μL) Volym (μL) Resulterande DNA-molmassa (fmol)
Moder Vektor fragment 1 1 3414.00 18.20 8.63 4.09 35.29
Moder Vektor fragment 2 1 4642.00 18.10 6.31 5.59 35.29
Gen av intresse 1 549.00 37.90 111.70 0.32 35.29
Total 10.00 105.87

Tabell 1: Beräkning av DNA-sammansättningsreaktionsblandning (steg 1.13). Kolumnerna 2 & 3 är baserade på storleken på de DNA-fragment som monterats och koncentrationen av dessa fragment efter PCR-förstärkning och agarosgelextraktion (steg 1.11). Den nedre cellen i den fjärde kolumnen (total reaktionsvolym) kan ändras. Den angivna volymen rekommenderas dock. Oformade celler genereras automatiskt.

0 100 200 400 500 750
1500 3000 0 100 200 400
500 750 1500 3000 0 100
200 400 500 750 1500 3000

Tabell 2: IRIS-programmering av ljusintensiteter (g.s.) för lätt induktionsexperiment i en 24-brunnsplatta med tre replikat (steg 3.4). Fördelning av ljusintensiteter från 0 till 3000 g.s. G.s.-gråskala enheter. Detta kan randomiseras av IRIS-programvaran efter behov.

Prov 1 Prov 2 Prov 3
Omvänd transkriptas master mix volym (μL) 4.00 4.00 4.00
RNA-mall (1000 ng) Volym (μL) 2.00 3.00 4.00
NF-H20 Volym (μL) 14.00 13.00 12.00
Total volym (μL) 20.00 20.00 20.00

Tabell 3: Beräkning av omvänd transkriptionshanterare (steg 6.5). Den rekommenderade totala volymen för reaktion är 20 μL, och dess komponenter är den omvända transkriptasenzymblandningen (här: 5x), RNA-mall och nukleasfritt vatten. I det här exemplet är RNA-koncentrationerna av proverna 1, 2 och 3 500, 333 respektive 250 ng/μL.

Prov 1 Prov 2 Prov 1 & 2 Multiplexed
GFP-sondvolym (μL) 1 ----- 1
GAPDH-sondvolym (μL) ------ 1 1
DNA-polymeras Master Mix Volume (μL) 10 10 10
cDNA (100 ng) Volym (μL) 2 2 2
NF-H20 Volym (μL) 7 7 7
Total volym (μL) 20 20 20

Tabell 4: Kvantitativ beräkning av PCR-huvudmix (steg 6.6). Den rekommenderade reaktionsvolymen är 20 μL och dess komponenter är DNA-polymerasenzymets mastermix (här: 2x), GFP- och/eller GAPDH-sonder, cDNA (100 ng totalt) och nukleasfritt vatten (NF-H20).

Figure 1
Bild 1: Kretsdesign och cellteknik. (A) Celltekniska verktyg, inklusive LITer syntetisk genkrets med FRT-integrationsplatser, rekombinasenzym (Flp recombinase) för kretsintegration, läkemedel som används för val av lämpliga genetiska kloner och cellinje av intresse som används för att skapa önskade optogenetiska däggdjurs cellinjer. (B) Konstruerade genetiska system kan integreras på en specifik FRT-plats som innehåller johannesbröd i det mänskliga genomet. Dessa genomiska lokus kan sedan uttrycka specifik antibiotikaresistens eller fluorescerande reportergener för val av korrekt integrerade genetiska kassetter. Genkretsintegration kan initieras med hjälp av rekombiner som känner igen specifika platser i den ursprungliga genetiska kassetten. Detta introducerar en ny gen för läkemedelsresistensval som kan säkerställa generering av korrekt konstruerade celler med önskad genkrets. Längst ner på panel B finns genkretsarkitekturen för det optogenetiska negativa återkopplingssystemet LITer2.0. Denna krets består av ett självrepressande TetR-protein smält med en ljus-syre-spänningsavkännande domän (LOV2), en länksekvens P2A som möjliggör en multicistronisk transkription och GFP. När blått ljus appliceras öppnas TIP-sekvensen från LOV2-domänen, vilket hämmar TetR-proteinet och möjliggör ökad, dosresponsiv transkription av både TetR och GFP-reportern. Det hämmade TetR-proteinet kan inte binda och undertryckas på DNA-operatörsstället, vilket ökar transkriptionen. Denna negativa feedback håller genuttrycksbruset lågt och möjliggör en högfaldig förändring av genuttrycket. FRT - flip recognition target, HygR - hygromycinresistens, LacZ - β-galactosidase, ZeoR - zeocinresistens, T - TetR, tetracyklinrepressorprotein, D2ir är en CMV-baserad promotor med TwtO-platser, LOV2 är ljus-syre-spänningsavkännande domän, TIP är tet-hämmande peptid som hämmar TetR-proteinet. Denna siffra har ändrats från Guinn och Balázsi (2020)55. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: LPA:s experimentella programmering. (A) Experiment kan programmeras med hjälp av de verktyg som listas på Tabor lab webbplats47 med flexibilitet för steady-state, dynamisk eller avancerad LPA-programmering31. Dessutom kan elektroniska filer sparas för framtida användning för tekniska replikat eller experimentell induktion av alternativa cellinjer. B) LPA-enhet med huvudkomponenter uppifrån och uppifrån och från sidan (C). D) Bilder av folieförslutna plattor som ska finnas på LPA. LPA - Ljusplatta Apparat, LED - lysdiod. Delar av denna siffra har ändrats från Guinn (2019)11. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3: Kalibrering av ljusplåtsapparaten. (A) Representativ bild av LPA för lysdioder som är inställda på 2000 g.s. baserat på IRIS-programvara. (B) Bild från panel (A) med bakgrunden subtraherad och tröskelvärde som används för att binarisera bilden för att beräkna pixelintensiteten för varje lysdiod. C) Histogram av pixelintensiteter (bestäms av MATLAB-bildanalys) av 96 lysdioder (4 LPA-plattor) som är inställda på samma IRIS-programvaruvärde (t.ex. 2000 g.s.). Den röda linjen representerar genomsnittlig LED-pixelintensitet, och CV i panelen representerar variationskoefficienten för de 96 brunnarna. (D) Värmekarta som visar LPA-bildens LED-intensitet i panel (A) normaliserad till lysdioden med maximal intensitet. (E) Värmekarta för kalibreringsvärde som fastställts för LPA-bilden i panel (A) för att skapa produktion med samma intensitet för varje lysdiod när den är programmerad för LPA. LPA - Ljusplatta Apparat, LED - ljusemitterande diod, CV - variationskoefficient. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Randomisering av LPA och ljustoxicitetseffekter. (A) Representativ bild av två programmerbara LPA LED-konfigurationer inställda från 25 till 4000 g.s, baserat på IRIS-programvaran. Den första konfigurationen är mer sannolikt att tillåta systematiska fel som kanteffekter av värme och ljus att korsa över (t.ex. den nedre raden i LPA som påverkar den andra lägsta raden). Den andra bilden randomiserar platsen för intensiteter, vilket minimerar systematiska fel (partiskhet) som orsakas av kanteffekter. (B) Matris som visar slumpmässig plats för ljusintensiteter i LPA som visas på panelen (A), som kan användas för att bestämma de intensitetsberoende resultaten av ett visst experiment. (C) Flödescytometridata för två olika ljusintensiteter (1250 och 4000 g.s.) för 3 dagars induktion vid kontinuerlig belysning. Den svarta porten är baserad på oinducerade celler. (D) Stapeldiagram som visar flödescytometridata som panel (C) men för ett brett spektrum av ljusintensiteter. LPA - Ljusplatta Apparatur, FSC - framåt spridning, SSC - sidospridning, g.s. - ljusintensitetsvärde mätt i gråskala. LITerceller11 hade en dosresponsiv minskning av cellöverlevnaden som var statistiskt signifikant med ANOVA 1-tailed test med ett p-värde på 0, 0022. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Representativa mikroskopibilder av konstruerade optogenetiska cellinjer. Cellerna avbildades på ett inverterat mikroskop med en kamera (14-bitars) för att förvärva faskontrast och fluorescens imaging. Cellerna exponerades för 5 ms för faskontrast (panel A, representativ ljusfältsbild) och 50 ms för GFP/FITC-förvärv (panel B) med 100% ljuskällaintensitet. Celler kan avbildas vid olika tidpunkter beroende på önskat steady-state förvärv eller dynamiskt svar, vilket leder till ett stabilt tillstånd. Cellerna här representerar en pulslängd titrering vid fast intensitet (1000 g.s.) som sträcker sig från ingen ljusexponering till 3 dagars ljusexponering. Enheten representerar ett ljusintensitetsvärde mätt i gråskala. Denna siffra har ändrats från Guinn (2019)11. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Flödescytometri av konstruerade optogenetiska cellinjer. Celler analyserades på en BD LSRFortessa flöde cytometer, med cirka 10 000 celler samlade inom en SSC-FSC (sida scatter-forward scatter) grind. Cellerna analyserades sedan med FCS Express-programvaran. Histogram eller spridningsdiagram kan genereras för att kvantifiera uttrycket av den intressanta genen (t.ex. GFP). A) Konstruerade celler ritade på SSC-FSC-axlar för gating inom den svarta linjen. (B) Representativa LITer-celler inducerade med varierande varaktighet av ljuspulser vid 1000 g. upp till 72 timmar induktion, vilket illustrerar dosrespons av genuttryck. (C) Representativa dos-responsdata för ljusintensitetstitrering som jämför LITer-genkretsen (TIP-baserat system) med VVD- eller LightOn-system40, vilket är ett positivt regleringssystem utan återkoppling. D) Histogram som motsvarar VVD-systemet, som illustrerar en bredare fördelning (och därmed högre genuttrycksbuller) jämfört med LITer-systemet. CV är variationskoefficienten, ett mått för genuttrycksbuller. FSC - framåt spridning, SSC - sidospridning, FITC - fluorescein isotiiocyanate, g.s. - ljusintensitetsvärde mätt i gråskala. Denna siffra har ändrats från Guinn (2019)11. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Kvantitativt PCR i realtid av konstruerade optogenetiska cellinjer. Representativa data som visar att flera genuttrycksnivåer kan induceras och kvantifieras med ljus som stimulans. Enheten Rq representerar relativ kvantifiering av uttrycksvikning jämfört med kontroll. LITerceller11 hade en dosresponsiv ökning av RNA-uttryck som var statistiskt signifikant med ANOVA 1-tailed test med ett p-värde på 0, 0352 respektive 0, 0477 för GFP- respektive KRAS- nivåer. Denna siffra har ändrats från Guinn (2019)11. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 8
Figur 8: Immunofluorescens av konstruerade optogenetiska cellinjer. Representativa data som visar uppskattningar på proteinnivå baserat på immunofluorescens. (A) Proteinnivåer av KRAS(G12V) och B) proteinnivåer av fosforylerad-ERK, som LITer-genkretsen inducerar enligt ökande ljusmängder direkt respektive indirekt. Data som visas i staplar är medelvärden, felstaplar är standardavvikelse (n = 3). A.u. - godtyckliga enheter, g.s. - ljusintensitetsvärde mätt i gråskala. LITerceller11 hade en dosresponsiv ökning av proteinnivåerna som var statistiskt signifikant med ANOVA 1-tailed test med ett p-värde på 2, 79E-04 respektive 0, 016 för KRAS- respektive fosforylerade ERK- nivåer. Denna siffra har ändrats från Guinn (2019)11. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Läsare av denna artikel kan få insikt i de steg som är avgörande för att karakterisera optogenetiska genkretsar (liksom andra genuttryckssystem), inklusive 1) genkretsdesign, konstruktion och validering; 2) Cellteknik för införande av genkretsar i stabila cellinjer (t.ex. Flp-FRT-rekombination). 3) Induktion av de konstruerade cellerna med en ljusbaserad plattform såsom LPA; 4) Inledande karakterisering av ljusinduktionsanalyser via fluorescensmikroskopi. och 5) slutlig genuttryck karakterisering med en mängd olika analyser, inklusive flödescytometri, kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) eller immunofluorescensanalyser.

Dessutom är de metoder som beskrivs ovan mycket modulära för i huvudsak alla genkretsarkitekturer som uttrycker gener av intresse, med de viktigaste potentiella protokolländringarna vid kretskonstruktionssteget och de analyser som utförs. När det gäller genkretskonstruktion gör flexibiliteten i molekylär kloning att alla gener av intresse kan utbytas eller uttryckas tillsammans med en fluorescensmarkör med mindre ändringar av primerdesign eller monteringsprotokoll. Dessutom, medan de förfaranden som beskrivs här främst fokuserar på en NF-genkretsdesign för exakt (lågbruset) genuttryckskontroll, kan andra arkitekturer som positiv reglering eller positiv feedback (PF) implementeras för att uppnå olika funktioner som hög vik förändring eller högt genuttrycksljud, respektive56,57 . Genom att använda en mängd olika genkretsarkitekturer (t.ex. PF, NF, etc.) kan forskare utforska olika biologiska frågor som de roller proteinnivå magnitud och buller spelar i läkemedelsresistens eller metastasering58. Protokollen som listas här fokuserar också på olika sätt att kvantifiera genuttryck, men valfritt antal funktionella analyser (t.ex. cellmotilitet, sårläkning, spridning etc.) kan läggas till efter mikroskopiförvärv med liten eller ingen effekt på de föregående metoderna. Detta är särskilt relevant för encelliga studier där optogenetik kan använda spatiotemporal induktion för att studera beteenden som pulsatil uttrycksdynamik59.

Som komplement till metodens modularitet är felsökning en annan viktig funktion i varje huvudprotokoll. För kretskonstruktion finns de viktigaste skillnaderna i lämplig kretsspecifik primerdesign, medan senare metoder som montering och plasmidförstärkning via bakterietillväxt är mer standardiserade och inkluderar vanligtvis sina egna omfattande felsökningsförfaranden. Cellteknik kan modifieras med läkemedelstitreringskurvor beroende på vilken cellinje som används. Om en kommersiell cellinje används kan felsökningsguider dessutom erhållas direkt från mobillinjetillverkaren. Oavsiktliga ljuseffekter är också viktiga att kvantifiera på de konstruerade cellinjerna. Till exempel, på grund av de fototoxiska effekterna av 470 nm ljus, bör en ljusintensitetskurva skapas för att undersöka induktion av död eller skada i en population. När en mängd olika ljusvärden har testats kan användare skapa en FSC-SSC-grind eller använda en metod som propidiumjodidfärgning för att kvantifiera döda / skadade celler och därför fungera som ett verktyg för att bestämma lämpliga ljusområden att använda experimentellt.

För felsökning av LPA kan lysdioder ge kanteffekter av ljus- och värmekorstalk med intilliggande brunnar. Högintensiva brunnar kan till exempel orsaka viss induktion i intilliggande brunnar om det finns en felaktig tätning eller en stor värme/ljusgradient mellan brunnar. Dessa effekter kan vara maximala om LPA är programmerad i en viss ordning (t.ex. stigande/fallande) av en ljusparameter. För att bekämpa detta tillåter IRIS-programvaran användare att använda en randomiseringsmatris för att randomisera brunnsintensiteterna och därmed minska systematiska fel. För felsökning av aspekter av fluorescensmikroskopi är exponeringstid, förstärkningsinställningar (kontroll av kamerans känslighet) och ljuskällans intensitet de viktigaste parametrarna som kan justeras. Att justera dessa parametrar kan möjliggöra optimal bildproduktion och idealiska signal-till-brus-förhållanden samt undvika övermättnad och fototoxicitet.

För felsökning av flödescytometri är fotomultiplikiplierrörspänningar och cellulär gating de viktigaste aspekterna som kan justeras. Justering av dessa parametrar kan möjliggöra idealiska jämförelser mellan experimentella förhållanden och kontrollprover, korrekt signalförvärv för både svaga eller starka fluorescenssignaler och uteslutning av cellulära skräp eller oönskade cellpopulationer. Det bör noteras att flödescytometrispänningar idealiskt hålls konstanta över experiment för att möjliggöra korrekta jämförelser. För optogenetiska system som kräver flera fluorescensutgångar (t.ex. FITC och PE) måste användarna dessutom vara medvetna om fluorescenskompensation som ges korsstalk mellan fluoroforer. I sådana fall är kontroller avgörande för att bestämma lämpliga fluorescenssignaler. Kontroller som kommer att vara nödvändiga för användare att utföra inkluderar fluorescerande pärlor, färgade celler med intressemarkör eller celler som utgör det fluorescensprotein som kan användas för att skapa en kompensationsmatris i flödescytometriprogramvaran av intresse. Oavsett om de använder en fluorescensmarkör eller mer bör alla användare dessutom rutinmässigt mäta fluorescenssignaler från varje markör för icke-fluorescerande celler, vilket ger autofluorescens/bakgrundssignaler. qRT-PCR-felsökning inkluderar varierande cDNA-mängder och sonddesign, som ofta är projektspecifika. Slutligen, för felsökning av immunofluorescens, är antikroppskoncentrationer den största variabeln för analyskvantifiering, vilket kräver optimal koncentrationsbestämning.

En felsökningsaspekt som är relevant för de flesta av ovanstående metoder är isoleringseffekten av att använda en förseglad platta med celler täckta med folie. Denna metod kan hämma det koldioxidgasutbyte som behövs för korrekt tillväxt av olika cellinjer. Från tidigare experimentell erfarenhet var detta inte ett betydande hinder för cellulär tillväxt för ett 3-5 dagars experiment med hjälp av de konstruerade cellinjerna i detta manuskript men kan bli viktigt för andra cellinjer eller experimentella varaktigheter. För att ta itu med detta problem omfattar en anpassning som genomförts med de förseglade plattorna att använda koldioxidoberoende medier, vilket inte har påverkat tillväxten av celler som används i denna studie. Det bör noteras för andra analyser eller cellinjer där ämnesomsättning, pH-nivåer och celltäthet är viktiga, andra interventioner kan behövas såsom byte av media eller näringsämnen oftare.

Gränserna för de metoder som beskrivs här finns i den genkrets som används, den optogenetiska teknikprecisionen och LPA-gränssnittet med annan utrustning som fluorescensmikroskop. Tekniken som beskrivs här är prisvärd, snabb att bygga och lätt att validera46 för populationer av optogenetiskt konstruerade celler. Det finns dock vissa rumsliga begränsningar, till exempel oförmågan att styra enstaka celler utan ändringar i ljusinduktionsinställningen, till exempel att använda digitala spegelenheter (DMD), med nyligen visade fördelar i levande celler60,61. Dessutom är de metoder som beskrivs här begränsade i live-cell spårning under optogenetisk stimulering, vilket endast möjliggör slutpunktsdata förvärv av hela experimentella tidskursen.

Trots dessa gränser kompletterar de optogenetiska metoder som beskrivs här den befintliga tekniken, såsom DMDs, som har flexibiliteten att kontrollera enskilda celler i realtid men begränsas av antalet prover man kan stimulera. Dessutom kontrasterar de stabila celllinjeteknikmetoder som diskuteras här befintliga syntetiska biologimetoder som ofta karakteriserar konstruerade genetiska system via transienta transfektioner. Transienta transfection metoder är i sig noisier på grund av att större genkrets kopia nummer variationen mellan celler. Däremot involverar de metoder som presenteras här monoklonala cellvarianter, var och en innehåller en genkretskopia. Stabila cellinjer gör det möjligt att utforska cellulära aspekter som genuttrycksvariation, proteinnivåeffekter på fenotypiska landskap och encelliga metoder med finare precision eftersom det finns högre förtroende för att varje cell är identisk med sina grannar.

Arbetet här visar en plattform för att designa alla genomiskt integrerade optogenetiska genkretsar av intresse, inducera sådana system med tillförlitliga experimentella verktyg och karakterisera dem med en mängd olika genuttryck och funktionella / fenotypiska analyser på ett standardiserat sätt. Framtida förbättringar av dessa protokoll kan omfatta integrering av dessa metoder med live-cell spårning med hjälp av andra optogenetiska tekniker såsom DMDs, vilket kommer att möjliggöra spatiotemporal kontroll av genuttryck och funktionella tillämpningar på encellsnivå. Sådana framsteg kommer att göra det möjligt att producera genuttrycksmönstret av intresse i enskilda celler, upprätta transkription / översättningsdynamik, kvantifiera proteinnivåer och studera deras roll i olika biologiska processer, inklusive cellmigration, spridning, metastasering och differentiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi vill tacka Balázsi lab för kommentarer och förslag, Dr. Karl P. Gerhardt och Dr. Jeffrey J. Tabor för att hjälpa oss att bygga den första LPA, och Dr Wilfried Weber för att dela LOV2-degron plasmids. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health [R35 GM122561 och T32 GM008444].; Laufer centrerar för läkarundersökning och kvantitativ biologi; och ett NDSEG-stipendium (National Defense Science and Engineering). Finansiering av öppen avgift: NIH [R35 GM122561].

Författarbidrag: M.T.G. och G.B. utformade projektet. M.T.G., D.C., och L.G., utförde experimenten. M.T.G., D.C., L.G., och G.B. analyserade data och förberedde manuskriptet. G.B och M.T.G. övervakade projektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes Eppendorf 951010006 reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X Thermo Fisher Scientific MT25053CI reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000020 tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000055 tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap Corning 352235 reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V Eppendorf 22628113 equipment for mammalian culture work
Agarose Denville Scientific GR140-500 reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates VWR® 60941-126 tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin Sigma Aldrich A9518-5G reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer Thermo Fisher Scientific 02215365PR tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140010 reagent for growing bacteria
BD LSRAria BD 656700 tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa BD 649225 tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine Government Scientific Source SIGA4919-1G reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC Corning 353043 plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge VWR 22628113 instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood N/A N/A instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid BD 353047 plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask USA Scientific CC7682-4825 container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fischer Scientific BP231-100 reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15-585-011 reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid Corning 353072 container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express De Novo Software: N/A software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL Corning 35-010-CV reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose Thermo Fisher Scientific 11-965-092 reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL Life Technologies 10687-010 reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad Laboratories 1708890 reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C VWR 76210-392 equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C Panasonic MDF-U74VC equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C VWR 76359-220 equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg Sigma-Aldrich L3022-250G reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000 Life Technologies L3000008 reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019 MathWorks N/A software for analyzing experimental data
Methanol Acros Organics 413775000 reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL VWR 20170-333 plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
MultiTherm Shaker Benchmark Scientific H5000-HC equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-NDL-US-CAN equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix NEB M0492S reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs (NEB) C3019H bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs (NEB) E2621L reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera Nikon Instruments Inc. N/A instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements Nikon Instruments Inc. N/A software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides IDT N/A reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control Panasonic MCO-170AICUVHL-PA instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade Electron Microscopy Sciences 15710-S reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) Invitrogen 14190144 reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x Fisher Scientific 15140-122 reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody Cell Signaling Technology 4370S primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody Sigma-Aldrich WH0003845M1 primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Eppendorf A28137 equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App Thermo Fisher Scientific N/A software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody Cell Signaling Technology 8889S secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody Invitrogen A11005 secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL Olympus Plastics 12-102 reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System Major Science UVCI-1200 tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene SnapGene N/A software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator Tokai Hit INU-TIZ tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557 reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn Life Technologies 4326317E qPCR Probe
Thermocycler Bio-Rad 1851148 tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated PerkinElmer 1450-605 plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm VWR 14673-010 reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System VWR 89032-290 equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293 Thermo Fisher Scientific R75007 Engineered cell line with FRT site

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822 (2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247 (2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670 (2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), New York, N.Y. 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18 (2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131 (2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521 (2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547 (2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314 (2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111 (2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887 (2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128 (2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591 (2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , Stockton Press. New York. (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. TaborLab IRIS. TaborLab IRIS Software. , Available from: http://taborlab.github.io/Iris/index.html (2021).
  48. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849 (2017).
  49. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  50. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  51. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
  52. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  53. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436 (2020).
  54. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  55. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , Ann Arbor. Ph.D (2020).
  56. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766 (2019).
  57. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  58. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726 (2020).
  59. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  60. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  61. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355 (2020).

Tags

Bioengineering nummer 173 optogenetik genuttryckskontroll syntetisk biologi negativ återkoppling genkretsar
Tillförlitligt konstruera och kontrollera stabila optogenetiska genkretsar i däggdjursceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., … More

Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (173), e62109, doi:10.3791/62109 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter