Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

هندسة ومراقبة الدوائر الجينية البصرية المستقرة في خلايا الثدييات بشكل موثوق

Published: July 6, 2021 doi: 10.3791/62109
Automatic Translation
1,2,3, *2, *2, 1,2
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program
* These authors contributed equally

Summary

يتطلب التحكم الموثوق في خلايا الثدييات المستجيبة للضوء توحيد الطرق البصرية الوراثية. ولتحقيق هذا الهدف، تحدد هذه الدراسة خط أنابيب لبناء الدوائر الجينية، وهندسة الخلايا، وتشغيل المعدات البصرية الوراثية، واختبارات التحقق لتوحيد دراسة التعبير الجيني الناجم عن الضوء باستخدام دائرة جينية بصرية وراثية سلبية كدراسة حالة.

Abstract

يتطلب التحكم الموثوق في التعبير الجيني في خلايا الثدييات أدوات ذات تغيير عالي في الطية ، وضوضاء منخفضة ، ووظائف نقل محددة من المدخلات إلى المخرجات ، بغض النظر عن الطريقة المستخدمة. ولتحقيق هذا الهدف، اكتسبت أنظمة التعبير الجيني البصري الوراثي الكثير من الاهتمام على مدى العقد الماضي للتحكم الزماني المكاني في مستويات البروتين في خلايا الثدييات. ومع ذلك، فإن معظم الدوائر الحالية التي تتحكم في التعبير الجيني الناجم عن الضوء تختلف في العمارة، ويتم التعبير عنها من البلازميدات، وتستخدم معدات بصرية وراثية متغيرة، مما يخلق حاجة لاستكشاف توصيف وتوحيد المكونات البصرية الجينية في خطوط الخلايا المستقرة. هنا ، توفر الدراسة خط أنابيب تجريبي لبناء دائرة جينية موثوقة ، والتكامل ، والتوصيف للتحكم في التعبير الجيني المستحث للضوء في خلايا الثدييات ، باستخدام دائرة بصرية وراثية سلبية كمثال على ذلك. توضح البروتوكولات أيضا كيف يمكن لتوحيد المعدات البصرية الوراثية وأنظمة الضوء أن يكشف بشكل موثوق عن ميزات الدائرة الجينية مثل ضوضاء التعبير الجيني وحجم التعبير البروتيني. وأخيرا، قد تكون هذه الورقة مفيدة للمختبرات غير المألوفة في علم البصريات الوراثي الذين يرغبون في اعتماد مثل هذه التكنولوجيا. يجب أن ينطبق خط الأنابيب الموصوف هنا على الدوائر البصرية الجينية الأخرى في خلايا الثدييات ، مما يسمح بتوصيف أكثر موثوقية وتفصيلا والتحكم في التعبير الجيني على مستوى النسخ والبروتيوم والنمط الظاهري في نهاية المطاف في خلايا الثدييات.

Introduction

وعلى غرار التخصصات الهندسية الأخرى، تهدف البيولوجيا التركيبية إلى توحيد البروتوكولات، مما يسمح باستخدام الأدوات ذات الوظائف القابلة للتكرار للغاية لاستكشاف الأسئلة ذات الصلة بالنظم البيولوجية1،2. أحد المجالات في البيولوجيا التركيبية حيث تم بناء العديد من أنظمة التحكم هو مجال تنظيم التعبير الجيني3,4. يمكن أن يستهدف التحكم في التعبير الجيني كلا من مستويات البروتين والتباين (الضوضاء أو معامل التباين ، CV = σ / μ ، مقاسا على أنه الانحراف المعياري عن المتوسط) ، وهي خصائص خلوية حاسمة بسبب أدوارها في الحالات الخلوية الفسيولوجية والمرضية5،6،7،8. تم تصميم العديد من الأنظمة الاصطناعية التي يمكنها التحكم في مستويات البروتين والضوضاء4،9،10،11،12 ، مما يخلق فرصا لتوحيد البروتوكولات عبر الأدوات.

إحدى الأدوات الجديدة التي يمكنها التحكم في شبكات الجينات التي ظهرت مؤخرا هي علم البصريات الوراثي ، مما يتيح استخدام الضوء للتحكم في التعبير الجيني13،14،15،16،17. على غرار سابقاتها الكيميائية، يمكن إدخال دوائر الجينات البصرية الجينية في أي نوع من الخلايا، بدءا من البكتيريا إلى الثدييات، مما يسمح بالتعبير عن أي جين في اتجاه مجرى النهر محل اهتمام18،19. ومع ذلك ، بسبب التوليد السريع للأدوات البصرية الجينية الجديدة ، ظهرت العديد من الأنظمة التي تختلف في بنية الدوائر الجينية ، وآلية التعبير (على سبيل المثال ، التكامل القائم على البلازميد مقابل التكامل الفيروسي) ، ومعدات التحكم في إمدادات الضوء 11،16،20،21،22،23،24،25 . لذلك ، فإن هذا يترك مجالا لتوحيد السمات البصرية الجينية مثل بناء الدوائر الجينية وتحسينها ، وطريقة استخدام النظام (على سبيل المثال ، التكامل مقابل التعبير العابر) ، والأدوات التجريبية المستخدمة في الحث ، وتحليل النتائج.

لإحراز تقدم في توحيد البروتوكولات البصرية الجينية في خلايا الثدييات، يصف هذا البروتوكول خط أنابيب تجريبي لهندسة الأنظمة البصرية الجينية في خلايا الثدييات باستخدام دائرة جينية ذات ردود فعل سلبية (NF) مدمجة في خلايا HEK293 (خط خلايا الكلى الجنينية البشرية) كمثال. NF هو نظام مثالي لإثبات التوحيد القياسي لأنه وفير للغاية26،27،28 في الطبيعة ، مما يسمح بضبط مستويات البروتين وتقليل الضوضاء. باختصار ، يسمح NF بالتحكم الدقيق في التعبير الجيني بواسطة المثبط الذي يقلل من تعبيره بسرعة كافية ، وبالتالي يحد من أي تغيير بعيدا عن الحالة الثابتة. يمكن تغيير الحالة الثابتة بواسطة محفز يعطل أو يزيل المثبط للسماح بمزيد من إنتاج البروتين حتى يتم الوصول إلى حالة مستقرة جديدة لكل تركيز محفز. في الآونة الأخيرة، تم إنشاء نظام بصري وراثي NF مصمم هندسيا يمكنه إنتاج استجابة ديناميكية واسعة للتعبير الجيني، والحفاظ على ضوضاء منخفضة، والاستجابة للمحفزات الضوئية مما يسمح بإمكانية التحكم في التعبير الجيني المكاني11. هذه الأدوات ، المعروفة باسم الموالفات المستحثة للضوء (LITers) ، مستوحاة من الأنظمة السابقة التي سمحت بالتحكم في التعبير الجيني في الخلايا الحية4،10،29،30 وتم دمجها بشكل ثابت في خطوط الخلايا البشرية لضمان التحكم في التعبير الجيني على المدى الطويل.

هنا، باستخدام LITer كمثال، يتم تحديد بروتوكول لإنشاء دوائر جينية مستجيبة للضوء، وتحفيز التعبير الجيني باستخدام جهاز لوحة الضوء (LPA، وهو جهاز تحريض بصري وراثي)31، وتحليل استجابات خطوط الخلايا المهندسة التي يمكن التحكم فيها بصريا لمحفزات الضوء المخصصة. يسمح هذا البروتوكول للمستخدمين باستخدام أدوات LITer لأي جين وظيفي يرغبون في استكشافه. ويمكن أيضا تكييفها مع الأنظمة البصرية الجينية الأخرى ذات معماريات الدوائر المتنوعة (على سبيل المثال، ردود الفعل الإيجابية، والتنظيم السلبي، وما إلى ذلك) من خلال دمج الأساليب والمعدات البصرية الوراثية الموضحة أدناه. على غرار بروتوكولات البيولوجيا التركيبية الأخرى ، يمكن تطبيق تسجيلات الفيديو والبروتوكولات البصرية الجينية الموضحة هنا في دراسات الخلية الواحدة في مجالات متنوعة ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر بيولوجيا السرطان والتطور الجنيني وتمايز الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصميم الدوائر الجينية

  1. حدد المكونات الجينية لتتحد في دائرة جينية واحدة / بلازميد واحد (على سبيل المثال ، زخارف تسلسل تكامل الحمض النووي للثدييات 32 ، العناصر المستجيبة للضوء33 ، أو الجينات الوظيفية 34).
  2. باستخدام أي هندسة وراثية و/أو برنامج استنساخ جزيئي، قم بتخزين تسلسلات الحمض النووي لاستخدامها والرجوع إليها لاحقا، والتعليق على كل تسلسل، وفحص جميع الميزات الضرورية (على سبيل المثال، كودونات START، أو التسلسلات التنظيمية، أو المترجمة)35.
  3. تطوير أو اعتماد أجزاء وفقا للتصميم العام للدائرة الجينية36. على سبيل المثال، بالنسبة للمثبطات البصرية الجينية كما هو الحال في LITers11، قم بدمج ترميز تسلسل جيني لمجال قادر على التدهور الناجم عن الضوء37,38 أو تعطيل قدرة ربط الحمض النووي للمثبط39، بجوار الجين المثبط وفي إطاره (على سبيل المثال، TetR)4.
    1. بالنسبة للمنشطات البصرية الوراثية، تأكد من وجود مجال منشط40 يعزز التعبير الجيني عند ربط الحمض النووي الناجم عن الضوء41. بالنسبة للتنظيم التلقائي السلبي أو الإيجابي ، تأكد من وجود موقع ملزم تنظيمي في أو في المنبع لمروج الجين المنظم (على سبيل المثال ، مواقع tetO في أو في المنبع من TetR الذي يعبر عن المروج)42.
  4. تصميم الاشعال لتضخيم تسلسل الحمض النووي أو تسلسل البلازميد باستخدام برنامج الاستنساخ الجزيئي لكل دائرة جينية.
  5. التحقق من صحة الاشعال حسابيا لبناء البلازميد من خلال الولائم المدمجة في برامج الاستنساخ الجزيئي (على سبيل المثال ، محاذاة التسلسل).
  6. اطلب أوليغونوكليوتيد الاشعال من الشركة المصنعة. يمكن العثور على البلازميدات التي تم بناؤها واستخدامها في هذا العمل في المواد الداعمة الأصلية11 إلى جانب الاشعال المصممة والمستخدمة.
  7. قم بتخفيف الاشعال إلى تركيز مخزون 100 mM في الماء المقطر المزدوج (ddH2O).
  8. قم بتخفيف مخزون الاشعال من 100 mM إلى تركيز 10 mM ل PCR.
  9. قم بإعداد مزيج PCR مع 1 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي ، و 1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي ، و 1 ميكرولتر من الحمض النووي للقالب إلى كتلة إجمالية تبلغ 0.5-500 نانوغرام للجينومي أو 0.5 pg-5 ng للبلازميد أو الحمض النووي الفيروسي ، و 12.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لبوليميراز الحمض النووي 2x (أو الحجم الذي يلبي عامل التخفيف الخاص بالشركة المصنعة) ، و 9.5 ميكرولتر من ddH2O لحجم تفاعل إجمالي قدره 25 ميكرولتر.
  10. احتضان مزيج PCR في جهاز تدوير حراري في الإعدادات المناسبة اعتمادا على الإنزيم المختار43. تتضمن دورات التفاعل المقترحة ما يلي:
    الخطوة 1: دورة واحدة من 30 ثانية خطوة تمسخ أولية عند 95 درجة مئوية.
    الخطوة 2: 40 دورة من 5 ثانية من خطوة تمسخ عند 98 درجة مئوية.
    الخطوة 3: دورة واحدة من 30 ثانية من خطوة التلدين عند 65 درجة مئوية (تحددها الاشعال المصممة مسبقا).
    الخطوة 4: دورة واحدة مدتها دقيقة واحدة من التمديد عند 72 درجة مئوية (~ 1 كيلو قاعدة (kb) طول جزء القالب).
    الخطوة 5: دورة واحدة من تمديد 2 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
    استمر في التفاعل عند 4 درجات مئوية حتى يمكن اختباره عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي. سيختلف هذا البروتوكول اعتمادا على الكواشف المستخدمة (على سبيل المثال ، البوليميراز والمخازن المؤقتة).
  11. كرر الخطوة 1.9 لتضخيم جميع الأجزاء التي سيتم استخدامها في تفاعل تجميع الحمض النووي المطلوب لربط منتجات PCR الخطية بمتجه حمض نووي دائري واحد.
  12. قم بتشغيل منتجات PCR على جل أغاروز بنسبة 1٪ متبوعا بتنقية الأشرطة ذات الطول المطلوب.
  13. تحضير المزيج الرئيسي لتفاعل تجميع الحمض النووي (الجدول 1).
    ملاحظة: في هذا المثال، يتم تقسيم المتجه الأم إلى جزأين لزيادة كفاءة خطوات تفاعل البوليميراز المتسلسل دون التسبب في تغييرات كبيرة في نتيجة التجميع الإجمالية.
  14. احتضان المزيج الرئيسي لتفاعل تجميع الحمض النووي في جهاز تدوير حراري عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (ما لم ينص على خلاف ذلك في بروتوكول كاشف تجميع الحمض النووي) وتخزين التفاعل عند 4 درجات مئوية لاستخدام منتج التفاعل للتحول البكتيري.
  15. إعداد التحول البكتيري (الكيميائي أو الكهربي) باستخدام خلايا الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية) المختصة وبروتوكول التحول البكتيري المقابل. بعد التحول، استخدم ألواح أجار لوريا بيرتاني البكتيرية (LB) التي تحتوي على علامة الاختيار البكتيرية المختارة (على سبيل المثال، الأمبيسيلين) لطلاء مزيج التحول. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها44.
  16. تحقق من اللوحات في اليوم التالي. لتلقيح المستعمرات ، اختر مستعمرات فردية من الألواح وأعد تعليقها في مرق LB سائل مع علامة الانتقاء البكتيرية المقابلة في أنابيب الزرع. احتضن في حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية ، 300 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
  17. إجراء بروتوكول تحضير البلازميد لاستخراج الحمض النووي البلازميد من الثقافة البكتيرية.
  18. تحقق من صحة الدائرة في خطوتين. أولا ، قم بإجراء عملية هضم تجريبية باستخدام إنزيمات التقييد كتحقق خام لمعرفة ما إذا كان قد تم الحصول على منتج البلازميد التقريبي. ثانيا ، إذا تم اجتياز / تأكيد اختبار الهضم ، فقم بإرسال البلازميد إلى منشأة تسلسل Sanger (أو العملية باستخدام المعدات المتاحة) للحصول على تسلسل الحمض النووي الدقيق لمقارنته لاحقا بالتسلسل المتوقع في برنامج التصميم.
    1. لإجراء عملية هضم الاختبار، حدد اثنين على الأقل من إنزيمات التقييد التي تنتج جزأين على الأقل، استنادا إلى برنامج الاستنساخ الجزيئي المستخدم. بمجرد اختيار الإنزيمات ، قم بإعداد عينات الاختبار عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من كل إنزيم ، و 5 ميكرولتر من الحمض النووي المتولد ، و 13 ميكرولتر من الماء مع الأملاح والمخازن المؤقتة المناسبة اعتمادا على الإنزيمات المستخدمة. احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، أو كما تقترح الشركة المصنعة للإنزيم. قم بتشغيل منتجات هضم الاختبار على هلام أغاروز بنسبة 1٪ وحدد ما إذا كانت الأشرطة صحيحة.
      ملاحظة: إذا كانت النطاقات صحيحة، فانتقل إلى التسلسل.
    2. لإجراء التسلسل ، قم بإنشاء الاشعال استنادا إلى الحمض النووي المخزن في البرنامج بحيث تكون مناطق التلدين في الاشعال على بعد حوالي 500 نقطة أساس (أزواج قاعدة) وتغطي الجزء محل الاهتمام (مكون الدائرة الجينية) أو البلازميد الكامل. قم بتخفيف الاشعال بالماء النقي الخالي من النوكليز (NF-H2O) إلى تركيز 10 ملليمتر. قم بإعداد عينات التسلسل عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي 10 نانوغرام / ميكرولتر ، و 1 ميكرولتر من التمهيدي ، و 8 ميكرولتر من NF-H2O إلى أنبوب 0.2 مل. كرر هذا لكل تمهيدي.
      ملاحظة: عند إعداد العينات، قم بإسقاطها في مرفق التسلسل وقارن النتائج مع تسلسل البلازميد باستخدام برنامج الاستنساخ الجزيئي.
  19. في هذه الخطوة ، قم بإنشاء ما يقرب من 100-1000 نانوغرام / ميكرولتر من عينة الحمض النووي لدمج البلازميدات التي تحتوي على دوائر جينية في خط الخلية المناسب.

2. هندسة خط الخلية المستقرة

  1. اطلب خط خلية ثدييات مصمم للتوليد السريع للخطوط الفرعية المستقرة التي تضمن تعبيرا عالي المستوى عن البروتين الذي يثير الاهتمام من متجه تعبير الثدييات. يمكن أن يكون نوع الخلية وسهولة هندسة خط الخلية متغيرين اعتمادا على ما يفضله المستخدمون أو يهدفون إلى تحقيقه.
    1. على سبيل المثال، إذا كان المستخدمون يفضلون هندسة خط الخلايا مع الحد الأدنى من الخطوات الوسيطة، فقم بترتيب الخلايا التي تحتوي على موقع تكامل مستقر واحد (على سبيل المثال، FRT) في موضع جينومي نشط نسخيا. إذا كانت هندسة الخلايا أكثر دقة، فقم بإنشاء مواقع تكامل في المواقع المفضلة باستخدام أدوات الهندسة الوراثية مثل CRISPR/Cas9.
  2. تنمو الخلايا في 5٪ CO2 في الهواء الرطب عند 37 درجة مئوية. اضبط ظروف النمو حسب الحاجة لنوع الخلية.
  3. نقل الدوائر الجينية المصممة أعلاه في الخلايا المطلوبة التي تم الحصول عليها من الخطوات السابقة لبدء عملية توليد خط خلية مستقرة. لتحقيق ذلك ، استخدم خليط الجسيمات الشحمية45 من الحمض النووي للدائرة الجينية مع recombinase المناسب (على سبيل المثال ، Flp-recombinase لإعادة تركيب Flp-FRT) أو من خلال طرق أخرى مثل الكهربية.
  4. بعد يومين من النقل ، قم بتقسيم الخلايا إلى التقاء بنسبة 25٪.
  5. بعد ست ساعات من تقسيم الخلايا ، ابدأ في اختيار المضادات الحيوية عن طريق تبادل الوسائط إلى وسائط جديدة تحتوي على 50 ميكروغرام / مل من المضاد الحيوي Hygromycin (أو عامل مضاد حيوي آخر يتوافق مع جين مقاومة المضادات الحيوية للثدييات الذي تم اختياره أثناء بناء البلازميد).
    ملاحظة: هناك مجموعة متنوعة من جينات مقاومة المضادات الحيوية للثدييات المستخدمة في بناء الدوائر الجينية ، ولكل منها منحنى قتل مختلف. لذلك ، أيا كان جين مقاومة المضادات الحيوية للثدييات الذي يتم اختياره لبناء الدائرة ، يجب دراسة منحنى القتل المناسب في الخلايا ذات الاهتمام. تضمن هذه الخطوة إثراء الخلايا التي تحتوي على حمولة الدائرة الجينية بينما يتم قتل الخلايا التي لا تحتوي على النظام.
  6. اسمح للخلايا بالنمو في وسائط اختيار المضادات الحيوية ، وقم بالتغيير إلى وسائط جديدة كل 2-3 أيام حتى تحتوي اللوحة أو القارورة على بضع عشرات من البؤر. تمر الثقافات الملتصقة عندما تكون في مرحلة السجل قبل أن تصل إلى الالتقاء.
  7. بمجرد وجود العديد من البؤر بما فيه الكفاية ، قم بالتريبسين على الخلايا مع 1 مل من 0.25٪ من التربسين ، و 0.1٪ EDTA في محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) بدون الكالسيوم والمغنيسيوم وبيكربونات الصوديوم لعدة دقائق. تحييد التربسين مع وسائل الإعلام الطازجة وتمرير جميع الخلايا في حاوية جديدة.
  8. بمجرد أن تكون الخلايا الموجودة في الحاوية الطازجة متقاربة بنسبة 80٪ -100٪ ، قم بتجميدها في مزيج من 45٪ من الوسائط القديمة ، و 45٪ من الوسائط الجديدة ، و 10٪ DMSO. انقل الخلايا المتبقية إلى أنبوب معقم وقم بإجراء فرز أحادي الخلية لعزل الخلايا وحيدة النسيلة في صفيحة من 96 بئرا.
  9. بعد حوالي 2-3 أسابيع من الفرز أحادي النسيلة ، يجب أن تحتوي الآبار داخل لوحة البئر المكونة من 96 بئرا على بؤر. عندما يلتقي حوالي 50٪ -60٪ ، قم بتقسيم الخلايا إلى صفيحة من 12 بئرا.
  10. بمجرد أن تكون اللوحة المكونة من 12 بئرا ملتقية بنسبة 80٪ -100٪ ، تنقسم إلى قارورة T-25 المعالجة بزراعة الأنسجة. بمجرد أن تلتقي الخلايا الموجودة في قارورة T-25 بنسبة 80٪ -100٪ ، قم بتجميد الخلايا والحفاظ على ممر لتوصيف واختبار خطوط الخلايا وحيدة النسيلة.
    1. توصيف خطوط الخلايا وحيدة النسيلة عن طريق الفحص المجهري ومقايسات قياس التدفق الخلوي للإبلاغ عن ملامح التعبير الجيني بناء على إنتاج مراسل الفلورسنت المستحث. تحقق من إنتاج البروتين الوظيفي عن طريق وضع العلامات على الأجسام المضادة الفلورية وفحص التألق المناعي. اختبر تحريض التعبير الجيني على مستوى النسخ عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR). التحقق من صحة التسلسل الجيني ودقة التكامل من خلال تسلسل الجينوم المحلي والكامل للمستنسخات.

3. مقايسات تحريض جهاز لوحة الضوء

  1. بناء جهاز LPA31,46 لاستخدامه في الحث الضوئي للخلايا الهندسية. باختصار ، هناك العديد من الخطوات الواسعة الحاسمة لإنشاء LPA لاستخدامها في التحكم في التعبير الجيني. وتشمل هذه مكونات إطار LPA الطباعة 3D ، وبناء لوحة الدوائر ، وبرمجة الدائرة عبر مبرمج microcontroller ، وتجميع المكونات في LPA النهائي ، وبرمجة بطاقة الذاكرة عبر برنامج IRIS ، ومعايرة الجهاز النهائي. للحصول على شرح أكثر شمولا ، راجع المراجع المذكورة أعلاه.
    1. اطبع الأجزاء ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في Gerhardt et al. (2016 و 2019)31,46.
    2. قم بتجميع لوحة الدوائر كما هو موضح في Gerhardt et al. (2016 و 2019)31,46.
    3. أضف البرنامج الثابت إلى دائرة LPA المجمعة باستخدام مبرمج المتحكم الدقيق كما هو موضح في Gerhardt et al. (2016 و 2019)31,46.
    4. الجمع بين الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد ولوحة الدوائر المجمعة كما هو موضح في Gerhardt et al. (2016 و 2019)31,46. ويشمل ذلك أخذ لوحة التركيب ، ولوحة الدوائر ، وفاصل LED (الثنائيات الباعثة للضوء) ، ومحول اللوحة ، ولوحة 24 بئرا ، وغطاء لوحة ، ومسامير التثبيت ، وصواميل الجناح ومكونات التراص كما هو موضح في الفيديو المصور والشكل 2.
    5. لبرمجة بطاقة الذاكرة ومعايرتها للجهاز، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
  2. استخدم برنامج IRIS المتوفر على موقع مختبر تابور47 لبرمجة بطاقة SD لجهاز لوحة الضوء (LPA)31 واستكشاف ظروف الإضاءة المناسبة اللازمة لبدء تجربة بصرية وراثية.
    ملاحظة: برنامج IRIS هو تطبيق قائم على الويب لبرمجة الأجهزة الإلكترونية البصرية الجينية ، والمعروفة باسم LPA ، التي طورها مختبر تابور. يسمح البرنامج ببرمجة قيم IRIS النسبية التي تتحكم في الثنائيات الفردية الباعثة للضوء (LEDs) في كل بئر من أجهزة LPA.
  3. اختر خيار القائمة المنسدلة LPA (4 × 6)، متبوعا بالنقر فوق نهج الإضاءة المناسب (الحالة الثابتة، الديناميكية، المتقدمة).
    ملاحظة: بالنسبة لهذه المخطوطة، ستركز جميع الفحوصات على أمثلة الحالة الثابتة. ومع ذلك ، يمكن استخدام أمثلة الإعداد المتقدمة لفترات النبض وأنظمة دورة العمل.
  4. اختر ما إذا كانت مصابيح LED العلوية أو السفلية ستضيء عن طريق إدخال قيم في الخلايا المقابلة لآبار اللوحة. بالنسبة ل LPAs المستخدمة في هذا العمل ، تم استخدام مصابيح LED الزرقاء الموضوعة في الموضع العلوي في جميع التجارب. يمكن لكل مصباح LED ، بمجرد برمجته ، توفير التعرض المستمر للضوء مع شدة ضوء ثابتة. يسمح برنامج IRIS بمستويات كثافة 4096 التي يمكن برمجتها.
  5. بمجرد اختيار مواقع LED ، أدخل قيم الكثافة للمخطط التفصيلي التجريبي المطلوب. على سبيل المثال، أدخل 8 كثافات ضوء مختلفة (أو فترات نبض أو دورات عمل) مع ثلاثة تكرارات تقنية لكل لوحة (الجدول 2). يشير G.s. إلى وحدات التدرج الرمادي - قيم قياس مستوى شدة الضوء المستخدمة في برمجة LPA في برنامج IRIS.
    1. عند تصميم ملفات IRIS التجريبية ، ضع في اعتبارك تأثيرات الحافة من الآبار المجاورة على جهاز LPA ، وسمية الضوء الناتجة عن زيادة شدة التعرض للضوء الأزرق ، وتحديد نوع استجابة الجرعة المطلوبة (على سبيل المثال ، رتيبة مقابل غير أحادية التوتر).
    2. إذا قام المستخدمون ببرمجة الخلايا في LPA بترتيب تصاعدي / تنازلي لمعلمة ضوء معينة (على سبيل المثال ، الكثافة) ، فقد تنتج الآبار تأثيرات حافة من الحديث المتبادل للضوء أو حتى الحرارة التي يمكن أن تؤثر على الآبار المجاورة. هذا يمكن أن يؤثر عن غير قصد على نتائج المخرجات المقاسة عند اكتمال التجارب. للتخفيف من هذا ، يمكن للمستخدمين تنفيذ مصفوفة عشوائية على برنامج IRIS للتدافع على مواقع الآبار ، مما يقلل من تأثيرات الحافة. ويرد وصف مثال على ذلك في النتائج التمثيلية أدناه (الشكل 4 ألف - باء).
    3. وبالإضافة إلى ذلك، وجد أن الكثافة العالية للضوء الأزرق تتداخل مع النمو الخلوي وقابلية البقاء48. لذلك ، للتخفيف من سمية الضوء ، من المهم إنتاج منحنى استجابة شدة الضوء أو مدة النبض أو دورة العمل اعتمادا على الطريقة التي يتم التحقيق فيها.
      1. على سبيل المثال ، برنامج 8 قيم شدة الضوء مع ثلاثة تكرارات لكل لوحة 24 بئر ، مع نطاق من عدم وجود ضوء إلى أقصى كثافة ل LPA. بعد ذلك ، قم بتشغيل هذه العينات على مقياس تدفق خلوي مع بوابة SSC-FSC أو بقعة حية مثل يوديد البروبيديوم لتحديد بقاء الخلايا السكانية (الخلايا الحية مقارنة بإجمالي الأحداث بما في ذلك الخلايا الميتة / الحطام الخلوي) في كل قيمة ضوء.
      2. بعد ذلك ، حدد الكمية المثالية لبقاء السكان على قيد الحياة للإعداد التجريبي ، لأن أي حافز قد يؤثر سلبا على الانتشار أو التعبير الجيني أو البقاء على قيد الحياة (على سبيل المثال ، تحديد بقاء 80٪ من الخلايا كمقايضة مناسبة). على سبيل المثال ، في هذا العمل ، بمجرد معايرته ، لم تتجاوز الكثافة 3000 وحدة جم (~ 3/4 الحد الأقصى لكثافة جهاز LPA). ويرد مثال على ذلك في النتائج التمثيلية أدناه.
    4. بالإضافة إلى تقييد قيم الضوء بسبب السمية ، قد يرغب المستخدمون في تقييد قيم الضوء لتوصيف جزء معين من استجابة الجرعة ، مثل نطاق الاستجابة الرتيبة.
      1. ولتحقيق ذلك، قم في البداية بمسح مجموعة واسعة من شدة الضوء أو فترات النبض أو دورات العمل اعتمادا على الطريقة التي يتم تحليلها عند تحديد استجابة الجرعة المطلوبة (الجدول 2) لتضييق نطاق نظام الضوء محل الاهتمام، على سبيل المثال، حيث يرتبط التعبير الجيني بشكل إيجابي مع زيادة قيم الضوء لاستجابة الجرعة الرتيبة.
      2. لتحديد نطاق الضوء محل الاهتمام ، قم ببرمجة LPA واحد مع ما يصل إلى 24 بئرا ذات كثافة مختلفة / مدة النبض / دورة العمل / إلخ أو المزيد من الآبار (على سبيل المثال ، 48 ، 72 ، 96 ، إلخ) اعتمادا على ما إذا كانت LPAs متعددة معايرة لتقديم كميات ضوئية مكافئة والمضي قدما في عمل أو فحوصات زراعة الخلايا الموضحة أدناه. لذلك ، ابدأ في توصيف نظام بصري وراثي مع مجموعة واسعة من جرعة المحفزات الضوئية لتحديد الفاصل الزمني للنطاق الذي يعطي التعبير الجيني المطلوب ومن ثم إجراء تجارب في نطاق الجرعة المكررة هذا.
      3. على سبيل المثال ، في هذا العمل ، مرة واحدة تم تحديد وحدات 3000 g.s. كعتبة لشدة الضوء السام ؛ تم استخدام هذه العتبة كحد أعلى للضوء للمقايسات الموضحة أدناه (على سبيل المثال ، التألق المناعي).
        ملاحظة: الخطوات المذكورة أعلاه مستقلة عن المعايرة البصرية ل LPA وتشير إلى معايرة على المستوى الجزيئي لكل نظام بصري وراثي.
  6. بمجرد برمجة قيم شدة الضوء المناسبة في IRIS، أدخل بطاقة ذاكرة مزودة بمنفذ USB 3.0 في LPA لتنزيل الملفات ونقلها.
  7. إذا اكتملت معايرة LPA31 ، فانتقل إلى عمل زراعة الخلايا لبدء فحص تحريض الضوء. إذا لم يتم إجراء المعايرة، فقم بمعايرة LPA باستخدام طريقة تحليل الصور (الخطوات 3.7.1-3.7.3) بمجرد برمجة LPA باستخدام مبرمج المتحكم الدقيق.
    1. برمجة LPA لفترة وجيزة للحصول على نفس مستوى IRIS كما هو موضح من قبل Gerhardt et al. (2016)31.
      ملاحظة: بالنسبة للمعايرة، تمت برمجة LPA بحيث تبلغ قيمتها 2000 غرام.
    2. بمجرد برمجة الجهاز باستخدام بطاقة الذاكرة والضغط على زر إعادة الضبط (الزر الفعلي على LPA) ، احصل على صورة للجهاز بأكمله (على سبيل المثال ، جهاز تصوير محطة الهلام ، جهاز الماسح الضوئي ، إلخ). للمعايرة، احصل على صورتين مع تدوير الجهاز بمقدار 180 درجة.
    3. ثم ، استخدم برنامجا مفتوح المصدر صممه Gerhardt et al. (2016)31 لإظهار التباين في كثافة LED على لوحة LPA وحساب قيم تعويض LED لجعل الكثافة متساوية عبر الآبار. ويرد مثال على ذلك في النتائج الممثلة أدناه (الشكل 3). بمجرد اكتمال هذه المعايرة ، انتقل إلى عمل زراعة الخلايا لبدء فحص تحريض الضوء.
  8. احصل على قوارير من الخلايا وحيدة النسيلة المهندسة من القسم السابق للتحقيق في تأثيرات الحث الضوئي على التعبير الجيني.
  9. قم بإزالة الوسائط القديمة من القارورة.
  10. أضف 1 مل من التربسين إلى الخلايا واحتضنها لمدة 5 دقائق.
  11. بعد 5 دقائق ، قم بتحييد التربسين بإضافة 4 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM أو الوسائط الأخرى المرغوبة) المكملة بالمواد الكيميائية الضرورية (استخدم هذا العمل 50 ميكروغرام / مل من الهيغروميسين ، محلول البنسلين / الستربتومايسين 10٪ ، مصل البقر الجنيني ، FBS).
  12. أضف ~ 75000 خلية لكل بئر في صفيحة سوداء مكونة من 24 بئرا بحجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر. يمكن أن يختلف عدد الخلايا المصنفة اعتمادا على مدة التجربة المطلوبة ونوع الخلية المستخدمة.
    ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، لاحظ أن كثافة بذر الخلايا تؤثر على الحفاظ على الثقافة وربما على مدة التجربة. إن البدء من عدد أقل من الخلايا لكل بئر يضمن فترات زمنية أطول قبل أن تصل الثقافة إلى التقاء. وعلاوة على ذلك، فإن نوع المكونات البصرية الجينية المدمجة في الدوائر الجينية ذات الأهمية سيؤثر عندما يصل التعبير الجيني إلى حالة ثابتة، وبالتالي يؤثر على مدة التجارب. العوامل الأخرى التي يمكن أخذها في الاعتبار هي معدلات النمو الخاصة بخط الخلية ، وتكوين الوسائط ، وتأثيرات النمو المشروطة (أي الضوء).
  13. بعد الطلاء ، ضع الخلايا في حاضنة رطبة مع 5٪ CO2 للسماح لها بالاستقرار لمدة 2-6 ساعات.
  14. بعد الحضانة ، انقل الخلايا إلى غطاء زراعة الأنسجة ، وقم بإزالة الغطاء البلاستيكي ، وأضف شريطا لاصقا إلى الجزء العلوي من اللوحة (الشكل 2D). تسمح هذه الخطوة بالحد الأدنى من نقل الضوء بين الآبار ، حيث يتم طلاء الجزء العلوي وجوانب الآبار ، ولا يمكن للضوء الآن الدخول إلا من أسفل البئر حيث يتم وضع LED.
  15. ضع اللوحة في الأجزاء 3D المجهزة من LPA. ثم ، قم بتغطية اللوحة بغطاء LPA المطبوع 3D ، والذي يتناسب مع مسامير الجهاز في كل زاوية.
  16. قم بتوصيل الجهاز بمصدر الطاقة واضغط على زر إعادة الضبط على جهاز LPA لضمان تطبيق إعدادات تجربة LPA المحدثة.
  17. احتضان الخلايا داخل النظام التجريبي لفترة مناسبة من الوقت ، اعتمادا على كثافة البذر الأصلية ، وسرعة النمو الخاصة بخط الخلية ، وظروف النمو. في هذا المثال ، تم تحفيز خطوط الخلايا لمدة 3 أيام متواصلة للتعبير الجيني للوصول إلى حالة ثابتة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن العديد من الأنظمة البصرية الجينية (على سبيل المثال ، VVD) قد تصل إلى التعبير الجيني في حالة ثابتة في وقت أقرب بكثير (على سبيل المثال ، 24 ساعة) ، وبالتالي يمكن تقليل أوقات الحث التجريبية أو إطالة أمدها حسب الحاجة.
  18. في نهاية تجربة الحث الضوئي ، استخدم العينات لأي من الفحوصات الأربعة التالية لتوصيف خطوط الخلايا الهندسية (الأقسام 4-7).

4. المجهر الفلوري للخلايا الهندسية المستحثة بالضوء

  1. 24-72 ساعة بعد الحث ، قم بإزالة الخلايا الموجودة في LPA من الحاضنة ووضعها في غطاء زراعة الأنسجة.
  2. قم بإزالة شريط الرقائق واترك اللوحة لمدة 1-2 دقيقة. هذا يمنع التكثيف من التشكل على الغطاء البلاستيكي ، إذا تم وضعه على الفور على اللوحة.
  3. بعد 1-2 دقيقة من الجلوس ، ضع الغطاء البلاستيكي الأصلي مرة أخرى على اللوحة.
  4. صورة الخلايا باستخدام تباين الطور المناسب أو المجهر الفلوري.
  5. اعتمادا على الجهاز، اضبط وقت التعريض الضوئي وشدة مصدر الضوء والكسب لعرض الخلايا الهندسية. في هذه التجربة ، تم تطبيق المعلمات التالية: 50 مللي ثانية لوقت التعرض لمصدر الضوء FITC / GFP (البروتين الفلوري الأخضر) و 1-5 مللي ثانية لوقت التعرض لتباين الطور بكثافة 100٪ لكل منهما.
    ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أن أوقات التعرض المثلى ومستويات الكسب وكثافة مصدر الضوء غالبا ما تستمد تجريبيا من تجربة هذا العمل لتقليل التشبع الزائد في مراسل التألق ، وتقليل الضرر الخلوي ، والتقاط صور كافية للتحليل النوعي والكمي. عند تحديد مستويات كل من هذه المعلمات ، تشمل الجوانب التي يجب وضعها في الاعتبار زيادة نسب الإشارة إلى الضوضاء إلى أقصى حد ، وتقليل السمية الضوئية ، وتقليل التشبع المفرط لإشارات التألق ، وزيادة القدرة على تضخيم إشارات التألق الضعيفة.
    1. تحسين هذه المعلمات بشكل كبير مخصص ؛ ومع ذلك ، فإن القيم التجريبية السابقة (على سبيل المثال ، شدة مصدر الضوء التي تسبب التشبع الزائد لمراسل التألق) يمكن أن توجه الإعدادات التجريبية المستقبلية عند الاقتضاء. على سبيل المثال، يمكن استخدام إعدادات الكسب وأوقات التعرض والقيم الأولية لشدة الضوء من دائرة واحدة (LITer1.0) أو الإعداد التجريبي (على سبيل المثال، شدة الضوء) كنقطة انطلاق عند الانتقال إلى دائرة جينية مماثلة ولكنها مختلفة (LITer2.0)11 أو طريقة إضاءة مختلفة (على سبيل المثال، دورة عمل خفيفة).
  6. تبسيط تصوير الصفائح بواسطة قالب إحداثي مبرمج في برنامج الفحص المجهري مما يسمح لحجم اللوحة بالكامل (على سبيل المثال ، 24 بئرا) بالحصول الآلي على الصور من مواقع صور متعددة لكل بئر.

5. قياس التدفق الخلوي للخلايا الهندسية المستحثة بالضوء

  1. 24-72 ساعة بعد الحث ، قم بإزالة الخلايا من LPA في الحاضنة أو من المجهر بعد التصوير ووضعها في غطاء زراعة الأنسجة.
  2. إذا تمت إزالته مباشرة من LPA ، فقم بإزالة شريط الرقائق ، واترك اللوحة تجلس لمدة دقيقة أو دقيقتين.
  3. استنشاق الوسائط من كل بئر (من لوحة ال 24 بئرا بأكملها إذا تم استخدام جميع الآبار).
  4. أضف 100 ميكرولتر من التربسين بنسبة 0.25٪ إلى كل بئر ، وقم بتغطية اللوحة بغطاء بلاستيكي ، وضعها مرة أخرى في الحاضنة.
  5. اترك الخلايا دون إزعاج في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
  6. بعد 5 دقائق ، قم بإزالة اللوحة وأعدها إلى غطاء زراعة الأنسجة.
  7. تحييد كل التربسين جيدا مع 400 ميكرولتر من DMEM.
  8. قم بتسمية أنبوب البوليسترين ذو القاع المستدير سعة 5 مل مع مصفاة الخلية (أو أنبوب قياس التدفق الخلوي المناسب الذي يمكن تصفيته لإزالة كتل كبيرة من الخلايا غير المثقبة بالكامل) باسم يتوافق مع كل بئر.
  9. استخدم ماصة P1000 لماصة محتويات كل بئر لأعلى ولأسفل 6-8 مرات لكسر كتل الخلايا وإنشاء عينات أحادية الخلية لقياس التدفق الخلوي49.
  10. انقل محتويات كل بئر بالكامل (~ 500 ميكرولتر) إلى الأنابيب المصنفة باستخدام المصفاة.
  11. أحضر الخلايا إلى أداة قياس التدفق الخلوي المناسبة باستخدام أشعة الليزر ذات الأطوال الموجية الصحيحة (يمكن إحضار أنابيب بها خلايا على الجليد أو خارجه).
    ملاحظة: كان مقياس التدفق الخلوي المستخدم في هذا العمل جزءا من منشأة أساسية تقع في المستشفى الجامعي.
  12. إنشاء بوابة تشتت أمامية وجانبية (FSC و SSC ، على التوالي) لالتقاط الخلايا المفردة ذات الحجم والدقة المناسبين لاستبعاد الحطام والكتل الخلوية على برنامج قياس التدفق الخلوي.
  13. بمجرد تعيين البوابة ، التقط ما يقرب من 10000 خلية باستخدام البوابة المناسبة. اضبط هذا الرقم بناء على كمية البيانات الخلوية التي يبحث عنها المستخدمون. كرر ذلك لكل أنبوب يحتوي على خلايا التجربة.
  14. بمجرد اكتمال التجربة ، قم باستيراد البيانات إلى برنامج بيانات قياس التدفق الخلوي المتاح لتحليلها.
  15. قم بإنشاء بوابة FSC-SSC (كما كان من قبل أثناء الاستحواذ) وقم بتطبيقها على كل دفعة من البيانات التجريبية. يتم استخدام بئر مرجعي لمجموعات الخلايا غير المستحثة لإنشاء هذه البوابة في هذه المخطوطة ، ولكن توجد مقاييس أخرى لإنشاء البوابة ، مثل البوابات القائمة على الكثافة.
  16. باستخدام الظروف التجريبية المغلقة ببوابة FSC-SSC ، قم برسم بيانات قياس التدفق الخلوي كرسوم بيانية أو تمثيلها بطرق أخرى لتوضيح أنماط التعبير التي تم الحصول عليها. في هذه التجربة ، تم التقاط التألق بواسطة قنوات GFP / FITC أو PE / TexasRed.

6. استخراج الحمض النووي الريبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لمكونات الدائرة الجينية

  1. 24-72 ساعة بعد الحث ، قم بإزالة الخلايا من LPA في الحاضنة أو من المجهر بعد التصوير ووضعها في غطاء زراعة الأنسجة.
  2. إذا تمت إزالته مباشرة من LPA ، فقم بإزالة شريط الرقائق ، واترك اللوحة تجلس لمدة دقيقة أو دقيقتين.
  3. استنشاق الوسائط من كل بئر (من لوحة ال 24 بئرا بأكملها إذا تم استخدام جميع الآبار).
  4. تابع استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي المناسبة.
  5. بمجرد اكتمال استخراج الحمض النووي الريبي، قم بإجراء تفاعل نسخ عكسي لكل عينة (الجدول 3).
  6. علاوة على ذلك ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لكل عينة (الجدول 4). استخدم بوليميراز الحمض النووي والبروتوكول المرتبط به لإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل. لهذه الخطوة ، قم بإعداد تفاعل متعدد الإرسال باستخدام جين التدبير المنزلي وجين مثير للاهتمام ، أو قم بإنشاء تفاعلات منفصلة. في هذا المثال ، تم فحص مستويات GFP و KRAS و glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). بعد الانتهاء من تجربة qRT-PCR ، تابع التحليل عبر البرامج المتاحة لتوضيح تغير طية دائرة الجينات على مستوى الحمض النووي الريبي.

7. التألق المناعي لمكونات الدائرة الجينية

  1. استخدم حمام ثلج أو فريزر لتبريد الميثانول.
  2. 24-72 ساعة بعد الحث ، قم بإزالة الخلايا من LPA في الحاضنة أو من المجهر بعد التصوير ووضعها في غطاء زراعة الأنسجة.
  3. إذا تمت إزالته مباشرة من LPA ، فقم بإزالة شريط الرقائق ، واترك اللوحة لمدة 1-2 دقيقة.
  4. استنشاق الوسائط من كل بئر (من لوحة ال 24 بئرا بأكملها إذا تم استخدام جميع الآبار).
  5. أضف 100 ميكرولتر من التربسين بنسبة 0.25٪ إلى كل بئر ، وقم بتغطية اللوحة بغطاء بلاستيكي ، وضعها مرة أخرى في الحاضنة.
  6. اترك الخلايا دون إزعاج في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
  7. بعد 5 دقائق ، قم بإزالة اللوحة وأعدها إلى غطاء زراعة الأنسجة.
  8. تحييد كل التربسين جيدا مع 400 ميكرولتر من DMEM.
  9. قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي الصغيرة بأسماء تتوافق مع كل بئر.
  10. استخدم ماصة P1000 وماصة محتويات كل بئر لأعلى ولأسفل 6-8 مرات لكسر كتل الخلايا.
  11. انقل محتويات كل بئر بالكامل (~ 500 ميكرولتر) إلى الأنابيب الموسومة.
  12. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 400 × غرام.
  13. عند الانتهاء، تخلص من المادة الفائقة وانقل العينات إلى غطاء الدخان الكيميائي.
  14. أعد تعليق الخلايا (استخدم ماصة P1000 وماصة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات في كل أنبوب لكسر كتل الخلايا) في 750-1000 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد (مخفف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، PBS).
  15. اسمح للخلايا بالجلوس لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  16. بعد الحضانة ، أضف 750-1000 ميكرولتر من PBS. ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات.
  17. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 400 × غرام.
  18. عند الانتهاء، تخلص من المادة الفائقة وانقل العينات إلى غطاء الدخان الكيميائي.
  19. أعد تعليق الخلايا (استخدم ماصة P1000 وماصة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات في كل أنبوب لكسر كتل الخلايا) في 750-1000 ميكرولتر من الميثانول البارد المثلج.
  20. اسمح للخلايا بالجلوس لمدة 30 دقيقة على الجليد أو في ثلاجة -20 درجة مئوية.
  21. بعد الحضانة ، أضف 750-1000 ميكرولتر من PBS. ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات.
  22. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 400 × غرام.
  23. عند الانتهاء، تخلص من المادة الفائقة وانقل العينات إلى غطاء الدخان الكيميائي.
  24. اعتمادا على نوع الأجسام المضادة المستخدمة ، قم بتعديل البروتوكول من هذه النقطة فصاعدا. اتبع أي من الخطوتين 7.24.1-7.24.14 أو 7.24.15-7.24.22.
    1. في حالة استخدام جسم مضاد أولي وثانوي ، أعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة P1000 / P200 وماصة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات في كل أنبوب لكسر كتل الخلايا في 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية. في هذه الحالة ، تم إجراء تخفيف بنسبة 1: 800 للأجسام المضادة للمخزون ، بما في ذلك الأجسام المضادة KRAS أو الأجسام المضادة ERK ، وسمح لها بالجلوس لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تخفيف الأجسام المضادة في مخزن مؤقت للحضانة مصنوع من 1x PBS مع 0.5 جم من BSA.
      ملاحظة: حدد التخفيف الدقيق للجسم المضاد تجريبيا عن طريق إنشاء منحنى قياسي لتخفيفات الأجسام المضادة مقابل المستضد محل الاهتمام.
    2. بعد إضافة الأجسام المضادة ، قم بتغطية الأنابيب برقائق لمنع تأثيرات الضوء على الأجسام المضادة الموسومة.
    3. بعد الحضانة ، أضف 750-1000 ميكرولتر من مخزن الحضانة المؤقت. ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات.
    4. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 400 × غرام.
    5. عند الانتهاء، تخلص من المادة الفائقة وانقل العينات إلى غطاء الدخان الكيميائي.
    6. أعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة P1000 / P200 وماصة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات في كل أنبوب لكسر كتل الخلايا في 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية. في هذه الحالة ، تم إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية عند تخفيف 1:800 للجسم المضاد KRAS أو 1:2000 للجسم المضاد ERK وسمح لها بالجلوس لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. على غرار الأجسام المضادة الأولية ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية في مخزن الحضانة كما هو موضح أعلاه. تحديد تخفيفات الأجسام المضادة الثانوية بناء على النتائج التجريبية للمنحنى القياسي.
    7. بعد إضافة الأجسام المضادة ، قم بتغطية الأنابيب برقائق لمنع تأثيرات الضوء على الأجسام المضادة الموسومة.
    8. بعد الحضانة ، أضف 750-1000 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحضانة. ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات.
    9. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 400 × غرام.
    10. عند الانتهاء، تخلص من المادة الفائقة وانقل العينات إلى غطاء الدخان الكيميائي.
    11. أعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة P1000 وماصة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات في كل أنبوب لكسر كتل الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS.
    12. انقل محتويات كل أنبوب بالكامل (~ 500 ميكرولتر) إلى الأنابيب المصنفة مع مصفاة.
    13. أحضر الخلايا إلى أدوات قياس التدفق الخلوي المناسبة باستخدام أشعة الليزر ذات الأطوال الموجية الصحيحة (يمكن إحضار أنابيب بها خلايا على الجليد أو خارجه).
      ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أن وجود العديد من الضوابط أمر مهم للتقدم في قياس التدفق الخلوي وتحليل التعبير الجيني للخلية المهندسة. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون وجود خلايا غير ملطخة تماما ، وخلايا ملطخة بالأجسام المضادة الأولية وحدها ، والخلايا الملطخة بالأجسام المضادة الثانوية وحدها مفيدا لمقارنة النتائج بإشارات الخلفية من الأجسام المضادة.
    14. بعد ذلك ، تابع التحليل كما هو موضح في القسم 5.
    15. في حالة استخدام جسم مضاد أولي فقط، أعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة P1000/P200 وماصة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات في كل أنبوب لكسر كتل الخلايا في 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية الموسومة. تحديد تخفيف الأجسام المضادة المناسبة وحضانتها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تحديد تخفيف الأجسام المضادة من المنحنى القياسي تجريبيا.
    16. بعد إضافة الأجسام المضادة ، قم بتغطية الأنابيب برقائق لمنع تأثيرات الضوء على الأجسام المضادة الموسومة.
    17. بعد الحضانة ، أضف 750-1000 ميكرولتر من مخزن الحضانة المؤقت. ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات.
    18. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 400 × غرام.
    19. أعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة P1000 وماصة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات في كل أنبوب لكسر كتل الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS.
    20. انقل محتويات كل أنبوب بالكامل (~ 500 ميكرولتر) إلى أنابيب ذات ملصقات مع مصافي.
    21. أحضر الخلايا إلى أدوات قياس التدفق الخلوي المناسبة باستخدام أشعة الليزر ذات الأطوال الموجية الصحيحة (يمكن إحضار أنابيب بها خلايا على الجليد أو خارجه).
      ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أن وجود العديد من الضوابط أمر مهم للتقدم في قياس التدفق الخلوي وتحليل التعبير الجيني للخلية المهندسة. إن وجود خلايا غير ملطخة تماما وخلايا ملطخة بالأجسام المضادة الأولية وحدها مفيد لمقارنة النتائج بإشارات الخلفية من الأجسام المضادة.
    22. من هذه النقطة ، تابع التحليل كما هو موضح في القسم 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استند تجميع الدوائر الجينية وتوليد خط الخلية المستقرة في هذه المقالة إلى خلايا HEK-293 التجارية المعدلة التي تحتوي على موقع FRT واحد مستقر نشط نسخيا (الشكل 1). تم بناء الدوائر الجينية في ناقلات تحتوي على مواقع FRT داخل البلازميد ، مما يسمح بدمج Flp-FRT في جينوم خلية HEK-293. لا يقتصر هذا النهج على خلايا Flp-In ، حيث يمكن إضافة مواقع FRT إلى أي خط خلوي ذي أهمية في أي مكان في الجينوم باستخدام تقنية تحرير الحمض النووي مثل CRISPR / Cas950.

بمجرد بناء خطوط الخلايا المناسبة والتحقق من صحتها للإدخال الصحيح ، تم اختيار برنامج LPA و IRIS كبروتوكول موحد للتحريض الضوئي للتعبير الجيني 31,51. يسمح نظام LPA ببرمجة 24 بئرا لتحريض خلايا الثدييات في ظروف تجريبية متعددة اعتمادا على شدة الضوء ومدة النبض ودورة العمل (الشكل 2). ضمن هذه المقالة، تم إعطاء الأولوية لشدة الضوء الموحدة مكانيا، ومدة النبض، ودورة العمل. ومع ذلك ، يمكن للباحثين استخدام برنامج IRIS و LPA لبرمجة أكثر تقدما لأنماط موجات الضوء الزمنية.

أحد الجوانب الحاسمة حول LPA التي يجب معالجتها قبل بدء التجارب هو المعايرة البصرية التي يمكن إجراؤها لأجهزة واحدة أو متعددة. تتطلب طريقة تحليل الصور الموصوفة سابقا31 المستخدمة للمعايرة صورة ل LPA بالكامل مع تشغيل جميع مصابيح LED ذات الأهمية ، والتي يمكن الحصول عليها من مجموعة متنوعة من المصادر52 ، بما في ذلك جهاز تصوير هلامي. هنا ، تم استخدام ماسح ضوئي للكمبيوتر للحصول على الصور (الشكل 3A). بمجرد الحصول على الصورة ، تم استخدام البرنامج مفتوح المصدر الذي أنشأه Gerhardt et al. (2016)31 لحساب قيم التعويض لكل LED لضمان أن كل LPA ينبعث منه نفس الكثافة عند قيمة تدرج رمادي معينة. يطرح البرنامج إشارة الخلفية ، ويعتب الصورة في فئة ثنائية ، ويحسب كثافة البكسل (الشكل 3B). من المعايرة ، تم العثور على اختلاف ضئيل بين مصابيح LED ، مع سيرة ذاتية تبلغ 0.04 بين 96 بئرا (أو 4 لوحات معايرة ، الشكل 3C). وأخيرا، أظهر استخدام برنامج المعايرة تباين LED حسب الموقع (الشكل 3D) وأنشأ تعديلا للتدرج الرمادي (الشكل 3E) بحيث يتم تطبيع كل مؤشر LED بنفس الكثافة.

بالإضافة إلى المعايرة ، تشمل الجوانب المهمة الأخرى لاستخدام LPA دمج العديد من عناصر التحكم في خط الأنابيب التجريبي الذي يمكن أن يقلل من الأخطاء النظامية عن طريق الحد من المتغيرات المربكة مثل تأثيرات السمية الضوئية وقيود التصميم القائمة على المواد التجريبية. على سبيل المثال ، يوضح الشكل 4 تكوينين مختلفين لبرمجة شدة الضوء المختلفة في آبار LPA. توضح اللوحة الفرعية الأولى من الشكل 4A تنظيما تصاعديا لشدة الضوء. هذا يمكن أن يجعل من السهل البرمجة وتحليل البيانات ولكن يمكن أن تنتج تأثيرات حافة حيث الصف السفلي من LPA لديه أعلى كثافة الضوء ويمكن أن يسبب الحرارة غير المرغوب فيها وتحريض الضوء من الآبار القريبة. وبالمثل ، في اللوحة الفرعية الثانية من الشكل 4A ، تم تطبيق مصفوفة عشوائية على برنامج IRIS ، مما أدى إلى إنشاء كثافة ضوء مختلفة في مواضع عشوائية. هذا يمكن أن يقلل من التأثيرات النظامية لتأثيرات الحافة. يتم إنشاء مصفوفة مخربوطة (الشكل 4B) باستخدام برنامج IRIS ، والذي يمكن استخدامه بعد ذلك لتحديد الظروف التجريبية بعد الانتهاء من التجربة وأثناء التحليل. على غرار التوزيع العشوائي للآبار ، يجب أن يكون المستخدمون أيضا على دراية بتأثيرات سمية الضوء التي قد تحدث (الضوء الأزرق في هذا العمل). في الشكل 4C، تظهر شدتان مختلفتان للضوء تستخدمان في تحريض الدائرة الجينية بنفس بوابة FSC-SSC استنادا إلى مجموعة الخلايا الهندسية غير المستحثة. وعلى هذا النحو، ينبغي للمستخدمين إجراء استجابة للجرعة بشأن طريقة الضوء ذات الأهمية (مثل النبض، ودورة العمل، وما إلى ذلك) لتحديد آثار سمية الضوء التي يمكن أن تحدث في نهاية التعرض القصوى (الشكل 4D). هنا ، تسببت زيادة مستويات الضوء الأزرق في حدوث حطام خلوي يعتمد على الجرعة ، وخلايا ميتة ، وكتل مقارنة بالخلايا غير المحفزة. على هذا النحو ، تم تقييد شدة الضوء المستمرة إلى حوالي 3/4 من الحد الأقصى لشدة LPA (~ 3000 g.s. وحدة).

بمجرد إعداد المعدات المناسبة ، تم تحفيز التعبير الجيني في دوائر جين LITer المهندسة عبر المجهر الفلوري (الشكل 5). تم تحفيز الخلايا في فترات مختلفة من نبضات الضوء على LPA ، والتي أعطت استجابة جرعة خفيفة من التعبير الجيني على مستوى السكان. تم تصوير الخلايا داخل هذا العمل لتعبير GFP باستخدام 50 مللي ثانية لوقت التعرض لمصدر الضوء FITC / GFP وللتصوير الميداني الساطع باستخدام 1-5 مللي ثانية لوقت التعرض لتباين الطور. نظرا لمتانة بروتوكول هندسة خط الخلية هذا ، يمكن استخدام أي علامة تألق بدلا من GFP. يمكن تحفيز الخلايا بأنظمة ضوئية متعددة وتنتج مجموعة كبيرة من الاستجابات (الشكل 5). هذا الأخير مفيد في زيادة التحكم في التعبير عن الجينات الوظيفية (على سبيل المثال ، الجين الورمي KRAS (G12V) في العمل الأصلي 53).

مباشرة بعد الفحص المجهري الفلوري ، يمكن تحليل الخلايا في مجموعة متنوعة من البروتوكولات التجريبية ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي ، qRT-PCR ، والتألق المناعي. في هذا العمل ، تم إجراء قياس التدفق الخلوي كإجراء أول للتحقق من الصحة وتم تنفيذه باتباع الطرق الموضحة أعلاه (الشكل 6). وعلى غرار الفحص المجهري، تم تحفيز الخلايا بقيم مختلفة لطول النبض، وأظهرت استجابة جرعة من التعبير الجيني لأكثر من أربعة أضعاف التغير من الحالات غير المستحثة على مستوى السكان (الشكل 6A-B). وبالمثل ، يمكن إظهار تقليل ضوضاء التعبير الجيني من خلال مقارنة قيم شدة الضوء المختلفة (الشكل 6C-D) لنظام LITer مقابل نظام تنظيم إيجابي (بدون ملاحظات) مثل VVD / LightOn54. عند مقارنة LITer مع نظام VVD ، تحقق ردود الفعل السلبية أكثر من خمسة أضعاف الحد من ضوضاء التعبير الجيني . يمكن أيضا تحليل نفس الخلايا المستحثة مسبقا التي تم تصويرها على الفحص المجهري عبر qRT-PCR (الشكل 7). على غرار قياس التدفق الخلوي ، يمكن لخلايا LITer المهندسة التعبير عن مستويات الحمض النووي الريبي بطريقة تستجيب للجرعة (أكثر من 10 أضعاف الحث من الحالات غير المستحثة) ، مطابقة استجابة الجرعة لمستويات البروتين المحددة كميا بواسطة تعبير GFP على قياس التدفق الخلوي. يمكن معايرة بيانات الفحص المجهري الفلوري وقياس التدفق الخلوي المذكورة باستخدام خلايا غير فلورية ، تعبر بشكل أساسي عن الخلايا الفلورية ، وخرز التحقق من صحة الفلورسنت 6-8-8 الذروة (على سبيل المثال ، قناة FL1 الخضراء ، الخرز الفلورسنت). كل من هذه المكونات يمكن أن تسمح بتطبيع التعبير الجيني في تجربة واحدة. ومع ذلك ، يمكن لهذه العوامل أيضا أن تسمح بتطبيع الدوائر والخلايا الهندسية عبر لوحات تجريبية مختلفة ، وظروف تجريبية ، وأيام للسماح بمقارنة وتوحيد بيانات التعبير الجيني.

وأخيرا، يمكن هندسة الدوائر الجينية LITer للتعبير عن الجينات الوظيفية، مثل KRAS (G12V، الشكل 8). تتيح براعة خط الأنابيب هذا للمستخدمين استخدام بنية LITer مع هندسة الخلايا لأي جين وظيفي ذي أهمية ، وربما دمج معماريات إضافية مثل ردود الفعل الإيجابية. أظهر LITer كميات متزايدة من الضوء الأزرق الذي أدى إلى زيادة مستويات إنتاج الدائرة الجينية (KRAS (G12V) مستويات البروتين) ، وبالتالي مستويات الفوسفوريلات ERK ، وكلاهما يمكن تحديده كميا عن طريق اختبارات التألق المناعي.

جزء نسبه الحجم (نقطة أساس) تركيز وزن جزء الحمض النووي (نانوغرام / ميكرولتر) تركيز مولي جزء الحمض النووي (fmol / μL) الحجم (ميكرولتر) الكتلة المولية الناتجة للحمض النووي (fmol)
الأم ناقلات جزء 1 1 3414.00 18.20 8.63 4.09 35.29
الأم ناقلات جزء 2 1 4642.00 18.10 6.31 5.59 35.29
جين الاهتمام 1 549.00 37.90 111.70 0.32 35.29
مجموع 10.00 105.87

الجدول 1: حساب المزيج الرئيسي لتفاعل تجميع الحمض النووي (الخطوة 1.13). يعتمد العمودان 2 و 3 على حجم شظايا الحمض النووي المجمعة وتركيز هذه الشظايا بعد تضخيم PCR واستخراج هلام الأغاروز (الخطوة 1.11). يمكن تعديل الخلية السفلية للعمود 4th (إجمالي حجم التفاعل) ؛ ومع ذلك ، يوصى بالمجلد المذكور. يتم إنشاء الخلايا غير المظللة تلقائيا.

0 100 200 400 500 750
1500 3000 0 100 200 400
500 750 1500 3000 0 100
200 400 500 750 1500 3000

الجدول 2: برمجة قزحية العين لشدة الضوء (g.s) لتجربة تحريض الضوء في صفيحة من 24 بئرا مع ثلاثة تكرارات (الخطوة 3.4). توزيع شدة الضوء التي تتراوح من 0 إلى 3000 g.s. G.s. وحدات التدرج الرمادي. يمكن أن يكون هذا عشوائيا بواسطة برنامج IRIS حسب الحاجة.

نموذج 1 نموذج 2 نموذج 3
عكس النسخ ماستر ميكس حجم (μL) 4.00 4.00 4.00
حجم قالب الحمض النووي الريبي (1000 نانوغرام) (ميكرولتر) 2.00 3.00 4.00
حجم NF-H20 (ميكرولتر) 14.00 13.00 12.00
الحجم الكلي (ميكرولتر) 20.00 20.00 20.00

الجدول 3: حساب المزيج الرئيسي للنسخ العكسي (الخطوة 6.5). الحجم الكلي للتفاعل الموصى به هو 20 ميكرولتر ، ومكوناته هي المزيج الرئيسي لإنزيم النسخ العكسي (هنا: 5x) ، وقالب الحمض النووي الريبي ، والماء الخالي من النوكلياز. في هذا المثال، تركيزات الحمض النووي الريبي للعينات 1 و2 و3 هي 500 و333 و250 نانوغرام/ميكرولتر على التوالي.

نموذج 1 نموذج 2 نموذج 1 و 2 متعدد الإرسال
حجم مسبار GFP (ميكرولتر) 1 ----- 1
حجم مسبار GAPDH (ميكرولتر) ------ 1 1
حجم المزيج الرئيسي للبوليميراز الحمض النووي (μL) 10 10 10
cDNA (100 نانوغرام) حجم (ميكرولتر) 2 2 2
حجم NF-H20 (ميكرولتر) 7 7 7
الحجم الكلي (ميكرولتر) 20 20 20

الجدول 4: حساب المزيج الرئيسي الكمي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (الخطوة 6.6). الحجم الكلي للتفاعل الموصى به هو 20 ميكرولتر ومكوناته هي المزيج الرئيسي لإنزيم بوليميراز الحمض النووي (هنا: 2x) ، ومجسات GFP و / أو GAPDH ، و cDNA (إجمالي 100 نانوغرام) ، والماء الخالي من النوكليز (NF-H20).

Figure 1
الشكل 1: تصميم الدوائر وهندسة الخلايا. (أ) أدوات هندسة الخلايا، بما في ذلك دائرة الجينات الاصطناعية LITer مع مواقع تكامل FRT، وإنزيم recombinase (Flp recombinase) لتكامل الدائرة، والأدوية المستخدمة لاختيار المستنسخات الجينية المناسبة، وخط الخلية محل الاهتمام المستخدم لإنشاء خطوط خلايا الثدييات البصرية الوراثية المرغوبة. (ب) يمكن دمج النظم الجينية الهندسية في موقع FRT محدد يحتوي على موضع داخل الجينوم البشري. يمكن لهذه المواقع الجينومية بعد ذلك التعبير عن مقاومة محددة للمضادات الحيوية أو جينات مراسل الفلورسنت لاختيار أشرطة الكاسيت الجينية المتكاملة بشكل صحيح. يمكن بدء تكامل الدوائر الجينية باستخدام المؤتلفات التي تتعرف على مواقع محددة داخل الكاسيت الجيني الأصلي. وهذا يقدم جينا جديدا لاختيار مقاومة الأدوية يمكن أن يضمن توليد خلايا مصممة بشكل صحيح مع الدائرة الجينية المطلوبة. في الجزء السفلي من اللوحة B توجد بنية الدائرة الجينية لنظام التغذية المرتدة السلبية البصرية الجينية ، LITer2.0. تتكون هذه الدائرة من بروتين TetR ذاتي التثبيط المنصهر مع مجال استشعار الضوء والأكسجين والجهد (LOV2) ، وتسلسل الرابط P2A الذي يتيح نسخة متعددة السيسترونيك ، و GFP. عند تطبيق الضوء الأزرق ، يفتح تسلسل TIP من مجال LOV2 ، مما يثبط بروتين TetR ، ويسمح بنسخ متزايد يستجيب للجرعة لكل من TetR ومراسل GFP. بروتين TetR المثبط غير قادر على الارتباط والقمع في موقع مشغل الحمض النووي ، وبالتالي زيادة النسخ. هذه التغذية الراجعة السلبية تبقي ضوضاء التعبير الجيني منخفضة وتسمح بتغيير كبير في التعبير الجيني. FRT - هدف التعرف على الوجه ، HygR - مقاومة hygromycin ، LacZ - β-galactosidase ، ZeoR - مقاومة الزيوسين ، T - TetR ، بروتين مثبط التتراسيكلين ، D2ir هو مروج قائم على CMV مع مواقع TwtO ، LOV2 هو مجال استشعار الضوء والأكسجين والجهد ، TIP هو الببتيد المثبط للتيت الذي يثبط بروتين TetR. تم تعديل هذا الرقم من Guinn and Balázsi (2020)55. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: البرمجة التجريبية LPA. (أ) يمكن برمجة التجارب باستخدام الأدوات المدرجة على موقع مختبر تابور47 مع المرونة لبرمجة LPA ذات الحالة الثابتة أو الديناميكية أو المتقدمة31. علاوة على ذلك ، يمكن حفظ الملفات الإلكترونية لاستخدامها في المستقبل للنسخ المتماثلة التقنية أو الحث التجريبي لخطوط الخلايا البديلة. (B) جهاز LPA مع المكونات الرئيسية التي يتم عرضها من الأعلى والجانب (C). (د) صور للوحات مختومة بالرقائق المعدنية لوضعها على LPA. LPA - جهاز لوحة الضوء ، LED - الصمام الثنائي الباعث للضوء. تم تعديل عناصر هذا الرقم من Guinn (2019)11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: معايرة جهاز لوحة الضوء . (أ) صورة تمثيلية ل LPA لمصابيح LED مضبوطة على 2000 جم استنادا إلى برنامج IRIS. (B) صورة من اللوحة (A) مع طرح الخلفية والعتبة المستخدمة لربط الصورة لحساب كثافة البكسل لكل LED. (ج) رسم بياني لكثافة البكسل (يحدده تحليل صورة MATLAB) ل 96 مصباح LED (4 لوحات LPA) مضبوطة على نفس قيمة برنامج IRIS (على سبيل المثال ، 2000 g.s.). يمثل الخط الأحمر متوسط كثافة بكسل LED ، ويمثل CV في اللوحة معامل التباين للآبار ال 96. (D) خريطة حرارية توضح كثافة LED لصورة LPA في اللوحة (A) تم تطبيعها إلى الحد الأقصى لشدة LED. (ه) خريطة حرارية لقيمة المعايرة محددة لصورة LPA في اللوحة (A) لإنشاء إنتاج متساو الكثافة لكل مؤشر LED عند برمجته ل LPA. LPA - جهاز لوحة الضوء ، LED - الصمام الثنائي الباعث للضوء ، CV - معامل الاختلاف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التوزيع العشوائي ل LPA وتأثيرات سمية الضوء . (أ) صورة تمثيلية لتكوينين LPA LED قابلين للبرمجة تم ضبطهما من 25 إلى 4000 جم ، استنادا إلى برنامج IRIS. من المرجح أن يسمح التكوين الأول للأخطاء المنهجية مثل تأثيرات الحافة للحرارة والضوء بالعبور (على سبيل المثال ، الصف السفلي من LPA الذي يؤثر على الصف الأدنى 2nd ). الصورة الثانية عشوائية موقع الكثافات، وبالتالي تقليل الخطأ المنهجي (التحيز) الناجم عن تأثيرات الحافة. (ب) مصفوفة تبين موقع التوزيع العشوائي لشدة الضوء في LPA المبين في اللوحة (A) ، والتي يمكن استخدامها لتحديد النتائج المعتمدة على الشدة لتجربة معينة. (ج) بيانات قياس التدفق الخلوي لشدتين مختلفتين للضوء (1250 و 4000 جم) لمدة 3 أيام من الحث عند الإضاءة المستمرة. تعتمد البوابة السوداء على الخلايا غير المستحثة. (د) رسم بياني شريطي يوضح بيانات قياس التدفق الخلوي مثل اللوحة (C) ولكن لمجموعة واسعة من شدة الضوء. LPA - جهاز لوحة الضوء ، FSC - التشتت الأمامي ، SSC - التشتت الجانبي ، g.s. - قيمة شدة الضوء المقاسة بالتدرج الرمادي. كان لدى خلايا LITer11 انخفاض مستجيب للجرعة في بقاء الخلايا على قيد الحياة كان ذا دلالة إحصائية باستخدام اختبار ANOVA 1-tailed بقيمة p تبلغ 0.0022. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: صور مجهرية تمثيلية لخطوط الخلايا البصرية الجينية المهندسة. تم تصوير الخلايا على مجهر مقلوب بكاميرا (14 بت) للحصول على تباين الطور والتصوير الفلوري. تم تعريض الخلايا لمدة 5 مللي ثانية لتباين الطور (اللوحة A ، صورة المجال الساطع التمثيلية) و 50 مللي ثانية للحصول على GFP / FITC (اللوحة B) بكثافة مصدر الضوء بنسبة 100٪. يمكن تصوير الخلايا في نقاط زمنية مختلفة اعتمادا على اكتساب الحالة الثابتة المطلوبة أو الاستجابة الديناميكية ، مما يؤدي إلى حالة ثابتة. تمثل الخلايا هنا معايرة مدة النبض بكثافة ثابتة (1000 جم) تتراوح من عدم التعرض للضوء إلى 3 أيام من التعرض للضوء. تمثل الوحدة g.s قيمة شدة الضوء المقاسة بالتدرج الرمادي. تم تعديل هذا الرقم من Guinn (2019)11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: قياس التدفق الخلوي لخطوط الخلايا البصرية الجينية الهندسية. تم تحليل الخلايا على مقياس تدفق الخلايا BD LSRFortessa ، مع ما يقرب من 10000 خلية تم جمعها داخل بوابة SSC-FSC (تشتت جانبي إلى الأمام). ثم تم تحليل الخلايا باستخدام برنامج FCS Express. يمكن إنشاء مخطط بياني أو مخططات مبعثرة لتحديد حجم التعبير عن الجين محل الاهتمام (على سبيل المثال ، GFP). (أ) خلايا هندسية مخططة على محاور SSC-FSC للبوابات داخل الخط الأسود. (ب) خلايا LITer التمثيلية المستحثة بمدة متفاوتة من نبضات الضوء عند 1000 غرام حتى 72 ساعة من الحث ، مما يوضح استجابة الجرعة للتعبير الجيني. (ج) بيانات الجرعة والاستجابة التمثيلية لمعايرة شدة الضوء التي تقارن بين الدائرة الجينية LITer (النظام القائم على TIP) مقابل VVD أو LightOn system40 ، وهو نظام تنظيم إيجابي بدون أي ملاحظات. (د) رسم بياني مطابق لنظام VVD ، يوضح توزيعا أوسع (وبالتالي ضوضاء تعبير جيني أعلى) مقارنة بنظام LITer. CV هو معامل التباين ، وهو مقياس لضوضاء التعبير الجيني. FSC - مبعثر أمامي ، SSC - مبعثر جانبي ، FITC - فلوريسين إيزوثيوسيانات ، g.s. - قيمة شدة الضوء المقاسة بالتدرج الرمادي. تم تعديل هذا الرقم من Guinn (2019)11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي لخطوط الخلايا البصرية الجينية المهندسة. بيانات تمثيلية تظهر أنه يمكن تحفيز مستويات التعبير الجيني المتعددة وتحديدها كميا باستخدام الضوء كحافز. تمثل الوحدة Rq القياس الكمي النسبي لتغيير أضعاف التعبير مقارنة بالتحكم. كان لدى خلايا LITer11 زيادة مستجيبة للجرعة في تعبير الحمض النووي الريبي كانت ذات دلالة إحصائية باستخدام اختبار ANOVA 1-tailed بقيمة p تبلغ 0.0352 و 0.0477 لمستويات GFP و KRAS ، على التوالي. تم تعديل هذا الرقم من Guinn (2019)11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: التألق المناعي لخطوط الخلايا البصرية الجينية المهندسة. بيانات تمثيلية تظهر تقديرات مستوى البروتين استنادا إلى التألق المناعي. (أ) مستويات البروتين من KRAS (G12V) و (B) مستويات البروتين من الفوسفوريلات ERK ، والتي تحفزها دائرة جين LITer وفقا لزيادة كميات الضوء بشكل مباشر وغير مباشر ، على التوالي. البيانات المعروضة في الأشرطة هي قيم متوسطة، وأشرطة الخطأ هي انحراف معياري (n = 3). A.u. - الوحدات التعسفية ، g.s. - قيمة شدة الضوء المقاسة بالتدرج الرمادي. كان لدى خلايا LITer11 زيادة مستجيبة للجرعة في مستويات البروتين التي كانت ذات دلالة إحصائية باستخدام اختبار ANOVA 1-tailed بقيمة p تبلغ 2.79E-04 و 0.016 لمستويات KRAS و ERK المفسفرة ، على التوالي. تم تعديل هذا الرقم من Guinn (2019)11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن لقراء هذه المقالة اكتساب نظرة ثاقبة على الخطوات الحيوية لتوصيف الدوائر الجينية البصرية (بالإضافة إلى أنظمة التعبير الجيني الأخرى) ، بما في ذلك 1) تصميم الدوائر الجينية وبنائها والتحقق من صحتها. 2) هندسة الخلايا لإدخال الدوائر الجينية في خطوط الخلايا المستقرة (على سبيل المثال ، إعادة تركيب Flp-FRT) ؛ 3) تحريض الخلايا الهندسية مع منصة قائمة على الضوء مثل LPA ؛ 4) التوصيف الأولي لمقايسات تحريض الضوء عن طريق المجهر الفلوري ؛ و 5) توصيف التعبير الجيني النهائي مع مجموعة متنوعة من المقايسات ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي ، PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) ، أو مقايسات التألق المناعي.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن الطرق الموضحة أعلاه هي وحدات عالية لأي بنية دائرة جينية تعبر بشكل أساسي عن الجينات ذات الأهمية ، مع تعديلات البروتوكول المحتملة الرئيسية في خطوة بناء الدائرة وإجراء المقايسات. وفي حالة بناء الدوائر الجينية، تسمح مرونة الاستنساخ الجزيئي بتبادل أي جين ذي أهمية أو التعبير عنه بالاشتراك مع علامة تألق مع تعديلات طفيفة على تصميم التمهيدي أو بروتوكولات التجميع. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن الإجراءات الموضحة هنا تركز في الغالب على تصميم دائرة جين NF للتحكم الدقيق (منخفض الضوضاء) في التعبير الجيني ، يمكن تنفيذ معماريات أخرى مثل التنظيم الإيجابي أو ردود الفعل الإيجابية (PF) لتحقيق ميزات مختلفة مثل التغيير العالي أو ضوضاء التعبير الجيني العالية ، على التوالي56,57 . يمكن أن يسمح استخدام مجموعة متنوعة من معماريات الدوائر الجينية (على سبيل المثال ، PF و NF وما إلى ذلك) للباحثين باستكشاف أسئلة بيولوجية متنوعة مثل الأدوار التي تلعبها أحجام مستوى البروتين والضوضاء في مقاومة الأدوية أو الانبثاث58. تركز البروتوكولات المدرجة هنا أيضا على طرق مختلفة لتحديد كمية التعبير الجيني ، ولكن يمكن إضافة أي عدد من الفحوصات الوظيفية (على سبيل المثال ، حركية الخلايا ، والتئام الجروح ، والانتشار ، وما إلى ذلك) بعد الحصول على الفحص المجهري مع تأثير ضئيل أو معدوم على الطرق السابقة. ويرتبط هذا بشكل خاص بدراسات الخلية الواحدة حيث يمكن لعلم البصريات الوراثي استخدام الحث الزماني المكاني لدراسة سلوكيات مثل ديناميكيات التعبير النابض59.

تكملة طريقة نمطية ، استكشاف الأخطاء وإصلاحها هي ميزة أخرى مهمة لكل بروتوكول رئيسي. بالنسبة لبناء الدائرة، تكمن الاختلافات الرئيسية في تصميم التمهيدي المناسب الخاص بالدائرة، في حين أن الطرق اللاحقة مثل التجميع وتضخيم البلازميد عن طريق نمو البكتيريا أكثر توحيدا وعادة ما تتضمن إجراءات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الشاملة الخاصة بها. يمكن تعديل هندسة الخلايا باستخدام منحنيات معايرة الأدوية اعتمادا على خط الخلية المستخدم. بالإضافة إلى ذلك، إذا تم استخدام خط خلية تجاري، يمكن الحصول على أدلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها مباشرة من الشركة المصنعة لخط الخلية. أيضا ، من المهم تحديد التأثيرات الضوئية غير المقصودة كميا على خطوط الخلايا الهندسية. على سبيل المثال ، بسبب التأثيرات السامة للضوء من ضوء 470 نانومتر ، يجب إنشاء منحنى شدة الضوء للتحقيق في تحريض الموت أو الضرر في السكان. بمجرد اختبار مجموعة متنوعة من قيم الضوء ، يمكن للمستخدمين إنشاء بوابة FSC-SSC أو استخدام طريقة مثل تلطيخ يوديد البروبيديوم لتحديد الخلايا الميتة / التالفة ، وبالتالي ، تعمل كأداة لتحديد نطاقات الضوء المناسبة لاستخدامها تجريبيا.

لاستكشاف أخطاء LPA وإصلاحها ، يمكن أن تنتج مصابيح LED تأثيرات حافة من الضوء والحرارة مع الآبار المجاورة. على سبيل المثال، قد تسبب الآبار عالية الكثافة بعض الحث في الآبار المجاورة إذا كان هناك ختم غير مناسب أو تدرج حراري / ضوئي كبير بين الآبار. يمكن أن تكون هذه التأثيرات قصوى إذا تمت برمجة LPA بترتيب معين (على سبيل المثال ، تصاعدي / تنازلي) لمعلمة الضوء. لمكافحة هذا ، يسمح برنامج IRIS للمستخدمين باستخدام مصفوفة عشوائية لتوزيع كثافة البئر عشوائيا وبالتالي تقليل الخطأ المنهجي. بالنسبة لجوانب استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الفحص المجهري الفلوري ، فإن وقت التعرض للضوء وإعدادات الكسب (التحكم في حساسية الكاميرا) وكثافة مصدر الضوء هي المعلمات الرئيسية التي يمكن ضبطها. يمكن أن يسمح ضبط هذه المعلمات بإنتاج الصورة الأمثل ونسب الإشارة إلى الضوضاء المثالية بالإضافة إلى تجنب التشبع الزائد والسمية الضوئية.

لاستكشاف أخطاء قياس التدفق الخلوي وإصلاحها ، تعد فولتية أنبوب المضاعف الضوئي والبوابة الخلوية هي الجوانب الرئيسية التي يمكن تعديلها. يمكن أن يسمح ضبط هذه المعلمات بإجراء مقارنات مثالية بين الظروف التجريبية وعينات التحكم ، والحصول على إشارة مناسبة لكل من إشارات التألق الضعيفة أو القوية ، واستبعاد الحطام الخلوي أو مجموعات الخلايا غير المرغوب فيها. تجدر الإشارة إلى أن الجهد الكهربي للتدفق الخلوي يتم الاحتفاظ به ثابتا بشكل مثالي عبر التجارب للسماح بإجراء مقارنات مناسبة. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للأنظمة البصرية الجينية التي تتطلب مخرجات فلورية متعددة (على سبيل المثال ، FITC و PE) ، سيحتاج المستخدمون إلى أن يكونوا على دراية بتعويض التألق بالنظر إلى الحديث المتبادل بين الفلوروفورات. في مثل هذه السيناريوهات، تعتبر الضوابط حاسمة لتحديد إشارات التألق المناسبة. تشمل عناصر التحكم التي ستكون ضرورية للمستخدمين لأدائها حبات الفلورسنت أو الخلايا الملطخة بعلامة الاهتمام أو الخلايا التي تعبر بشكل أساسي عن بروتين التألق الذي يمكن استخدامه لإنشاء مصفوفة تعويض في برنامج قياس التدفق الخلوي المثير للاهتمام. بالإضافة إلى ذلك ، سواء باستخدام علامة تألق واحدة أو أكثر ، يجب على جميع المستخدمين قياس إشارات التألق بشكل روتيني لكل علامة للخلايا غير الفلورية ، والتي تنتج إشارات التألق الذاتي / الخلفية. يتضمن استكشاف أخطاء qRT-PCR وإصلاحها كميات مختلفة من cDNA وتصميم المسبار ، والتي غالبا ما تكون خاصة بالمشروع. وأخيرا ، بالنسبة لاستكشاف أخطاء التألق المناعي وإصلاحها ، تعد تركيزات الأجسام المضادة أكبر متغير للقياس الكمي للفحص ، مما يستلزم تحديد التركيز الأمثل.

أحد جوانب استكشاف الأخطاء وإصلاحها ذات الصلة بمعظم الطرق المذكورة أعلاه هو تأثير العزل لاستخدام لوحة مغلقة مع خلايا مغطاة بورق معدني. قد تعيق هذه الطريقة تبادل غاز ثاني أكسيد الكربون اللازم للنمو السليم لخطوط الخلايا المختلفة. من التجربة التجريبية السابقة ، لم يكن هذا عائقا كبيرا أمام النمو الخلوي لتجربة مدتها 3-5 أيام باستخدام خطوط الخلايا الهندسية داخل هذه المخطوطة ولكن قد يصبح مهما لخطوط الخلايا الأخرى أو المدد التجريبية. لمعالجة هذا القلق ، يتضمن أحد التعديلات التي تم تنفيذها باستخدام الألواح المختومة استخدام وسائط مستقلة عن ثاني أكسيد الكربون ، والتي لم تؤثر على نمو الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة. تجدر الإشارة إلى الفحوصات الأخرى أو خطوط الخلايا حيث يكون التمثيل الغذائي ومستويات الأس الهيدروجيني وكثافات الخلايا مهمة ، وقد تكون هناك حاجة إلى تدخلات أخرى مثل تغيير الوسائط أو العناصر الغذائية بشكل متكرر.

تكمن حدود الطرق الموضحة هنا في الدائرة الجينية المستخدمة ، ودقة التكنولوجيا البصرية الجينية ، وواجهة LPA مع معدات أخرى مثل المجاهر الفلورية. التكنولوجيا الموصوفة هنا ميسورة التكلفة، وسريعة البناء، وسهلة التحقق من صحتها46 لمجموعات الخلايا المهندسة بصريا. ومع ذلك ، هناك بعض القيود المكانية ، مثل عدم القدرة على التحكم في الخلايا المفردة دون تعديلات على إعداد تحريض الضوء ، مثل استخدام أجهزة المرآة الرقمية (DMDs) ، مع الفوائد التي تم إثباتها مؤخرا في الخلايا الحية60,61. وعلاوة على ذلك، فإن الطرق الموضحة هنا محدودة في تتبع الخلايا الحية أثناء التحفيز البصري الجيني، مما يسمح فقط بالحصول على بيانات نقطة النهاية للدورة الزمنية التجريبية بأكملها.

على الرغم من هذه الحدود ، فإن الطرق البصرية الجينية الموضحة هنا مكملة للتكنولوجيا الحالية مثل DMDs ، والتي تتمتع بالمرونة للتحكم في الخلايا المفردة في الوقت الفعلي ولكنها محدودة بعدد العينات التي يمكن للمرء تحفيزها. علاوة على ذلك ، فإن طرق هندسة خط الخلية المستقرة التي نوقشت هنا تتناقض مع طرق البيولوجيا التركيبية الحالية التي غالبا ما تميز الأنظمة الوراثية الهندسية عبر عمليات النقل العابرة. نهج النقل العابر هي بطبيعتها أكثر ضوضاء بسبب التباين الأكبر في عدد نسخ الدائرة الجينية بين الخلايا. في المقابل، تتضمن الطرق المعروضة هنا متغيرات الخلايا وحيدة النسيلة، يحتوي كل منها على نسخة واحدة من الدائرة الجينية. تسمح خطوط الخلايا المستقرة باستكشاف الجوانب الخلوية مثل تباين التعبير الجيني ، وتأثيرات مستوى البروتين على المناظر الطبيعية للنمط الظاهري ، وطرق الخلية الواحدة بدقة أدق نظرا لوجود ثقة أكبر في أن كل خلية متطابقة مع جيرانها.

يوضح العمل هنا منصة لتصميم أي دائرة جينية بصرية وراثية متكاملة جينيا ذات أهمية ، وتحفيز هذه الأنظمة بأدوات تجريبية موثوقة ، وتوصيفها بمجموعة متنوعة من التعبير الجيني والفحوصات الوظيفية / المظهرية بطريقة موحدة. قد تشمل التحسينات المستقبلية لهذه البروتوكولات دمج هذه الأساليب مع تتبع الخلايا الحية باستخدام تقنيات بصرية وراثية أخرى مثل DMDs ، والتي ستسمح بالتحكم الزماني المكاني للتعبير الجيني والتطبيقات الوظيفية على مستوى الخلية الواحدة. وسيسمح هذا التقدم باستخدام الضوء لإنتاج نمط التعبير الجيني الذي يهتم به الخلايا المفردة، وإنشاء ديناميكيات النسخ / الترجمة، وتحديد مستويات البروتين كميا، ودراسة دورها في العمليات البيولوجية المتنوعة، بما في ذلك هجرة الخلايا، والانتشار، والانبثاث، والتمايز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

نود أن نشكر مختبر Balázsi على التعليقات والاقتراحات ، والدكتور كارل ب. جيرهاردت والدكتور جيفري ج. تابور لمساعدتنا في بناء أول LPA ، والدكتور ويلفريد ويبر لمشاركة بلازميدات LOV2-degron. وقد دعمت هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة [R35 GM122561 و T32 GM008444]؛ مركز لوفر للبيولوجيا الفيزيائية والكمية. وزمالة الدراسات العليا في علوم وهندسة الدفاع الوطني (NDSEG). تمويل رسوم الوصول المفتوح: المعاهد الوطنية للصحة [R35 GM122561].

مساهمات المؤلف: M.T.G. و G.B. تصور المشروع. أجرى كل من M.T.G. و D.C. و L.G. التجارب. قام كل من M.T.G. و D.C. و L.G. و G.B. بتحليل البيانات وإعداد المخطوطة. أشرف G.B. و M.T.G. على المشروع.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes Eppendorf 951010006 reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X Thermo Fisher Scientific MT25053CI reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000020 tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000055 tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap Corning 352235 reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V Eppendorf 22628113 equipment for mammalian culture work
Agarose Denville Scientific GR140-500 reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates VWR® 60941-126 tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin Sigma Aldrich A9518-5G reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer Thermo Fisher Scientific 02215365PR tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140010 reagent for growing bacteria
BD LSRAria BD 656700 tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa BD 649225 tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine Government Scientific Source SIGA4919-1G reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC Corning 353043 plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge VWR 22628113 instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood N/A N/A instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid BD 353047 plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask USA Scientific CC7682-4825 container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fischer Scientific BP231-100 reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15-585-011 reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid Corning 353072 container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express De Novo Software: N/A software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL Corning 35-010-CV reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose Thermo Fisher Scientific 11-965-092 reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL Life Technologies 10687-010 reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad Laboratories 1708890 reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C VWR 76210-392 equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C Panasonic MDF-U74VC equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C VWR 76359-220 equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg Sigma-Aldrich L3022-250G reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000 Life Technologies L3000008 reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019 MathWorks N/A software for analyzing experimental data
Methanol Acros Organics 413775000 reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL VWR 20170-333 plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
MultiTherm Shaker Benchmark Scientific H5000-HC equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-NDL-US-CAN equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix NEB M0492S reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs (NEB) C3019H bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs (NEB) E2621L reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera Nikon Instruments Inc. N/A instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements Nikon Instruments Inc. N/A software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides IDT N/A reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control Panasonic MCO-170AICUVHL-PA instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade Electron Microscopy Sciences 15710-S reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) Invitrogen 14190144 reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x Fisher Scientific 15140-122 reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody Cell Signaling Technology 4370S primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody Sigma-Aldrich WH0003845M1 primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Eppendorf A28137 equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App Thermo Fisher Scientific N/A software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody Cell Signaling Technology 8889S secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody Invitrogen A11005 secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL Olympus Plastics 12-102 reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System Major Science UVCI-1200 tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene SnapGene N/A software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator Tokai Hit INU-TIZ tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557 reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn Life Technologies 4326317E qPCR Probe
Thermocycler Bio-Rad 1851148 tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated PerkinElmer 1450-605 plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm VWR 14673-010 reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System VWR 89032-290 equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293 Thermo Fisher Scientific R75007 Engineered cell line with FRT site

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822 (2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247 (2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670 (2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), New York, N.Y. 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18 (2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131 (2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521 (2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547 (2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314 (2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111 (2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887 (2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128 (2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591 (2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , Stockton Press. New York. (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. TaborLab IRIS. TaborLab IRIS Software. , Available from: http://taborlab.github.io/Iris/index.html (2021).
  48. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849 (2017).
  49. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  50. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  51. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
  52. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  53. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436 (2020).
  54. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  55. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , Ann Arbor. Ph.D (2020).
  56. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766 (2019).
  57. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  58. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726 (2020).
  59. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  60. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  61. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355 (2020).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 173 ، علم البصريات الوراثي ، التحكم في التعبير الجيني ، البيولوجيا التركيبية ، ردود الفعل السلبية ، الدوائر الجينية
هندسة ومراقبة الدوائر الجينية البصرية المستقرة في خلايا الثدييات بشكل موثوق
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., … More

Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (173), e62109, doi:10.3791/62109 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter