Summary
光応答性哺乳動物細胞を確実に制御するには、光遺伝学的方法の標準化が必要です。この目標に向けて、本研究では、ネガティブフィードバック光遺伝学遺伝子回路を用いた光誘導遺伝子発現の研究を標準化するための遺伝子回路構築、細胞工学、光遺伝学的装置操作、検証アッセイのパイプラインをケーススタディとして概説する。
Abstract
哺乳動物細胞における信頼性の高い遺伝子発現制御には、使用される方法に関係なく、高いフォールド変化、低ノイズ、および決定された入力-出力伝達関数を備えたツールが必要です。この目標に向けて、哺乳類細胞におけるタンパク質レベルの時空間制御のために、光遺伝学的遺伝子発現系が過去10年間に多くの注目を集めてきた。しかし、光誘導遺伝子発現を制御する既存の回路のほとんどは、構造が異なり、プラスミドから発現され、可変光遺伝学的装置を利用するため、安定した細胞株における光遺伝学的構成要素の特性評価および標準化を検討する必要性が生じている。ここで、本研究は、事例例としてネガティブフィードバック光遺伝学回路を使用して、哺乳動物細胞における光誘導性遺伝子発現を制御するための信頼性の高い遺伝子回路構築、統合、および特性評価の実験パイプラインを提供する。また、これらのプロトコルは、光遺伝学的装置と光レジームを標準化することで、遺伝子発現ノイズやタンパク質発現の大きさなどの遺伝子回路の特徴を確実に明らかにする方法も示しています。最後に、この論文は、光遺伝学に不慣れな研究室で、そのような技術を採用したいと考えている人にとっては役に立つかもしれません。ここで説明するパイプラインは、哺乳動物細胞における他の光遺伝学的回路に適用され、哺乳動物細胞における転写、プロテオミクス、そして最終的には表現型レベルでの遺伝子発現のより信頼性が高く、詳細な特徴付けおよび制御を可能にするべきである。
Introduction
他の工学分野と同様に、合成生物学はプロトコルを標準化し、再現性の高い機能を持つツールを生物学的システムに関連する質問の探求に利用できるようにすることを目指しています1,2。多くの制御システムが構築されてきた合成生物学の1つの領域は、遺伝子発現調節の領域です3,4。遺伝子発現制御は、生理学的および病理学的細胞状態におけるそれらの役割のために重要な細胞特性であるタンパク質レベルおよび変動性(ノイズまたは変動係数、CV = σ/μ、平均に対する標準偏差として測定)の両方を標的とすることができる5,6,7,8。タンパク質レベルとノイズを制御できる多くの合成システム4,9,10,11,12が設計されており、ツール間でプロトコルを標準化する機会を生み出しています。
最近出現した遺伝子ネットワークを制御できる新しいツールセットの1つは光遺伝学であり、光を使用して遺伝子発現を制御することを可能にします13,14,15,16,17。それらの化学的前任者と同様に、光遺伝学的遺伝子回路は、細菌から哺乳動物に至るまで、あらゆる細胞型に導入することができ、目的の任意の下流遺伝子の発現を可能にする18,19。しかしながら、新規な光遺伝学的ツールの急速な生成により、遺伝子回路アーキテクチャ、発現機構(例えば、プラスミドベース対ウイルス統合)、および光供給制御装置において変化する多くのシステムが出現している11、16、20、21、22、23、24、25.そのため、遺伝子回路の構築や最適化、システム利用方法(統合と一過性発現など)、誘導に用いる実験ツール、結果解析など、光遺伝学的特徴の標準化の余地が残されています。
哺乳動物細胞における光遺伝学的プロトコルの標準化を進めるために、このプロトコルは、HEK293細胞(ヒト胚性腎臓細胞株)に組み込まれた負帰還(NF)遺伝子回路を用いて哺乳動物細胞における光遺伝学的システムを工学的にエンジニアリングする実験パイプラインを例に記述している。NFは、本質的に非常に豊富であるため、標準化を実証するのに理想的なシステムです26,27,28、タンパク質レベルを調整し、ノイズを最小限に抑えることができます。要するに、NFは、リプレッサーがそれ自身の発現を十分に速く減少させることによって正確な遺伝子発現制御を可能にし、それによって定常状態から離れるあらゆる変化を制限する。定常状態は、リプレッサーを不活性化または排除するインデューサーによって変更され、各インデューサー濃度に対して新しい定常状態に達するまで、より多くのタンパク質生産を可能にすることができる。最近、遺伝子発現の広い動的応答を生成し、低ノイズを維持し、空間的遺伝子発現制御の可能性を可能にする光刺激に応答することができる、操作されたNF光遺伝学的システムが作成された11。光誘導チューナー(LITers)として知られるこれらのツールは、生細胞における遺伝子発現制御を可能にする以前のシステムに触発され4、10、29、30、およびヒト細胞株に安定して統合され、長期的な遺伝子発現制御を確実にした。
ここでは、LITerを例にとり、光応答性遺伝子回路を作成し、ライトプレート装置(LPA、光遺伝学的誘導ハードウェア)31を用いて遺伝子発現を誘導し、操作された光遺伝学的に制御可能な細胞株のカスタム光刺激に対する応答を分析するためのプロトコルを概説する。このプロトコルにより、ユーザーはLITerツールを利用して、探索したい機能遺伝子を使用することができます。また、以下に概説する方法および光遺伝学的装置を統合することによって、多様な回路アーキテクチャ(例えば、正帰還、負調節など)を有する他の光遺伝学的システムに適合させることもできる。他の合成生物学プロトコルと同様に、ここで概説するビデオ録画および光遺伝学的プロトコルは、癌生物学、胚発生、および組織分化を含むがこれらに限定されない、多様な分野の単一細胞研究に適用することができる。
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Protocol
1. 遺伝子回路設計
- 単一の遺伝子回路/プラスミドに結合する遺伝的構成要素(例えば、哺乳動物DNA組み込み配列モチーフ32、光応答性エレメント33、または機能遺伝子34)を選択する。
- 遺伝子工学および/または分子クローニングソフトウェアを使用して、後で使用するためにDNA配列を保存し、参照し、各配列に注釈を付け、必要なすべての特徴(例えば、STARTコドン、調節、または翻訳配列)を調べる35。
- 全体的な遺伝子回路設計に従って部品を開発または採用する36。一例として、LITers11のような光遺伝学的リプレッサーの場合、リプレッサー遺伝子(例えばTetR)4に隣接し、かつフレーム内に、光誘導性分解37、38またはリプレッサーのDNA結合能39の不活性化が可能なドメインをコードする遺伝子配列を融合させる。
- 光遺伝学的アクチベーターの場合、光誘導DNA結合時に遺伝子発現を促進するアクチベータードメイン40 の存在を確認する41。陰性または陽性の自己調節のために、調節遺伝子のプロモーター内または上流に調節結合部位(例えば、TetR発現プロモーター内または上流のtetO部位)が存在することを確認する42。
- 各遺伝子回路の分子クローニングソフトウェアを使用して、プラスミドのDNA配列増幅または配列決定のためのプライマーを設計します。
- 分子クローニングソフトウェアの組み込みのごちそう(配列アライメントなど)を通じて、プラスミド構築のためのプライマーを計算的に検証します。
- オリゴヌクレオチドプライマーを製造業者に注文する。本作で構築・使用したプラスミドは、設計・使用したプライマーとともに、元の支持材11 に見出すことができます。
- プライマーを二重蒸留水(ddH2O)で100 mMストック濃度に希釈する。
- PCRのために100 mMストックプライマーのストックを10 mM濃度に希釈する。
- ゲノムの場合は 0.5 ~ 500 ng、プラスミドまたはウイルス DNA の場合は 0.5 pg-5 ng の総質量に対する 1 μL の鋳型 DNA、12.5 μL の DNA ポリメラーゼ 2x マスターミックス (またはメーカーの希釈倍率を満たす容量)、および 9.5 μL の ddH2O (総反応容量 25 μL) で PCR ミックスを調製します。
- PCRミックスをサーモサイクラーで、選択した酵素に応じて適切な設定でインキュベートします43。推奨される反応サイクルは次のとおりです。
工程1:95°Cで30s初期変性工程を1サイクル。
工程2:98°Cで5sの変性工程を40サイクル。
工程3:65°Cで30秒のアニーリング工程を1サイクル(先に設計したプライマーにより決定)。
ステップ4:72°Cで1分間の伸長の1サイクル(〜1キロベース(kb)テンプレート断片長)。
ステップ5:72°Cで2分間の延長を1サイクル行う。
ゲル電気泳動で試験できるようになるまで反応物を4°Cに保持する。このプロトコルは、使用される試薬(例えば、ポリメラーゼおよび緩衝液)に応じて変化する。 - ステップ 1.9 を繰り返して、リニア PCR 産物を単一の円形 DNA ベクターに連結するために必要な DNA アセンブリ反応に使用するすべてのフラグメントを増幅します。
- PCR産物を1%アガロースゲル上で実行し、続いて所望の長さのバンドを精製する。
- DNA集合反応用のマスターミックスを調製する(表1)。
注: この例では、マザーベクターは 2 つのフラグメントに分割され、組み立て結果全体に大きな変化を生じさせることなく、PCR ステップの効率が向上します。 - DNA集合反応マスターミックスを50°Cのサーモサイクラー中で1時間インキュベートし(DNA集合試薬プロトコルで特に指定がない限り)、反応物を4°Cで保存して反応生成物を細菌形質転換に使用する。
- 有能な大腸菌(大腸菌)細胞および対応する細菌形質転換プロトコルを使用して、細菌形質転換(化学的またはエレクトロポレーション)を設定します。形質転換後、選択した細菌選択マーカー(例えば、アンピシリン)を含む細菌ルリア・ベルタニ(LB)寒天プレートを使用して、形質転換ミックスをプレートします。プレートを37°Cで一晩インキュベートする44。
- 翌日プレートを確認してください。コロニーを接種するには、プレートから個々のコロニーをピックアップし、培養チューブ内の対応する細菌選択マーカーを含む液体LBブロスに再懸濁する。シェーカーインキュベーター中で37°C、300rpmで一晩インキュベートする。
- プラスミド調製プロトコールを行い、細菌培養物からプラスミドDNAを抽出する。
- 回路を 2 つのステップで検証します。まず、粗精製として制限酵素を用いた試験消化を行い、おおよそのプラスミド産物が得られたか否かを確認する。次に、テスト消化に合格/確認された場合は、プラスミドをサンガーシーケンシング施設(または利用可能な機器を使用したプロセス)に提出して正確なDNA配列を取得し、後で設計ソフトウェアで予想される配列と比較します。
- テスト消化を実行するには、使用する分子クローニングソフトウェアに基づいて、少なくとも2つのフラグメントを生成する少なくとも2つの制限酵素を選択します。酵素を選択したら、使用する酵素に応じて、各酵素1 μL、生成されたDNA5 μL、および水13 μLと適切な塩とバッファーを加えて、試験サンプルを調製します。反応物を37°Cで1時間、または酵素メーカーが示唆するようにインキュベートする。1%アガロースゲル上で試験消化産物を実行し、バンドが正しいかどうかを判断します。
メモ: バンドが正しい場合は、シーケンスに進みます。 - シーケンシングを行うには、ソフトウェアに保存されたDNAに基づいてプライマーを生成し、プライマーのアニーリング領域が約500 bp(塩基対)離れ、目的のフラグメント(遺伝子回路コンポーネント)またはフルプラスミドをカバーするようにします。プライマーを純粋なヌクレアーゼフリー水(NF-H2O)で10mM濃度に希釈する。1 μL の 10 ng/μL の DNA、1 μL のプライマー、および 8 μL の NF-H2O を 0.2 mL チューブに追加してシーケンシングサンプルを調製します。プライマーごとにこれを繰り返します。
注:サンプルが調製されたら、シーケンシング施設にサンプルを降ろし、分子クローニングソフトウェアを使用して結果をプラスミド配列と比較します。
- テスト消化を実行するには、使用する分子クローニングソフトウェアに基づいて、少なくとも2つのフラグメントを生成する少なくとも2つの制限酵素を選択します。酵素を選択したら、使用する酵素に応じて、各酵素1 μL、生成されたDNA5 μL、および水13 μLと適切な塩とバッファーを加えて、試験サンプルを調製します。反応物を37°Cで1時間、または酵素メーカーが示唆するようにインキュベートする。1%アガロースゲル上で試験消化産物を実行し、バンドが正しいかどうかを判断します。
- このステップでは、遺伝子回路を含むプラスミドを適切な細胞株に組み込むための約100〜1000ng/μLのDNAサンプルを生成します。
2. 安定した細胞株工学
- 哺乳動物発現ベクターから目的のタンパク質の高レベル発現を保証する安定したサブラインの迅速な生成のために設計された哺乳動物細胞株を注文する。細胞の種類と細胞株エンジニアリングの容易さは、ユーザーが何を好むか、または達成しようとしているかに応じて可変であり得る。
- 例えば、ユーザーが最小限の中間ステップで細胞株エンジニアリングを好む場合、単一の安定な集積部位(例えば、FRT)を含む細胞を転写活性ゲノム遺伝子座で注文する。より微妙な細胞工学が望ましい場合は、CRISPR/Cas9などの遺伝子工学ツールを使用して、好ましい場所に統合サイトを作成します。
- 37°Cの加湿空気中の5%CO2 中で細胞を増殖させる。 細胞型に応じて増殖条件を調整します。
- 上記のステップから得られた所望の細胞に上記で設計した遺伝子回路をトランスフェクトして、安定した細胞株生成プロセスを開始する。これを達成するために、遺伝子回路DNAのリポソーム混合物45 を適切なリコンビナーゼ(例えば、Flp−FRT組換えのためのFlp−リコンビナーゼ)と共に、またはエレクトロポレーションなどの他の方法を介して使用する。
- トランスフェクションの2日後、細胞を25%コンフルエントに分割した。
- 細胞を分裂してから6時間後、培地を50μg/mLのハイグロマイシン抗生物質(またはプラスミド構築中に選択された哺乳動物の抗生物質耐性遺伝子に対応する別の抗生物質剤)を含む新鮮な培地に交換することによって抗生物質の選択を開始する。
注:遺伝子回路構築に利用される哺乳類抗生物質耐性遺伝子には様々なものがあり、それぞれが異なる殺傷曲線を有する。したがって、どの哺乳類の抗生物質耐性遺伝子が回路構築のために選択されても、目的の細胞において適切な死滅曲線が研究されるべきである。このステップにより、遺伝子回路ペイロードを含む細胞が濃縮され、システムを持たない細胞が確実に排除されます。 - 細胞が抗生物質選択培地中で増殖するのを許し、プレートまたはフラスコが数十の病巣を有するまで2〜3日ごとに新鮮な培地に交換する。付着した培養物が合流点に達する前に対数段階にあるときの通過。
- 病巣が十分に多くなったら、カルシウム、マグネシウム、炭酸水素ナトリウムを含まないハンクス平衡塩溶液(HBSS)中の0.25%トリプシン、0.1%EDTAの1mLで細胞を数分間トリプシン処理します。新鮮な培地でトリプシンを中和し、すべての細胞を新鮮な容器に入れます。
- 新鮮な容器内の細胞が80%〜100%コンフルエントになったら、45%の古い培地、45%の新鮮な培地、および10%のDMSOの混合物でそれらを凍結する。残りの細胞を滅菌チューブに移し、単一細胞選別を行い、モノクローナル細胞を96ウェルプレートに単離する。
- モノクローナル選別後約2〜3週間で、96ウェルプレート内のウェルは病巣を有するはずである。約50%〜60%コンフルエントになったら、細胞を12ウェルプレートに分割する。
- 12穴プレートが80%~100%コンフルエントになったら、組織培養処理したT-25フラスコに分割する。T-25フラスコ内の細胞が80%~100%コンフルエントになったら、細胞を凍結し、モノクローナル細胞株の特性評価および試験のために継代を維持します。
- 顕微鏡法およびフローサイトメトリーアッセイによってモノクローナル細胞株を特徴付け、誘導された蛍光レポーター産生に基づいて遺伝子発現プロファイルを報告する。蛍光抗体標識および免疫蛍光アッセイによる機能的タンパク質産生の検証。定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を介して転写レベルの遺伝子発現誘導を試験する。クローンの局所および全ゲノムシーケンシングを介して遺伝子配列と統合精度を検証します。
3. ライトプレート装置誘導アッセイ
- 操作された細胞の光誘導に使用されるLPA装置31、46 を構築する。簡単に言えば、遺伝子発現を制御するために使用するLPAを作成するためには、いくつかの広範なステップが不可欠です。これらには、LPAフレームコンポーネントの3Dプリント、回路基板の構築、マイクロコントローラプログラマによる回路のプログラミング、コンポーネントを最終的なLPAに組み立てること、IRISソフトウェアを介したメモリカードのプログラミング、および完成したデバイスの較正が含まれます。より詳細な説明については、上記の参考文献を参照してください。
- Gerhardt et al. (2016 and 2019)31,46 で概説されているように 3D パーツを印刷します。
- Gerhardt et al. (2016 and 2019)31,46に概説されているように回路基板を組み立てる。
- Gerhardt et al. (2016 and 2019)31,46に概説されているように、マイクロコントローラプログラマを使用してアセンブリされたLPA回路にファームウェアを追加します。
- Gerhardt et al. (2016 and 2019)31,46に概説されているように、3Dプリントされた部品と組み立てられた回路基板を組み合わせる。これには、取り付けプレート、回路基板、LED(発光ダイオード)スペーサー、プレートアダプター、24ウェルプレート、プレート蓋、取り付けボルト、およびフィルム化されたビデオおよび図2に示すように、ウィングナットおよび積層部品の撮影が含まれる。
- デバイスのメモリカードのプログラミングとキャリブレーションについては、以下の手順に従ってください。
- Tabor Lab の Web サイト47 にある IRIS ソフトウェアを使用して、ライト プレート デバイス (LPA)31 用の SD カードをプログラムし、光遺伝学的実験を開始するために必要な適切な光条件を調べます。
注:IRISソフトウェアは、Tabor Labによって開発されたLPAとして知られる光遺伝学的電子ハードウェアをプログラミングするためのWebベースのアプリケーションです。このソフトウェアでは、LPAハードウェアの各ウェル内の個々の発光ダイオード(LED)を制御する相対IRIS値をプログラミングできます。 - LPA(4 x 6)ドロップダウンオプションを選択し、適切な照明アプローチ(定常状態、ダイナミック、アドバンスト)をクリックします。
注:この原稿では、すべてのアッセイが定常状態の例に焦点を当てます。ただし、高度な設定例は、パルス持続時間とデューティサイクルレジームに使用できます。 - プレートのウェルに対応するセルに値を入力して、上部または下部のLEDを点灯させるかどうかを選択します。本研究で使用したLPAについては、全ての実験で最上部に配置した青色LEDを用いた。各LEDは、一度プログラムされると、一定の光強度で連続的な光露光を提供することができます。IRISソフトウェアは、プログラム可能な4096強度レベルを可能にします。
- LEDの位置を選択したら、目的の実験アウトラインの強度値を入力します。たとえば、プレートごとに3つの技術反復で8つの異なる光強度(またはパルス持続時間またはデューティサイクル)を入力します(表2)。G.s.はグレースケール単位、つまりIRISソフトウェアのLPAプログラミングに使用される光強度レベルの測定値を指します。
- IRIS実験ファイルを設計するときは、LPA装置上の隣接するウェルからのエッジ効果、青色光曝露の強度の増加による光毒性、および所望の用量反応のタイプ(例えば、単調対非単調)の決定に留意してください。
- ユーザーがLPA内の細胞を特定の光パラメータ(例えば、強度)の昇順/降順でプログラムする場合、ウェルは光クロストークのエッジ効果または隣接するウェルに影響を与える可能性のある熱さえも生じ得る。これは、実験が完了したときに測定された出力の結果に誤って影響を与える可能性があります。これを軽減するために、ユーザーはIRISソフトウェアにランダム化行列を実装して、適切な位置をスクランブルし、エッジの影響を最小限に抑えることができます。例については、下記の代表結果(図4A-B)で説明します。
- さらに、より高い強度の青色光は、細胞の成長および生存率を妨げることが見出されている48。したがって、光毒性を緩和するには、調査対象のモダリティに応じて光強度、パルス持続時間、またはデューティサイクル応答曲線を生成することが重要です。
- 例えば、24ウェルプレート当たり3回の反復で8つの光強度値をプログラムし、無光からLPAの最大強度までの範囲を有する。次に、これらのサンプルをSSC-FSCゲートまたはヨウ化プロピジウムなどのライブ染色剤を備えたフローサイトメーターで実行し、各光値で集団細胞の生存(死細胞/細胞破片を含む総事象と比較した生細胞)を定量化します。
- 次に、任意の刺激が増殖、遺伝子発現、または生存に悪影響を及ぼす可能性があるため(例えば、適切なトレードオフとして80%の細胞生存率を設定する)、実験セットアップのための理想的な集団生存量を決定する。例えば、この作業では、一旦較正されると、強度は3000g.s.単位(LPA装置の最大強度の約3/4)を超えなかった。その一例については、以下の代表的な結果で説明します。
- 毒性のために光値を制限することに加えて、ユーザーは、単調応答の範囲など、用量反応の特定の部分を特徴付けるために光値を制限したい場合があります。
- これを達成するために、所望の用量反応を決定する際に分析されるモダリティに応じて広範囲の光強度、パルス持続時間またはデューティサイクルを最初にスキャンし(表2)、目的の光レジームに絞り込む(例えば、遺伝子発現が単調な用量応答のための光値の増加と正の相関する場合)。
- 目的の光範囲を決定するには、複数のLPAが同等の光量を供給するように較正され、以下に概説する細胞培養作業またはアッセイを続行するかどうかに応じて、異なる強度/パルス持続時間/デューティサイクル/等またはそれ以上のウェル(例えば、48、72、96など)の最大24ウェルを有する単一のLPAをプログラムする。したがって、広い用量範囲の光刺激による光遺伝学的システムの特性評価を開始して、所望の遺伝子発現を与える範囲間隔を決定し、続いてその洗練された用量範囲で実験を行う。
- 例えば、この研究では、3000gs単位が有毒な光強度の閾値として決定されると、この閾値を、以下に概説するアッセイ(例えば、免疫蛍光)のための光の上限として使用した。
注:上記の手順は、LPAの光学較正とは無関係であり、各光遺伝学系の分子レベルの較正を参照しています。
- 適切な光強度の値をIRISでプログラムしたら、USB 3.0コンセント付きのメモリカードをLPAに挿入して、ファイルをダウンロードして転送します。
- LPAの較正が完了したら31、光誘導アッセイの開始のための細胞培養作業に進む。キャリブレーションが行われていない場合は、マイクロコントローラプログラマでLPAをプログラムしたら、画像解析方法(ステップ3.7.1~3.7.3)を使用してLPAをキャリブレーションします。
- Gerhardt et al. (2016)31 によって記述されたのと同じ IRIS レベルを持つように LPA を簡潔にプログラムします。
注: 較正のために、LPA は 2000 g.s の値を持つようにプログラムされました。 - デバイスがメモリカードでプログラムされ、リセットボタン(LPA上の物理ボタン)が押されたら、デバイス全体(例えば、ゲルステーションイメージャ、スキャナデバイスなど)の画像を取得します。キャリブレーションでは、デバイスを180°回転させた状態で2つの画像を取得します。
- 次に、Gerhardt et al. (2016)31 によって設計されたオープンソースソフトウェアを使用して、LPAプレート上のLED強度の変動性を示し、LED補償値を計算してウェル間で強度を等しくします。この例は、以下の表される結果で説明されています(図3)。この較正が完了したら、光誘導アッセイの開始のための細胞培養作業に進む。
- Gerhardt et al. (2016)31 によって記述されたのと同じ IRIS レベルを持つように LPA を簡潔にプログラムします。
- 前のセクションから操作されたモノクローナル細胞のフラスコを入手し、遺伝子発現に対する光誘導効果を調べます。
- フラスコから古いメディアを取り出します。
- 1mLのトリプシンを細胞に加え、5分間インキュベートする。
- 5分後、必要な化学物質を添加したダルベッコ修飾イーグル培地(DMEMまたは他の所望の培地)を4mL加えてトリプシンを中和する(この研究は、50μg/mLのハイグロマイシン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、10%ウシ胎児血清、FBSを使用した)。
- 500 μLの総容量で24ウェルの黒色プレートに1ウェルあたり約75,000個の細胞を加える。播種される細胞の数は、所望の実験の持続時間および使用される細胞型に応じて変化し得る。
注:さらに、細胞播種密度は培養の維持および潜在的に実験の持続時間に影響を及ぼすことに留意されたい。ウェルあたりの細胞数を減らすことで、培養がコンフルエントに達するまでの時間が長くなります。さらに、目的の遺伝子回路に組み込まれた光遺伝学的構成要素の種類は、遺伝子発現が定常状態に達する時期に影響を与え、したがって実験の持続時間に影響を及ぼす。考慮され得る他の因子は、細胞株特異的増殖速度、培地組成、および条件付き増殖効果(すなわち、光)である。 - プレーティング後、細胞を5%CO2 の加湿インキュベーターに入れて、2〜6時間沈降させます。
- インキュベーション後、細胞を組織培養フードに移し、プラスチック製の蓋を外し、プレートの上部に接着箔ストリップを追加します(図2D)。このステップでは、ウェルの上部と側面がコーティングされているため、ウェル間の光移動を最小限に抑えることができ、LEDが配置されているウェルの下部からのみ光が入るようになりました。
- LPA の取り付けられた 3D パーツにプレートを置きます。次に、3D プリントされた LPA の蓋でプレートを覆い、各コーナーのデバイスのネジにフィットします。
- デバイスを電源に接続し、LPA デバイスのリセット ボタンを押して、更新された LPA 実験設定が適用されていることを確認します。
- 実験系内で細胞を、元の播種密度、細胞株特異的増殖速度、および増殖条件に応じて、適切な時間インキュベートする。この例では、細胞株を、遺伝子発現が定常状態に達するまで3日間連続して誘導した。しかしながら、多くの光遺伝学的システム(例えば、VVD)は、はるかに早く(例えば、24時間)定常状態の遺伝子発現に達する可能性があり、したがって、実験誘導時間は、必要に応じて短縮または延長され得ることに留意すべきである。
- 光誘導実験の最後に、以下の4つのアッセイのいずれかにサンプルを利用して、操作された細胞株を特徴付ける(セクション4〜7)。
4. 光誘導操作細胞の蛍光顕微鏡
- 誘導後24〜72時間、LPA中の細胞をインキュベーターから取り出し、組織培養フードに入れる。
- ホイルストリップを取り外し、プレートを1〜2分間放置します。これにより、プレートにすぐに置いた場合、プラスチック製の蓋に結露が形成されるのを防ぎます。
- 1〜2分座った後、元のプラスチック製の蓋をプレートに戻します。
- 適切な位相差顕微鏡または蛍光顕微鏡で細胞を画像化する。
- 機器に応じて、露光時間、光源強度、および操作されたセルを表示するためのゲインを調整します。この実験では、以下のパラメータを適用した:FITC / GFP(緑色蛍光タンパク質)光源露光時間に対して50ms、およびそれぞれ100%強度での位相コントラスト露光時間に対して1〜5ms。
注:最適な露光時間、ゲインレベル、および光源強度は、蛍光レポーターの過飽和を最小限に抑え、細胞損傷を最小限に抑え、定性的および定量的分析のための適切な画像をキャプチャするために、この研究の経験から経験的に導出されることが多いことに留意すべきである。これらの各パラメータのレベルを決定する際に留意すべき側面には、信号対雑音比の最大化、光毒性の最小化、蛍光信号の過飽和の最小化、および弱い蛍光信号の増幅能力の増加が含まれる。- これらのパラメータをひどくアドホックに最適化します。しかしながら、以前の実験値(例えば、蛍光レポーターの過飽和を引き起こす光源強度)は、適用可能な場合、将来の実験設定を導くことができる。例えば、1つの回路(LITer1.0)または実験セットアップ(例えば、光強度)からのゲイン設定、露光時間、および光強度初期値は、類似しているが異なる遺伝子回路(LITer2.0)11 または異なる光モダリティ(例えば、光デューティサイクル)に移動する際の出発点として使用することができる。
- 顕微鏡ソフトウェアにプログラムされた座標テンプレートによってプレートイメージングを合理化し、プレートサイズ全体(例えば、24ウェル)がウェルごとに複数の画像位置からの画像取得を自動化できるようにします。
5. 光誘導操作細胞のフローサイトメトリー
- 誘導後24〜72時間で、インキュベーター内のLPAから細胞を取り出し、またはイメージング後に顕微鏡から細胞を取り出し、組織培養フードに入れる。
- LPAから直接取り外す場合は、ホイルストリップを取り外し、プレートを1〜2分間放置します。
- 各ウェルから培地を吸引します(すべてのウェルが使用されている場合は、24ウェルプレート全体のうち)。
- 各ウェルに100 μLの0.25%トリプシンを加え、プレートをプラスチック製の蓋で覆い、インキュベーターに戻します。
- 細胞をインキュベーター内で5分間邪魔されずに放置する。
- 5分後、プレートを取り出し、組織培養フードに戻した。
- 各トリプシン処理した各DMEMを400 μLでよく中和します。
- 5 mL ポリスチレン丸底チューブをセルストレーナー (または、完全にトリプシン処理されていない細胞の大きな凝集塊を除去するためにろ過できる適切なフローサイトメトリーチューブ) で、各ウェルに対応する名前でラベル付けします。
- P1000ピペットを使用して、各ウェルの内容物を6~8回上下にピペットでピペットで固定し、細胞凝集塊を分解し、フローサイトメトリー49用の単細胞サンプルを作成します。
- 各ウェルの内容物全体(約500μL)をストレーナーで標識チューブに移します。
- 正しい波長のレーザーで細胞を適切なフローサイトメトリー装置に持ってきてください(細胞を入れたチューブを氷の上または外に持ち込むことができます)。
注:本研究で使用したフローサイトメーターは、大学病院の中核施設の一部でした。 - 順方向散乱ゲートと側方散乱ゲート(それぞれFSCとSSC)を作成して、適切なサイズと粒度の単一細胞を捕捉し、フローサイトメトリーソフトウェア上の破片や細胞凝集塊を排除します。
- ゲートを設定したら、適切なゲートで約 10,000 個のセルをキャプチャします。この数値は、ユーザーが探しているモバイルデータ通信の量に応じて調整します。実験からの細胞を含む各チューブについて繰り返す。
- 実験が完了したら、分析のために利用可能なフローサイトメトリーデータソフトウェアにデータをインポートします。
- FSC-SSCゲートを作成し(取得中と同様に)、実験データの各バッチに適用します。この原稿では、誘導されていない細胞集団の参照ウェルがこのゲートの作成に使用されていますが、密度ベースのゲートなど、ゲート作成のための他のメトリックが存在します。
- FSC-SSCゲートでゲートした実験条件で、フローサイトメトリーデータをヒストグラムとしてプロットするか、または他の方法で表現して、得られた発現パターンを例示する。この実験では、蛍光はGFP/FITCまたはPE/TexasRedチャネルによって捕捉された。
6. 遺伝子回路成分のRNA抽出と定量PCR
- 誘導後24〜72時間で、インキュベーター内のLPAから細胞を取り出し、またはイメージング後に顕微鏡から細胞を取り出し、組織培養フードに入れる。
- LPA から直接取り外す場合は、ホイルストリップを取り外し、プレートを 1 ~ 2 分間放置します。
- 各ウェルから培地を吸引します(すべてのウェルが使用されている場合は、24ウェルプレート全体のうち)。
- 適切なRNA抽出キットを用いて細胞からRNAを抽出する。
- RNA抽出が完了したら、各試料の逆転写反応を行う(表3)。
- また、各試料の定量PCRを行った(表4)。DNAポリメラーゼおよび関連するプロトコルを利用して、PCR反応を設定します。このステップでは、ハウスキーピング遺伝子と目的遺伝子との多重化反応を設定するか、別々の反応を作成します。この例では、GFP、KRAS、およびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)レベルがプローブされた。qRT-PCR実験を完了した後、利用可能なソフトウェアを介して解析を進め、RNAレベルでの遺伝子回路フォールド変化を例示します。
7. 遺伝子回路構成要素の免疫蛍光
- 氷浴または冷凍庫を使用してメタノールを冷却します。
- 誘導後24〜72時間で、インキュベーター内のLPAから細胞を取り出し、またはイメージング後に顕微鏡から細胞を取り出し、組織培養フードに入れる。
- LPAから直接取り外す場合は、ホイルストリップを取り外し、プレートを1〜2分間放置します。
- 各ウェルから培地を吸引します(すべてのウェルが使用されている場合は、24ウェルプレート全体のうち)。
- 各ウェルに100 μLの0.25%トリプシンを加え、プレートをプラスチック製の蓋で覆い、インキュベーターに戻します。
- 細胞をインキュベーター内で5分間邪魔されずに放置する。
- 5分後、プレートを取り出し、組織培養フードに戻した。
- 各トリプシン処理した各DMEMを400 μLでよく中和します。
- ミニ遠心チューブに各ウェルに対応する名前でラベルを付けます。
- P1000ピペットを使用し、各ウェルの内容物を6〜8回上下にピペットして細胞凝集塊を切断する。
- 各ウェルの内容物全体(約500μL)を標識チューブに移す。
- 細胞を400 x gで5分間遠心分離 する。
- 完了したら、上清を捨て、サンプルを化学ヒュームフードに移動します。
- 細胞を再懸濁する(P1000ピペットとピペットを各チューブで6〜8回上下させて細胞凝集塊を壊す)750〜1000μLの4%パラホルムアルデヒド(リン酸緩衝生理食塩水、PBSで希釈)。
- 細胞を室温で15分間座らせます。
- インキュベーション後、750〜1000μLのPBSを添加する。ピペットを数回上下させます。
- 細胞を400 x gで5分間遠心分離 する。
- 完了したら、上清を捨て、サンプルを化学ヒュームフードに移動します。
- 細胞を再懸濁する(P1000ピペットとピペットを各チューブで上下に6〜8回使用して細胞凝集塊を壊す)750〜1000 μLの氷冷メタノール。
- 細胞を氷の上または-20°Cの冷凍庫に30分間座らせます。
- インキュベーション後、750〜1000μLのPBSを添加する。ピペットを数回上下させます。
- 細胞を400 x gで5分間遠心分離 する。
- 完了したら、上清を捨て、サンプルを化学ヒュームフードに移動します。
- 使用する抗体の種類に応じて、この時点からプロトコルを変更します。ステップ 7.24.1-7.24.14 または 7.24.15-7.24.22 のいずれかを実行します。
- 一次抗体と二次抗体を使用する場合は、P1000/P200ピペットとピペットを使用して各チューブで6〜8回上下にピペットを使用して細胞を再懸濁し、100 μLの一次抗体中の細胞凝集塊を切断します。この際、KRAS抗体又はERK抗体を含むストック抗体について1:800の希釈液を作り、室温で1時間座らせた。抗体を、0.5gのBSAと共に1x PBSから作製されたインキュベーション緩衝液中で希釈した。
注: 抗体希釈率と目的抗原の標準曲線を作成することで、抗体の正確な希釈率を経験的に決定します。 - 抗体を加えた後は、チューブをホイルで覆い、標識抗体への軽い影響を防ぎます。
- インキュベーション後、750-1000 μLのインキュベーションバッファーを加える。ピペットを数回上下させます。
- 細胞を400 x gで5分間遠心分離 する。
- 完了したら、上清を捨て、サンプルを化学ヒュームフードに移動します。
- P1000/P200ピペットとピペットを使用して細胞を各チューブで6~8回上下に再懸濁し、100 μLの二次抗体中の細胞凝集塊を切断します。このとき、細胞をKRAS抗体の場合は1:800またはERK抗体の場合は1:2000の希釈で100 μLの二次抗体に再懸濁し、室温で30分間座らせた。一次抗体と同様に、二次抗体を上記のようにインキュベーションバッファーで希釈する。標準曲線の経験的知見に基づいて二次抗体の希釈率を決定する。
- 抗体を加えた後、チューブをホイルで覆い、標識抗体への軽い影響を防ぎます。
- インキュベーション後、750〜1000μLのインキュベーションバッファーを加える。ピペットを数回上下させます。
- 細胞を400 x gで5分間遠心分離 する。
- 完了したら、上清を捨て、サンプルを化学ヒュームフードに移動します。
- P1000ピペットおよびピペットを用いて細胞を各チューブ内で6〜8回上下に再懸濁し、500 μLのPBS中の細胞凝集塊を切断する。
- 各チューブの内容物全体(約500μL)をストレーナーで標識チューブに移します。
- 正しい波長のレーザーを備えた適切なフローサイトメトリー装置に細胞を持参してください(細胞が入ったチューブを氷の上または氷の外に持ち込むことができます)。
注:いくつかのコントロールを有することは、操作された細胞遺伝子発現のフローサイトメトリー測定および分析を進めるために重要であることに留意すべきである。例えば、完全に染色されていない細胞、一次抗体のみで染色された細胞、および二次抗体のみで染色された細胞を有することは、結果を抗体からのバックグラウンドシグナルと比較するのに有用であり得る。 - 次に、セクション 5 の説明に従って分析を続行します。
- 一次抗体のみを使用する場合は、P1000/P200ピペットとピペットを使用して細胞を各チューブ内で6〜8回上下に再懸濁し、標識一次抗体100 μLの細胞凝集塊を切断します。適切な抗体希釈率を決定し、室温で1時間インキュベートする。検量線から抗体希釈率を経験的に求める。
- 抗体を加えた後は、チューブをホイルで覆い、標識抗体への軽い影響を防ぎます。
- インキュベーション後、750-1000 μLのインキュベーションバッファーを加える。ピペットを数回上下させます。
- 細胞を400 x gで5分間遠心分離 する。
- P1000ピペットおよびピペットを用いて細胞を各チューブ内で6〜8回上下に再懸濁し、500 μLのPBS中の細胞凝集塊を切断する。
- 各チューブの内容物全体(約500μL)をストレーナーで標識されたチューブに移します。
- 正しい波長のレーザーを備えた適切なフローサイトメトリー装置に細胞を持参してください(細胞が入ったチューブを氷の上または氷の外に持ち込むことができます)。
注:いくつかのコントロールを有することは、操作された細胞遺伝子発現のフローサイトメトリー測定および分析を進めるために重要であることに留意すべきである。完全に染色されていない細胞および一次抗体のみで染色された細胞を有することは、抗体からのバックグラウンドシグナルと結果を比較するのに有用である。 - この時点から、セクション 5 の説明に従って分析を続行します。
- 一次抗体と二次抗体を使用する場合は、P1000/P200ピペットとピペットを使用して各チューブで6〜8回上下にピペットを使用して細胞を再懸濁し、100 μLの一次抗体中の細胞凝集塊を切断します。この際、KRAS抗体又はERK抗体を含むストック抗体について1:800の希釈液を作り、室温で1時間座らせた。抗体を、0.5gのBSAと共に1x PBSから作製されたインキュベーション緩衝液中で希釈した。
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Representative Results
この記事内の遺伝子回路アセンブリおよび安定な細胞株生成は、転写活性で単一の安定FRT部位を含む市販の改変HEK-293細胞に基づいていた(図1)。遺伝子回路は、プラスミド内にFRT部位を有するベクターに構築され、HEK−293細胞ゲノムへのFlp−FRTの統合を可能にした。このアプローチはFlp-In細胞に限定されず、FRT部位はCRISPR/Cas950などのDNA編集技術を使用してゲノム内の任意の目的の細胞株に添加することができる。
適切な細胞株が構築され、正しい挿入について検証されると、LPAおよびIRISソフトウェアを、遺伝子発現の光誘導のための標準化されたプロトコルとして選択した31、51。LPAシステムにより、光強度、パルス持続時間、デューティサイクルに応じて、複数の実験条件で哺乳動物細胞を誘導するように24ウェルをプログラムすることができます(図2)。この記事では、空間的に均一な光強度、パルス持続時間、およびデューティサイクルが優先されました。しかし、研究者はIRISソフトウェアとLPAを使用して、時間的光波パターンのより高度なプログラミングを行うことができます。
実験を開始する前に対処すべきLPAに関する重要な側面は、単一または複数のデバイスに対して実行できる光較正です。較正に使用される前述の画像解析方法31 は、対象となるすべてのLEDがオンのLPA全体の画像を必要とし、これはゲルイメージャを含む様々なソース52から取得することができる。ここでは、画像取得にコンピュータスキャナを使用しました(図3A)。画像が取得されると、Gerhardt et al. (2016)31 によって作成されたオープンソースソフトウェアを使用して、各LEDの補償値を計算し、各LPAが所定のグレースケール値で同じ強度を放射するようにしました。ソフトウェアは背景信号を減算し、画像をバイナリカテゴリにスレッショルドし、ピクセル強度を計算します(図3B)。較正から、LED間の変動は最小限に抑えられ、96ウェル間のCVは0.04(または較正された4プレート、 図3C)であることが判明しました。最後に、キャリブレーションソフトウェアを使用して、位置によるLEDの変化(図3D)を示し、各LEDが同じ強度に正規化されるようにグレースケール調整(図3E)を作成しました。
較正に加えて、LPAを使用する他の重要な側面には、光毒性効果や実験材料に基づく設計制限などの交絡変数を制限することによって全身誤差を最小限に抑えることができるいくつかのコントロールを実験パイプラインに統合することが含まれる。たとえば、 図 4 は、LPA ウェルで異なる光強度をプログラミングするための 2 つの異なる構成を示しています。 図4Aの第1 サブパネルは、光強度の上昇組織を示す。これにより、プログラミングとデータ分析が容易になりますが、LPAの一番下の行が最も高い光強度を持ち、近くの井戸の望ましくない熱と光の誘導を引き起こす可能性があるエッジ効果を生成する可能性があります。同様に、 図4Aの第2サブパネルでは、ランダム化行列がIRISソフトウェアに適用され、ランダムな位置に様々な光強度が作成されている。これにより、エッジ効果の全身的な影響を最小限に抑えることができます。IRISソフトウェアでスクランブル解除されたマトリックス(図4B)が作成され、実験終了後および分析中に実験条件を決定するために利用することができます。井戸の無作為化と同様に、使用者も起こり得る光毒性効果(この作業内の青色光)に注意すべきである。 図4Cでは、遺伝子回路誘導に使用される2つの異なる光強度が、誘導されていない操作された細胞集団に基づいて、同じFSC-SSCゲートで示されている。そのため、ユーザーは、対象となる光モダリティ(パルス、デューティサイクルなど)に対して用量反応を実行して、被ばくのハイエンドで起こり得る光毒性の影響を決定する必要があります(図4D)。ここで、青色光レベルの増加は、非刺激細胞と比較して用量依存的な細胞破片、死細胞、および凝集塊を引き起こした。そのため、連続光強度は最大LPA強度の約3/4(〜3000g.s.単位)に制限されていました。
適切な機器がセットアップされると、蛍光顕微鏡を介して操作されたLITer遺伝子回路で遺伝子発現が誘導されました(図5)。細胞はLPA上で異なる光パルス持続時間で誘導され、集団レベルでの遺伝子発現の光線量応答を与えた。この研究内の細胞は、FITC/GFP光源露光時間に50msを使用し、明視野イメージングのために位相コントラスト露光時間に1〜5msを用いてGFP発現のために画像化した。この細胞株工学プロトコルの堅牢性を考えると、GFPの代わりに任意の蛍光マーカーを使用することができる。細胞は複数の光レジームで誘導され、広範囲の応答を生成することができます(図5)。後者は、機能的遺伝子(例えば、元の研究におけるKRAS(G12V)癌遺伝子)の発現をさらに制御する上で有益である53。
蛍光顕微鏡の直後に、フローサイトメトリー、qRT-PCR、免疫蛍光など、さまざまな実験プロトコルで細胞を分析できました。この作業では、フローサイトメトリーを最初の検証手順として実施し、上記で概説した方法に従って実施しました(図6)。顕微鏡観察と同様に、細胞を異なるパルス長値で誘導し、集団レベルで非誘導状態から4倍以上の変化の遺伝子発現の用量反応を示した(図6A−B)。同様に、遺伝子発現ノイズ低減は、LITerシステムのさまざまな光強度値(図6C-D)とVVD/LightOn54などの正の調節(フィードバックなし)システムを比較することによって示すことができます。LITerをVVDシステムと比較すると、負のフィードバックは5倍以上の遺伝子発現ノイズリダクションを達成します。顕微鏡で画像化された同じ事前誘導細胞も、qRT-PCRを介して分析することができた(図7)。フローサイトメトリーと同様に、操作されたLITer細胞は、フローサイトメトリー上のGFP発現によって定量化されたタンパク質レベルの用量応答と一致する、用量応答性様式(非誘導状態からの10倍以上の誘導)でRNAレベルを発現することができた。前述の蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーデータは、非蛍光細胞、恒常的に発現する蛍光細胞、および蛍光6〜8ピーク検証ビーズ(例えば、FL1チャネルグリーン、蛍光ビーズ)を使用して較正することができる。これらの成分の各々は、単一の実験における遺伝子発現の正規化を可能にすることができる。しかし、これらの因子はまた、遺伝子発現データの比較および標準化を可能にするために、異なる実験プレート、実験条件、および日にわたる回路および操作された細胞の正規化を可能にすることもできる。
最後に、LITer遺伝子回路は、KRASなどの機能的遺伝子を発現するように操作することができる(G12V、 図8)。このパイプラインの汎用性により、ユーザーはLITerアーキテクチャを細胞工学とともに目的の機能遺伝子に利用することができ、おそらく正帰還などの追加のアーキテクチャを組み込むことができます。LITerは、遺伝子回路出力のレベル(KRAS(G12V)タンパク質レベル)の増加をもたらし、その結果、リン酸化-ERKレベルをもたらし、どちらも免疫蛍光アッセイを介して定量することができる青色光の量の増加を示した。
| 断片 | 比 | サイズ (bp) | DNA断片重量濃度(ng/μL) | DNA断片モル濃度(fmol/μL) | 容量 (μL) | 得られたDNAモル質量(fmol) |
| マザーベクター断片1 | 1 | 3414.00 | 18.20 | 8.63 | 4.09 | 35.29 |
| マザーベクター断片2 | 1 | 4642.00 | 18.10 | 6.31 | 5.59 | 35.29 |
| 関心のある遺伝子 | 1 | 549.00 | 37.90 | 111.70 | 0.32 | 35.29 |
| トータル | 10.00 | 105.87 |
表1:DNA集合反応マスターミックス計算(ステップ1.13)。 カラム2および3は、PCR増幅およびアガロースゲル抽出後の、組み立てられたDNA断片のサイズおよびこれらの断片の濃度に基づいている(ステップ1.11)。第 4列の下部セル(全反応量)は変更可能である。ただし、記載されたボリュームをお勧めします。シェーディングされていないセルは自動的に生成されます。
| 0 | 100 | 200 | 400 | 500 | 750 |
| 1500 | 3000 | 0 | 100 | 200 | 400 |
| 500 | 750 | 1500 | 3000 | 0 | 100 |
| 200 | 400 | 500 | 750 | 1500 | 3000 |
表2:3回の反復を有する24ウェルプレートにおける光誘導実験のための光強度(g.s.)のIRISプログラミング(ステップ3.4)。 0 ~ 3000 g.s. G.s.グレースケール単位の範囲の光強度の分布。これは、必要に応じてIRISソフトウェアによってランダム化することができます。
| サンプル1 | サンプル2 | サンプル3 | |
| 逆転写酵素マスターミックス容量(μL) | 4.00 | 4.00 | 4.00 |
| RNA テンプレート (1000 ng) 容量 (μL) | 2.00 | 3.00 | 4.00 |
| NF-H20 容量 (μL) | 14.00 | 13.00 | 12.00 |
| 総容量(μL) | 20.00 | 20.00 | 20.00 |
表3:逆転写マスターミックスの計算(ステップ6.5)。 推奨される反応の総容量は20 μLで、その成分は逆転写酵素マスターミックス(ここでは5倍)、RNAテンプレート、およびヌクレアーゼを含まない水です。この例では、サンプル 1、2、および 3 の RNA 濃度は、それぞれ 500、333、および 250 ng/μL です。
| サンプル1 | サンプル2 | サンプル 1 & 2 多重化 | |
| GFPプローブ容量(μL) | 1 | ----- | 1 |
| GAPDH プローブ容量 (μL) | ------ | 1 | 1 |
| DNAポリメラーゼマスターミックス量(μL) | 10 | 10 | 10 |
| cDNA (100 ng) 容量 (μL) | 2 | 2 | 2 |
| NF-H20 容量 (μL) | 7 | 7 | 7 |
| 総容量(μL) | 20 | 20 | 20 |
表 4: 定量的 PCR マスターミックスの計算 (ステップ 6.6)。 推奨される反応の総容量は20 μLで、その成分はDNAポリメラーゼ酵素マスターミックス(ここでは2x)、GFPおよび/またはGAPDHプローブ、cDNA(合計100 ng)、およびヌクレアーゼ自由水(NF-H20)です。
図1:回路設計とセル工学 (A)FRT組み込み部位を有するLITer合成遺伝子回路、回路統合のためのリコンビナーゼ酵素(Flpリコンビナーゼ)、適切な遺伝子クローンの選択に使用される薬物、および所望の光遺伝学的哺乳動物細胞株の作成に使用される目的の細胞株を含む細胞工学ツール。(B)操作された遺伝子システムは、ヒトゲノム内の遺伝子座を含む特定のFRT部位に組み込むことができる。これらのゲノム遺伝子座は、次いで、適切に統合された遺伝子カセットの選択のために特異的な抗生物質耐性または蛍光レポーター遺伝子を発現することができる。遺伝子回路の統合は、元の遺伝子カセット内の特定の部位を認識するリコンビナーゼを使用して開始することができる。これにより、所望の遺伝子回路を有する正しく操作された細胞の生成を確実にすることができる新規な薬剤耐性選択遺伝子が導入される。パネルBの下部には、光遺伝学的負帰還システムLITer2.0の遺伝子回路アーキテクチャがあります。この回路は、光-酸素-電圧感知ドメイン(LOV2)と融合した自己抑制TetRタンパク質、マルチシストロニック転写を可能にするリンカー配列P2A、GFPで構成されています。青色光が適用されると、TIP配列はLOV2ドメインから開き、TetRタンパク質を阻害し、TetRおよびGFPレポーターの両方の用量応答性転写の増加を可能にする。阻害されたTetRタンパク質は、DNA操作部位で結合および抑制することができず、したがって転写を増加させる。この負のフィードバックは、遺伝子発現ノイズを低く保ち、遺伝子発現の高倍の変化を可能にする。FRT-フリップ認識標的は、HygR-ハイグロマイシン耐性、LacZ-β-ガラクトシダーゼ、ZeoR-ゼオシン耐性、T-TetR、テトラサイクリンリプレッサータンパク質、D2irはTwtO部位を有するCMVベースのプロモーターであり、LOV2は光酸素電圧感知ドメインであり、TIPはTetRタンパク質を阻害するtet阻害ペプチドである。この数字はGuinn and Balázsi (2020)55から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:LPA実験プログラミング (A) 実験は、Taborラボのウェブサイト47 に記載されているツールを使用してプログラムすることができ、定常状態、動的、または高度なLPAプログラミングのための柔軟性を備えています31。さらに、電子ファイルは、代替細胞株の技術的複製または実験的誘導のための将来の使用のために保存することができる。(B)(C)上面及び側面から見た主成分を有するLPA装置。(D)LPA上に存在する箔密封プレートの画像。LPA - ライトプレート装置、LED - 発光ダイオード。この図の要素は、Guinn (2019)11から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ライトプレート装置の較正 。(A)IRISソフトウェアに基づいて2000g.s.に設定されたLED用のLPAの代表的な画像。(B)パネル(A)からの画像は、背景を減算し、各LEDのピクセル強度を計算するために画像を二値化するために使用される閾値を有する。(C) 同じ IRIS ソフトウェア値 (例えば、2000 g.s) に設定された 96 個の LED(4 枚の LPA プレート)のピクセル強度 (MATLAB 画像解析によって決定される) のヒストグラム。赤い線は平均LEDピクセル強度を表し、パネルのCVは96ウェルの変動係数を表します。(D)パネル(A)におけるLPA画像のLED強度を最大強度LEDに正規化したLEDを示すヒートマップ。(E)パネル(A)のLPA画像に対して決定された較正値ヒートマップは、LPA用にプログラムされたときに各LEDに対して等しい強度の生成を作成する。LPA - ライトプレート装置、LED - 発光ダイオード、CV - 変動係数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:LPAのランダム化と光毒性の影響。 (A)IRISソフトウェアに基づいて、25〜4000g.sに設定された2つのプログラム可能なLPA LED構成の代表的な画像。最初の構成では、熱と光のエッジ効果などの系統的なエラーが交差する可能性が高くなります(たとえば、LPAの下段が2番目に 低い行に影響を与えます)。2番目の画像は強度の位置をランダム化し、エッジ効果によって引き起こされる系統誤差(バイアス)を最小限に抑えます。(B)パネル(A)に示されるLPAにおける光強度についてのランダム化位置を示す行列は、所与の実験の強度依存性結果を決定するために使用することができる。(C)連続照明での誘導の3日間の2つの異なる光強度(1250および4000g.s.)についてのフローサイトメトリーデータ。黒い門は、誘導されていない細胞に基づいています。(d)パネル(C)が広範囲の光強度についてフローサイトメトリーデータを示す棒グラフ。LPA-ライトプレート装置は、FSC-前方散乱、SSC-側方散乱、g.s.-グレースケールで測定した光強度値。LITer細胞11 は、p値が0.0022のANOVA 1尾検定を用いて統計的に有意であった細胞生存の用量応答性の低下を有した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:操作された光遺伝学的細胞株の代表的な顕微鏡画像。 細胞を、位相コントラストおよび蛍光画像化を取得するためのカメラ(14ビット)を備えた倒立顕微鏡で画像化した。細胞を位相コントラスト(パネルA、代表的な明視野画像)のために5ms、GFP/FITC取得(パネルB)のために50msを100%光源強度で露光した。細胞は、所望の定常状態取得または動的応答に応じて様々な時点で画像化することができ、定常状態をもたらす。ここでの細胞は、光曝露なしから3日間の光曝露までの範囲の固定強度(1000g.s.)でのパルス持続時間滴定を表す。単位g.sは、グレースケールで測定された光強度値を表す。この図はGuinn (2019)11から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:操作された光遺伝学的細胞株のフローサイトメトリー。 細胞をBD LSRFortessaフローサイトメーターで分析し、SSC-FSC(側方散乱-前方散乱)ゲート内に約10,000個の細胞を採取した。次いで、細胞をFCS Expressソフトウェアで分析した。ヒストグラムまたは散布図は、目的の遺伝子(例えばGFP)の発現を定量化するために生成され得る。(A)黒い線の内側にゲーティングするためにSSC-FSC軸上にプロットされた操作された細胞。(b)1000g.s.で光パルスの様々な持続時間で誘導された代表的なLITer細胞から、誘導の72時間までの、遺伝子発現の用量反応を示す。(C)LITer遺伝子回路(TIPベースのシステム)と、フィードバックのない正の調節システムであるVVDまたはLightOnシステム40との比較比較の光強度滴定のための代表的な用量反応データ。(d)VVD系に対応するヒストグラムは、LITer系と比較してより広い分布(したがってより高い遺伝子発現ノイズ)を示す。CVは変動係数であり、遺伝子発現ノイズの指標である。FSC-前方散乱、SSC-側方散乱、FITC-フルオレセインイソチオシアネート、g.s.-グレースケールで測定した光強度値。この図はGuinn (2019)11から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:操作された光遺伝学的細胞株の定量的リアルタイムPCR。 複数の遺伝子発現レベルが刺激として光を用いて誘導および定量され得ることを示す代表的なデータ。単位Rqは、対照と比較した発現フォールド変化の相対定量化を表す。LITer細胞11 は、GFPおよびKRASレベルについてそれぞれp値が0.0352および0.0477のANOVA 1両側検定を用いて統計的に有意であったRNA発現の用量応答性の増加を有した。この図はGuinn (2019)11から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:操作された光遺伝学的細胞株の免疫蛍光。 免疫蛍光に基づくタンパク質レベルの推定値を示す代表的なデータ。(A)KRAS(G12V)のタンパク質レベルおよび(B)リン酸化-ERKのタンパク質レベルは、LITer遺伝子回路がそれぞれ直接的および間接的に増加する光量に従って誘導する。バーで示すデータは平均値であり、エラーバーは標準偏差(n=3)である。A.u. - 任意の単位、g.s. - グレースケールで測定された光強度値。LITer細胞11 は、KRASおよびリン酸化-ERKレベルについてそれぞれp値が2.79E-04および0.016のANOVA 1尾側検定を用いて統計的に有意であったタンパク質レベルの用量応答性の増加を有した。この図はGuinn (2019)11から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この記事の読者は、1)遺伝子回路の設計、構築、および検証を含む、光遺伝学的遺伝子回路(および他の遺伝子発現システム)を特徴付けるために不可欠なステップについての洞察を得ることができます。2)遺伝子回路を安定な細胞株に導入するための細胞工学(例えば、Flp-FRT組換え);3)LPAなどの光ベースのプラットフォームによる操作された細胞の誘導;4)蛍光顕微鏡による光誘導アッセイの初期特性評価;5)フローサイトメトリー、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)、または免疫蛍光アッセイを含む様々なアッセイによる最終的な遺伝子発現特性評価。
さらに、上記で概説した方法は、関心のある遺伝子を発現する本質的にあらゆる遺伝子回路アーキテクチャに対して高度にモジュール化されており、回路構築ステップおよび実施されるアッセイにおいて、主な潜在的なプロトコル変更を伴う。遺伝子回路構築の場合、分子クローニングの柔軟性により、プライマー設計またはアセンブリプロトコルに若干の変更を加えた蛍光マーカーで目的の遺伝子を交換または共発現させることができます。さらに、ここで概説する手順は、主に正確な(低ノイズの)遺伝子発現制御のためのNF遺伝子回路設計に焦点を当てていますが、ポジティブレギュレーションやポジティブフィードバック(PF)などの他のアーキテクチャを実装して、それぞれ高倍変化や高遺伝子発現ノイズなどのさまざまな機能を達成することができます56,57。.さまざまな遺伝子回路アーキテクチャ(PF、NFなど)を使用することで、研究者は、薬剤耐性や転移におけるタンパク質レベルの大きさやノイズの役割など、多様な生物学的疑問を探ることができます58。ここに列挙したプロトコールは、遺伝子発現定量の様々な方法にも焦点を当てているが、顕微鏡取得後に任意の数の機能的アッセイ(例えば、細胞運動性、創傷治癒、増殖など)を、先行する方法にほとんどまたは全く影響を及ぼさずに追加することができる。これは、光遺伝学が時空間誘導を使用して拍動性発現ダイナミクスなどの行動を研究できる単一細胞研究に特に関連しています59。
メソッドのモジュール性を補完するトラブルシューティングは、各メインプロトコルのもう1つの重要な機能です。回路構築における主な違いは、適切な回路特異的プライマー設計にありますが、細菌増殖によるアセンブリやプラスミド増幅などの後の方法はより標準化されており、通常は独自の広範なトラブルシューティング手順が含まれます。細胞工学は、使用される細胞株に応じて薬物滴定曲線で修正することができる。さらに、市販の細胞株を使用する場合、トラブルシューティングガイドは細胞株メーカーから直接入手することができます。また、意図しない光の影響は、操作された細胞株上で定量化するために重要です。例えば、470nmの光の光毒性作用のために、集団における死亡または損傷の誘発を調査するために光強度曲線を作成するべきである。さまざまな光値がテストされると、ユーザーはFSC-SSCゲートを作成したり、ヨウ化プロピジウム染色などの方法を利用して死/損傷した細胞を定量できるため、実験的に使用する適切な光範囲を決定するためのツールとして機能します。
LPA のトラブルシューティングでは、LED は隣接するウェルとの光と熱のクロストークのエッジ効果を生み出す可能性があります。例えば、高強度のウェルは、ウェル間に不適切なシールまたは大きな熱/光勾配がある場合、隣接するウェルに何らかの誘導を引き起こす可能性がある。これらの効果は、LPA がライト パラメータの特定の順序(昇順/降順など)でプログラムされている場合に最大になる可能性があります。これに対処するために、IRISソフトウェアを使用すると、ユーザーはランダム化マトリックスを使用して坑井強度をランダム化し、体系的な誤差を減らすことができます。蛍光顕微鏡のトラブルシューティングの側面では、露光時間、ゲイン設定(カメラ感度の制御)、光源強度が調整可能な主なパラメータです。これらのパラメータを調整することで、最適な画像生成と理想的な信号対雑音比を実現し、過飽和や光毒性を回避できます。
フローサイトメトリーのトラブルシューティングでは、光電子増倍管電圧とセルゲートが調整可能な主な側面です。これらのパラメータを同調することで、実験条件と対照サンプル間の理想的な比較、弱い蛍光シグナルまたは強い蛍光シグナルの両方に対する適切なシグナル取得、および細胞破片または望ましくない細胞集団の排除が可能になります。フローサイトメトリーの電圧は、適切な比較を可能にするために、実験間で理想的に一定に保たれることに留意すべきである。さらに、複数の蛍光出力を必要とする光遺伝学的システム(FITCやPEなど)の場合、ユーザーは蛍光色素分子間のクロストークによる蛍光補償に注意する必要があります。このようなシナリオでは、適切な蛍光シグナルを決定するためにコントロールが重要です。ユーザーが実行する必要があるコントロールには、蛍光ビーズ、目的のマーカーで染色された細胞、または目的のフローサイトメトリーソフトウェアで補償マトリックスを作成するために使用できる蛍光タンパク質を恒常的に発現する細胞が含まれます。さらに、1つの蛍光マーカーを使用するか複数使用するかにかかわらず、すべてのユーザーは、自家蛍光/バックグラウンドシグナルを生成する非蛍光細胞の各マーカーの蛍光シグナルを定期的に測定する必要があります。qRT-PCR のトラブルシューティングには、さまざまな cDNA 量とプローブ設計が含まれますが、これらは多くの場合、プロジェクト固有です。最後に、免疫蛍光のトラブルシューティングでは、抗体濃度はアッセイ定量の最大の変数であり、最適な濃度決定が必要です。
上記の方法のほとんどに関連するトラブルシューティングの側面の1つは、ホイルで覆われたセルを備えた密閉プレートを使用することによる分離効果です。この方法は、様々な細胞株の適切な増殖に必要な二酸化炭素ガス交換を妨げ得る。以前の実験経験から、これは、この原稿内の操作された細胞株を用いた3〜5日間の実験のための細胞増殖に対する重大な障害ではなかったが、他の細胞株または実験期間にとって重要になる可能性がある。この懸念に対処するために、密封プレートで実施された適応の1つは、二酸化炭素非依存性媒体を使用することを含み、これはこの研究で使用された細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。代謝、pHレベル、および細胞密度が重要である他のアッセイまたは細胞株については、培地または栄養素をより頻繁に変更するなどの他の介入が必要であり得ることに留意すべきである。
ここで概説する方法の限界は、使用される遺伝子回路、光遺伝学的技術の精度、およびLPAと蛍光顕微鏡などの他の装置とのインターフェースにある。ここで説明する技術は、手頃な価格で、構築が迅速で、光遺伝学的に操作された細胞の集団に対して検証が容易です46。しかし、デジタルミラーデバイス(DMD)を利用するなど、光誘導セットアップを変更せずに単一細胞を制御することができないなど、特定の空間的制限があり、生細胞で最近実証された利点があります60,61。さらに、ここで概説した方法は、光遺伝学的刺激中の生細胞追跡において制限されており、実験時間経過全体のエンドポイントデータ取得のみを可能にする。
これらの限界にもかかわらず、ここで概説する光遺伝学的方法は、単一細胞をリアルタイムで制御する柔軟性を有するが、刺激できるサンプルの数によって制限されるDMDなどの既存の技術を補完するものである。さらに、ここで議論される安定した細胞株工学的方法は、一過性トランスフェクションを介して操作された遺伝子系を特徴付けることが多い既存の合成生物学法とは対照的である。一過性トランスフェクションアプローチは、細胞間の遺伝子回路コピー数の変動が大きいため、本質的にノイズが多いです。対照的に、ここで提示された方法は、それぞれが1つの遺伝子回路コピーを含むモノクローナル細胞変異体を含む。安定した細胞株は、各細胞がその隣接細胞と同一であるというより高い信頼性があるため、遺伝子発現の変動、表現型ランドスケープに対するタンパク質レベルの影響、および単一細胞法などの細胞側面をより詳細な精度で探索することを可能にする。
今回の研究は、ゲノム的に統合された目的の光遺伝学的遺伝子回路を設計し、信頼性の高い実験ツールでそのようなシステムを誘導し、標準化された方法でさまざまな遺伝子発現および機能的/表現型アッセイでそれらを特徴付けるためのプラットフォームを実証する。これらのプロトコルの将来の改善には、単一細胞レベルでの遺伝子発現および機能的アプリケーションの時空間制御を可能にするDMDなどの他の光遺伝学的技術を用いた生細胞追跡とこれらの方法の統合が含まれる可能性がある。このような進歩により、光利用は、単一細胞における目的の遺伝子発現パターンの生成、転写/翻訳ダイナミクスの確立、タンパク質レベルの定量化、および細胞移動、増殖、転移、分化を含む多様な生物学的プロセスにおけるそれらの役割の研究を可能にする。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
Balázsi研究室のコメントと提案、最初のLPAの構築を支援してくれたKarl P. Gerhardt博士とJeffrey J. Tabor博士、LOV2-degronプラスミドを共有してくれたWilfried Weber博士に感謝します。この研究は、国立衛生研究所[R35 GM122561およびT32 GM008444]によって支援された。物理的および定量的生物学のためのローファーセンター;国防理工学大学院(NDSEG)フェローシップ。オープンアクセス料金の資金調達:NIH [R35 GM122561]。
著者の貢献:M.T.G.とG.B.がプロジェクトを考案しました。M.T.G.、D.、およびL.G.は、実験を行.Cた。M.T.G.、D.G.、L.G.、およびG..C.は、データを分析し、原稿を準備した.B。G..B.とM.T.G.がプロジェクトを監督した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tubes | Eppendorf | 951010006 | reagent for carrying out PCR |
| 0.25% Trypsin EDTA 1X | Thermo Fisher Scientific | MT25053CI | reagent for splitting & harvesting mammalian cells |
| 0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000020 | tool used for pipetting reactions |
| 100-1000 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
| 20-200 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000055 | tool used for pipetting reactions |
| 2-20 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
| 5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | reagent for flow cytometry |
| 5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V | Eppendorf | 22628113 | equipment for mammalian culture work |
| Agarose | Denville Scientific | GR140-500 | reagent for gel electrophoresis |
| Aluminum Foils for 96-well Plates | VWR® | 60941-126 | tool used for covering plates in light-induction experiments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9518-5G | reagent for selecting bacteria with correct plasmid |
| Analog vortex mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365PR | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140010 | reagent for growing bacteria |
| BD LSRAria | BD | 656700 | tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations |
| BD LSRFortessa | BD | 649225 | tool for characterizing engineered cell lines |
| BSA, Bovine Serum Albumine | Government Scientific Source | SIGA4919-1G | reagent for IF incubation buffer |
| Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC | Corning | 353043 | plate used for growing monoclonal cells |
| Centrifuge | VWR | 22628113 | instrument for mammalian cell culture |
| Chemical fume hood | N/A | N/A | instrument for carrying out IF reactions |
| Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid | BD | 353047 | plate used for growing monoclonal cells |
| CytoOne T25 filter cap TC flask | USA Scientific | CC7682-4825 | container for growing mammalian cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fischer Scientific | BP231-100 | reagent used for freezing down engineered mammalian cells |
| Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15-585-011 | reagent for gel electrophoresis |
| Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid | Corning | 353072 | container for growing sorted monoclonal cells |
| FCS Express | De Novo Software: | N/A | software for characterizing flow cytometry data |
| Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL | Corning | 35-010-CV | reagent for growing mammalian cells |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | equipment for growing bacteria |
| Gibco DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11-965-092 | reagent for growing mammalian cells |
| Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
| Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL | Life Technologies | 10687-010 | reagent for selecting cells with proper gene circuit integration |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | reagent for converting RNA to cDNA |
| Laboratory Freezer -20 °C | VWR | 76210-392 | equipment for storing experimental reagents |
| Laboratory Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U74VC | equipment for storing experimental reagents |
| Laboratory Refrigerator +4 °C | VWR | 76359-220 | equipment for storing experimental reagents |
| LB Broth (Lennox) , 1 kg | Sigma-Aldrich | L3022-250G | reagent for growing bacteria |
| LIPOFECTAMINE 3000 | Life Technologies | L3000008 | reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells |
| MATLAB 2019 | MathWorks | N/A | software for analyzing experimental data |
| Methanol | Acros Organics | 413775000 | reagent for immunofluorescence reaction |
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL | VWR | 20170-333 | plasticware container |
| Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
| MultiTherm Shaker | Benchmark Scientific | H5000-HC | equipment for bacterial transformation |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-NDL-US-CAN | equipment for DNA/RNA concentration measurement |
| NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix | NEB | M0492S | reagent for PCR of gene circuit fragments |
| NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs (NEB) | C3019H | bacterial cells for amplifying gene circuit of interest |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs (NEB) | E2621L | reagent for combining gene circuit fragements |
| Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera | Nikon Instruments Inc. | N/A | instrument for quantifying gene expression |
| NIS-Elements | Nikon Instruments Inc. | N/A | software for characterizing fluorescence microscopy data |
| oligonucleotides | IDT | N/A | reagent used for PCR of gene circuit components |
| Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control | Panasonic | MCO-170AICUVHL-PA | instrument for growing mammalian cells |
| Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | reagent |
| PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) | Invitrogen | 14190144 | reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x | Fisher Scientific | 15140-122 | reagent for growing mammalian cells |
| primary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 4370S | primary ERK antibody for immunifluorescence |
| primary KRAS antibody | Sigma-Aldrich | WH0003845M1 | primary KRAS antibody for immunifluorescence |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | reagent kit for purifying gene circuit plasmids |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | reagent kit for purifying gene circuit fragments |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Eppendorf | A28137 | equipment for qRT-PCR |
| Relative Quantification App | Thermo Fisher Scientific | N/A | software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | kit for extracting RNA of engineered mammalian cells |
| Secondary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 8889S | secondary ERK antibody for immunifluorescence |
| secondary KRAS antibody | Invitrogen | A11005 | secondary KRAS antibody for immunifluorescence |
| Serological Pipets 5.0 mL | Olympus Plastics | 12-102 | reagents used for setting up a variety of chemical reactions |
| SmartView Pro Imager System | Major Science | UVCI-1200 | tool for imaging correct PCR bands |
| SnapGene Viewer (free) or SnapGene | SnapGene | N/A | software DNA sequence design and analysis |
| Stage top incubator | Tokai Hit | INU-TIZ | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | reagent for PCR of gene circuit fragments |
| TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn | Life Technologies | 4326317E | qPCR Probe |
| Thermocycler | Bio-Rad | 1851148 | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated | PerkinElmer | 1450-605 | plate used for light-induction experiments |
| VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm | VWR | 14673-010 | reagent for mammalian cell culture |
| VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System | VWR | 89032-290 | equipment for DNA gel electrophoresis |
| Flp-In 293 | Thermo Fisher Scientific | R75007 | Engineered cell line with FRT site |
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