Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Pålitelig prosjektering og kontroll av stabile optogenetiske genkretser i pattedyrceller

Published: July 6, 2021 doi: 10.3791/62109
Automatic Translation
1,2,3, *2, *2, 1,2
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program
* These authors contributed equally

Summary

Pålitelig kontroll av lysresponsive pattedyrceller krever standardisering av optogenetiske metoder. Mot dette målet skisserer denne studien en rørledning av genkretskonstruksjon, celleteknikk, optogenetisk utstyrsoperasjon og verifikasjonsanalyser for å standardisere studiet av lysindusert genuttrykk ved hjelp av en negativ-feedback optogenetisk genkrets som en casestudie.

Abstract

Pålitelig genuttrykkskontroll i pattedyrceller krever verktøy med høy foldeendring, lav støy og bestemte input-to-output overføringsfunksjoner, uavhengig av metoden som brukes. Mot dette målet har optogenetiske genuttrykkssystemer fått mye oppmerksomhet det siste tiåret for romlig kontroll av proteinnivåer i pattedyrceller. Imidlertid varierer de fleste eksisterende kretser som kontrollerer lysindusert genuttrykk i arkitektur, uttrykkes fra plasmider, og bruker variabelt optogenetisk utstyr, noe som skaper et behov for å utforske karakterisering og standardisering av optogenetiske komponenter i stabile cellelinjer. Her gir studien en eksperimentell rørledning av pålitelig genkretskonstruksjon, integrasjon og karakterisering for å kontrollere lys-inducible genuttrykk i pattedyrceller, ved hjelp av en negativ feedback optogenetisk krets som eksempel. Protokollene illustrerer også hvordan standardisering av optogenetisk utstyr og lysregimer på en pålitelig måte kan avdekke genkretsfunksjoner som genuttrykksstøy og proteinuttrykksstørrelse. Til slutt kan dette papiret være til nytte for laboratorier som ikke er kjent med optogenetikk som ønsker å ta i bruk slik teknologi. Rørledningen som er beskrevet her, bør søke om andre optogenetiske kretser i pattedyrceller, noe som gir mer pålitelig, detaljert karakterisering og kontroll av genuttrykk ved transkripsjons-, proteomisk og til slutt fenotypisk nivå i pattedyrceller.

Introduction

I likhet med andre ingeniørdisipliner har syntetisk biologi som mål å standardisere protokoller, slik at verktøy med svært reproduserbare funksjoner kan brukes til å utforske spørsmål som er relevante for biologiske systemer1,2. Et domene i syntetisk biologi der mange kontrollsystemer er bygget er området genuttrykksregulering3,4. Genuttrykkskontroll kan målrette både proteinnivåer og variasjonsevne (støy eller variasjonskoeffisient, CV = σ/μ, målt som standardavviket over gjennomsnittet), som er avgjørende cellulære egenskaper på grunn av deres roller i fysiologiske og patologiske cellulære tilstander5,6,7,8. Mange syntetiske systemer som kan kontrollere proteinnivåer og støy4,9,10,11,12 er utviklet, noe som skaper muligheter til å standardisere protokoller på tvers av verktøy.

Et nytt sett med verktøy som kan kontrollere gennettverk som nylig har dukket opp er optogenetikk, slik at bruk av lys for å kontrollere genuttrykk13,14,15,16,17. I likhet med deres kjemiske forgjengere kan optogenetiske genkretser innføres i enhver celletype, alt fra bakterier til pattedyr, noe som tillater uttrykk for ethvert nedstrøms gen av interesse18,19. På grunn av den raske generasjonen av nye optogenetiske verktøy har det imidlertid oppstått mange systemer som varierer i genetisk kretsarkitektur, uttrykksmekanisme (f.eks. plasmidbasert kontra viral integrasjon) og lysforsyningskontrollutstyr11,16,20,21,22,23,24,25 . Derfor gir dette rom for standardisering av optogenetiske funksjoner som genkretskonstruksjon og optimalisering, metode for systemutnyttelse (f.eks. integrasjon vs. forbigående uttrykk), eksperimentelle verktøy som brukes til induksjon og analyse av resultater.

For å gjøre fremskritt med å standardisere optogenetiske protokoller i pattedyrceller, beskriver denne protokollen en eksperimentell rørledning for å konstruere optogenetiske systemer i pattedyrceller ved hjelp av en negativ feedback (NF) genkrets integrert i HEK293-celler (human embryonal nyrecellelinje) som eksempel. NF er et ideelt system for å demonstrere standardisering siden det er svært rikelig26,27,28 i naturen, slik at proteinnivåer kan justeres og støyminimering kan forekomme. Kort fortalt åpner NF for presis genuttrykkskontroll av en undertrykker som reduserer sitt eget uttrykk tilstrekkelig raskt, og begrenser dermed enhver endring bort fra en jevn tilstand. Steady state kan endres av en induser som inaktiverer eller eliminerer undertrykkeren for å muliggjøre mer proteinproduksjon til en ny steady state er nådd for hver induserkonsentrasjon. Nylig ble det opprettet et konstruert NF optogenetisk system som kan produsere en bred dynamisk respons av genuttrykk, opprettholde lav støy og reagere på lysstimuli som tillater potensialet for romlig genuttrykkskontroll11. Disse verktøyene, kjent som lys-inducible tunere (LITers), ble inspirert av tidligere systemer som tillot genuttrykkskontroll i levende celler4,10,29,30 og ble stabilt integrert i menneskelige cellelinjer for å sikre langsiktig genuttrykkskontroll.

Her, ved hjelp av LITer som eksempel, er en protokoll skissert for å skape lysresponsive genkretser, indusere genuttrykk med et lysplateapparat (LPA, en optogenetisk induksjonsmaskinvare)31, og analysere responsen til de konstruerte, optogenetisk kontrollerbare cellelinjene til tilpassede lysstimuli. Denne protokollen lar brukerne bruke LITer-verktøyene for ethvert funksjonelt gen de ønsker å utforske. Det kan også tilpasses andre optogenetiske systemer med ulike kretsarkitekturer (f.eks. positiv tilbakemelding, negativ regulering, etc.) ved å integrere metodene og optogenetisk utstyr som er skissert nedenfor. I likhet med andre syntetiske biologiprotokoller kan videoopptakene og optogenetiske protokoller som er skissert her, brukes i encellede studier på forskjellige områder, inkludert, men ikke begrenset til, kreftbiologi, embryonal utvikling og vevsdifferensiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design av genkrets

  1. Velg genetiske komponenter som skal kombineres i en enkelt genkrets/plasmid (f.eks. motiver for pattedyr DNA-integrasjonssekvens, lysresponsive elementer33 eller funksjonelle gener34).
  2. Bruk programvare for genteknologi og/eller molekylær kloning, lagre DNA-sekvensene for senere bruk og referanse, kommenter hver sekvens og undersøk alle nødvendige funksjoner (f.eks.
  3. Utvikle eller ta i bruk deler i henhold til den generelle genkretsdesignen36. For optogenetiske undertrykkere som i LITers11 smelter du for eksempel sammen en gensekvenskoding for et domene som er i stand til lysindusert nedbrytning37,38 eller inaktivering av en repressors DNA-bindingsevne39, ved siden av og i rammen av undertrykkergenet (f.eks.
    1. For optogenetiske aktivatorer, sørg for tilstedeværelsen av et aktivatordomene40 som fremmer genuttrykk ved lysindusert DNA-binding41. For negativ eller positiv autoregulering, sikre tilstedeværelsen av et regulatorisk bindende nettsted i eller oppstrøms for regulatorgenets promotor (f.eks. tetO-nettsteder i eller oppstrøms for TetR-uttrykkspromotoren)42.
  4. Design primerne for DNA-sekvensforsterkning eller sekvensering av plasmidet ved hjelp av molekylær kloningsprogramvare for hver genkrets.
  5. Valider primerne beregningsmessig for plasmidkonstruksjon gjennom de innebygde festene til molekylær kloningsprogramvare (f.eks. sekvensjustering).
  6. Bestill oligonukleotidprimere fra produsenten. Plasmider konstruert og brukt i dette arbeidet finnes i det originale støttematerialet11 sammen med primerne designet og brukt.
  7. Fortynn primerne til 100 mM lagerkonsentrasjon i dobbeltdestillert vann (ddH2O).
  8. Fortynn lageret på 100 mM lagerprimere til 10 mM konsentrasjon for PCR.
  9. Forbered PCR-blandingen med 1 μL fremoverprimer, 1 μL reversprimer, 1 μL mal-DNA til en total masse på 0,5-500 ng for genomisk eller 0,5 pg-5 ng for plasmid eller viralt DNA, 12,5 μL DNA-polymerase 2x master mix (eller volumet som tilfredsstiller produsentens fortynningsfaktor), og 9,5 μL ddH2O for et totalt reaksjonsvolum på 25 μL.
  10. Inkuber PCR-blandingen i en termosykler ved passende innstillinger, avhengig av enzymet som er valgt43. Foreslåtte reaksjonssykluser inkluderer:
    Trinn 1: En syklus på 30 s første denaturering trinn ved 95 °C.
    Trinn 2: 40 sykluser med 5 s denaturering trinn ved 98 °C.
    Trinn 3: En syklus på 30 s annealing trinn ved 65 °C (bestemt av primere designet tidligere).
    Trinn 4: En syklus på 1 min forlengelse ved 72 °C (~1 kilobase (kb) malfragmentlengde).
    Trinn 5: En syklus med en 2 min forlengelse ved 72 °C.
    Hold reaksjonen ved 4 °C til den kan testes via gelelektroforese. Denne protokollen vil variere avhengig av reagensene som brukes (f.eks. polymerase og buffere).
  11. Gjenta trinn 1.9 for å forsterke alle fragmentene som skal brukes i en DNA-monteringsreaksjon som kreves for å koble lineære PCR-produkter til en enkelt sirkulær DNA-vektor.
  12. Kjør PCR-produktene på en 1% agarose gel etterfulgt av rensing av båndene av ønsket lengde.
  13. Forbered masterblandingen for en DNA-monteringsreaksjon (tabell 1).
    MERK: I dette eksemplet er modervektoren delt inn i to fragmenter for å øke effektiviteten til PCR-trinnene uten å forårsake betydelige endringer i det totale monteringsresultatet.
  14. Inkuber DNA-monteringsreaksjonsmesterblandingen i en termosykler ved 50 °C i 1 t (med mindre annet er spesifisert i DNA-monteringsreagensprotokollen) og oppbevar reaksjonen ved 4 °C for å bruke reaksjonsproduktet til bakteriell transformasjon.
  15. Sett opp bakteriell transformasjon (kjemisk eller elektroporasjon) ved hjelp av kompetente E. coli (Escherichia coli) celler og den tilsvarende bakterielle transformasjonsprotokollen. Etter transformasjon, bruk bakterielle Luria-Bertani (LB) agarplater som inneholder den valgte bakterievalgmarkøren (f.eks. Ampicillin) for å plate transformasjonsblandingen. Inkuber platene ved 37 °C over natten44.
  16. Kontroller platene dagen etter. For å inokulere koloniene, velg individuelle kolonier fra platene og resuspend dem i en flytende LB-buljong med den tilsvarende bakterievalgmarkøren i kulturrør. Inkuber i en shaker inkubator ved 37 °C, 300 o/min over natten.
  17. Utfør plasmid forberedelsesprotokoll for å trekke ut det plasmide DNA fra bakteriekulturen.
  18. Valider kretsen i to trinn. Først må du utføre en testfordøyelse ved hjelp av begrensningsenzymer som en rå verifisering for å se om det omtrentlige plasmidproduktet ble oppnådd. For det andre, hvis testfordøyelsen er bestått/bekreftet, send plasmidet til et Sanger-sekvenseringsanlegg (eller prosess ved hjelp av det tilgjengelige utstyret) for å få den nøyaktige DNA-sekvensen for å sammenligne den senere med den forventede sekvensen i designprogramvaren.
    1. For å utføre testfordøyelse, velg minst to begrensningsenzymer som produserer minst to fragmenter, basert på den molekylære kloningsprogramvaren som brukes. Når enzymer er valgt, klargjør du testprøvene ved å tilsette 1 μL av hvert enzym, 5 μL av det genererte DNA-et og 13 μL vann med passende salter og buffere avhengig av enzymene som brukes. Inkuber reaksjonen ved 37 °C i 1 time, eller som enzymprodusenten antyder. Kjør testfordøyelsesproduktene på en 1% agarose gel og bestem om båndene er riktige.
      MERK: Hvis båndene er riktige, går du videre til sekvensering.
    2. For å utføre sekvensering, generer primere basert på DNA lagret i programvaren slik at glødeområdene til primerne er ca 500 bp (basepar) fra hverandre og dekker fragmentet av interesse (genkretskomponent) eller full plasmid. Fortynn primerne med rent nukleasefritt vann (NF-H2O) til 10 mM konsentrasjon. Forbered sekvenseringsprøvene ved å legge til 1 μL 10 ng/μL DNA, 1 μL primer og 8 μL NF-H2O i et 0,2 ml rør. Gjenta dette for hver primer.
      MERK: Når prøver er forberedt, slipp dem av på sekvenseringsanlegget og sammenlign resultatene med plasmidsekvens ved hjelp av molekylær kloningsprogramvare.
  19. På dette trinnet, generere ca 100-1000 ng / μL av DNA-prøve for å integrere plasmider som inneholder genkretser i riktig cellelinje.

2. Stabil cellelinjeteknikk

  1. Bestill en pattedyrcellelinje designet for rask generering av stabile underlinjer som sikrer høyt nivå uttrykk for proteinet av interesse fra en pattedyruttrykksvektor. Celletypen og enkel cellelinjeteknikk kan variere avhengig av hva brukerne foretrekker eller har som mål å oppnå.
    1. Hvis brukerne for eksempel foretrekker cellelinjeteknikk med minimale mellomtrinn, må du bestille cellene som inneholder ett enkelt stabilt integreringssted (f.eks. FRT) ved et transkripsjonelt aktivt genomisk locus. Hvis mer nyansert celleteknikk foretrekkes, kan du opprette integrasjonssteder på foretrukne steder ved hjelp av genteknologiske verktøy som CRISPR/Cas9.
  2. Vokse celler i 5% CO2 i fuktig luft ved 37 °C. Juster vekstforholdene etter behov for celletypen.
  3. Transfekt genkretsene designet ovenfor i de ønskede cellene hentet fra de forrige trinnene for å starte en stabil cellelinjegenereringsprosess. For å oppnå dette, bruk en liposomeblanding45 av genkrets-DNA med passende rekombininase (for eksempel Flp-rekombininase for Flp-FRT-rekombinasjon) eller gjennom andre metoder som elektroporasjon.
  4. To dager etter transfeksjon, del cellene til 25% samløp.
  5. Seks timer etter å ha delt cellene, begynn antibiotikavalg ved å bytte media til et friskt medium som inneholder 50 μg / ml hygromycin antibiotika (eller et annet antibiotikamiddel som tilsvarer pattedyrets antibiotikaresistensgen valgt under plasmidkonstruksjon).
    MERK: Det finnes en rekke pattedyr antibiotikaresistensgener som brukes i genkretskonstruksjon, som hver har en annen kill curve. Derfor, uansett hvilket pattedyr antibiotikaresistensgen som er valgt for kretskonstruksjon, bør en riktig drapskurve studeres i cellene av interesse. Dette trinnet sikrer at celler som inneholder genkretsnytten blir beriket mens de uten systemet blir drept.
  6. La cellene vokse i antibiotikavalgsmediet, bytt til friske medier hver 2-3 dager til platen eller kolben har et par dusin foci. Passasjetilhørighetskulturer når de er i loggfasen før de når samløp.
  7. Når det er tilstrekkelig mange foci, trypsinize cellene med 1 ml av 0,25% trypsin, 0,1% EDTA i Hanks balansert saltoppløsning (HBSS) uten kalsium, magnesium og natrium bikarbonat i flere minutter. Nøytraliser trypsin med friske medier og send alle cellene inn i en ny beholder.
  8. Når cellene i den friske beholderen er 80% -100% sammenløp, fryser du dem ned i en blanding av 45% gamle medier, 45% friske medier og 10% DMSO. Overfør de resterende cellene til et sterilt rør og utfør encellet sortering for å isolere monoklonale celler til en 96-brønns plate.
  9. Omtrent 2-3 uker etter monoklonal sortering, bør brønner innenfor 96-brønnsplaten ha foci. Når ca. 50%-60% sammenløp, del cellene i en 12-brønns plate.
  10. Når 12-brønnsplaten er 80% -100% confluent, delt inn i en vevskultur behandlet T-25 kolbe. Når cellene i T-25-kolben er 80% -100% sammenfallende, fryser cellene og opprettholder en passasje for karakterisering og testing av monoklonale cellelinjer.
    1. Karakteriserer monoklonale cellelinjer ved mikroskopi og strømningscytometrianalyser for å rapportere genuttrykksprofiler basert på den induserte fluorescerende reporterproduksjonen. Kontroller funksjonell proteinproduksjon via fluorescerende antistoffmerking og immunfluorescensanalyse. Test transkripsjonsnivå genuttrykksinduksjon via kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR). Valider den genetiske sekvensen og integrasjonsnøyaktigheten via lokal og fullgenomsekvensering av klonene.

3. Lysplateapparat induksjonsanalyser

  1. Konstruer en LPA-enhet31,46 som skal brukes til lysinduksjon av konstruerte celler. Kort sagt er flere brede trinn avgjørende for å skape LPA som skal brukes til å kontrollere genuttrykk. Disse inkluderer 3D-utskrift av LPA-rammekomponenter, kretskortkonstruksjon, programmering av kretsen via mikrokontrollerprogrammerer, montering av komponentene i en endelig LPA, programmering av minnekortet via IRIS-programvare og kalibrering av den ferdige enheten. Hvis du vil ha en grundigere forklaring, kan du se referansene ovenfor.
    1. Skriv ut 3D-delene som beskrevet i Gerhardt et al. (2016 og 2019)31,46.
    2. Monter kretskortet som beskrevet i Gerhardt et al. (2016 og 2019)31,46.
    3. Legg fastvaren til den monterte LPA-kretsen ved hjelp av mikrokontrollerprogrammerer som beskrevet i Gerhardt et al. (2016 og 2019)31,46.
    4. Kombiner 3D-trykte deler og det monterte kretskortet som beskrevet i Gerhardt et al. (2016 og 2019)31,46. Dette inkluderer å ta monteringsplaten, kretskortet, LED-en (lysdioder) avstandsstykke, plateadapteren, en 24-brønns plate, et platelokk, monteringsbolter og vingemuttere og stablingskomponenter som vist i den filmede videoen og figur 2.
    5. Følg fremgangsmåten nedenfor for programmering og kalibrering av minnekortet av enheten.
  2. Bruk IRIS-programvaren som er tilgjengelig på Tabor Lab-nettstedet47 for å programmere et SD-kort for Light Plate Apparatus (LPA)31 og utforske passende lysforhold som trengs for å starte et optogenetisk eksperiment.
    MERK: IRIS-programvaren er et nettbasert program for programmering av optogenetisk elektronisk maskinvare, kjent som LPA, utviklet av Tabor Lab. Programvaren tillater programmering av relative IRIS-verdier som styrer de enkelte lysdioder (lysdioder) i hver brønn av LPA-maskinvaren.
  3. Velg RULLEGARDINLISTEN LPA (4 x 6), etterfulgt av å klikke riktig belysningstilnærming (Steady-state, Dynamic, Advanced).
    MERK: For dette manuskriptet vil alle analysene fokusere på steady-state-eksemplene. De avanserte innstillingseksemplene kan imidlertid brukes til pulsvarigheter og driftssyklusregimer.
  4. Velg om topp- eller bunnlampene skal belyses ved å skrive inn verdier i cellene som tilsvarer platens brønner. For LPAene som brukes i dette arbeidet, ble blå lysdioder plassert i toppposisjon brukt i alle eksperimenter. Hver LED, når den er programmert, kan gi kontinuerlig lyseksponering med konstant lysintensitet. IRIS-programvaren gir mulighet for 4096 intensitetsnivåer som kan programmeres.
  5. Når LED-stedene er valgt, angir du intensitetsverdier for ønsket eksperimentell omriss. Angi for eksempel 8 forskjellige lysintensiteter (eller pulsvarigheter eller driftssykluser) med tre tekniske repliker per plate (tabell 2). G.s. refererer til gråtoneenheter – målverdiene for lysintensitetsnivå som brukes for LPA-programmering i IRIS-programvaren.
    1. Når du designer IRIS eksperimentelle filer, må du huske på kanteffekter fra tilstøtende brønner på LPA-enheten, lystoksisitet fra økende intensiteter av blålyseksponering og bestemme hvilken type doserespons som ønskes (f.eks. monoton vs. ikke-monoton).
    2. Hvis brukere programmerer celler i LPA i stigende/synkende rekkefølge av en bestemt lysparameter (f.eks. intensitet), kan brønner gi kanteffekter av lyskryss eller til og med varme som kan påvirke tilstøtende brønner. Dette kan utilsiktet påvirke utfallet av målte utganger når forsøkene er fullført. For å lindre dette kan brukere implementere en randomiseringsmatrise på IRIS-programvaren for å rykke ut brønnsteder og minimere kanteffekter. Et eksempel er beskrevet i de representative resultatene nedenfor (figur 4A-B).
    3. I tillegg har høyere intensiteter av blått lys vist seg å forstyrre cellulær vekst og levedyktighet48. Derfor, for å redusere lystoksisitet, er det viktig å produsere en lysintensitet, pulsvarighet eller driftssyklusresponskurve avhengig av modaliteten som undersøkes.
      1. For eksempel, program 8 lysintensitetsverdier med tre replikerer per 24-brønns plate, med et område fra intet lys til en maksimal intensitet av LPA. Kjør deretter disse prøvene på et strømningscytometer med en SSC-FSC-port eller en levende flekk som propidiumjodid for å kvantifisere populasjonscelleoverlevelsen (levende celler sammenlignet med totale hendelser, inkludert døde celler / cellulært rusk) ved hver lysverdi.
      2. Bestem deretter den ideelle mengden befolkningsoverlevelse for det eksperimentelle oppsettet, siden enhver stimulans kan påvirke spredning, genuttrykk eller overlevelse negativt (f.eks. å sette 80% celleoverlevelse som en passende avveining). I dette arbeidet, når den var kalibrert, oversteg for eksempel ikke intensiteten 3000 g.s. enheter (~3/4 LPA-enhetens maksimale intensitet). Et eksempel på dette er beskrevet i de representative resultatene nedenfor.
    4. I tillegg til å begrense lysverdier på grunn av toksisitet, kan brukere ønske å begrense lysverdier for å karakterisere en bestemt del av doseresponsen, for eksempel rekkevidden av monoton respons.
      1. For å oppnå dette, skann først et bredt spekter av lysintensiteter, pulsvarigheter eller driftssykluser avhengig av modaliteten som analyseres når man bestemmer ønsket doserespons (tabell 2) for å begrense lysregimet av interesse, for eksempel der genuttrykk korrelerer positivt med økende lysverdier for en monoton doserespons.
      2. For å bestemme lysområdet av interesse, programmere en enkelt LPA med opptil 24 brønner med forskjellig intensitet / pulsvarighet / driftssyklus / etc. eller flere brønner (f.eks. 48, 72, 96, etc.) avhengig av om flere LPAer er kalibrert for å levere tilsvarende lysmengder og fortsette med cellekulturarbeidet eller analysen som er skissert nedenfor. Derfor, start karakterisering av et optogenetisk system med et bredt doseområde av lysstimuli for å bestemme intervallet som gir ønsket genuttrykk og deretter utføre eksperimenter i det raffinerte doseområdet.
      3. For eksempel, i dette arbeidet, når 3000 g.s. enheter ble bestemt som terskelen for giftig lysintensitet; denne terskelen ble brukt som øvre lysgrense for analyser som er skissert nedenfor (f.eks. immunfluorescens).
        MERK: Trinnene ovenfor er uavhengige av den optiske kalibreringen av LPA og refererer til en kalibrering på molekylært nivå for hvert optogenetisk system.
  6. Når de riktige lysintensitetsverdiene er programmert i IRIS, setter du inn et minnekort med USB 3.0-uttaket i LPA for å laste ned og overføre filene.
  7. Hvis kalibrering av LPA er fullført31, fortsett til cellekulturarbeid for initiering av lysinduksjonsanalyse. Hvis kalibreringen ikke er utført, kalibrerer du LPA ved hjelp av en bildeanalysemetode (trinn 3.7.1-3.7.3) når LPA er programmert med mikrokontrollerprogrammereren.
    1. Programmer kort LPA til å ha samme IRIS-nivå som beskrevet av Gerhardt et al. (2016)31.
      MERK: For kalibrering ble LPA programmert til å ha en verdi på 2000 g.s.
    2. Når enheten er programmert med minnekortet og tilbakestillingsknappen (fysisk knapp på LPA) er trykket inn, må du skaffe deg et bilde av hele enheten (f.eks. gelstasjonsbilder, skannerenhet osv.). For kalibreringen får du to bilder med enheten rotert med 180°.
    3. Bruk deretter programvare med åpen kildekode designet av Gerhardt et al. (2016)31 for å vise variasjonen i LED-intensiteten på LPA-platen og beregne LED-kompensasjonsverdiene for å gjøre intensiteten lik på tvers av brønner. Et eksempel på dette er beskrevet i de representerte resultatene nedenfor (figur 3). Når denne kalibreringen er fullført, fortsett til cellekulturarbeid for initiering av lysinduksjonsanalyse.
  8. Få kolber av konstruerte monoklonale celler fra forrige avsnitt for å undersøke lysinduksjonseffekter på genuttrykk.
  9. Fjern det gamle mediet fra kolben.
  10. Tilsett 1 ml trypsin i cellene og inkuber i 5 min.
  11. Etter 5 min, nøytraliser trypsin ved å legge til 4 ml Dulbecco-modifisert Eagle medium (DMEM eller andre ønskede medier) supplert med de nødvendige kjemikaliene (dette arbeidet brukte 50 μg / ml hygromycin, 1% penicillin / streptomycinløsning, 10% fetal bovin serum, FBS).
  12. Tilsett ~75 000 celler per brønn i en 24-brønns svart plate i et totalt volum på 500 μL. Antall celler sådd kan variere avhengig av varigheten av eksperimentet ønsket og celletypen som brukes.
    MERK: Vær også oppmerksom på at cellesåingstetthet påvirker kulturvedlikeholdet og potensielt varigheten av eksperimentet. Å starte med et lavere antall celler per brønn sikrer lengre varighet før kulturen når samløp. Videre vil typen optogenetiske komponenter integrert i genkretsene av interesse påvirke når genuttrykket når en jevn tilstand og derfor påvirker varigheten av forsøkene. Andre faktorer som kan vurderes er cellelinjespesifikke vekstrater, mediesammensetning og betingede veksteffekter (dvs. lys).
  13. Etter plating, plasser cellene i en fuktet inkubator med 5% CO2 for å la dem bosette seg i 2-6 timer.
  14. Etter inkubasjonen overfører du cellene til en vevskulturhette, fjerner plastlokket og legger til en klebende foliestripe til toppen av platen (figur 2D). Dette trinnet tillater minimal lysoverføring mellom brønner, da toppen og sidene av brønnene er belagt, og lyset kan nå bare komme inn fra bunnen av brønnen der LED-lampen er plassert.
  15. Plasser platen i de monterte 3D-delene av LPA. Dekk deretter platen med det 3D-trykte LPA-lokket, som passer over enhetsskruene på hvert hjørne.
  16. Koble enheten til strømkilden og trykk på tilbakestillingsknappen på LPA-enheten for å sikre at de oppdaterte LPA-eksperimentinnstillingene brukes.
  17. Inkuber cellene i det eksperimentelle systemet i riktig tid, avhengig av den opprinnelige såddtettheten, cellelinjespesifikk veksthastighet og vekstforhold. I dette eksemplet ble cellelinjene indusert i 3 dager kontinuerlig for at genuttrykket skulle nå en jevn tilstand. Det skal imidlertid bemerkes at mange optogenetiske systemer (f.eks. VVD) kan nå steady-state genuttrykk mye raskere (f.eks. 24 timer), og derfor kan eksperimentelle induksjonstider reduseres eller forlenges etter behov.
  18. På slutten av lysinduksjonseksperimentet, bruk prøvene for noen av de følgende fire analysene for å karakterisere de konstruerte cellelinjene (seksjon 4-7).

4. Fluorescensmikroskopi av lysinduserte konstruerte celler

  1. 24-72 h etter induksjon, fjern cellene i LPA fra inkubatoren og legg dem i en vevskulturhette.
  2. Fjern foliestripen og la platen sitte i 1-2 min. Dette forhindrer at det dannes kondens på plastlokket, hvis det plasseres umiddelbart på platen.
  3. Etter 1-2 min sittende, legg det originale plastlokket tilbake på platen.
  4. Bilde cellene med riktig fasekontrast eller fluorescensmikroskop.
  5. Avhengig av instrumentet justerer du eksponeringstiden, lyskildeintensiteten og forsterkningen for å vise konstruerte celler. I dette eksperimentet ble følgende parametere brukt: 50 ms for FITC / GFP (grønt fluorescerende protein) lyskildeeksponeringstid og 1-5 ms for eksponeringstid for fasekontrast med 100% intensitet for hver.
    MERK: Det skal bemerkes at optimale eksponeringstider, forsterkningsnivåer og lyskildeintensiteter ofte avledes empirisk fra erfaringene fra dette arbeidet for å minimere overmetning i fluorescensreporteren, minimere cellulær skade og fange tilstrekkelige bilder for kvalitativ og kvantitativ analyse. Når du bestemmer nivåene av hver av disse parametrene, inkluderer aspektene å huske på å maksimere signal-til-støy-forhold, minimere fototoksisitet, minimere overmetning av fluorescenssignaler og øke evnen til å forsterke svake fluorescenssignaler.
    1. Optimaliser disse parameterne grovt ad-hoc; Tidligere eksperimentelle verdier (f.eks. lyskildeintensitet som forårsaker overmetning av fluorescensreporter) kan imidlertid veilede fremtidige eksperimentelle innstillinger når det er aktuelt. For eksempel kan forsterkningsinnstillingene, eksponeringstiden og startverdiene for lysintensitet fra en krets (LITer1.0) eller eksperimentelt oppsett (f.eks. lysintensitet) brukes som utgangspunkt når du flytter til en lignende, men forskjellig genkrets (LITer2.0)11 eller en annen lysmodalitet (f.eks. lysavgiftssyklus).
  6. Effektiviser plateavbildningen med en koordinatmal programmert inn i mikroskopiprogramvaren, slik at hele platestørrelsen (f.eks. 24 brønner) kan ha automatisert bildeanskaffelse fra flere bildesteder per brønn.

5. Strømningscytometri av lysinduserte konstruerte celler

  1. 24-72 h etter induksjon, fjern cellene fra LPA i inkubatoren eller fra mikroskopet etter avbildning og plasser dem i vevskulturhetten.
  2. Hvis den fjernes direkte fra LPA, fjern foliestripen og la platen sitte i et minutt eller to.
  3. Aspirer mediene fra hver brønn (av hele 24-brønnsplaten hvis alle brønnene brukes).
  4. Tilsett 100 μL 0,25% trypsin til hver brønn, dekk platen med et plastlokk, og legg den tilbake i inkubatoren.
  5. La cellene være uforstyrret i inkubatoren i 5 min.
  6. Etter 5 min, fjern platen og returner den til vevskulturhetten.
  7. Nøytraliser hver trypsinisert brønn med 400 μL DMEM.
  8. Merk et 5 ml polystyren rundbunnsrør med cellesil (eller passende strømningscytometrirør som kan filtreres for å fjerne store klumper av celler som ikke er fullstendig prøvet) med et navn som tilsvarer hver brønn.
  9. Bruk en P1000 pipette til å pipette innholdet i hver brønn opp og ned 6-8 ganger for å bryte celleklumper og lage encellede prøver for strømningscytometri49.
  10. Overfør hele innholdet i hver brønn (~500 μL) til de merkede rørene med silen.
  11. Ta med celler til riktig strømningscytometriinstrument med lasere av de riktige bølgelengdene (kan bringe rør med celler på eller utenfor isen).
    MERK: Strømningscytometeret som ble brukt i dette arbeidet var en del av et kjerneanlegg lokalisert ved universitetssykehuset.
  12. Opprett en forover- og sidespredningsport (henholdsvis FSC og SSC) for å fange opp enkeltcellene av riktig størrelse og granularitet for å utelukke rusk og cellulære klumper på flytcytometriprogramvaren.
  13. Når porten er satt, kan du fange omtrent 10.000 celler med riktig port. Juster dette tallet avhengig av mengden mobildata brukerne søker. Gjenta for hvert rør som inneholder cellene fra eksperimentet.
  14. Når eksperimentet er fullført, importerer du dataene til den tilgjengelige flytcytometridataprogramvaren for analyse.
  15. Opprett en FSC-SSC-port (som før under oppkjøpet) og bruk den på hver gruppe eksperimentelle data. En referansebrønn for den ikke-induserte cellepopulasjonen brukes til å opprette denne porten i dette manuskriptet, men det finnes andre beregninger for gateoppretting, for eksempel tetthetsbaserte porter.
  16. Med de eksperimentelle forholdene inngjerdet med en FSC-SSC-port, plott flytcytometridataene som histogrammer eller representerer på andre måter for å illustrere de oppnådde uttrykksmønstrene. I dette eksperimentet ble fluorescensen fanget opp av GFP / FITC- eller PE / TexasRed-kanalene.

6. RNA-ekstraksjon og kvantitativ PCR av genkretskomponenter

  1. 24-72 h etter induksjon, fjern cellene fra LPA i inkubatoren eller fra mikroskopet etter avbildning og plasser dem i vevskulturhetten.
  2. Hvis den fjernes direkte fra LPA, fjern foliestripen og la platen sitte i et minutt eller to.
  3. Aspirer mediene fra hver brønn (av hele 24-brønnsplaten hvis alle brønnene brukes).
  4. Fortsett å trekke ut RNA fra cellene ved hjelp av riktig RNA-ekstraksjonssett.
  5. Når RNA-ekstraksjonen er fullført, utfører du en omvendt transkripsjonsreaksjon av hver prøve (tabell 3).
  6. Videre utfører du kvantitativ PCR for hvert utvalg (tabell 4). Bruk en DNA-polymerase og tilhørende protokoll for å sette opp PCR-reaksjoner. For dette trinnet, sett opp en multiplekset reaksjon med et rengjøringsgen og et gen av interesse, eller skape separate reaksjoner. I dette eksemplet ble GFP-, KRAS- og glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenasenivåer (GAPDH) undersøkt. Etter å ha fullført qRT-PCR-eksperimentet, fortsett med analysen via tilgjengelig programvare for å illustrere endring av genkretsfold på RNA-nivå.

7. Immunfluorescence av genkretskomponenter

  1. Bruk et isbad eller fryser for å kjøle ned metanol.
  2. 24-72 h etter induksjon, fjern cellene fra LPA i inkubatoren eller fra mikroskopet etter avbildning og plasser dem i vevskulturhetten.
  3. Hvis den fjernes direkte fra LPA, fjern foliestripen og la platen sitte i 1-2 min.
  4. Aspirer mediene fra hver brønn (av hele 24-brønnsplaten hvis alle brønnene brukes).
  5. Tilsett 100 μL 0,25% trypsin til hver brønn, dekk platen med et plastlokk, og legg den tilbake i inkubatoren.
  6. La cellene være uforstyrret i inkubatoren i 5 min.
  7. Etter 5 min, fjern platen og returner den til vevskulturhetten.
  8. Nøytraliser hver trypsinisert brønn med 400 μL DMEM.
  9. Merk mini-sentrifugerør med navn som tilsvarer hver brønn.
  10. Bruk en P1000 pipette og pipette innholdet i hver brønn opp og ned 6-8 ganger for å bryte celleklumper.
  11. Overfør hele innholdet i hver brønn (~500 μL) til de merkede rørene.
  12. Sentrifuger cellene i 5 min ved 400 x g.
  13. Når du er ferdig, kast supernatanten og flytt prøvene til en kjemisk avtrekkshette.
  14. Resuspend cellene (bruk en P1000 pipette og pipette opp og ned 6-8 ganger i hvert rør for å bryte celle klumper) i 750-1000 μL av 4% paraformaldehyd (fortynnet i fosfatbufret saltvann, PBS).
  15. La cellene sitte i 15 min ved romtemperatur.
  16. Etter inkubasjonen legger du til 750-1000 μL PBS. Pipette opp og ned flere ganger.
  17. Sentrifuger cellene i 5 min ved 400 x g.
  18. Når du er ferdig, kast supernatanten og flytt prøvene til en kjemisk avtrekkshette.
  19. Resuspend cellene (bruk en P1000 pipette og pipette opp og ned 6-8 ganger i hvert rør for å bryte celle klumper) i 750-1000 μL iskald metanol.
  20. La cellene sitte i 30 min på is eller i en -20 °C fryser.
  21. Etter inkubasjonen legger du til 750-1000 μL PBS. Pipette opp og ned flere ganger.
  22. Sentrifuger cellene i 5 min ved 400 x g.
  23. Når du er ferdig, kast supernatanten og flytt prøvene til en kjemisk avtrekkshette.
  24. Avhengig av hvilken type antistoffer som brukes, endre protokollen fra dette tidspunktet fremover. Følg enten trinn 7.24.1-7.24.14 eller 7.24.15-7.24.22.
    1. Hvis du bruker et primært og sekundært antistoff, resuspenderer du cellene ved hjelp av en P1000/P200 pipette og pipette opp og ned 6-8 ganger i hvert rør for å bryte celleklumper i 100 μL primært antistoff. I dette tilfellet ble det laget en fortynning på 1:800 for lagerantistoffer, inkludert KRAS-antistoff eller ERK-antistoff, og fikk lov til å sitte i 1 time ved romtemperatur. Antistoffer ble fortynnet i en inkubasjonsbuffer laget av 1x PBS med 0,5 g BSA.
      MERK: Bestem den nøyaktige fortynning av antistoffet empirisk ved å lage en standard kurve av antistofffortynning vs. antigenet av interesse.
    2. Etter å ha tilslått antistoffer, dekk rørene med en folie for å forhindre lyseffekter på merkede antistoffer.
    3. Etter inkubasjon legger du til 750-1000 μL av inkubasjonsbufferen. Pipette opp og ned flere ganger.
    4. Sentrifuger cellene i 5 min ved 400 x g.
    5. Når du er ferdig, kast supernatanten og flytt prøvene til en kjemisk avtrekkshette.
    6. Resuspend cellene ved hjelp av en P1000/P200 pipette og pipette opp og ned 6-8 ganger i hvert rør for å bryte celle klumper i 100 μL sekundært antistoff. I dette tilfellet ble celler resuspendert i 100 μL sekundært antistoff ved en fortynning på 1:800 for KRAS antistoff eller 1:2000 for ERK antistoff og fikk lov til å sitte i 30 minutter ved romtemperatur. I likhet med primære antistoffer, fortynn de sekundære antistoffene i inkubasjonsbufferen som beskrevet ovenfor. Bestem fortynning av sekundære antistoffer basert på empiriske funn av en standardkurve.
    7. Etter å ha tilslått antistoffer, dekk rørene med en folie for å forhindre lyseffekter på de merkede antistoffene.
    8. Etter inkubasjonen legger du til 750-1000 μL av inkubasjonsbufferen. Pipette opp og ned flere ganger.
    9. Sentrifuger cellene i 5 min ved 400 x g.
    10. Når du er ferdig, kast supernatanten og flytt prøvene til en kjemisk avtrekkshette.
    11. Resuspend cellene ved hjelp av en P1000 pipette og pipette opp og ned 6-8 ganger i hvert rør for å bryte celle klumper i 500 μL AV PBS.
    12. Overfør hele innholdet i hvert rør (~500 μL) til de merkede rørene med siler.
    13. Ta cellene til passende strømningscytometriinstrumenter med lasere av de riktige bølgelengdene (kan bringe rør med celler på eller utenfor isen).
      MERK: Det skal bemerkes at det å ha flere kontroller er viktig for å komme videre med strømningscytometrimåling og analyse av konstruert cellegenuttrykk. For eksempel, å ha helt unstained celler, celler farget med primære antistoff alene, og celler farget med sekundært antistoff alene kan være nyttig for å sammenligne resultater med bakgrunnssignaler fra antistoffer.
    14. Deretter fortsetter du med analysen som beskrevet i avsnitt 5.
    15. Hvis du bare bruker et primært antistoff, resuspenderer du cellene ved hjelp av en P1000/P200 pipette og pipette opp og ned 6-8 ganger i hvert rør for å bryte celleklumper i 100 μL merket primært antistoff. Bestem passende antistofffortynning og inkuber i 1 time ved romtemperatur. Bestem antistofffortynning fra standardkurven empirisk.
    16. Etter å ha tilslått antistoffer, dekk rørene med en folie for å forhindre lyseffekter på merkede antistoffer.
    17. Etter inkubasjon legger du til 750-1000 μL av inkubasjonsbufferen. Pipette opp og ned flere ganger.
    18. Sentrifuger cellene i 5 min ved 400 x g.
    19. Resuspend cellene ved hjelp av en P1000 pipette og pipette opp og ned 6-8 ganger i hvert rør for å bryte celle klumper i 500 μL AV PBS.
    20. Overfør hele innholdet i hvert rør (~500 μL) til merkede rør med siler.
    21. Ta cellene til passende strømningscytometriinstrumenter med lasere av de riktige bølgelengdene (kan bringe rør med celler på eller utenfor isen).
      MERK: Det skal bemerkes at det å ha flere kontroller er viktig for å komme videre med strømningscytometrimåling og analyse av konstruert cellegenuttrykk. Å ha helt ubeskridede celler og celler farget med primært antistoff alene er nyttige for å sammenligne resultater med bakgrunnssignaler fra antistoffer.
    22. Fra dette tidspunktet fortsetter du med analysen som beskrevet i avsnitt 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Genkretsmontering og stabil cellelinjegenerering i denne artikkelen var basert på kommersielle, modifiserte HEK-293-celler som inneholder et transkripsjonelt aktivt, enkeltstabilt FRT-sted (figur 1). Genkretsene ble konstruert i vektorer som hadde FRT-anlegg i plasmidet, noe som muliggjør Flp-FRT-integrasjon i HEK-293-cellegenomet. Denne tilnærmingen er ikke begrenset til Flp-In-celler, da FRT-nettsteder kan legges til hvilken som helst cellelinje av interesse hvor som helst i genomet ved hjelp av DNA-redigeringsteknologi som CRISPR / Cas950.

Når passende cellelinjer ble konstruert og validert for riktig innsetting, ble LPA- og IRIS-programvaren valgt som en standardisert protokoll for lysinduksjon av genuttrykk31,51. LPA-systemet gjør det mulig å programmere 24 brønner for induksjon av pattedyrceller under flere eksperimentelle forhold, avhengig av lysintensitet, pulsvarighet og driftssyklus (figur 2). I denne artikkelen ble romlig jevn lysintensitet, pulsvarighet og driftssyklus prioritert. Forskere kan imidlertid bruke IRIS-programvaren og LPA for mer avansert programmering av temporale lysbølgemønstre.

Et avgjørende aspekt ved LPA som skal håndteres før eksperimenter påbegynnes, er den optiske kalibreringen som kan utføres for én eller flere enheter. Den tidligere beskrevne bildeanalysemetoden31 som brukes til kalibrering krever et bilde av hele LPA med alle lysdioder av interesse slått på, som kan anskaffes fra en rekke kilder52, inkludert en gel-imager. Her ble en dataskanner brukt til bildeanskaffelse (figur 3A). Når bildet er anskaffet, ble open source-programvaren opprettet av Gerhardt et al. (2016)31 brukt til å beregne kompensasjonsverdier for hver LED for å sikre at hver LPA avgir samme intensitet til en gitt gråtoneverdi. Programvaren trekker fra bakgrunnssignalet, terskler bildet inn i en binær kategori og beregner pikselintensiteten (figur 3B). Fra kalibreringen ble det funnet en minimal variasjon blant lysdiodene, med en CV på 0,04 mellom 96 brønner (eller 4 plater kalibrert, figur 3C). Til slutt demonstrerte bruk av kalibreringsprogramvaren LED-variasjonen etter sted (figur 3D) og opprettet en gråtonejustering (figur 3E) slik at hver LED normaliseres til samme intensitet.

I tillegg til kalibrering inkluderer andre viktige aspekter ved bruk av LPA å integrere flere kontroller i den eksperimentelle rørledningen som kan minimere systemiske feil ved å begrense forvirrende variabler som lystoksisitetseffekter og designbegrensninger basert på eksperimentelle materialer. Figur 4 illustrerer for eksempel to ulike konfigurasjoner for programmering av ulike lysintensiteter i LPA-brønnene. Det første underpanelet i figur 4A viser en stigende organisering av lysintensitet. Dette kan gjøre det enklere å programmere og analysere data, men kan gi kanteffekter der den nederste raden i LPA har høyest lysintensitet og potensielt kan forårsake uønsket varme og lysinduksjon av nærliggende brønner. På samme måte, i det andre underpanelet i figur 4A, har en randomiseringsmatrise blitt brukt på IRIS-programvaren, og skaper forskjellige lysintensiteter i tilfeldige posisjoner. Dette kan minimere systemiske påvirkninger av kanteffekter. En descrambled matrise (figur 4B) er opprettet med IRIS-programvaren, som deretter kan brukes til å bestemme de eksperimentelle forholdene etter at eksperimentet er fullført og under analysen. I likhet med randomisering av brønner, bør brukerne også være oppmerksomme på lystoksisitetseffekter som kan oppstå (blått lys i dette arbeidet). I figur 4C vises to forskjellige lysintensiteter som brukes til genkretsinduksjon med samme FSC-SSC-port basert på den ikke-induserte populasjonen av konstruerte celler. Som sådan bør brukerne utføre en doserespons på den lette modaliteten av interesse (f.eks. puls, driftssyklus, etc.) for å bestemme lystoksisitetseffekter som kan oppstå i den høye enden av eksponeringen (figur 4D). Her forårsaket økende blått lysnivå doseavhengig cellulært rusk, døde celler og klumper sammenlignet med ikke-stimulerte celler. Som sådan var den kontinuerlige lysintensiteten begrenset til rundt 3/4 av maksimal LPA-intensitet (~ 3000 g.s. enheter).

Når riktig utstyr ble satt opp, ble genuttrykket deretter indusert i konstruerte LITer-genkretser via fluorescensmikroskopi (figur 5). Celler ble indusert ved forskjellige lyspulsvarigheter på LPA, noe som ga en lett doserespons av genuttrykk på befolkningsnivå. Celler i dette arbeidet ble avbildet for GFP-uttrykk ved hjelp av 50 ms for FITC / GFP lyskildeeksponeringstid og for lysfeltavbildning ved hjelp av 1-5 ms for fasekontrasteksponeringstid. Gitt robustheten til denne cellelinjeteknikkprotokollen, kan enhver fluorescensmarkør brukes i stedet for GFP. Cellene kan induseres med flere lysregimer og produsere et stort spekter av svar (figur 5). Sistnevnte er gunstig for å kontrollere uttrykket av funksjonelle gener (f.eks. KRAS (G12V) oncogene i det opprinnelige arbeidet53).

Umiddelbart etter fluorescensmikroskopi kunne celler analyseres i en rekke eksperimentelle protokoller, inkludert strømningscytometri, qRT-PCR og immunfluorescens. I dette arbeidet ble strømningscytometri utført som en første valideringsprosedyre og utført etter metodene beskrevet ovenfor (figur 6). I likhet med mikroskopi ble celler indusert ved forskjellige pulslengdeverdier, og viste en doserespons av genuttrykk av over fire ganger endring fra ikke-induserte tilstander på befolkningsnivå (figur 6A-B). På samme måte kan støyreduksjon av genuttrykk vises ved å sammenligne ulike lysintensitetsverdier (figur 6C-D) for LITer-systemet kontra et positivt reguleringssystem (ingen tilbakemelding) som VVD/LightOn54. Når du sammenligner LITer med VVD-systemet, oppnår negativ tilbakemelding over fem ganger støyreduksjon av genuttrykk. De samme forhåndsinduserte cellene som er avbildet på mikroskopi, kan også analyseres via qRT-PCR (figur 7). I likhet med strømningscytometri kan de konstruerte LITer-cellene uttrykke RNA-nivåer på en doseresponsiv måte (over 10 ganger induksjon fra ikke-induserte tilstander), som samsvarer med doseresponsen av proteinnivåer kvantifisert av GFP-uttrykk på strømningscytometri. Fluorescensmikroskopi- og strømningscytometridataene som nevnes, kan kalibreres ved hjelp av ikke-fluorescerende celler, som vanligvis uttrykker fluorescerende celler og fluorescerende 6-8-topp valideringsperler (f.eks. FL1-kanals grønne, fluorescerende perler). Hver av disse komponentene kan tillate normalisering av genuttrykk i et enkelt eksperiment. Imidlertid kan disse faktorene også tillate normalisering av kretser og konstruerte celler på tvers av forskjellige eksperimentelle plater, eksperimentelle forhold og dager for å tillate sammenligning og standardisering av genuttrykksdata.

Til slutt kan LITer-genkretsene konstrueres for å uttrykke funksjonelle gener, for eksempel KRAS (G12V, figur 8). Allsidigheten til denne rørledningen gjør det mulig for brukere å bruke LITer-arkitekturen med celleteknikk for ethvert funksjonelt gen av interesse, muligens innlemme ytterligere arkitekturer som positiv tilbakemelding. LITer viste økende mengder blått lys som resulterte i økte nivåer av genkretsutgangen (KRAS (G12V) proteinnivåer) og følgelig fosforrylatert-ERK-nivåer, som begge kan kvantifiseres via immunfluorescensanalyser.

Fragment Forhold Størrelse (bp) DNA fragment vekt konsentrasjon (ng / μL) DNA fragment molar konsentrasjon (fmol / μL) Volum (μL) Resulterende DNA molar masse (fmol)
Mor Vektor fragment 1 1 3414.00 18.20 8.63 4.09 35.29
Mor Vektor fragment 2 1 4642.00 18.10 6.31 5.59 35.29
Gen av interesse 1 549.00 37.90 111.70 0.32 35.29
Total 10.00 105.87

Tabell 1: Beregning av DNA-monteringsreaksjonsmasterblanding (trinn 1.13). Kolonne 2 og 3 er basert på størrelsen på DNA-fragmentene som er samlet og konsentrasjonen av disse fragmentene etter PCR-forsterkning og agarosegelekstraksjon (trinn 1.11). Den nederste cellen i den fjerde kolonnen (totalt reaksjonsvolum) kan endres; Det angitte volumet anbefales imidlertid. Celler som ikke er skyggelagt, genereres automatisk.

0 100 200 400 500 750
1500 3000 0 100 200 400
500 750 1500 3000 0 100
200 400 500 750 1500 3000

Tabell 2: IRIS-programmering av lysintensiteter (f.eks.) for lett induksjonseksperiment i en 24-brønnsplate med tre replikeringer (trinn 3.4). Fordeling av lysintensiteter fra 0 til 3000 g.s. G.s.-gråtoneenheter. Dette kan randomiseres av IRIS-programvaren etter behov.

Eksempel 1 Eksempel 2 Eksempel 3
Omvendt transkripsjon master mix volum (μL) 4.00 4.00 4.00
Volum for RNA-mal (1000 ng) (μL) 2.00 3.00 4.00
NF-H20 Volum (μL) 14.00 13.00 12.00
Totalt volum (μL) 20.00 20.00 20.00

Tabell 3: Omvendt transkripsjon master mix beregning (trinn 6.5). Reaksjonen anbefalte totalt volum er 20 μL, og komponentene er omvendt transkripsjonsenzym master mix (her: 5x), RNA mal og nukleasefritt vann. I dette eksemplet er RNA-konsentrasjonene av prøvene 1, 2 og 3 henholdsvis 500, 333 og 250 ng/μL.

Eksempel 1 Eksempel 2 Eksempel 1 og 2 Multiplekset
Volum for GFP-sonde (μL) 1 ----- 1
GAPDH-sondevolum (μL) ------ 1 1
DNA polymerase Master Mix Volum (μL) 10 10 10
cDNA (100 ng) Volum (μL) 2 2 2
NF-H20 Volum (μL) 7 7 7
Totalt volum (μL) 20 20 20

Tabell 4: Kvantitativ PCR-hovedmiksberegning (trinn 6.6). Reaksjonen anbefalt totalt volum er 20 μL og dens komponenter er DNA polymerase enzyme master mix (her: 2x), GFP og / eller GAPDH sonder, cDNA (100 ng totalt), og nukleasefritt vann (NF-H20).

Figure 1
Figur 1: Kretsdesign og celleteknikk. (A) Celletekniske verktøy, inkludert LITer syntetisk genkrets med FRT integrasjonssteder, rekombininasenzym (Flp rekombininase) for kretsintegrasjon, stoff som brukes til valg av passende genetiske kloner, og cellelinje av interesse som brukes til å skape ønskede optogenetiske pattedyrcellelinjer. (B) Konstruerte genetiske systemer kan integreres på et spesifikt FRT-sted som inneholder locus i det menneskelige genom. Disse genomiske loci kan deretter uttrykke spesifikk antibiotikaresistens eller fluorescerende reportergener for valg av riktig integrerte genetiske kassetter. Genkretsintegrasjon kan initieres ved bruk av rekombininaser som gjenkjenner spesifikke steder i den opprinnelige genetiske kassetten. Dette introduserer et nytt gen for valg av legemiddelresistens som kan sikre generering av riktig konstruerte celler med ønsket genkrets. Nederst i panel B er genkretsarkitekturen for det optogenetiske negative tilbakemeldingssystemet LITer2.0. Denne kretsen består av et selvundertrykkende TetR-protein smeltet sammen med et LETT-oksygen-spenningssensordomene (LOV2), en linkersekvens P2A som muliggjør en multicistronic transkripsjon, og GFP. Når blått lys påføres, åpnes TIP-sekvensen fra LOV2-domenet, hemmer TetR-proteinet og tillater økt, doseresponsiv transkripsjon av både TetR og GFP-reporteren. Det hemmet TetR-proteinet kan ikke bindes og undertrykkes på DNA-operatørstedet, og øker dermed transkripsjonen. Denne negative tilbakemeldingen holder genuttrykksstøyen lav og tillater en høyfoldsendring av genuttrykk. FRT - flip recognition target, HygR - hygromycin motstand, LacZ - β-galactosidase, ZeoR - zeocin motstand, T - TetR, tetracyklin repressor protein, D2ir er en CMV-basert promotor med TwtO nettsteder, LOV2 er Lys-oksygen-spenning-sensing domene, TIP er tet-hemmende peptid som hemmer TetR protein. Denne figuren er endret fra Guinn og Balázsi (2020)55. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: LPA eksperimentell programmering. (A) Eksperimenter kan programmeres ved hjelp av verktøyene som er oppført på Tabor lab website47 med fleksibilitet for steady-state, dynamisk eller avansert LPA-programmering31. Videre kan elektroniske filer lagres for fremtidig bruk for tekniske replikeringer eller eksperimentell induksjon av alternative cellelinjer. (B) LPA-enhet med hovedkomponenter sett fra topp og side (C). (D) Bilder av folieforseglede plater som skal ligge på LPA. LPA - Lysplateapparat, LED - lysdiode. Elementer av denne figuren er endret fra Guinn (2019)11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kalibrering av lysplateapparatet. (A) Representativt bilde av LPA for lysdioder satt til 2000 g.s. basert på IRIS-programvare. (B) Bilde fra panel (A) med bakgrunn trukket og terskel som brukes til å binarisere bildet for å beregne pikselintensiteten til hver LED. (C) Histogram av pikselintensiteter (bestemt av MATLAB bildeanalyse) av 96 lysdioder (4 LPA-plater) satt til samme IRIS-programvareverdi (f.eks. 2000 g.h.). Den røde linjen representerer gjennomsnittlig LED-pikselintensitet, og CV i panelet representerer variasjonskoeffisienten for de 96 brønnene. (D) Varmekart som viser LED-intensitetene til LPA-bildet i panelet (A) normalisert til led-lampen med maksimal intensitet. (E) Varmekart for kalibreringsverdi som bestemmes for LPA-bildet i panelet (A) for å skape produksjon med lik intensitet for hver LED når den er programmert for LPA. LPA - Lysplateapparat, LED - lysdiode, CV - variasjonskoeffisient. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Randomisering av LPA og lystoksisitetseffekter. (A) Representativt bilde av to programmerbare LPA LED-konfigurasjoner satt fra 25 til 4000 g.s, basert på IRIS-programvaren. Den første konfigurasjonen er mer sannsynlig å tillate systematiske feil som kanteffekter av varme og lys å krysse over (f.eks. den nedre raden i LPA som påvirker den andre laveste raden). Det andre bildet randomiserer plasseringen av intensiteter, og minimerer derfor systematiske feil (bias) forårsaket av kanteffekter. (B) Matrise som viser randomiseringssted for lysintensiteter i LPA vist i panel (A), som kan brukes til å bestemme intensitetsavhengige resultater av et gitt eksperiment. (C) Strømning av cytometridata for to forskjellige lysintensiteter (1250 og 4000 g.s.) i 3 dager med induksjon ved kontinuerlig belysning. Den svarte porten er basert på uinduserte celler. (D) Stolpediagram som viser strømningscytometridata som panel (C), men for et bredt spekter av lysintensiteter. LPA - Lysplateapparat, FSC - fremoverspredning, SSC - sidespredning, g.s. - lysintensitetsverdi målt i gråtoner. LITer-cellene11 hadde en doseresponsiv reduksjon i celleoverlevelse som var statistisk signifikant ved hjelp av ANOVA 1-tailed test med en p-verdi på 0,0022. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative mikroskopibilder av konstruerte optogenetiske cellelinjer. Celler ble avbildet på et invertert mikroskop med et kamera (14-bit) for å skaffe fasekontrast og fluorescensavbildning. Celler ble eksponert i 5 ms for fasekontrast (panel A, representativt lysfeltbilde) og 50 ms for GFP / FITC-oppkjøp (panel B) med 100% lyskildeintensitet. Celler kan avbildes på ulike tidspunkter, avhengig av ønsket steady-state-oppkjøp eller dynamisk respons, noe som fører til en jevn tilstand. Celler her representerer en puls varighet titrering ved fast intensitet (1000 g.s.) som spenner fra ingen lyseksponering til 3 dager med lyseksponering. Enheten g.s representerer en lysintensitetsverdi målt i gråtoner. Dette tallet er endret fra Guinn (2019)11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Strømningscytometri av konstruerte optogenetiske cellelinjer. Celler ble analysert på et BD LSRFortessa strømningscytometer, med omtrent 10 000 celler samlet inn i en SSC-FSC(side scatter-forward scatter) port. Cellene ble deretter analysert med FCS Express-programvaren. Histogram eller scatter-plott kan genereres for å kvantifisere uttrykket av genet av interesse (f.eks. (A) Konstruerte celler tegnet på SSC-FSC-akser for gating innenfor den svarte linjen. (B) Representative LITer-celler indusert med varierende varighet av lyspulser ved 1000 g.s. opptil 72 t induksjon, som illustrerer doserespons av genuttrykk. (C) Representative doseresponsdata for lysintensitetstitrering som sammenligner LITer-genkretsen (TIP-basert system) versus VVD- eller LightOn-system40, som er et positivt reguleringssystem uten tilbakemelding. (D) Histogram som tilsvarer VVD-systemet, som illustrerer bredere fordeling (og dermed høyere genuttrykksstøy) sammenlignet med LITer-systemet. CV er variasjonskoeffisienten, en beregning for genuttrykksstøy. FSC - fremoverspredning, SSC - sidespredning, FITC - fluorescein isothiocyanate, g.s. - lysintensitetsverdi målt i gråtoner. Dette tallet er endret fra Guinn (2019)11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Kvantitativ sanntids-PCR for konstruerte optogenetiske cellelinjer. Representative data som viser at flere genuttrykksnivåer kan induseres og kvantifiseres ved hjelp av lys som stimulans. Enheten Rq representerer relativ kvantifisering av uttrykksfoldendring sammenlignet med kontroll. LITer-cellene11 hadde en doseresponsiv økning i RNA-uttrykk som var statistisk signifikant ved hjelp av ANOVA 1-tailed test med en p-verdi på henholdsvis 0,0352 og 0,0477 for GFP- og KRAS-nivåer. Dette tallet er endret fra Guinn (2019)11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Immunfluorescence av konstruerte optogenetiske cellelinjer. Representative data som viser anslag på proteinnivå basert på immunfluorescens. (A) Proteinnivåer av KRAS(G12V) og (B) proteinnivåer av fosforylatert-ERK, som LITer-genkretsen induserer i henhold til økende lysmengder henholdsvis direkte og indirekte. Data som vises i stolper er gjennomsnittsverdier, feilfelt er standardavvik (n = 3). A.u. - vilkårlige enheter, g.s. - lysintensitetsverdi målt i gråtoner. LITer-cellene11 hadde en doseresponsiv økning i proteinnivåer som var statistisk signifikant ved bruk av ANOVA 1-tailed test med en p-verdi på henholdsvis 2,79E-04 og 0,016 for KRAS- og fosforerlated-ERK-nivåer. Dette tallet er endret fra Guinn (2019)11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lesere av denne artikkelen kan få innsikt i trinnene som er avgjørende for å karakterisere optogenetiske genkretser (så vel som andre genuttrykkssystemer), inkludert 1) genkretsdesign, konstruksjon og validering; 2) celleteknikk for innføring av genkretser i stabile cellelinjer (f.eks. Flp-FRT-rekombinasjon); 3) induksjon av de konstruerte cellene med en lysbasert plattform som LPA; 4) innledende karakterisering av lysinduksjonsanalyser via fluorescensmikroskopi; og 5) endelig genuttrykkskarakterisering med en rekke analyser, inkludert strømningscytometri, kvantitativ PCR i sanntid (qRT-PCR) eller immunfluorescensanalyser.

I tillegg er metodene som er skissert ovenfor svært modulære for i hovedsak enhver genkretsarkitektur som uttrykker gener av interesse, med de viktigste potensielle protokollmodifikasjonene på kretskonstruksjonstrinnet og analysene som utføres. Når det gjelder genkretskonstruksjon, tillater fleksibiliteten til molekylær kloning ethvert gen av interesse å bli utvekslet eller co-uttrykt med en fluorescensmarkør med mindre modifikasjoner på primerdesign eller monteringsprotokoller. I tillegg, mens prosedyrene som er skissert her fokuserer mest på en NF-genkretsdesign for presis (lavstøy) genuttrykkskontroll, kan andre arkitekturer som positiv regulering eller positiv tilbakemelding (PF) implementeres for å oppnå forskjellige funksjoner som høyfoldsendring eller høy genuttrykksstøy, henholdsvis56,57 . Ved hjelp av en rekke genkretsarkitekturer (f.eks. PF, NF osv.) kan forskere utforske ulike biologiske spørsmål som rollene proteinnivå og støy spiller i legemiddelresistens eller metastase58. Protokollene som er oppført her fokuserer også på ulike måter å kvantifisere genuttrykk på, men et hvilket som helst antall funksjonelle analyser (f.eks. cellemotilitet, sårheling, spredning, etc.) kan legges til etter mikroskopioppkjøp med liten eller ingen effekt på de foregående metodene. Dette er spesielt relevant for encellede studier der optogenetikk kan bruke romlig induksjon for å studere atferd som pulsatile expression dynamics59.

Komplementerende metode modularitet, feilsøking er en annen viktig funksjon i hver hovedprotokoll. For kretskonstruksjon ligger de viktigste forskjellene i riktig kretsspesifikk primerdesign, mens senere metoder som montering og plasmidforsterkning via bakterievekst er mer standardiserte og inkluderer vanligvis sine egne omfattende feilsøkingsprosedyrer. Celleteknikk kan endres med legemiddeltitreringskurver avhengig av cellelinjen som brukes. Hvis en kommersiell cellelinje brukes, kan du i tillegg få feilsøkingsveiledninger direkte fra produsenten av cellelinjen. Utilsiktede lyseffekter er også viktige for å kvantifisere på de konstruerte cellelinjene. For eksempel, på grunn av de fototoksiske effektene av 470 nm lys, bør det opprettes en lysintensitetskurve for å undersøke induksjonen av død eller skade i en befolkning. Når en rekke lysverdier er testet, kan brukerne opprette en FSC-SSC-port eller bruke en metode som propidiumjodidfarging for å kvantifisere døde / skadede celler, og derfor tjene som et verktøy for å bestemme passende lysområder som skal brukes eksperimentelt.

For LPA-feilsøking kan lysdioder produsere kanteffekter av lys- og varmekryss med tilstøtende brønner. For eksempel kan høyintensitetsbrønner forårsake en viss induksjon i tilstøtende brønner hvis det er feil tetning eller stor varme-/lysgradient mellom brønnene. Disse effektene kan være maksimale hvis LPA er programmert i en bestemt rekkefølge (f.eks. stigende/synkende) av en lysparameter. For å bekjempe dette tillater IRIS-programvaren brukere å bruke en randomiseringsmatrise for å randomisere brønnintensitetene og dermed redusere systematisk feil. For feilsøking av aspekter ved fluorescensmikroskopi, eksponeringstid, forsterkningsinnstillinger (kontrollere kameraets følsomhet) og lyskildeintensitet er de viktigste parametrene som kan justeres. Justering av disse parametrene kan muliggjøre optimal bildeproduksjon og ideelle signal-til-støy-forhold, samt unngå overmetning og fototoksisitet.

For strømning cytometri feilsøking, photomultiplier rørspenninger og cellulær gating er de viktigste aspektene som kan justeres. Tuning av disse parametrene kan tillate ideelle sammenligninger mellom eksperimentelle forhold og kontrollprøver, riktig signalanskaffelse for både svake eller sterke fluorescenssignaler, og utelukkelse av cellulært rusk eller uønskede cellepopulasjoner. Det skal bemerkes at strømningscytometrispenninger ideelt holdes konstant på tvers av eksperimenter for å tillate riktige sammenligninger. I tillegg, for optogenetiske systemer som krever flere fluorescensutganger (f.eks. FITC og PE), må brukerne være oppmerksomme på fluorescenskompensasjon gitt krysstale mellom fluoroforer. I slike scenarier er kontroller avgjørende for å bestemme riktige fluorescenssignaler. Kontroller som vil være nødvendige for brukere å utføre inkluderer fluorescerende perler, fargede celler med interessemarkøren, eller celler som vanligvis uttrykker fluorescensproteinet som kan brukes til å lage en kompensasjonsmatrise i strømningscytometriprogramvaren av interesse. I tillegg, enten de bruker en fluorescensmarkør eller mer, bør alle brukere rutinemessig måle fluorescenssignaler fra hver markør for ikke-fluorescerende celler, noe som gir autofluorescens / bakgrunnssignaler. qRT-PCR-feilsøking inkluderer varierende cDNA-mengder og sondedesign, som ofte er prosjektspesifikke. Til slutt, for immunfluorescence feilsøking, antistoff konsentrasjoner er den største variabelen for analyse kvantifisering, nødvendiggjør optimal konsentrasjon bestemmelse.

Et feilsøkingsaspekt som er relevant for de fleste metodene ovenfor, er isolasjonseffekten av å bruke en forseglet plate med celler dekket med folie. Denne metoden kan hindre karbondioksidgassutvekslingen som trengs for riktig vekst av ulike cellelinjer. Fra tidligere eksperimentell erfaring var dette ikke et betydelig hinder for cellulær vekst for et 3-5 dagers eksperiment ved hjelp av de konstruerte cellelinjene i dette manuskriptet, men kan bli viktig for andre cellelinjer eller eksperimentelle varigheter. For å løse denne bekymringen inkluderer en tilpasning implementert med de forseglede platene bruk av karbondioksid uavhengige medier, som ikke har påvirket veksten av celler som brukes i denne studien. Det bør bemerkes for andre analyser eller cellelinjer der metabolisme, pH-nivåer og celletetthet er viktige, andre intervensjoner kan være nødvendig som å endre medier eller næringsstoffer oftere.

Grensene for metodene som er skissert her ligger i genkretsen som brukes, optogenetisk teknologipresisjon og LPA-grensesnitt med annet utstyr som fluorescensmikroskop. Teknologien som er beskrevet her er rimelig, rask å bygge og enkel å validere46 for populasjoner av optogenetisk konstruerte celler. Imidlertid er det visse romlige begrensninger, for eksempel manglende evne til å kontrollere enkeltceller uten endringer i lysinduksjonsoppsettet, for eksempel bruk av digitale speilenheter (DMDer), med nylig demonstrerte fordeler i levende celler60,61. Videre er metodene som er skissert her begrenset i live-celle sporing under optogenetisk stimulering, slik at bare for sluttpunkt datainnsamling av hele eksperimentelle tidsforløpet.

Til tross for disse grensene er de optogenetiske metodene som er skissert her, komplementære til den eksisterende teknologien som DMDene, som har fleksibilitet til å kontrollere enkeltceller i sanntid, men er begrenset av antall prøver man kan stimulere. Videre står de stabile cellelinjeteknikkmetodene som diskuteres her kontrasterer eksisterende syntetiske biologimetoder som ofte karakteriserer konstruerte genetiske systemer via forbigående transfeksjoner. Forbigående transfeksjonsmetoder er iboende støyende på grunn av større variasjon av genkretsens kopinummer mellom celler. I motsetning til dette involverer metodene som presenteres her monoklonale cellevarianter, som hver inneholder en genkretskopi. Stabile cellelinjer gjør det mulig å utforske cellulære aspekter som genuttrykksvariasjon, proteinnivåeffekter på fenotypiske landskap og encellede metoder med finere presisjon siden det er høyere tillit til at hver celle er identisk med naboene.

Arbeidet her demonstrerer en plattform for å designe enhver genomisk integrert optogenetisk genkrets av interesse, indusere slike systemer med pålitelige eksperimentelle verktøy, og karakterisere dem med en rekke genuttrykk og funksjonelle / fenotypiske analyser på en standardisert måte. Fremtidige forbedringer av disse protokollene kan omfatte integrering av disse metodene med live-celle sporing ved hjelp av andre optogenetiske teknologier som DMDs, som vil tillate romlig kontroll av genuttrykk og funksjonelle applikasjoner på encellet nivå. Slike fremskritt vil tillate lysutnyttelse å produsere genuttrykksmønsteret av interesse for enkeltceller, etablere transkripsjon / oversettelsesdynamikk, kvantifisere proteinnivåer og studere deres rolle i ulike biologiske prosesser, inkludert cellemigrasjon, spredning, metastase og differensiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi vil takke Balázsi lab for kommentarer og forslag, Dr. Karl P. Gerhardt og Dr. Jeffrey J. Tabor for å hjelpe oss med å konstruere den første LPA, og Dr. Wilfried Weber for å dele LOV2-degron plasmider. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R35 GM122561 og T32 GM008444]; Laufersenteret for fysisk og kvantitativ biologi; og et NDSEG-stipend (National Defense Science and Engineering Graduate). Støtte til åpen tilgang: NIH [R35 GM122561].

Forfatterbidrag: M.T.G. og G.B. unnfanget prosjektet. M.T.G., D.C. og L.G., utførte eksperimentene. M.T.G., D.C., L.G., og G.B. analyserte dataene og utarbeidet manuskriptet. G.B. og M.T.G. ledet prosjektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes Eppendorf 951010006 reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X Thermo Fisher Scientific MT25053CI reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000020 tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000055 tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap Corning 352235 reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V Eppendorf 22628113 equipment for mammalian culture work
Agarose Denville Scientific GR140-500 reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates VWR® 60941-126 tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin Sigma Aldrich A9518-5G reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer Thermo Fisher Scientific 02215365PR tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140010 reagent for growing bacteria
BD LSRAria BD 656700 tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa BD 649225 tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine Government Scientific Source SIGA4919-1G reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC Corning 353043 plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge VWR 22628113 instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood N/A N/A instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid BD 353047 plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask USA Scientific CC7682-4825 container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fischer Scientific BP231-100 reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15-585-011 reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid Corning 353072 container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express De Novo Software: N/A software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL Corning 35-010-CV reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose Thermo Fisher Scientific 11-965-092 reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL Life Technologies 10687-010 reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad Laboratories 1708890 reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C VWR 76210-392 equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C Panasonic MDF-U74VC equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C VWR 76359-220 equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg Sigma-Aldrich L3022-250G reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000 Life Technologies L3000008 reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019 MathWorks N/A software for analyzing experimental data
Methanol Acros Organics 413775000 reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL VWR 20170-333 plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
MultiTherm Shaker Benchmark Scientific H5000-HC equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-NDL-US-CAN equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix NEB M0492S reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs (NEB) C3019H bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs (NEB) E2621L reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera Nikon Instruments Inc. N/A instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements Nikon Instruments Inc. N/A software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides IDT N/A reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control Panasonic MCO-170AICUVHL-PA instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade Electron Microscopy Sciences 15710-S reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) Invitrogen 14190144 reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x Fisher Scientific 15140-122 reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody Cell Signaling Technology 4370S primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody Sigma-Aldrich WH0003845M1 primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Eppendorf A28137 equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App Thermo Fisher Scientific N/A software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody Cell Signaling Technology 8889S secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody Invitrogen A11005 secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL Olympus Plastics 12-102 reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System Major Science UVCI-1200 tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene SnapGene N/A software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator Tokai Hit INU-TIZ tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557 reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn Life Technologies 4326317E qPCR Probe
Thermocycler Bio-Rad 1851148 tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated PerkinElmer 1450-605 plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm VWR 14673-010 reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System VWR 89032-290 equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293 Thermo Fisher Scientific R75007 Engineered cell line with FRT site

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822 (2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247 (2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670 (2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), New York, N.Y. 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18 (2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131 (2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521 (2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547 (2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314 (2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111 (2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887 (2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128 (2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591 (2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , Stockton Press. New York. (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. TaborLab IRIS. TaborLab IRIS Software. , Available from: http://taborlab.github.io/Iris/index.html (2021).
  48. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849 (2017).
  49. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  50. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  51. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
  52. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  53. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436 (2020).
  54. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  55. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , Ann Arbor. Ph.D (2020).
  56. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766 (2019).
  57. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  58. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726 (2020).
  59. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  60. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  61. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355 (2020).

Tags

Bioingeniør Utgave 173 optogenetikk genuttrykkskontroll syntetisk biologi negativ tilbakemelding genkretser
Pålitelig prosjektering og kontroll av stabile optogenetiske genkretser i pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., … More

Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (173), e62109, doi:10.3791/62109 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter