Summary
可靠地控制光响应性哺乳动物细胞需要光遗传学方法的标准化。为了实现这一目标，本研究概述了基因电路构建，细胞工程，光遗传学设备操作和验证分析的管道，以标准化使用负反馈光遗传学基因电路作为案例研究的光诱导基因表达研究。
Abstract
无论使用何种方法，哺乳动物细胞中可靠的基因表达控制都需要具有高折叠变化、低噪声和确定的输入到输出传递函数的工具。为了实现这一目标，光遗传学基因表达系统在过去十年中因哺乳动物细胞中蛋白质水平的时空控制而受到广泛关注。然而，大多数控制光诱导基因表达的现有电路在结构上各不相同，由质粒表达，并利用可变光遗传学设备，因此需要探索稳定细胞系中光遗传学成分的表征和标准化。在这里，该研究提供了可靠的基因电路构建，整合和表征的实验管道，用于控制哺乳动物细胞中的光诱导基因表达，以负反馈光遗传学电路为例。这些方案还说明了标准化光遗传学设备和光照制度如何可靠地揭示基因电路特征，如基因表达噪声和蛋白质表达幅度。最后，本文可能适用于希望采用这种技术的光遗传学不熟悉的实验室。这里描述的管道应该适用于哺乳动物细胞中的其他光遗传学回路，从而可以在哺乳动物细胞的转录，蛋白质组学和最终表型水平上更可靠，更详细地表征和控制基因表达。
Introduction
与其他工程学科类似，合成生物学旨在标准化实验方案，允许使用具有高度可重复功能的工具来探索与生物系统相关的问题1，2。合成生物学中已经建立了许多控制系统的一个领域是基因表达调控领域3，4。基因表达控制可以靶向蛋白质水平和变异性（噪声或变异系数，CV = σ/μ，作为平均值的标准偏差测量），这是关键的细胞特征，因为它们在生理和病理细胞状态中的作用5，6，7，8。许多可以控制蛋白质水平和噪声的合成系统4，9，10，11，12 已经过设计，为跨工具标准化协议创造了机会。
最近出现的一套可以控制基因网络的新工具是光遗传学，能够使用光来控制基因表达13，14，15，16，17。与它们的化学前身类似，光遗传学基因回路可以引入任何细胞类型，从细菌到哺乳动物，允许表达任何感兴趣的下游基因18，19。然而，由于新型光遗传学工具的快速产生，许多系统在遗传电路结构、表达机制（例如，基于质粒与病毒整合）和供光控制设备方面存在差异11，16，20，21，22，23，24，25.因此，这为光遗传学特征的标准化留下了空间，例如基因电路构建和优化，系统利用方法（例如，积分与瞬态表达），用于诱导的实验工具以及结果分析。
为了在哺乳动物细胞中标准化光遗传学方案方面取得进展，该协议描述了一种实验管道，以使用集成到HEK293细胞（人类胚胎肾细胞系）中的负反馈（NF）基因电路来设计哺乳动物细胞中的光遗传学系统为例。NF是证明标准化的理想系统，因为它在本质上非常丰富26，27，28 ，允许调整蛋白质水平并实现噪声最小化。简而言之，NF允许通过抑制器精确控制基因表达，从而足够快地减少其自身表达，从而限制远离稳定状态的任何变化。稳态可以通过诱导剂来改变，该诱导剂使抑制剂失活或消除抑制剂，以允许更多的蛋白质产生，直到每个诱导剂浓度达到新的稳态。最近，一种工程NF光遗传学系统被创建出来，该系统可以产生基因表达的宽动态响应，保持低噪声，并对光刺激做出反应，从而具有空间基因表达控制的潜力11。这些工具被称为光诱导调节器（LITers），其灵感来自早期的系统，该系统允许在活细胞中进行基因表达控制4，10，29，30 ，并稳定地整合到人类细胞系中以确保长期的基因表达控制。
在这里，以LITer为例，概述了一种方案，用于创建光响应基因电路，使用光板装置（LPA，一种光遗传学诱导硬件）诱导基因表达31，并分析工程化的光遗传学可控细胞系对定制光刺激的反应。该协议允许用户将LITer工具用于他们希望探索的任何功能基因。它还可以通过集成下面概述的方法和光遗传学设备，适用于具有不同电路架构（例如，正反馈、负调节等）的其他光遗传学系统。与其他合成生物学方案类似，此处概述的视频记录和光遗传学方案可以应用于不同领域的单细胞研究，包括但不限于癌症生物学，胚胎发育和组织分化。
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Protocol
1. 基因电路设计
- 选择遗传成分以组合成单个基因回路/质粒（例如，哺乳动物DNA整合序列基序32，光响应元件33或功能基因34）。
- 使用任何基因工程和/或分子克隆软件，存储DNA序列以供以后使用和参考，注释每个序列，并检查所有必要的特征（例如，START密码子，调控或翻译序列）35。
- 根据整体基因电路设计开发或采用零件36。例如，对于 LITers11 中的光遗传学抑制因子，融合编码能够进行光诱导降解37，38 或灭活抑制因子 DNA 结合能力39 的基因序列，该基因序列与抑制基因（例如，TetR）的框架相邻并处于抑制基因框架中4。
- 对于光遗传学激活剂，确保存在激活剂结构域40 ，该激活剂结构域可在光诱导的DNA结合时促进基因表达41。对于阴性或阳性的自调节，确保在调节基因的启动子中或上游存在调节结合位点（例如，表达TetR的启动子的tetO位点或上游）42。
- 使用每个基因电路的分子克隆软件设计用于质粒DNA序列扩增或测序的引物。
- 通过分子克隆软件的内置盛宴（例如，序列比对）以计算方式验证质粒构建的引物。
- 从制造商处订购寡核苷酸引物。在这项工作中构建和使用的质粒可以在原始支撑材料中找到11 以及设计和使用的引物。
- 将引物稀释至双蒸馏水（ddH 2 O）中的100mM储备浓度。
- 将100 mM原液引物的原液稀释至10 mM浓度以进行PCR。
- 用1μL正向引物，1μL反向引物，1μL模板DNA制备PCR混合物，总质量为0.5-500ng用于基因组或0.5 pg-5 ng用于质粒或病毒DNA，12.5μLDNA聚合酶2x预混液（或满足制造商稀释因子的体积）和9.5μLdH2O，总反应体积为25μL。
- 根据所选的酶，在适当的设置下在热循环仪中孵育PCR混合物43。建议的反应循环包括：
步骤1：一个循环30秒的初始变性步骤在95°C下。
步骤2：在98°C下变性步骤40次5s。
步骤3：在65°C下退火步骤一个循环30秒（由先前设计的引物确定）。
步骤4：在72°C（〜1千碱（kb）模板片段长度）下延伸1分钟的一个循环。
步骤5：在72°C下延长2分钟的一个循环。
将反应保持在4°C，直到可以通过凝胶电泳进行测试。该方案将根据所使用的试剂（例如，聚合酶和缓冲液）而变化。 - 重复步骤1.9以扩增DNA组装反应中使用的所有片段，这些片段用于将线性PCR产物连接到单个环状DNA载体中。
- 在1%琼脂糖凝胶上运行PCR产物，然后纯化所需长度的条带。
- 为DNA组装反应准备预混液（表1）。
注意：在本例中，母载体被分成两个片段，以提高PCR步骤的效率，而不会对整体组装结果造成重大变化。 - 将DNA组装反应预混液在热循环仪中在50°C下孵育1小时（除非DNA组装试剂方案中另有规定），并将反应储存在4°C下以使用反应产物进行细菌转化。
- 使用合格的 大肠杆菌 （大肠杆菌）细胞和相应的细菌转化方案建立细菌转化（化学或电穿孔）。转化后，使用含有所选细菌选择标记物（例如氨苄西林）的细菌Luria-Bertani（LB）琼脂平板来接种转化混合物。将板在37°C孵育过夜44。
- 第二天检查盘子。要接种菌落，请从板中挑选单个菌落，并将其重悬于培养管中具有相应细菌选择标记的液体LB肉汤中。在37°C，300rpm的振荡器培养箱中孵育过夜。
- 执行质粒制备方案以从细菌培养物中提取质粒DNA。
- 分两步验证电路。首先，使用限制性内切酶作为粗体验证进行测试消化，以查看是否获得了近似的质粒产物。其次，如果测试消化通过/确认，则将质粒提交给Sanger测序设施（或使用可用设备进行处理）以获得精确的DNA序列，以便以后将其与设计软件中的预期序列进行比较。
- 要进行测试酶切，请根据所使用的分子克隆软件选择至少两种产生至少两个片段的限制性内切酶。选择酶后，根据所使用的酶，通过加入每种酶的1μL，生成的DNA的5μL和13μL水以及适当的盐和缓冲液来制备测试样品。将反应在37°C孵育1小时，或按照酶制造商的建议。在1%琼脂糖凝胶上运行测试消化产品，并确定条带是否正确。
注：如果条带正确，请继续测序。 - 为了进行测序，根据存储在软件中的DNA生成引物，以便引物的退火区域相距约500 bp（碱基对），并覆盖感兴趣的片段（基因电路组分）或全质粒。用纯无核酸酶水（NF-H2O）稀释引物至10 mM浓度。通过将1μL 10ng / μL DNA，1μL引物和8μLNF-H2 O加入0.2mL管中来制备测序样品。对每个引物重复此操作。
注：制备样品时，将其放在测序设施中，并使用分子克隆软件将结果与质粒序列进行比较。
- 要进行测试酶切，请根据所使用的分子克隆软件选择至少两种产生至少两个片段的限制性内切酶。选择酶后，根据所使用的酶，通过加入每种酶的1μL，生成的DNA的5μL和13μL水以及适当的盐和缓冲液来制备测试样品。将反应在37°C孵育1小时，或按照酶制造商的建议。在1%琼脂糖凝胶上运行测试消化产品，并确定条带是否正确。
- 在此步骤中，生成约100-1000ng / μL的DNA样品，用于将含有基因回路的质粒整合到适当的细胞系中。
2. 稳定的细胞系工程
- 订购哺乳动物细胞系，用于快速生成稳定的亚系，确保来自哺乳动物表达载体的感兴趣蛋白质的高水平表达。细胞类型和细胞系工程的易用性可以根据用户喜欢或目标实现的目标而变化。
- 例如，如果用户更喜欢中间步骤最少的细胞系工程，则在转录活性基因组位点处对包含单个稳定整合位点（例如FRT）的细胞进行排序。如果更喜欢更细微的细胞工程，请使用CRISPR / Cas9等基因工程工具在首选位置创建整合位点。
- 在37°C的加湿空气中，在5%CO 2 中生长细胞。 根据需要调整细胞类型的生长条件。
- 在从先前步骤中获得的所需细胞中转染上述设计的基因回路，以开始稳定的细胞系生成过程。为了实现这一点，使用具有适当重组酶（例如，用于Flp-FRT重组的Flp-重组酶）的基因电路DNA的脂质体混合物45 或通过其他方法（例如电穿孔）。
- 转染后两天，将细胞分裂成25%汇合度。
- 分裂细胞后六小时，通过将培养基交换到含有50μg/ mL潮霉素抗生素（或对应于质粒构建期间选择的哺乳动物抗生素耐药基因的另一种抗生素试剂）的新鲜培养基上，开始抗生素选择。
注意：在基因回路构建中利用了多种哺乳动物抗生素抗性基因，每种基因都有不同的杀伤曲线。因此，无论选择哪种哺乳动物抗生素耐药基因进行电路构建，都应在感兴趣的细胞中研究适当的杀伤曲线。该步骤确保含有基因回路有效载荷的细胞被富集，而那些没有系统的细胞被杀死。 - 让细胞在抗生素选择培养基中生长，每2-3天更换一次新鲜培养基，直到平板或烧瓶有几十个病灶。当它们处于对数阶段时，通过粘附文化，然后才能达到汇合点。
- 一旦有足够多的病灶，用1毫升0.25%胰蛋白酶，0.1%EDTA在汉克平衡盐溶液（HBSS）中将细胞胰蛋白酶消化，不含钙，镁和碳酸氢钠几分钟。用新鲜培养基中和胰蛋白酶，并将所有细胞放入新鲜容器中。
- 一旦新鲜容器中的细胞80%-100%汇合，将它们冷冻在45%旧培养基，45%新鲜培养基和10%DMSO的混合物中。将剩余细胞转移到无菌管中并进行单细胞分选，以将单克隆细胞分离到96孔板中。
- 单克隆分选后约2-3周，96孔板内的孔应具有病灶。当约50%-60%汇合时，将细胞分裂成12孔板。
- 一旦12孔板80%-100%汇合，分成组织培养处理的T-25烧瓶。一旦T-25烧瓶中的细胞80%-100%汇合，冷冻细胞并保持用于表征和测试单克隆细胞系的通道。
- 通过显微镜和流式细胞术测定表征单克隆细胞系，以报告基于诱导荧光报告基因的表达谱。通过荧光抗体标记和免疫荧光测定验证功能性蛋白质的产生。通过定量实时荧光定量 PCR （qRT-PCR） 测试转录水平的基因表达诱导。通过克隆的局部和全基因组测序来验证基因序列和整合准确性。
3. 光板装置感应试验
- 构建LPA器件31，46 ，用于工程电池的光诱导。简而言之，几个广泛的步骤对于创建用于控制基因表达的LPA至关重要。其中包括3D打印LPA框架组件，电路板结构，通过微控制器编程器对电路进行编程，将组件组装成最终的LPA，通过IRIS软件对存储卡进行编程以及校准成品设备。有关更全面的解释，请参阅上述参考资料。
- 按照Gerhardt等人（2016年和2019年）31，46中概述的打印3D部件。
- 组装电路板，如Gerhardt等人（2016年和2019年）31，46所述。
- 使用微控制器编程器将固件添加到组装的LPA电路中，如Gerhardt等人（2016和2019）31，46中所述。
- 将3D打印部件和组装的电路板结合在Gerhardt等人（2016和2019）31，46中概述。这包括安装板、电路板、LED（发光二极管）垫片、板适配器、24 孔板、板盖、安装螺栓、翼形螺母和堆叠组件，如拍摄的视频和 图 2 所示。
- 对于设备的存储卡编程和校准，请按照以下步骤操作。
- 使用 Tabor Lab 网站 47 上提供的 IRIS 软件对光板设备 （LPA）31 的 SD 卡进行编程，并探索开始光遗传学实验所需的适当光照条件。
注：IRIS软件是一个基于网络的应用程序，用于对光遗传学电子硬件（称为LPA）进行编程，由Tabor实验室开发。该软件允许对相对IRIS值进行编程，以控制LPA硬件每个孔中的单个发光二极管（LED）。 - 选择 LPA （4 x 6） 下拉选项，然后单击相应的照明方法（稳态、动态、高级）。
注意：对于本手稿，所有测定都将集中在稳态示例上。但是，高级设置示例可用于脉冲持续时间和占空比状态。 - 通过在与板孔相对应的电池中输入值来选择是照亮顶部还是底部LED。对于这项工作中使用的LPA，所有实验中都使用了放置在顶部位置的蓝色LED。每个 LED 一旦编程，就可以以恒定的光强度提供连续的光照。IRIS软件允许4096个强度水平，可以编程。
- 选择 LED 位置后，输入所需实验轮廓的强度值。例如，输入 8 种不同的光强度（或脉冲持续时间或占空比），每个板有三个技术重复（表 2）。G.s.是指灰度单位 - IRIS软件中用于LPA编程的光强度水平测量值。
- 在设计IRIS实验文件时，请记住LPA设备上相邻孔的边缘效应，蓝光暴露强度增加产生的光毒性，以及确定所需的剂量反应类型（例如，单调与非单调）。
- 如果用户以特定光参数（例如强度）的升序/降序对LPA中的细胞进行编程，则孔可能会产生光串扰甚至热量的边缘效应，从而影响相邻的孔。当实验完成时，这可能会无意中影响测量输出的结果。为了缓解这种情况，用户可以在IRIS软件上实现随机化矩阵来扰乱井位，从而最大限度地减少边缘效应。下面的代表性结果（图4A-B）中描述了一个示例。
- 此外，已经发现更高强度的蓝光会干扰细胞生长和活力48。因此，为了减轻光毒性，重要的是根据所研究的模式产生光强度、脉冲持续时间或占空比响应曲线。
- 例如，编程8个光强度值，每个24孔板有三个重复，范围从无光到LPA的最大强度。然后，在具有SSC-FSC门或活染色剂（如碘化丙啶）的流式细胞仪上运行这些样品，以量化每个光值处的群体细胞存活率（活细胞与包括死细胞/细胞碎片在内的总事件相比）。
- 然后，确定实验设置的理想群体存活量，因为任何刺激都可能对增殖、基因表达或存活产生不利影响（例如，将80%的细胞存活率设置为适当的权衡）。例如，在这项工作中，一旦校准，强度不超过3000 g.s.单位（〜LPA设备最大强度的3/4）。这方面的一个例子在下面的代表性成果中进行了描述。
- 除了由于毒性而限制光值外，用户可能还希望限制光值以表征剂量反应的特定部分，例如单调反应的范围。
- 为了实现这一点，首先扫描广泛的光强度，脉冲持续时间或占空比，具体取决于在确定所需剂量反应时所分析的模式（表2），以缩小感兴趣的光照状态，例如，基因表达与单调剂量反应的光值增加呈正相关。
- 为了确定感兴趣的光范围，根据是否校准多个LPA以提供等效光量，并对单个LPA进行编程，该LPA具有多达24个不同强度/脉冲持续时间/占空比/等的孔或更多孔（例如，48，72，96等），并继续进行下面概述的细胞培养工作或测定。因此，开始表征具有宽剂量范围光刺激的光遗传学系统，以确定提供所需基因表达的范围间隔，然后在此精制剂量范围内进行实验。
- 例如，在这项工作中，一旦确定了3000 g.s.单位作为有毒光强度的阈值;该阈值用作下面概述的测定（例如，免疫荧光）的光的上限。
注：上述步骤与LPA的光学校准无关，并参考每个光遗传学系统的分子水平校准。
- 在IRIS中编程适当的光强度值后，将带有USB 3.0插座的存储卡插入LPA以下载和传输文件。
- 如果LPA的校准完成31，请继续进行细胞培养工作以启动光诱导测定。如果尚未完成校准，则在使用微控制器编程器对LPA进行编程后，使用图像分析方法（步骤3.7.1-3.7.3）校准LPA。
- 简要地将LPA编程为具有与Gerhardt等人（2016）描述的相同的IRIS水平31。
注：对于校准，LPA被编程为具有2000 g.s的值。 - 一旦使用存储卡对器件进行编程并按下复位按钮（LPA上的物理按钮），即可获取整个器件（例如，凝胶站成像仪、扫描仪设备等）的图像。对于校准，请在设备旋转180°的情况下采集两张图像。
- 然后，使用Gerhardt等人（2016）31 设计的开源软件来显示LPA板上LED强度的变化，并计算LED补偿值以使孔之间的强度相等。下面表示的结果（图 3）中描述了一个示例。校准完成后，继续进行细胞培养工作以启动光诱导测定。
- 简要地将LPA编程为具有与Gerhardt等人（2016）描述的相同的IRIS水平31。
- 从上一节中获取工程化单克隆细胞的烧瓶，以研究光诱导对基因表达的影响。
- 从烧瓶中取出旧介质。
- 向细胞中加入1mL胰蛋白酶并孵育5分钟。
- 5分钟后，通过加入4mLDulbecco改性Eagle培养基（DMEM或其他所需培养基）补充必要的化学物质（这项工作使用50μg/ mL潮霉素，1%青霉素/链霉素溶液，10%胎牛血清，FBS）来中和胰蛋白酶。
- 在24孔黑板中每孔加入约75，000个细胞，总体积为500μL。接种的细胞数量可以根据所需实验的持续时间和使用的细胞类型而变化。
注意：此外，请注意，细胞接种密度会影响培养物的维持以及潜在的实验持续时间。从每孔的细胞数较少开始，可确保在培养物达到汇合之前具有更长的持续时间。此外，集成到目标基因回路中的光遗传学成分的类型将影响基因表达何时达到稳定状态，从而影响实验的持续时间。可以考虑的其他因素包括细胞系特异性生长速率、培养基组成和条件性生长效应（即光照）。 - 接种后，将细胞置于具有5%CO 2 的加湿培养箱中，以使其沉降2-6小时。
- 孵育后，将细胞转移到组织培养罩中，取下塑料盖，并在板的顶部添加粘合箔条（图2D）。这一步骤允许孔之间的最小光传递，因为孔的顶部和侧面被涂覆，并且光现在只能从放置LED的井的底部进入。
- 将板放置在LPA的安装3D部件中。然后，用3D打印的LPA盖子盖住板，该盖子适合每个角落的设备螺钉。
- 将设备插入电源，然后按下 LPA 设备上的重置按钮，以确保应用更新的 LPA 实验设置。
- 根据原始接种密度，细胞系特异性生长速度和生长条件，在实验系统中孵育细胞适当的时间。在本例中，连续诱导细胞系3天，使基因表达达到稳定状态。然而，应该注意的是，许多光遗传学系统（例如VVD）可以更快地达到稳态基因表达（例如，24小时），因此实验诱导时间可以根据需要减少或延长。
- 在光诱导实验结束时，利用样品进行以下四种测定中的任何一种，以表征工程细胞系（第4-7节）。
4. 光诱导工程细胞的荧光显微镜
- 诱导后24-72小时，从培养箱中取出LPA中的细胞并将其置于组织培养罩中。
- 取出铝箔条，让板静置1-2分钟。这可以防止塑料盖上形成冷凝，如果立即放在板上。
- 坐下1-2分钟后，将原来的塑料盖放回盘子上。
- 用适当的相差或荧光显微镜对细胞进行成像。
- 根据仪器的不同，调整曝光时间、光源强度和增益，以显示工程电池。在该实验中，应用了以下参数：FITC / GFP（绿色荧光蛋白）光源曝光时间为50 ms，相差曝光时间为1-5 ms，强度为100%。
注意：应该注意的是，最佳曝光时间，增益水平和光源强度通常从这项工作的经验中得出，以最大限度地减少荧光报告器中的过饱和度，最大限度地减少细胞损伤，并捕获足够的图像进行定性和定量分析。在确定每个参数的水平时，要记住的方面包括最大化信噪比，最小化光毒性，最小化荧光信号的过饱和度，以及提高放大弱荧光信号的能力。- 非常临时地优化这些参数;然而，先前的实验值（例如，导致荧光报告器过饱和的光源强度）可以在适用时指导未来的实验设置。例如，当移动到相似但不同的基因电路（LITer2.0） 11或不同的光模式（例如，光占空比）时，可以将来自一个电路（LITer1.0）或实验设置（例如，光强度）的增益设置、曝光时间和光强度初始值用作起点。
- 通过编程到显微镜软件中的坐标模板简化板成像，允许整个板尺寸（例如，24孔）从每个孔的多个图像位置自动获取图像。
5. 光诱导工程细胞的流式细胞术
- 诱导后24-72小时，在成像后从培养箱中的LPA或显微镜中取出细胞，并将其置于组织培养罩中。
- 如果直接从LPA中取出，请取出铝箔条，并让板静置一两分钟。
- 从每个孔中吸出培养基（如果使用了所有孔，则从整个24孔板中吸出）。
- 向每个孔中加入100μL0.25%胰蛋白酶，用塑料盖盖住板，然后将其放回培养箱中。
- 将细胞在培养箱中不受干扰地放置5分钟。
- 5分钟后，取出板并将其返回组织培养罩。
- 用400μLDMEM中和每个胰蛋白酶消化孔。
- 用细胞过滤器（或适当的流式细胞术管，可过滤以去除未完全胰蛋白酶消化的大团块细胞）标记5 mL聚苯乙烯圆底管，并带有与每个孔相对应的名称。
- 使用P1000移液器上下移液每个孔的内容物6-8次，以打破细胞团块并创建用于流式细胞术的单细胞样品49。
- 用过滤器将每个孔的全部内容物（约500μL）转移到标记的管中。
- 使用正确波长的激光将细胞带到适当的流式细胞术仪器（可以将带有细胞的试管放在冰上或冰下）。
注：本工作中使用的流式细胞仪是位于大学医院的核心设施的一部分。 - 创建一个正向和侧向散射门（分别为FSC和SSC）以捕获适当大小和粒度的单个细胞，以排除流式细胞术软件上的碎片和细胞团块。
- 设置门后，使用适当的门捕获大约10，000个细胞。根据用户所需的蜂窝移动数据量调整此数字。对含有实验中细胞的每个试管重复上述步骤。
- 实验完成后，将数据导入到可用的流式细胞术数据软件中进行分析。
- 创建一个FSC-SSC门（就像在采集过程中一样）并将其应用于每批实验数据。在本手稿中，未诱导细胞群的参考孔用于创建该门，但存在用于创建门的其他指标，例如基于密度的门。
- 使用FSC-SSC门控门控实验条件，将流式细胞术数据绘制为直方图或以其他方式表示以说明获得的表达模式。在该实验中，荧光被GFP / FITC或PE / TexasRed通道捕获。
6. 基因电路组分的RNA提取和定量PCR
- 诱导后24-72小时，在成像后从培养箱中的LPA或显微镜中取出细胞，并将其置于组织培养罩中。
- 如果直接从LPA中取出，请取出铝箔条，并让板静置一两分钟。
- 从每个孔中吸出培养基（如果使用了所有孔，则从整个24孔板中吸出）。
- 使用适当的RNA提取试剂盒从细胞中提取RNA。
- RNA提取完成后，对每个样品进行逆转录反应（表3）。
- 此外，对每个样品进行定量PCR（表4）。利用DNA聚合酶和相关方案建立PCR反应。对于此步骤，使用管家基因和目的基因建立多重反应，或创建单独的反应。在本例中，探测了GFP，KRAS和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）水平。完成qRT-PCR实验后，通过可用软件进行分析，以说明RNA水平的基因电路折叠变化。
7. 基因回路组件的免疫荧光
- 使用冰浴或冰柜冷却甲醇。
- 诱导后24-72小时，在成像后从培养箱中的LPA或显微镜中取出细胞，并将其置于组织培养罩中。
- 如果直接从LPA中取出，请取出铝箔条，让板静置1-2分钟。
- 从每个孔中吸出培养基（如果使用了所有孔，则从整个24孔板中吸出）。
- 向每个孔中加入100μL0.25%胰蛋白酶，用塑料盖盖住板，然后将其放回培养箱中。
- 将细胞在培养箱中不受干扰地放置5分钟。
- 5分钟后，取出板并将其返回组织培养罩。
- 用400μLDMEM中和每个胰蛋白酶消化孔。
- 用与每个孔对应的名称标记微型离心管。
- 使用P1000移液器，将每个孔的内容物上下移液6-8次，以打破细胞团块。
- 将每个孔的全部内容物（约500μL）转移到标记的管中。
- 将细胞在400× g下离心5分钟。
- 完成后，丢弃上清液并将样品移至化学通风橱。
- 将细胞重悬于750-1000μL4%多聚甲醛（在磷酸盐缓冲盐水中稀释，PBS）中（使用P1000移液管并在每个管中上下移液6-8次以打破细胞团块）。
- 让细胞在室温下静置15分钟。
- 孵育后，加入750-1000μLPBS。上下移液几次。
- 将细胞在400× g下离心5分钟。
- 完成后，丢弃上清液并将样品移至化学通风橱。
- 将细胞重悬于750-1000μL冰冷甲醇中（使用P1000移液器并在每个管中上下移液6-8次以打破细胞团块）。
- 让细胞在冰上或-20°C冰箱中静置30分钟。
- 孵育后，加入750-1000μLPBS。上下移液几次。
- 将细胞在400× g下离心5分钟。
- 完成后，丢弃上清液并将样品移至化学通风橱。
- 根据所使用的抗体类型，从现在开始修改方案。执行步骤 7.24.1-7.24.14 或 7.24.15-7.24.22。
- 如果使用一抗和二抗，请使用P1000 /P200移液器重悬细胞，并在每个试管中上下移液6-8次，以在100μL一抗中破坏细胞团块。在这种情况下，对储备抗体（包括KRAS抗体或ERK抗体）进行1：800的稀释，并在室温下静置1小时。将抗体稀释在由1x PBS和0.5gBSA制成的孵育缓冲液中。
注意：通过创建抗体稀释度与目标抗原的标准曲线，根据经验确定抗体的确切稀释度。 - 添加抗体后，用箔片覆盖试管，以防止光对标记的抗体产生影响。
- 孵育后，加入750-1000μL孵育缓冲液。上下移液几次。
- 将细胞在400× g下离心5分钟。
- 完成后，丢弃上清液并将样品移至化学通风橱。
- 使用P1000 / P200移液器重悬细胞，并在每个试管中上下移液6-8次，以在100μL二抗中破碎细胞团块。在这种情况下，将细胞重悬于100μL二抗中，稀释1：800（对于KRAS抗体）或1：2000（对于ERK抗体），并在室温下静置30分钟。与一抗类似，如上所述在孵育缓冲液中稀释二抗。根据标准曲线的经验发现确定二抗的稀释度。
- 添加抗体后，用箔片覆盖试管，以防止光对标记的抗体产生影响。
- 孵育后，加入750-1000μL孵育缓冲液。上下移液几次。
- 将细胞在400× g下离心5分钟。
- 完成后，丢弃上清液并将样品移至化学通风橱。
- 使用P1000移液器重悬细胞，并在每个管中上下移液6-8次，以在500μLPBS中破碎细胞团块。
- 将每个管的全部内容物（约500μL）转移到带有过滤器的标记管中。
- 将细胞带到适当的流式细胞术仪器上，使用正确波长的激光（可以将带有细胞的试管放在冰上或冰下）。
注意：应该注意的是，拥有多个对照对于工程细胞基因表达的流式细胞术测量和分析的进展非常重要。例如，具有完全未染色的细胞，仅用一抗染色的细胞以及仅用二抗染色的细胞可用于将结果与抗体的背景信号进行比较。 - 接下来，按照第 5 节中所述继续进行分析。
- 如果仅使用一抗，则使用P1000 / P200移液器重悬细胞，并在每个管中上下移液6-8次，以在100μL标记的一抗中破坏细胞团块。确定适当的抗体稀释并在室温下孵育1小时。根据经验从标准曲线确定抗体稀释度。
- 添加抗体后，用箔片覆盖试管，以防止光对标记的抗体产生影响。
- 孵育后，加入750-1000μL孵育缓冲液。上下移液几次。
- 将细胞在400× g下离心5分钟。
- 使用P1000移液器重悬细胞，并在每个管中上下移液6-8次，以在500μLPBS中破碎细胞团块。
- 将每个管的全部内容物（约500μL）转移到带有过滤器的标记管中。
- 将细胞带到适当的流式细胞术仪器上，使用正确波长的激光（可以将带有细胞的试管放在冰上或冰下）。
注意：应该注意的是，拥有多个对照对于工程细胞基因表达的流式细胞术测量和分析的进展非常重要。完全未染色的细胞和仅用一抗染色的细胞可用于将结果与抗体的背景信号进行比较。 - 从这一点开始，继续按照第 5 节中所述进行分析。
- 如果使用一抗和二抗，请使用P1000 /P200移液器重悬细胞，并在每个试管中上下移液6-8次，以在100μL一抗中破坏细胞团块。在这种情况下，对储备抗体（包括KRAS抗体或ERK抗体）进行1：800的稀释，并在室温下静置1小时。将抗体稀释在由1x PBS和0.5gBSA制成的孵育缓冲液中。
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Representative Results
本文中的基因电路组装和稳定细胞系生成基于含有转录活性，单个稳定FRT位点的商业改良HEK-293细胞（图1）。基因回路被构建到质粒内具有FRT位点的载体中，允许Flp-FRT整合到HEK-293细胞基因组中。这种方法不仅限于Flp-In细胞，因为FRT位点可以使用DNA编辑技术（如CRISPR / Cas950）添加到基因组中任何感兴趣的细胞系中。
一旦构建并验证了正确的插入，LPA和IRIS软件就被选为基因表达光诱导的标准化方案31，51。LPA系统允许对24个孔进行编程，以便在多种实验条件下诱导哺乳动物细胞，具体取决于光强度，脉冲持续时间和占空比（图2）。在本文中，对空间上均匀的光强度、脉冲持续时间和占空比进行了优先排序。然而，研究人员可以使用IRIS软件和LPA对时间光波模式进行更高级的编程。
在开始实验之前，要解决的LPA的一个关键方面是可以对单个或多个设备执行的光学校准。前面描述的用于校准的图像分析方法31 需要打开所有目标LED的整个LPA的图像，该图像可以从各种来源获取52，包括凝胶成像仪。这里，使用计算机扫描仪进行图像采集（图3A）。一旦获得图像，Gerhardt等人（2016）31 创建的开源软件就用于计算每个LED的补偿值，以确保每个LPA在给定的灰度值下发出相同的强度。软件减去背景信号，将图像阈值转换为二进制类别，并计算像素强度（图3B）。从校准中，发现LED之间的差异最小，96孔之间的CV为0.04（或校准了4个板， 图3C）。最后，使用校准软件演示了LED随位置的变化（图3D），并创建了灰度调整（图3E），以便每个LED归一化为相同的强度。
除校准外，使用LPA的其他重要方面包括在实验管道中集成多个对照，这些对照可以通过限制混杂变量（例如光毒性效应和基于实验材料的设计限制）来最大限度地减少系统误差。例如， 图4 说明了两种不同的配置，用于在LPA孔中编程不同的光强度。 图4A 的第一个子面板显示了光强度的上升组织。这可以简化编程和数据分析，但可能会在LPA的底排具有最高光强度的情况下产生边缘效应，并且可能导致附近井的不需要的热量和光感应。同样，在 图4A的第二个子面板中，随机化矩阵已应用于IRIS软件，在随机位置创建各种光强度。这可以最大限度地减少边缘效应的系统性影响。使用IRIS软件创建一个解压缩矩阵（图4B），然后可用于在实验完成后和分析期间确定实验条件。与井的随机化类似，用户还应注意可能发生的光毒性效应（本工作中的蓝光）。在 图4C中，基于未诱导的工程细胞群，使用相同的FSC-SSC门显示了用于基因电路诱导的两种不同的光强度。因此，用户应对感兴趣的光模式（例如，脉冲、占空比等）执行剂量反应，以确定在暴露的高端可能发生的光毒性效应（图4D）。在这里，与未受刺激的细胞相比，增加蓝光水平导致剂量依赖性细胞碎片，死细胞和团块。因此，连续光强度被限制在最大LPA强度的3/4左右（~3000 g.s.单位）。
一旦建立了适当的设备，然后通过荧光显微镜在工程化的LITer基因电路中诱导基因表达（图5）。在LPA上以不同的光脉冲持续时间诱导细胞，这在群体水平上给出了基因表达的轻度剂量反应。对这项工作中的细胞进行GFP表达成像，使用50 ms的FITC / GFP光源曝光时间，并使用1-5 ms的相差曝光时间进行明场成像。鉴于这种细胞系工程方案的稳健性，可以使用任何荧光标记物代替GFP。细胞可以通过多种光照方式诱导，并产生大范围的反应（图5）。后者有利于进一步控制功能基因（例如，原始工作中的KRAS（G12V）癌基因53）的表达。
荧光显微镜检查后，可以立即在各种实验方案中分析细胞，包括流式细胞术，qRT-PCR和免疫荧光。在这项工作中，流式细胞术作为第一个验证程序进行，并按照上述方法进行（图6）。与显微镜类似，细胞在不同的脉冲长度值下被诱导，并且显示出基因表达的剂量反应在群体水平上与未诱导状态相比变化超过四倍（图6A-B）。同样，通过比较LITer系统与VVD/LightOn54等正调节（无反馈）系统的不同光强度值（图6C-D），可以显示基因表达降噪。当将LITer与VVD系统进行比较时，负反馈实现了超过五倍的基因表达降噪。在显微镜下成像的相同预诱导细胞也可以通过qRT-PCR进行分析（图7）。与流式细胞术类似，工程化的LITer细胞可以以剂量响应方式表达RNA水平（从未诱导状态诱导超过10倍），与流式细胞术上GFP表达量化的蛋白质水平的剂量反应相匹配。所提到的荧光显微镜和流式细胞术数据可以使用非荧光细胞、本构表达的荧光细胞和荧光6-8峰验证微珠（例如，FL1通道绿色、荧光珠）进行校准。这些成分中的每一个都可以在单个实验中实现基因表达的归一化。然而，这些因素也可以允许不同实验板，实验条件和天数的电路和工程细胞归一化，以便对基因表达数据进行比较和标准化。
最后，LITer基因回路可以被设计成表达功能基因，例如KRAS（G12V， 图8）。该管道的多功能性允许用户将LITer架构与细胞工程用于任何感兴趣的功能基因，可能包含其他架构，如正反馈。LITer显示出越来越多的蓝光，导致基因回路输出水平（KRAS（G12V）蛋白水平）增加，因此磷酸化ERK水平，这两者都可以通过免疫荧光测定来量化。
| 片段 | 率 | 尺寸（英制） | DNA片段重量浓度（纳克/μL） | DNA片段摩尔浓度（fmol/μL） | 体积（μL） | 得到的DNA摩尔质量（fmol） |
| 母载体片段 1 | 1 | 3414.00 | 18.20 | 8.63 | 4.09 | 35.29 |
| 母载体片段 2 | 1 | 4642.00 | 18.10 | 6.31 | 5.59 | 35.29 |
| 感兴趣的基因 | 1 | 549.00 | 37.90 | 111.70 | 0.32 | 35.29 |
| 总 | 10.00 | 105.87 |
表1：DNA组装反应预混液计算（步骤1.13）。 第2和第3色谱柱基于组装的DNA片段的大小以及PCR扩增和琼脂糖凝胶提取后这些片段的浓度（步骤1.11）。第4塔 的底部泡池（总反应体积）可以修饰;但是，建议使用所述音量。将自动生成无阴影单元格。
| 0 | 100 | 200 | 400 | 500 | 750 |
| 1500 | 3000 | 0 | 100 | 200 | 400 |
| 500 | 750 | 1500 | 3000 | 0 | 100 |
| 200 | 400 | 500 | 750 | 1500 | 3000 |
表2：在具有三个重复的24孔板中用于光感应实验的光强度（g.s.）的IRIS编程（步骤3.4）。 光强度分布范围从 0 到 3000 g.s. G.s.灰度单位。这可以根据需要由IRIS软件随机化。
| 示例 1 | 示例 2 | 示例 3 | |
| 逆转录酶预混液体积（μL） | 4.00 | 4.00 | 4.00 |
| 核糖核酸模板 （1000 ng） 体积 （μL） | 2.00 | 3.00 | 4.00 |
| NF-H20 体积（μL） | 14.00 | 13.00 | 12.00 |
| 总体积（μL） | 20.00 | 20.00 | 20.00 |
表3：逆转录预混液计算（步骤6.5）。 反应推荐的总体积为20μL，其组分是逆转录酶预混液（此处：5x），RNA模板和无核酸酶水。在本例中，样品1、2和3的RNA浓度分别为500、333和250 ng/μL。
| 示例 1 | 示例 2 | 样本 1 和 2 多路复用 | |
| GFP 探头体积（μL） | 1 | ----- | 1 |
| GAPDH探针体积（μL） | ------ | 1 | 1 |
| DNA聚合酶预混液体积（μL） | 10 | 10 | 10 |
| cDNA （100 ng） 体积 （μL） | 2 | 2 | 2 |
| NF-H20 体积（μL） | 7 | 7 | 7 |
| 总体积（μL） | 20 | 20 | 20 |
表4：荧光定量PCR预混液计算（步骤6.6）。 推荐的反应总体积为20μL，其组分是DNA聚合酶预混液（此处：2x），GFP和/或GAPDH探针，cDNA（总100ng）和无核酸酶水（NF-H20）。
图 1：电路设计和单元工程。 （A）细胞工程工具，包括具有FRT整合位点的LITer合成基因电路，用于电路整合的重组酶（Flp重组酶），用于选择适当遗传克隆的药物，以及用于创建所需光遗传学哺乳动物细胞系的感兴趣的细胞系。（B）工程遗传系统可以整合到人类基因组中含有位点的特定FRT位点。然后，这些基因组位点可以表达特定的抗生素耐药性或荧光报告基因，以选择适当整合的遗传盒。基因回路整合可以通过使用重组酶来启动，这些重组酶识别原始遗传盒内的特定位点。这引入了一种新的耐药性选择基因，可以确保产生具有所需基因回路的正确工程细胞。图B的底部是光遗传学负反馈系统LITer2.0的基因电路架构。该电路由自抑制TetR蛋白与光氧电压检测域（LOV2），连接子序列P2A融合而成，可实现多顺电子转录本和GFP。当施加蓝光时，TIP序列从LOV2结构域打开，抑制TetR蛋白，并允许TetR和GFP报告基因的剂量反应性转录增加。被抑制的TetR蛋白无法在DNA操作者位点结合和抑制，从而增加转录。这种负反馈使基因表达噪声保持在较低水平，并允许基因表达的高倍变化。FRT - 翻转识别靶标，HygR - 潮霉素耐药性，LacZ - β-半乳糖苷酶，ZeoR - Zeocin抗性，T - TetR，四环素抑制蛋白，D2ir是具有TwTO位点的基于CMV的启动子，LOV2是光氧电压传感域，TIP是抑制TetR蛋白的tet抑制肽。此数字已从Guinn和Balázsi（2020）55修改而来。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：LPA 实验编程。 （A） 可以使用 Tabor 实验室网站47 上列出的工具对实验进行编程，并具有稳态、动态或高级 LPA 编程的灵活性31。此外，可以保存电子文件，以备将来用于替代细胞系的技术复制或实验诱导。（B）LPA装置，其主要部件从顶部和侧面（C）查看。（D）驻留在LPA上的铝箔密封板的图像。LPA - 光板装置，LED - 发光二极管。此图的元素已从 Guinn （2019）11 修改而来。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：灯板设备的校准。 （A） 基于 IRIS 软件设置为 2000 g.s. 的 LED 的 LPA 的代表性图像。（B） 面板 （A） 中的图像减去背景，阈值用于将图像二值化，以计算每个 LED 的像素强度。（C） 设置为相同 IRIS 软件值（例如，2000 g.s.）的 96 个 LED（4 个 LPA 板）的像素强度直方图（由 MATLAB 图像分析确定）。红线表示平均 LED 像素强度，面板中的 CV 表示 96 孔的变化系数。（D） 显示面板 （A） 中 LPA 图像的 LED 强度的热图，该热图已归一化为最大强度 LED。（E） 为面板（A）中的LPA图像确定校准值热图，以便在为LPA编程时为每个LED创建相同强度的产生。LPA - 灯板装置，LED - 发光二极管，CV - 变化系数。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：LPA 和光毒性效应的随机化。 （A） 基于 IRIS 软件的两个可编程 LPA LED 配置的代表性图像，设置为 25 至 4000 g.s。第一种配置更有可能允许系统误差（例如，热和光的边缘效应）交叉（例如，LPA的下行影响第二 行）。第二幅图像随机化强度的位置，从而最大限度地减少由边缘效应引起的系统误差（偏差）。（B）在面板（A）所示的LPA中显示光强度随机化位置的矩阵，可用于确定给定实验的强度相关结果。（C）连续照明下诱导3天两种不同光强度（1250和4000 g.s.）的流式细胞术数据。黑门基于未诱导的细胞。（D）条形图显示流式细胞术数据，如面板（C），但光强度范围很广。LPA - 光板装置，FSC - 正向散射，SSC - 侧散射，g.s. - 以灰度测量的光强度值。LITer cells11 的细胞存活率有剂量反应性降低，使用P值为0.0022的方差分析1尾试验具有统计学意义。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：工程光遗传学细胞系的代表性显微镜图像。 用相机（14位）在倒置显微镜上对细胞进行成像，以获得相差和荧光成像。在100%光源强度下，将细胞暴露5ms进行相衬（图A，代表性明场图像），将细胞暴露于GFP / FITC采集（图B）50 ms。细胞可以在不同的时间点成像，这取决于所需的稳态采集或动态响应，从而产生稳态。这里的细胞代表固定强度（1000 g.s.）的脉冲持续时间滴定，范围从无光照射到3天的光照。单位 g.s 表示以灰度为单位测量的光强度值。此数字已从 Guinn （2019）11 修改而来。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：工程光遗传学细胞系的流式细胞术。 在BD LSRFortessa流式细胞仪上分析细胞，在SSC-FSC（侧散射 - 前向散射）门内收集约10，000个细胞。然后使用FCS Express软件分析细胞。可以生成直方图或散点图来量化目的基因（例如GFP）的表达。（A）在SSC-FSC轴上绘制的工程单元，用于在黑线内进行门控。（B）在1000 g.s下诱导具有不同持续时间的光脉冲诱导的代表性LITer细胞，直到诱导72小时，说明基因表达的剂量反应。（C）光强度滴定的代表性剂量反应数据，比较LITer基因回路（基于TIP的系统）与VVD或LightOn system40，后者是一种没有反馈的正调节系统。（D）与VVD系统相对应的直方图，表明与LITer系统相比，分布更广（因此基因表达噪声更高）。CV是变异系数，是基因表达噪声的指标。FSC - 正向散射，SSC - 侧散射，FITC - 荧光素异硫氰酸酯，g.s. - 以灰度测量的光强度值。此数字已从 Guinn （2019）11 修改而来。 请点击此处查看此图的放大版本。
图7：工程光遗传学细胞系的定量实时荧光定量PCR。 代表性数据表明，使用光作为刺激物可以诱导和量化多个基因表达水平。单位Rq表示与对照相比表达折叠变化的相对定量。LITer cells11 的RNA表达剂量响应性增加，使用方差分析1尾试验具有统计学意义，GFP和KRAS水平的p值分别为0.0352和0.0477。此数字已从 Guinn （2019）11 修改而来。 请点击此处查看此图的放大版本。
图8：工程光遗传学细胞系的免疫荧光。 具有代表性的数据，显示基于免疫荧光的蛋白质水平估计值。（A）磷酸化ERK的KRAS（G12V）和（B）蛋白质水平的蛋白质水平，LITer基因电路分别根据直接和间接增加的光量诱导。柱中显示的数据是平均值，误差线是标准差 （n = 3）。A.u. - 任意单位，g.s. - 以灰度测量的光强度值。LITer cells11 的蛋白质水平具有剂量响应性增加，使用方差分析1尾试验具有统计学意义，KRAS和磷酸化ERK水平的p值分别为2.79E-04和0.016。此数字已从 Guinn （2019）11 修改而来。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
本文的读者可以深入了解表征光遗传学基因回路（以及其他基因表达系统）至关重要的步骤，包括1）基因回路的设计，构建和验证;2）用于将基因电路引入稳定细胞系的细胞工程（例如，Flp-FRT重组）;3）使用基于光的平台（如LPA）诱导工程电池;4）通过荧光显微镜对光诱导测定进行初始表征;5）通过各种测定进行最终的基因表达表征，包括流式细胞术，定量实时荧光定量PCR（qRT-PCR）或免疫荧光测定。
此外，上述方法对于表达目的基因的任何基因电路架构都是高度模块化的，在电路构建步骤和进行测定时进行了主要的潜在方案修改。在基因电路构建的情况下，分子克隆的灵活性允许任何目的基因与荧光标记物交换或共表达，并对引物设计或组装方案进行微小的修改。此外，虽然这里概述的程序主要集中在NF基因电路设计上，以实现精确（低噪声）基因表达控制，但可以实施其他架构，如正调控或正反馈（PF），以实现不同的特征，如高倍变化或高基因表达噪声，分别56，57.使用各种基因电路架构（例如PF，NF等）可以使研究人员探索各种生物学问题，例如蛋白质水平大小和噪声在耐药性或转移中的作用58。这里列出的方案也侧重于基因表达定量的各种方法，但是在显微镜获取后可以添加任意数量的功能测定（例如，细胞运动性，伤口愈合，增殖等），对上述方法几乎没有影响。这与单细胞研究特别相关，其中光遗传学可以使用时空诱导来研究脉动表达动力学等行为59。
作为方法模块化的补充，故障排除是每个主要协议的另一个重要特征。对于电路构建，主要区别在于适当的电路专用引物设计，而后来的方法（例如组装和通过细菌生长进行质粒扩增）更加标准化，并且通常包括其自己的广泛故障排除程序。细胞工程可以用药物滴定曲线进行修改，具体取决于所使用的细胞系。此外，如果使用商业细胞系，可以直接从细胞系制造商处获得故障排除指南。此外，意外的光效应对于量化工程细胞系也很重要。例如，由于470nm光的光毒性作用，应创建光强度曲线以研究人群中死亡或损伤的诱导。一旦测试了各种光值，用户就可以创建FSC-SSC门或利用碘化丙啶染色等方法来量化死亡/受损细胞，因此，作为确定实验中使用的适当光范围的工具。
对于LPA故障排除，LED可以产生与相邻孔的光和热串扰的边缘效应。例如，如果密封不当或油井之间的热/光梯度较大，高强度油井可能会导致相邻油井出现一些感应。如果 LPA 按光参数的特定顺序（例如，升序/降序）进行编程，则这些影响可能最大。为了解决这个问题，IRIS软件允许用户使用随机化矩阵来随机化井强度，从而减少系统误差。对于荧光显微镜的故障排除，曝光时间，增益设置（控制相机灵敏度）和光源强度是可以调整的主要参数。调整这些参数可以实现最佳图像生成和理想的信噪比，并避免过饱和和光毒性。
对于流式细胞术故障排除，光电倍增管电压和细胞门控是可以调整的主要方面。调整这些参数可以实现实验条件和对照样品之间的理想比较，对弱或强荧光信号进行适当的信号采集，并排除细胞碎片或不需要的细胞群。应该注意的是，流式细胞术电压在实验中理想地保持恒定，以便进行适当的比较。此外，对于需要多个荧光输出的光遗传学系统（例如，FITC和PE），用户需要知道荧光补偿给定荧光团之间的串扰。在这种情况下，对照对于确定正确的荧光信号至关重要。用户必须执行的对照包括荧光珠，具有目标标记物的染色细胞，或构成性表达荧光蛋白的细胞，可用于在感兴趣的流式细胞术软件中创建补偿基质。此外，无论是使用一种还是多种荧光标记物，所有用户都应常规测量非荧光细胞的每个标记物的荧光信号，从而产生自发荧光/背景信号。qRT-PCR故障排除包括不同的cDNA量和探针设计，这通常是特定于项目的。最后，对于免疫荧光故障排除，抗体浓度是测定定量的最大变量，需要最佳的浓度测定。
与上述大多数方法相关的一个故障排除方面是使用密封板的隔离效果，其中电池被箔覆盖。这种方法可能会阻碍各种细胞系正常生长所需的二氧化碳气体交换。根据以前的实验经验，对于使用本手稿中的工程细胞系进行3-5天的实验，这并不是细胞生长的重大障碍，但对于其他细胞系或实验持续时间可能变得很重要。为了解决这个问题，使用密封板实施的一种适应性包括使用二氧化碳独立培养基，这不会影响本研究中使用的细胞的生长。对于代谢、pH 值和细胞密度很重要的其他检测或细胞系，应注意这一点，可能需要其他干预措施，例如更频繁地更换培养基或营养素。
这里概述的方法的局限性在于所使用的基因电路，光遗传学技术精度以及LPA与其他设备（如荧光显微镜）的接口。这里描述的技术价格合理，构建快速，并且易于验证46 用于光遗传学工程细胞群。然而，存在某些空间限制，例如无法在不对光感应设置进行修改的情况下控制单个细胞，例如利用数字镜像设备（DMD），最近在活细胞中显示出益处60，61。此外，这里概述的方法在光遗传学刺激期间的活细胞跟踪中受到限制，仅允许整个实验时间过程的终点数据采集。
尽管有这些限制，这里概述的光遗传学方法是对现有技术的补充，例如DMD，后者具有实时控制单个细胞的灵活性，但受到可以刺激的样品数量的限制。此外，这里讨论的稳定细胞系工程方法与现有的合成生物学方法不同，这些方法通常通过瞬时转染来表征工程遗传系统。瞬时转染方法本质上更嘈杂，因为细胞之间的基因回路拷贝数变异更大。相比之下，这里介绍的方法涉及单克隆细胞变异，每个变异包含一个基因回路拷贝。稳定的细胞系允许以更高的精度探索细胞方面，例如基因表达变异，蛋白质水平对表型景观的影响以及单细胞方法，因为每个细胞与其邻居相同具有更高的置信度。
这里的工作展示了一个平台，用于设计任何基因组集成的光遗传学基因电路，使用可靠的实验工具诱导这样的系统，并以标准化的方式用各种基因表达和功能/表型测定来表征它们。这些方案的未来改进可能包括将这些方法与使用其他光遗传学技术（如DMDs）的活细胞跟踪相结合，这将允许在单细胞水平上对基因表达和功能应用进行时空控制。这些进展将允许光利用来产生单细胞中感兴趣的基因表达模式，建立转录/翻译动力学，量化蛋白质水平，并研究它们在各种生物过程中的作用，包括细胞迁移，增殖，转移和分化。
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Disclosures
作者声明没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们要感谢Balázsi实验室的意见和建议，Karl P. Gerhardt博士和Jeffrey J. Tabor博士帮助我们构建了第一个LPA，以及Wilfried Weber博士分享了LOV2-degron质粒。这项工作得到了美国国立卫生研究院[R35 GM122561和T32 GM008444]的支持;劳弗物理与定量生物学中心;以及国防科学与工程研究生（NDSEG）奖学金。开放获取费用的资金：NIH [R35 GM122561]。
作者贡献：M.T.G.和G.B.构思了这个项目。M.T.G.，D.C.和L.G.进行了实验。M.T.G.、D.C.、L.G.和G.B分析了数据并准备了手稿。G.B.和M.T.G.监督了这个项目。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tubes | Eppendorf | 951010006 | reagent for carrying out PCR |
| 0.25% Trypsin EDTA 1X | Thermo Fisher Scientific | MT25053CI | reagent for splitting & harvesting mammalian cells |
| 0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000020 | tool used for pipetting reactions |
| 100-1000 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
| 20-200 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000055 | tool used for pipetting reactions |
| 2-20 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
| 5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | reagent for flow cytometry |
| 5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V | Eppendorf | 22628113 | equipment for mammalian culture work |
| Agarose | Denville Scientific | GR140-500 | reagent for gel electrophoresis |
| Aluminum Foils for 96-well Plates | VWR® | 60941-126 | tool used for covering plates in light-induction experiments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9518-5G | reagent for selecting bacteria with correct plasmid |
| Analog vortex mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365PR | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140010 | reagent for growing bacteria |
| BD LSRAria | BD | 656700 | tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations |
| BD LSRFortessa | BD | 649225 | tool for characterizing engineered cell lines |
| BSA, Bovine Serum Albumine | Government Scientific Source | SIGA4919-1G | reagent for IF incubation buffer |
| Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC | Corning | 353043 | plate used for growing monoclonal cells |
| Centrifuge | VWR | 22628113 | instrument for mammalian cell culture |
| Chemical fume hood | N/A | N/A | instrument for carrying out IF reactions |
| Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid | BD | 353047 | plate used for growing monoclonal cells |
| CytoOne T25 filter cap TC flask | USA Scientific | CC7682-4825 | container for growing mammalian cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fischer Scientific | BP231-100 | reagent used for freezing down engineered mammalian cells |
| Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15-585-011 | reagent for gel electrophoresis |
| Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid | Corning | 353072 | container for growing sorted monoclonal cells |
| FCS Express | De Novo Software: | N/A | software for characterizing flow cytometry data |
| Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL | Corning | 35-010-CV | reagent for growing mammalian cells |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | equipment for growing bacteria |
| Gibco DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11-965-092 | reagent for growing mammalian cells |
| Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
| Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL | Life Technologies | 10687-010 | reagent for selecting cells with proper gene circuit integration |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | reagent for converting RNA to cDNA |
| Laboratory Freezer -20 °C | VWR | 76210-392 | equipment for storing experimental reagents |
| Laboratory Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U74VC | equipment for storing experimental reagents |
| Laboratory Refrigerator +4 °C | VWR | 76359-220 | equipment for storing experimental reagents |
| LB Broth (Lennox) , 1 kg | Sigma-Aldrich | L3022-250G | reagent for growing bacteria |
| LIPOFECTAMINE 3000 | Life Technologies | L3000008 | reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells |
| MATLAB 2019 | MathWorks | N/A | software for analyzing experimental data |
| Methanol | Acros Organics | 413775000 | reagent for immunofluorescence reaction |
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL | VWR | 20170-333 | plasticware container |
| Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
| MultiTherm Shaker | Benchmark Scientific | H5000-HC | equipment for bacterial transformation |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-NDL-US-CAN | equipment for DNA/RNA concentration measurement |
| NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix | NEB | M0492S | reagent for PCR of gene circuit fragments |
| NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs (NEB) | C3019H | bacterial cells for amplifying gene circuit of interest |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs (NEB) | E2621L | reagent for combining gene circuit fragements |
| Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera | Nikon Instruments Inc. | N/A | instrument for quantifying gene expression |
| NIS-Elements | Nikon Instruments Inc. | N/A | software for characterizing fluorescence microscopy data |
| oligonucleotides | IDT | N/A | reagent used for PCR of gene circuit components |
| Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control | Panasonic | MCO-170AICUVHL-PA | instrument for growing mammalian cells |
| Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | reagent |
| PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) | Invitrogen | 14190144 | reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x | Fisher Scientific | 15140-122 | reagent for growing mammalian cells |
| primary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 4370S | primary ERK antibody for immunifluorescence |
| primary KRAS antibody | Sigma-Aldrich | WH0003845M1 | primary KRAS antibody for immunifluorescence |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | reagent kit for purifying gene circuit plasmids |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | reagent kit for purifying gene circuit fragments |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Eppendorf | A28137 | equipment for qRT-PCR |
| Relative Quantification App | Thermo Fisher Scientific | N/A | software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | kit for extracting RNA of engineered mammalian cells |
| Secondary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 8889S | secondary ERK antibody for immunifluorescence |
| secondary KRAS antibody | Invitrogen | A11005 | secondary KRAS antibody for immunifluorescence |
| Serological Pipets 5.0 mL | Olympus Plastics | 12-102 | reagents used for setting up a variety of chemical reactions |
| SmartView Pro Imager System | Major Science | UVCI-1200 | tool for imaging correct PCR bands |
| SnapGene Viewer (free) or SnapGene | SnapGene | N/A | software DNA sequence design and analysis |
| Stage top incubator | Tokai Hit | INU-TIZ | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | reagent for PCR of gene circuit fragments |
| TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn | Life Technologies | 4326317E | qPCR Probe |
| Thermocycler | Bio-Rad | 1851148 | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated | PerkinElmer | 1450-605 | plate used for light-induction experiments |
| VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm | VWR | 14673-010 | reagent for mammalian cell culture |
| VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System | VWR | 89032-290 | equipment for DNA gel electrophoresis |
| Flp-In 293 | Thermo Fisher Scientific | R75007 | Engineered cell line with FRT site |
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