Ingeniería confiable y control de circuitos genéticos optogenéticos estables en células de mamíferos

Summary

El control fiable de las células de mamíferos sensibles a la luz requiere la estandarización de los métodos optogenéticos. Hacia este objetivo, este estudio describe una línea de construcción de circuitos genéticos, ingeniería celular, operación de equipos optogenéticos y ensayos de verificación para estandarizar el estudio de la expresión génica inducida por la luz utilizando un circuito genético optogenético de retroalimentación negativa como estudio de caso.

Abstract

El control confiable de la expresión génica en células de mamíferos requiere herramientas con alto cambio de pliegue, bajo ruido y funciones determinadas de transferencia de entrada a salida, independientemente del método utilizado. Hacia este objetivo, los sistemas de expresión génica optogenética han ganado mucha atención en la última década para el control espaciotemporal de los niveles de proteínas en las células de mamíferos. Sin embargo, la mayoría de los circuitos existentes que controlan la expresión génica inducida por la luz varían en arquitectura, se expresan a partir de plásmidos y utilizan equipos optogenéticos variables, lo que crea la necesidad de explorar la caracterización y estandarización de los componentes optogenéticos en líneas celulares estables. Aquí, el estudio proporciona una línea experimental de construcción, integración y caracterización de circuitos genéticos confiables para controlar la expresión génica inducible por la luz en células de mamíferos, utilizando un circuito optogenético de retroalimentación negativa como ejemplo de caso. Los protocolos también ilustran cómo la estandarización de equipos optogenéticos y regímenes de luz puede revelar de manera confiable las características del circuito génico, como el ruido de expresión génica y la magnitud de la expresión de proteínas. Por último, este documento puede ser de utilidad para los laboratorios que no están familiarizados con la optogenética que deseen adoptar dicha tecnología. La tubería descrita aquí debería aplicarse a otros circuitos optogenéticos en células de mamíferos, lo que permite una caracterización y un control más confiables y detallados de la expresión génica a nivel transcripcional, proteómico y, en última instancia, fenotípico en células de mamíferos.

Introduction

Al igual que otras disciplinas de la ingeniería, la biología sintética tiene como objetivo estandarizar los protocolos, permitiendo utilizar herramientas con funciones altamente reproducibles para explorar cuestiones relevantes para los sistemas ^{biológicos1,2}. Un dominio de la biología sintética donde se han construido muchos sistemas de control es el área de regulación de la expresión ^génica3,4. El control de la expresión génica puede dirigirse tanto a los niveles de proteínas como a la variabilidad (ruido o coeficiente de variación, CV = σ/μ, medido como la desviación estándar sobre la media), que son características celulares cruciales debido a su papel en los estados celulares fisiológicos y patológicos5,6,7,8. Muchos sistemas sintéticos que pueden controlar los niveles de proteínas y el ruido4,9,10,11,12 han sido diseñados, creando oportunidades para estandarizar protocolos en todas las herramientas.

Un nuevo conjunto de herramientas que pueden controlar las redes génicas que ha surgido recientemente es la optogenética, que permite el uso de la luz para controlar la expresión génica13,14,15,16,17. Al igual que sus predecesores químicos, los circuitos genéticos optogenéticos pueden introducirse en cualquier tipo de célula, desde bacterias hasta mamíferos, permitiendo la expresión de cualquier gen de interés aguas ^abajo18,19. Sin embargo, debido a la rápida generación de nuevas herramientas optogenéticas, han surgido muchos sistemas que varían en la arquitectura del circuito genético, el mecanismo de expresión (por ejemplo, la integración basada en plásmidos frente a la viral) y los equipos de control de suministro de luz11,16,20,21,22,23,24,25 . Por lo tanto, esto deja espacio para la estandarización de las características optogenéticas, como la construcción y optimización de circuitos genéticos, el método de utilización del sistema (por ejemplo, integración frente a expresión transitoria), las herramientas experimentales utilizadas para la inducción y el análisis de resultados.

Para avanzar en la estandarización de protocolos optogenéticos en células de mamíferos, este protocolo describe una tubería experimental para diseñar sistemas optogenéticos en células de mamíferos utilizando un circuito genético de retroalimentación negativa (NF) integrado en células HEK293 (línea celular de riñón embrionario humano) como ejemplo. NF es un sistema ideal para demostrar la estandarización, ya que es muy abundante26,27,28 en la naturaleza, lo que permite ajustar los niveles de proteínas y minimizar el ruido. En resumen, nf permite un control preciso de la expresión génica mediante un represor que reduce su propia expresión lo suficientemente rápido, limitando así cualquier cambio lejos de un estado estacionario. El estado estacionario puede ser alterado por un inductor que inactiva o elimina el represor para permitir una mayor producción de proteínas hasta que se alcanza un nuevo estado estacionario para cada concentración de inductor. Recientemente, se creó un sistema optogenético NF diseñado que puede producir una respuesta ampliamente dinámica de la expresión génica, mantener un ruido bajo y responder a los estímulos de la luz, lo que permite el potencial de control de la expresión génica ^espacial11. Estas herramientas, conocidas como sintonizadores inducibles por la luz (LITers), se inspiraron en sistemas anteriores que permitían el control de la expresión génica en células vivas4,10,29,30 y se integraron de manera estable en las líneas celulares humanas para garantizar el control de la expresión génica a largo plazo.

Aquí, usando el LITer como ejemplo, se describe un protocolo para crear circuitos genéticos sensibles a la luz, inducir la expresión génica con un Aparato de Placa de Luz (LPA, un hardware de inducción optogenética)³¹ y analizar las respuestas de las líneas celulares diseñadas y controlables optogenéticamente a estímulos de luz personalizados. Este protocolo permite a los usuarios utilizar las herramientas LITer para cualquier gen funcional que deseen explorar. También se puede adaptar para otros sistemas optogenéticos con diversas arquitecturas de circuitos (por ejemplo, retroalimentación positiva, regulación negativa, etc.) mediante la integración de los métodos y equipos optogenéticos que se describen a continuación. Al igual que otros protocolos de biología sintética, las grabaciones de video y los protocolos optogenéticos descritos aquí se pueden aplicar en estudios unicelulares en diversas áreas, que incluyen, entre otras, la biología del cáncer, el desarrollo embrionario y la diferenciación de tejidos.

Protocol

1. Diseño de circuitos genéticos

1. Seleccionar componentes genéticos para combinarlos en un solo circuito genético/plásmido (por ejemplo, motivos de secuencia de integración de ADN de ^mamíferos32, elementos sensibles a la ^luz33 o genes funcionales34).
2. Utilizando cualquier software de ingeniería genética y/o clonación molecular, almacene las secuencias de ADN para su uso y referencia posteriores, anote cada secuencia y examine todas las características necesarias (por ejemplo, codones START, secuencias regulatorias o traducidas)³⁵.
3. Desarrollar o adoptar partes de acuerdo con el diseño general del circuito ^genético36. A modo de ejemplo, para los represores optogenéticos como en los LITers11, fusionar una secuencia de genes que codifica para un dominio capaz de degradación inducible por la ^luz37,38 o inactivación de la capacidad de unión al ADN de un represor39, adyacente y en el marco del gen represor (por ejemplo, TetR)⁴.
   1. Para los activadores optogenéticos, asegurar la presencia de un dominio ^activador40 que promueva la expresión génica sobre la unión al ADN inducida por la ^luz41. Para la autorregulación negativa o positiva, asegúrese de la presencia de un sitio de unión reguladora en o aguas arriba del promotor del gen regulador (por ejemplo, sitios tetO en o aguas arriba del promotor que expresa TetR)⁴².
4. Diseñar los cebadores para la amplificación de la secuencia de ADN o secuenciación del plásmido utilizando el software de clonación molecular para cada circuito genético.
5. Valide los cebadores computacionalmente para la construcción de plásmidos a través de los feastures incorporados del software de clonación molecular (por ejemplo, alineación de secuencias).
6. Solicite cebadores de oligonucleótidos al fabricante. Los plásmidos construidos y utilizados en este trabajo se pueden encontrar en el material de soporte ^original11 junto con los cebadores diseñados y utilizados.
7. Diluya los cebadores a una concentración de stock de 100 mM en agua de doble destilación (_ddH2O).
8. Diluya el stock de imprimaciones de stock de 100 mM a una concentración de 10 mM para PCR.
9. Preparar la mezcla de PCR con 1 μL de cebador hacia adelante, 1 μL de cebador inverso, 1 μL de ADN plantilla a una masa total de 0,5-500 ng para genómica o 0,5 pg-5 ng para ADN plásmido o viral, 12,5 μL de mezcla maestra de ADN polimerasa 2x (o el volumen que satisface el factor de dilución del fabricante) y 9,5 μL de _ddH2O para un volumen de reacción total de 25 μL.
10. Incubar la mezcla de PCR en un termociclador en los ajustes adecuados en función de la enzima ^elegida43. Los ciclos de reacción sugeridos incluyen:
    Paso 1: Un ciclo de 30 s paso de desnaturalización inicial a 95 °C.
    Paso 2: 40 ciclos de 5 s de paso de desnaturalización a 98 °C.
    Paso 3: Un ciclo de 30 s de paso de recocido a 65 °C (determinado por cebadores diseñados anteriormente).
    Paso 4: Un ciclo de 1 min de extensión a 72 °C (~1 kilobase (kb) de longitud de fragmento de plantilla).
    Paso 5: Un ciclo de una extensión de 2 minutos a 72 °C.
    Mantenga la reacción a 4 °C hasta que se pueda probar mediante electroforesis en gel. Este protocolo variará dependiendo de los reactivos utilizados (por ejemplo, polimerasa y tampones).
11. Repita el paso 1.9 para amplificar todos los fragmentos que se utilizarán en una reacción de ensamblaje de ADN necesaria para vincular productos de PCR lineal en un solo vector de ADN circular.
12. Ejecute los productos de PCR en un gel de agarosa al 1% seguido de purificar las bandas de la longitud deseada.
13. Preparar la mezcla maestra para una reacción de ensamblaje de ADN (Tabla 1).
    NOTA: En este ejemplo, el vector madre se divide en dos fragmentos para aumentar la eficiencia de los pasos de PCR sin causar cambios significativos en el resultado general del ensamblaje.
14. Incubar la mezcla maestra de reacción de ensamblaje de ADN en un termociclador a 50 °C durante 1 h (a menos que se especifique lo contrario en el protocolo de reactivo de ensamblaje de ADN) y almacenar la reacción a 4 °C para usar el producto de reacción para la transformación bacteriana.
15. Establecer la transformación bacteriana (química o electroporación) utilizando células competentes de E. coli (Escherichia coli) y el protocolo de transformación bacteriana correspondiente. Después de la transformación, use las placas de agar bacteriano Luria-Bertani (LB) que contienen el marcador de selección bacteriana elegido (por ejemplo, ampicilina) para colocar la placa de la mezcla de transformación. Incubar las placas a 37 °C durante la ^noche44.
16. Revisa los platos al día siguiente. Para inocular las colonias, recoja colonias individuales de las placas y resuspóngalas en un caldo líquido LB con el marcador de selección bacteriana correspondiente en tubos de cultivo. Incubar en una incubadora agitadora a 37 °C, 300 rpm durante la noche.
17. Realizar el protocolo de preparación de plásmidos para extraer el ADN plásmido del cultivo bacteriano.
18. Valida el circuito en dos pasos. Primero, realice una prueba de digestión utilizando enzimas de restricción como una verificación cruda para ver si se obtuvo el producto plásmido aproximado. En segundo lugar, si la digestión de la prueba se pasa / confirma, envíe el plásmido a una instalación de secuenciación de Sanger (o proceso utilizando el equipo disponible) para obtener la secuencia precisa de ADN para compararla más tarde con la secuencia esperada en el software de diseño.
    1. Para realizar la digestión de prueba, seleccione al menos dos enzimas de restricción que produzcan al menos dos fragmentos, según el software de clonación molecular utilizado. Una vez seleccionadas las enzimas, prepare las muestras de prueba agregando 1 μL de cada enzima, 5 μL del ADN generado y 13 μL de agua con sales y tampones apropiados dependiendo de las enzimas utilizadas. Incubar la reacción a 37 °C durante 1 h, o como sugiere el fabricante de la enzima. Ejecute los productos de digestión de prueba en un gel de agarosa al 1% y determine si las bandas son correctas.
       NOTA: Si las bandas son correctas, proceda a la secuenciación.
    2. Para realizar la secuenciación, genere cebadores basados en el ADN almacenado en el software de modo que las regiones de recocido de los cebadores estén separadas por aproximadamente 500 pb (pares de bases) y cubran el fragmento de interés (componente del circuito genético) o el plásmido completo. Diluya los cebadores con agua pura libre de nucleasas (_NF-H2O) a una concentración de 10 mM. Prepare las muestras de secuenciación agregando 1 μL de ADN de 10 ng/μL, 1 μL de cebador y 8 μL de _NF-H2O a un tubo de 0,2 mL. Repita esto para cada imprimación.
       NOTA: Cuando se preparen las muestras, déjelas en la instalación de secuenciación y compare los resultados con la secuencia de plásmidos utilizando un software de clonación molecular.
19. En este paso, genere aproximadamente 100-1000 ng / μL de muestra de ADN para integrar los plásmidos que contienen circuitos genéticos en la línea celular apropiada.

2. Ingeniería de línea celular estable

1. Ordene una línea celular de mamíferos diseñada para la generación rápida de sublíneas estables que aseguren la expresión de alto nivel de la proteína de interés a partir de un vector de expresión de mamíferos. El tipo de célula y la facilidad de la ingeniería de líneas celulares pueden ser variables dependiendo de lo que los usuarios prefieran o pretendan lograr.
   1. Por ejemplo, si los usuarios prefieren la ingeniería de líneas celulares con pasos intermedios mínimos, ordene las células que contienen un solo sitio de integración estable (por ejemplo, FRT) en un locus genómico transcripcionalmente activo. Si se prefiere una ingeniería celular más matizada, cree sitios de integración en ubicaciones preferidas utilizando herramientas de ingeniería genética como CRISPR / Cas9.
2. Cultivar células en 5% de _CO2 en aire humidificado a 37 °C. Ajuste las condiciones de crecimiento según sea necesario para el tipo de célula.
3. Transfectar los circuitos genéticos diseñados anteriormente en las células deseadas obtenidas de los pasos anteriores para comenzar un proceso estable de generación de líneas celulares. Para lograr esto, utilice una mezcla de ^liposomas45 del ADN del circuito génico con la recombinasa adecuada (por ejemplo, Flp-recombinasa para la recombinación Flp-FRT) o a través de otros métodos como la electroporación.
4. Dos días después de la transfección, divida las células al 25% de confluencia.
5. Seis horas después de dividir las células, comience la selección de antibióticos intercambiando los medios a un medio fresco que contenga 50 μg / ml de antibiótico de higromicina (u otro agente antibiótico correspondiente al gen de resistencia a los antibióticos de mamíferos elegido durante la construcción del plásmido).
   NOTA: Hay una variedad de genes de resistencia a los antibióticos de mamíferos utilizados en la construcción de circuitos genéticos, cada uno de los cuales tiene una curva de muerte diferente. Por lo tanto, cualquiera que sea el gen de resistencia a los antibióticos de mamíferos que se elija para la construcción de circuitos, se debe estudiar una curva de muerte adecuada en las células de interés. Este paso garantiza que las células que contienen la carga útil del circuito genético se enriquezcan, mientras que las que no tienen el sistema se eliminan.
6. Permita que las células crezcan en el medio de selección de antibióticos, cambie a medios frescos cada 2-3 días hasta que la placa o matraz tenga unas pocas docenas de focos. Pasaje de cultivos adherentes cuando se encuentran en la fase logarítmica antes de que alcancen la confluencia.
7. Una vez que haya suficientes focos, tripsinizar las células con 1 ml de tripsina al 0,25%, EDTA al 0,1% en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin bicarbonato de calcio, magnesio y sodio durante varios minutos. Neutralice la tripsina con medios frescos y pase todas las células a un recipiente fresco.
8. Una vez que las células en el recipiente fresco sean 80% -100% confluentes, congélelas en una mezcla de 45% de medios viejos, 45% de medios frescos y 10% de DMSO. Transfiera las células restantes a un tubo estéril y realice una clasificación de una sola célula para aislar las células monoclonales en una placa de 96 pocillos.
9. Aproximadamente 2-3 semanas después de la clasificación monoclonal, los pozos dentro de la placa de 96 pocillos deben tener focos. Cuando aproximadamente el 50% -60% confluente, divida las células en una placa de 12 pocillos.
10. Una vez que la placa de 12 pocillos es 80% -100% confluente, divida en un matraz T-25 tratado con cultivo de tejido. Una vez que las células en el matraz T-25 son 80% -100% confluentes, congele las células y mantenga un pasaje para la caracterización y prueba de líneas celulares monoclonales.
    1. Caracterizar las líneas celulares monoclonales mediante microscopía y ensayos de citometría de flujo para reportar perfiles de expresión génica basados en la producción inducida de reportero fluorescentes. Verificar la producción de proteínas funcionales a través del etiquetado de anticuerpos fluorescentes y el ensayo de inmunofluorescencia. Probar la inducción de la expresión génica a nivel transcripcional mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Validar la secuencia genética y la precisión de la integración a través de la secuenciación local y del genoma completo de los clones.

3. Ensayos de inducción de aparatos de placas ligeras

1. Construir un dispositivo ^LPA31,46 para ser utilizado para la inducción de luz de células modificadas. Brevemente, varios pasos amplios son cruciales para la creación de LPA para usar para controlar la expresión génica. Estos incluyen componentes de marco LPA de impresión 3D, construcción de placa de circuito, programación del circuito a través del programador de microcontroladores, ensamblaje de los componentes en un LPA final, programación de la tarjeta de memoria a través del software IRIS y calibración del dispositivo terminado. Para una explicación más completa, consulte las referencias anteriores.
   1. Imprima las partes 3D como se describe en Gerhardt et al. (2016 y 2019)^31,46.
   2. Ensamble la placa de circuito como se describe en Gerhardt et al. (2016 y 2019)^31,46.
   3. Agregue el firmware al circuito LPA ensamblado utilizando el programador de microcontroladores como se describe en Gerhardt et al. (2016 y 2019)^31,46.
   4. Combine las piezas impresas en 3D y la placa de circuito ensamblada como se describe en Gerhardt et al. (2016 y 2019)^31,46. Esto incluye tomar la placa de montaje, la placa de circuito, el espaciador LED (diodos emisores de luz), el adaptador de placa, una placa de 24 pocillos, una tapa de placa, pernos de montaje y tuercas de ala y componentes de apilamiento como se muestra en el video filmado y la Figura 2.
   5. Para la programación y calibración de la tarjeta de memoria del dispositivo, siga los pasos que se describen a continuación.
2. Utilice el software IRIS disponible en el sitio web de Tabor ^Lab47 para programar una tarjeta SD para el Light Plate Apparatus (LPA)³¹ y explorar las condiciones de luz apropiadas necesarias para comenzar un experimento optogenético.
   NOTA: El software IRIS es una aplicación basada en la web para programar el hardware electrónico optogenético, conocido como LPA, desarrollado por el Tabor Lab. El software permite la programación de valores relativos de IRIS que controlan los diodos emisores de luz (LED) individuales en cada pozo del hardware LPA.
3. Elija la opción desplegable LPA (4 x 6), seguida de hacer clic en el enfoque de iluminación apropiado (estado estacionario, dinámico, avanzado).
   NOTA: Para este manuscrito, todos los ensayos se centrarán en los ejemplos de estado estacionario. Sin embargo, los ejemplos de configuración avanzada se pueden utilizar para la duración del pulso y los regímenes del ciclo de trabajo.
4. Elija si los LED superiores o inferiores se iluminarán introduciendo valores en las celdas correspondientes a los pocillos de la placa. Para los LPA utilizados en este trabajo, se utilizaron LED azules colocados en la posición superior en todos los experimentos. Cada LED, una vez programado, puede proporcionar una exposición continua a la luz con una intensidad de luz constante. El software IRIS permite 4096 niveles de intensidad que se pueden programar.
5. Una vez que se elijan las ubicaciones de los LED, ingrese los valores de intensidad para el esquema experimental deseado. Por ejemplo, introduzca 8 intensidades de luz diferentes (o duraciones de pulso o ciclos de trabajo) con tres réplicas técnicas por placa (Tabla 2). G.s. se refiere a las unidades de escala de grises: los valores de medición del nivel de intensidad de luz utilizados para la programación LPA en el software IRIS.
   1. Al diseñar archivos experimentales IRIS, tenga en cuenta los efectos de borde de los pozos adyacentes en el dispositivo LPA, la toxicidad de la luz por el aumento de las intensidades de exposición a la luz azul y la determinación del tipo de dosis-respuesta deseada (por ejemplo, monótona vs. no monótona).
   2. Si los usuarios programan células en el LPA en orden ascendente / descendente de un parámetro de luz particular (por ejemplo, intensidad), los pozos pueden producir efectos de borde de diafonía ligera o incluso calor que pueden influir en los pozos adyacentes. Esto puede influir inadvertidamente en el resultado de los resultados medidos cuando se completan los experimentos. Para aliviar esto, los usuarios pueden implementar una matriz de aleatorización en el software IRIS para codificar las ubicaciones de los pozos, minimizando los efectos de borde. Un ejemplo se describe en los resultados representativos a continuación (Figura 4A-B).
   3. Además, se ha encontrado que las intensidades más altas de luz azul interfieren con el crecimiento celular y la ^viabilidad48. Por lo tanto, para mitigar la toxicidad de la luz, es importante producir una curva de respuesta de intensidad de luz, duración del pulso o ciclo de trabajo dependiendo de la modalidad que se esté investigando.
      1. Por ejemplo, programe 8 valores de intensidad de luz con tres réplicas por placa de 24 pocillos, con un rango de sin luz a una intensidad máxima del LPA. Luego, ejecute estas muestras en un citómetro de flujo con una puerta SSC-FSC o una tinción viva como el yoduro de propidio para cuantificar la supervivencia de las células de la población (células vivas en comparación con los eventos totales, incluidas las células muertas / desechos celulares) en cada valor de luz.
      2. Luego, determine la cantidad ideal de supervivencia de la población para la configuración experimental, ya que cualquier estímulo puede afectar negativamente la proliferación, la expresión génica o la supervivencia (por ejemplo, establecer una supervivencia celular del 80% como una compensación adecuada). Por ejemplo, en este trabajo, una vez calibrado, la intensidad no superó los 3000 g.s. unidades (~3/4 de la intensidad máxima del dispositivo LPA). Un ejemplo de esto se describe en los resultados representativos a continuación.
   4. Además de restringir los valores de luz debido a la toxicidad, los usuarios pueden desear restringir los valores de luz para caracterizar una parte particular de la dosis-respuesta, como el rango de la respuesta monótona.
      1. Para lograr esto, inicialmente escanee una amplia gama de intensidades de luz, duraciones de pulsos o ciclos de trabajo dependiendo de la modalidad que se analice al determinar la dosis-respuesta deseada (Tabla 2) para reducir el régimen de luz de interés, por ejemplo, donde la expresión génica se correlaciona positivamente con el aumento de los valores de luz para una dosis-respuesta monotónica.
      2. Para determinar el rango de luz de interés, programe un solo LPA con hasta 24 pocillos de diferente intensidad / duración del pulso / ciclo de trabajo / etc. o más pozos (por ejemplo, 48, 72, 96, etc.) dependiendo de si se calibran múltiples LPA para entregar cantidades de luz equivalentes y continuar con el trabajo de cultivo celular o los ensayos que se describen a continuación. Por lo tanto, iniciar la caracterización de un sistema optogenético con un amplio rango de dosis de estímulos de luz para determinar el intervalo de rango que da la expresión génica deseada y posteriormente realizar experimentos en ese rango de dosis refinado.
      3. Por ejemplo, en este trabajo, una vez que se determinaron 3000 g.s. unidades como umbral para la intensidad de la luz tóxica; este umbral se utilizó como límite superior de la luz para los ensayos descritos a continuación (por ejemplo, inmunofluorescencia).
         NOTA: Los pasos anteriores son independientes de la calibración óptica del LPA y se refieren a una calibración a nivel molecular para cada sistema optogenético.
6. Una vez que se programan los valores de intensidad de luz adecuados en IRIS, inserte una tarjeta de memoria con la toma USB 3.0 en el LPA para descargar y transferir los archivos.
7. Si la calibración del LPA es ^completa31, proceda al trabajo de cultivo celular para el inicio del ensayo de inducción de luz. Si no se ha realizado la calibración, calibre el LPA utilizando un método de análisis de imagen (pasos 3.7.1-3.7.3) una vez que el LPA esté programado con el programador del microcontrolador.
   1. Programe brevemente el LPA para que tenga el mismo nivel de IRIS descrito por Gerhardt et al. (2016)³¹.
      NOTA: Para la calibración, el LPA fue programado para tener un valor de 2000 g.s.
   2. Una vez que el dispositivo está programado con la tarjeta de memoria y se presiona el botón de reinicio (botón físico en el LPA), adquiera una imagen de todo el dispositivo (por ejemplo, el generador de imágenes de la estación de gel, el dispositivo del escáner, etc.). Para la calibración, adquiera dos imágenes con el dispositivo girado 180°.
   3. Luego, use un software de código abierto diseñado por Gerhardt et al. (2016)³¹ para mostrar la variabilidad en la intensidad del LED en la placa LPA y calcular los valores de compensación del LED para que la intensidad sea igual en todos los pozos. Un ejemplo de esto se describe en los resultados representados a continuación (Figura 3). Una vez completada esta calibración, proceda al trabajo de cultivo celular para iniciar el ensayo de inducción de luz.
8. Obtener matraces de células monoclonales modificadas de la sección anterior para investigar los efectos de la inducción de luz en la expresión génica.
9. Retire los medios viejos del matraz.
10. Agregue 1 ml de tripsina a las células e incube durante 5 min.
11. Después de 5 min, neutralice la tripsina agregando 4 ml de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM u otro medio deseado) complementado con los productos químicos necesarios (este trabajo utilizó 50 μg / ml de higromicina, solución de penicilina / estreptomicina al 1%, suero bovino fetal al 10%, FBS).
12. Agregue ~ 75,000 células por pozo en una placa negra de 24 pocillos en un volumen total de 500 μL. El número de células sembradas puede variar dependiendo de la duración del experimento deseado y del tipo de célula utilizada.
    NOTA: Además, tenga en cuenta que la densidad de siembra celular afecta el mantenimiento del cultivo y potencialmente la duración del experimento. Comenzar con un número menor de células por pozo asegura una mayor duración del tiempo antes de que el cultivo alcance la confluencia. Además, el tipo de componentes optogenéticos integrados en los circuitos genéticos de interés influirá en cuándo la expresión génica alcanza un estado estacionario y, por lo tanto, afectará la duración de los experimentos. Otros factores que se pueden considerar son las tasas de crecimiento específicas de la línea celular, la composición de los medios y los efectos de crecimiento condicional (es decir, la luz).
13. Después del emplatado, coloque las células en una incubadora humidificada con 5% de _CO2 para que se asienten durante 2-6 h.
14. Después de la incubación, transfiera las células a una campana de cultivo de tejidos, retire la tapa de plástico y agregue una tira de lámina adhesiva a la parte superior de la placa (Figura 2D). Este paso permite una transferencia de luz mínima entre pozos, ya que la parte superior y los lados de los pozos están recubiertos, y la luz ahora solo puede ingresar desde la parte inferior del pozo donde se coloca el LED.
15. Coloque la placa en las partes 3D instaladas del LPA. Luego, cubra la placa con la tapa LPA impresa en 3D, que se ajusta sobre los tornillos del dispositivo en cada esquina.
16. Conecte el dispositivo a la fuente de alimentación y presione el botón de reinicio en el dispositivo LPA para asegurarse de que se aplica la configuración actualizada del experimento LPA.
17. Incubar las células dentro del sistema experimental durante un período de tiempo adecuado, dependiendo de la densidad de siembra original, la velocidad de crecimiento específica de la línea celular y las condiciones de crecimiento. En este ejemplo, las líneas celulares fueron inducidas durante 3 días de forma continua para que la expresión génica alcanzara un estado estacionario. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que muchos sistemas optogenéticos (por ejemplo, VVD) pueden alcanzar la expresión génica en estado estacionario mucho antes (por ejemplo, 24 h) y, por lo tanto, los tiempos de inducción experimental pueden reducirse o prolongarse según sea necesario.
18. Al final del experimento de inducción de luz, utilice las muestras para cualquiera de los siguientes cuatro ensayos para caracterizar las líneas celulares diseñadas (secciones 4-7).

4. Microscopía de fluorescencia de células modificadas por la luz

1. 24-72 h después de la inducción, retire las células en el LPA de la incubadora y colóquelas en una campana de cultivo de tejidos.
2. Retire la tira de papel de aluminio y deje que la placa repose durante 1-2 minutos. Esto evita que se forme condensación en la tapa de plástico, si se coloca inmediatamente en la placa.
3. Después de 1-2 minutos de estar sentado, vuelva a colocar la tapa de plástico original en el plato.
4. Tome imágenes de las células con el microscopio de contraste de fase o fluorescencia apropiado.
5. Dependiendo del instrumento, ajuste el tiempo de exposición, la intensidad de la fuente de luz y la ganancia para mostrar las celdas de ingeniería. En este experimento, se aplicaron los siguientes parámetros: 50 ms para el tiempo de exposición de la fuente de luz FITC / GFP (proteína fluorescente verde) y 1-5 ms para el tiempo de exposición al contraste de fase al 100% de intensidad para cada uno.
   NOTA: Cabe señalar que los tiempos óptimos de exposición, los niveles de ganancia y las intensidades de la fuente de luz a menudo se derivan empíricamente de la experiencia de este trabajo para minimizar la sobresaturación en el informador de fluorescencia, minimizar el daño celular y capturar imágenes adecuadas para el análisis cualitativo y cuantitativo. Al determinar los niveles de cada uno de estos parámetros, los aspectos a tener en cuenta incluyen maximizar las relaciones señal-ruido, minimizar la fototoxicidad, minimizar la sobresaturación de las señales de fluorescencia y aumentar la capacidad de amplificar las señales de fluorescencia débiles.
   1. Optimizar estos parámetros de forma groseramente ad-hoc; sin embargo, los valores experimentales previos (por ejemplo, la intensidad de la fuente de luz que causa la sobresaturación del informador de fluorescencia) pueden guiar futuros entornos experimentales cuando corresponda. Por ejemplo, los ajustes de ganancia, los tiempos de exposición y los valores iniciales de intensidad de luz de un circuito (LITer1.0) o configuración experimental (por ejemplo, intensidad de luz) se pueden usar como punto de partida cuando se mueve a un circuito genético similar pero diferente (LITer2.0)¹¹ o una modalidad de luz diferente (por ejemplo, ciclo de trabajo ligero).
6. Optimice las imágenes de placas mediante una plantilla de coordenadas programada en el software de microscopía que permite que todo el tamaño de la placa (por ejemplo, 24 pozos) tenga una adquisición de imágenes automatizada desde múltiples ubicaciones de imágenes por pozo.

5. Citometría de flujo de células modificadas inducidas por la luz

1. 24-72 h después de la inducción, retire las células del LPA en la incubadora o del microscopio después de la toma de imágenes y colóquelas en la campana de cultivo de tejidos.
2. Si se retira directamente del LPA, retire la tira de papel de aluminio y deje que la placa repose durante uno o dos minutos.
3. Aspire los medios de cada pozo (de toda la placa de 24 pocillos si se utilizan todos los pozos).
4. Agregue 100 μL de tripsina al 0.25% a cada pozo, cubra la placa con una tapa de plástico y colóquela nuevamente en la incubadora.
5. Deje las células sin molestar en la incubadora durante 5 minutos.
6. Después de 5 minutos, retire la placa y devuélvala a la campana de cultivo de tejidos.
7. Neutralizar cada pozo tripsinizado con 400 μL de DMEM.
8. Etiquete un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml con colador celular (o un tubo de citometría de flujo apropiado que se pueda filtrar para eliminar grandes grupos de células no completamente tripsinizadas) con un nombre correspondiente a cada pozo.
9. Utilice una pipeta P1000 para pipetear el contenido de cada pozo hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces para romper los grupos celulares y crear muestras unicelulares para la citometría de ^flujo49.
10. Transfiera todo el contenido de cada pocillo (~500 μL) a los tubos etiquetados con el colador.
11. Lleve las células al instrumento de citometría de flujo apropiado con láseres de las longitudes de onda correctas (puede traer tubos con células dentro o fuera del hielo).
    NOTA: El citómetro de flujo utilizado en este trabajo era parte de una instalación central ubicada en el hospital universitario.
12. Cree una compuerta de dispersión hacia adelante y hacia el lado (FSC y SSC, respectivamente) para capturar las células individuales del tamaño y la granularidad apropiados para excluir desechos y grupos celulares en el software de citometría de flujo.
13. Una vez que se establece la puerta, capture aproximadamente 10,000 celdas con la puerta apropiada. Ajuste este número dependiendo de la cantidad de datos celulares que los usuarios estén buscando. Repita para cada tubo que contenga las células del experimento.
14. Una vez que se complete el experimento, importe los datos al software de datos de citometría de flujo disponible para su análisis.
15. Cree una puerta FSC-SSC (como antes durante la adquisición) y aplíquela a cada lote de datos experimentales. Un pozo de referencia de la población celular no inducida se utiliza para crear esta puerta en este manuscrito, pero existen otras métricas para la creación de puertas, como las puertas basadas en la densidad.
16. Con las condiciones experimentales cerradas con una puerta FSC-SSC, grafique los datos de citometría de flujo como histogramas o represente de otras maneras para ilustrar los patrones de expresión obtenidos. En este experimento, la fluorescencia fue capturada por los canales GFP/FITC o PE/TexasRed.

6. Extracción de ARN y PCR cuantitativa de los componentes del circuito génico

1. 24-72 h después de la inducción, retire las células del LPA en la incubadora o del microscopio después de la toma de imágenes y colóquelas en la campana de cultivo de tejidos.
2. Si se retira directamente del LPA, retire la tira de papel de aluminio y deje que la placa repose durante uno o dos minutos.
3. Aspire los medios de cada pozo (de toda la placa de 24 pocillos si se utilizan todos los pozos).
4. Proceda a extraer el ARN de las células utilizando el kit de extracción de ARN apropiado.
5. Una vez completada la extracción de ARN, realizar una reacción de transcripción inversa de cada muestra (Tabla 3).
6. Además, realizar PCR cuantitativa de cada muestra (Tabla 4). Utilice una ADN polimerasa y un protocolo asociado para configurar reacciones de PCR. Para este paso, configure una reacción multiplexada con un gen de limpieza y un gen de interés, o cree reacciones separadas. En este ejemplo, se sondearon los niveles de GFP, KRAS y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Después de completar el experimento qRT-PCR, proceda con el análisis a través del software disponible para ilustrar el cambio de pliegue del circuito génico a nivel de ARN.

7. Inmunofluorescencia de los componentes del circuito genético

1. Use un baño de hielo o congelador para enfriar el metanol.
2. 24-72 h después de la inducción, retire las células del LPA en la incubadora o del microscopio después de la toma de imágenes y colóquelas en la campana de cultivo de tejidos.
3. Si se retira directamente del LPA, retire la tira de lámina y deje que la placa repose durante 1-2 minutos.
4. Aspire los medios de cada pozo (de toda la placa de 24 pocillos si se utilizan todos los pozos).
5. Agregue 100 μL de tripsina al 0.25% a cada pozo, cubra la placa con una tapa de plástico y colóquela nuevamente en la incubadora.
6. Deje las células sin molestar en la incubadora durante 5 minutos.
7. Después de 5 minutos, retire la placa y devuélvala a la campana de cultivo de tejidos.
8. Neutralizar cada pozo tripsinizado con 400 μL de DMEM.
9. Etiquete los tubos de minicentrífuga con los nombres correspondientes a cada pozo.
10. Use una pipeta P1000 y pipetee el contenido de cada pozo hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces para romper los grupos de celdas.
11. Transfiera todo el contenido de cada pocillo (~500 μL) a los tubos etiquetados.
12. Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g.
13. Cuando esté completo, deseche el sobrenadante y mueva las muestras a una campana de humos químicos.
14. Resuspender las células (use una pipeta P1000 y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces en cada tubo para romper los grupos celulares) en 750-1000 μL de paraformaldehído al 4% (diluido en solución salina tamponada con fosfato, PBS).
15. Deje que las celdas permanezcan durante 15 minutos a temperatura ambiente.
16. Después de la incubación, agregue 750-1000 μL de PBS. Pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces.
17. Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g.
18. Cuando esté completo, deseche el sobrenadante y mueva las muestras a una campana de humos químicos.
19. Resuspender las células (use una pipeta P1000 y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces en cada tubo para romper los grupos de celdas) en 750-1000 μL de metanol helado.
20. Deje que las celdas permanezcan durante 30 minutos en hielo o en un congelador de -20 °C.
21. Después de la incubación, agregue 750-1000 μL de PBS. Pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces.
22. Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g.
23. Cuando esté completo, deseche el sobrenadante y mueva las muestras a una campana de humos químicos.
24. Dependiendo del tipo de anticuerpos utilizados, modifique el protocolo a partir de este momento. Siga los pasos 7.24.1-7.24.14 o 7.24.15-7.24.22.
    1. Si usa un anticuerpo primario y secundario, resuspenda las células usando una pipeta P1000 / P200 y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces en cada tubo para romper los grupos celulares en 100 μL de anticuerpo primario. En este caso, se realizó una dilución de 1:800 para los anticuerpos de stock, incluido el anticuerpo KRAS o el anticuerpo ERK, y se dejó reposar durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos se diluyeron en un tampón de incubación hecho de 1x PBS con 0,5 g de BSA.
       NOTA: Determinar empíricamente la dilución exacta del anticuerpo mediante la creación de una curva estándar de diluciones de anticuerpos frente al antígeno de interés.
    2. Después de agregar anticuerpos, cubra los tubos con una lámina para evitar efectos de luz en los anticuerpos marcados.
    3. Después de la incubación, agregue 750-1000 μL del tampón de incubación. Pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces.
    4. Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g.
    5. Cuando esté completo, deseche el sobrenadante y mueva las muestras a una campana de humos químicos.
    6. Resuspender las células usando una pipeta P1000/P200 y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces en cada tubo para romper los grupos celulares en 100 μL de anticuerpo secundario. En este caso, las células se resuspendieron en un anticuerpo secundario de 100 μL a una dilución de 1:800 para el anticuerpo KRAS o 1:2000 para el anticuerpo ERK y se dejaron reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Similar a los anticuerpos primarios, diluya los anticuerpos secundarios en el tampón de incubación como se describió anteriormente. Determinar las diluciones de los anticuerpos secundarios basándose en los hallazgos empíricos de una curva estándar.
    7. Después de agregar anticuerpos, cubra los tubos con una lámina para evitar efectos de luz en los anticuerpos marcados.
    8. Después de la incubación, agregue 750-1000 μL del tampón de incubación. Pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces.
    9. Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g.
    10. Cuando esté completo, deseche el sobrenadante y mueva las muestras a una campana de humos químicos.
    11. Resuspender las células usando una pipeta P1000 y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces en cada tubo para romper los grupos de células en 500 μL de PBS.
    12. Transfiera todo el contenido de cada tubo (~500 μL) a los tubos etiquetados con coladores.
    13. Llevar las células a instrumentos de citometría de flujo apropiados con láseres de las longitudes de onda correctas (puede traer tubos con células dentro o fuera del hielo).
        NOTA: Cabe señalar que tener varios controles es importante para progresar con la medición de la citometría de flujo y el análisis de la expresión génica celular modificada. Por ejemplo, tener células completamente no teñidas, células teñidas con anticuerpo primario solo y células teñidas con anticuerpo secundario solo puede ser útil para comparar los resultados con las señales de fondo de los anticuerpos.
    14. A continuación, continúe con el análisis como se describe en la sección 5.
    15. Si usa solo un anticuerpo primario, resuspenda las células usando una pipeta P1000 / P200 y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces en cada tubo para romper los grupos celulares en 100 μL de anticuerpo primario marcado. Determinar la dilución adecuada de anticuerpos e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Determinar empíricamente la dilución de anticuerpos a partir de la curva estándar.
    16. Después de agregar anticuerpos, cubra los tubos con una lámina para evitar efectos de luz en los anticuerpos marcados.
    17. Después de la incubación, agregue 750-1000 μL del tampón de incubación. Pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces.
    18. Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g.
    19. Resuspender las células usando una pipeta P1000 y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces en cada tubo para romper los grupos de células en 500 μL de PBS.
    20. Transfiera todo el contenido de cada tubo (~500 μL) a tubos etiquetados con coladores.
    21. Llevar las células a instrumentos de citometría de flujo apropiados con láseres de las longitudes de onda correctas (puede traer tubos con células dentro o fuera del hielo).
        NOTA: Cabe señalar que tener varios controles es importante para progresar con la medición de la citometría de flujo y el análisis de la expresión génica celular modificada. Tener células completamente no teñidas y células teñidas con anticuerpos primarios solos es útil para comparar los resultados con las señales de fondo de los anticuerpos.
    22. A partir de este punto, proceda con el análisis descrito en la sección 5.

Representative Results

El ensamblaje de circuitos genéticos y la generación de líneas celulares estables dentro de este artículo se basaron en células HEK-293 comerciales modificadas que contienen un sitio FRT estable único y transcripcionalmente activo (Figura 1). Los circuitos genéticos se construyeron en vectores que tenían sitios FRT dentro del plásmido, lo que permitió la integración Flp-FRT en el genoma celular HEK-293. Este enfoque no se limita a las células Flp-In, ya que los sitios FRT se pueden agregar a cualquier línea celular de interés en cualquier parte del genoma utilizando tecnología de edición de ADN como CRISPR / ^Cas950.

Una vez construidas y validadas las líneas celulares adecuadas para la correcta inserción, se eligieron los software LPA e IRIS como protocolo estandarizado para la inducción lumínica de la expresión ^génica31,51. El sistema LPA permite programar 24 pocillos para la inducción de células de mamíferos en múltiples condiciones experimentales dependiendo de la intensidad de la luz, la duración del pulso y el ciclo de trabajo (Figura 2). Dentro de este artículo, se priorizó la intensidad de la luz espacialmente uniforme, la duración del pulso y el ciclo de trabajo. Sin embargo, los investigadores pueden usar el software IRIS y el LPA para una programación más avanzada de patrones de ondas de luz temporales.

Un aspecto crucial sobre el LPA que debe abordarse antes de comenzar los experimentos es la calibración óptica que se puede realizar para uno o varios dispositivos. El método de análisis de imágenes descrito ^{anteriormente31} utilizado para la calibración requiere una imagen de todo el LPA con todos los LED de interés encendidos, que se pueden adquirir de una variedad de ^fuentes52, incluido un generador de imágenes en gel. Aquí, se utilizó un escáner de computadora para la adquisición de imágenes (Figura 3A). Una vez que se adquirió la imagen, se utilizó el software de código abierto creado por Gerhardt et al. (2016)³¹ para calcular los valores de compensación para cada LED para garantizar que cada LPA emita la misma intensidad a un valor de escala de grises dado. El software resta la señal de fondo, coloca el umbral de la imagen en una categoría binaria y calcula la intensidad de píxeles (Figura 3B). A partir de la calibración, se encontró una variación mínima entre los LED, con un CV de 0,04 entre 96 pozos (o 4 placas calibradas, Figura 3C). Por último, utilizando el software de calibración se demostró la variación del LED por ubicación (Figura 3D) y se creó un ajuste en escala de grises (Figura 3E) para que cada LED se normalice a la misma intensidad.

Además de la calibración, otros aspectos importantes del uso del LPA incluyen la integración de varios controles en la tubería experimental que pueden minimizar los errores sistémicos al limitar las variables de confusión, como los efectos de toxicidad de la luz y las limitaciones de diseño basadas en materiales experimentales. Por ejemplo, la Figura 4 ilustra dos configuraciones diferentes para programar diferentes intensidades de luz en los pozos LPA. El primer subpanel de la Figura 4A muestra una organización ascendente de la intensidad de la luz. Esto puede facilitar la programación y el análisis de datos, pero puede producir efectos de borde donde la fila inferior del LPA tiene la mayor intensidad de luz y puede causar calor no deseado e inducción de luz de pozos cercanos. Del mismo modo, en el segundo subpanel de la Figura 4A, se ha aplicado una matriz de aleatorización al software IRIS, creando varias intensidades de luz en posiciones aleatorias. Esto puede minimizar las influencias sistémicas de los efectos de borde. Se crea una matriz descodificada (Figura 4B) con el software IRIS, que luego se puede utilizar para determinar las condiciones experimentales después de la finalización del experimento y durante el análisis. Al igual que la aleatorización de los pozos, los usuarios también deben ser conscientes de los efectos de toxicidad de la luz que pueden ocurrir (luz azul dentro de este trabajo). En la Figura 4C, se muestran dos intensidades de luz diferentes utilizadas para la inducción de circuitos genéticos con la misma puerta FSC-SSC basada en la población no inducida de células modificadas. Como tal, los usuarios deben realizar una dosis-respuesta en la modalidad de luz de interés (por ejemplo, pulso, ciclo de trabajo, etc.) para determinar los efectos de toxicidad lumínica que pueden ocurrir en el extremo superior de la exposición (Figura 4D). Aquí, el aumento de los niveles de luz azul causó desechos celulares dependientes de la dosis, células muertas y grupos en comparación con las células no estimuladas. Como tal, la intensidad de luz continua se restringió a alrededor de 3/4 de la intensidad máxima de LPA (~ 3000 g.s. unidades).

Una vez que se estableció el equipo adecuado, la expresión génica se indujo en circuitos de genes LITer diseñados a través de microscopía de fluorescencia (Figura 5). Las células fueron inducidas a diferentes duraciones de pulso de luz en el LPA, lo que dio una dosis-respuesta ligera de la expresión génica a nivel de la población. Las células dentro de este trabajo se tomaron imágenes para la expresión de GFP utilizando 50 ms para el tiempo de exposición de la fuente de luz FITC / GFP y para imágenes de campo brillante utilizando 1-5 ms para el tiempo de exposición de contraste de fase. Dada la robustez de este protocolo de ingeniería de líneas celulares, se podría utilizar cualquier marcador de fluorescencia en lugar de GFP. Las células pueden ser inducidas con múltiples regímenes de luz y producen una amplia gama de respuestas (Figura 5). Este último es beneficioso para controlar aún más la expresión de genes funcionales (por ejemplo, el oncogén KRAS (G12V) en el trabajo ^original53).

Inmediatamente después de la microscopía de fluorescencia, las células podrían analizarse en una variedad de protocolos experimentales, incluida la citometría de flujo, la qRT-PCR y la inmunofluorescencia. En este trabajo, la citometría de flujo se realizó como primer procedimiento de validación y se llevó a cabo siguiendo los métodos descritos anteriormente (Figura 6). De manera similar a la microscopía, las células se indujeron a diferentes valores de longitud de pulso y mostraron una dosis-respuesta de la expresión génica de más de cuatro veces el cambio de los estados no inducidos a nivel de la población (Figura 6A-B). Del mismo modo, la reducción del ruido de expresión génica se puede mostrar comparando varios valores de intensidad de luz (Figura 6C-D) para el sistema LITer versus un sistema de regulación positiva (sin retroalimentación) como el VVD / ^LightOn54. Al comparar el LITer con el sistema VVD, la retroalimentación negativa logra una reducción del ruido de expresión génica de más de cinco veces. Las mismas células preinducidas fotografiadas en microscopía también podrían analizarse a través de qRT-PCR (Figura 7). De manera similar a la citometría de flujo, las células LITer diseñadas podrían expresar los niveles de ARN de una manera sensible a la dosis (inducción de más de 10 veces a partir de estados no inducidos), coincidiendo con la dosis-respuesta de los niveles de proteína cuantificados por la expresión de GFP en la citometría de flujo. La microscopía de fluorescencia y los datos de citometría de flujo mencionados se pueden calibrar utilizando células no fluorescentes, células fluorescentes que expresan constitutivamente y perlas fluorescentes de validación de 6-8 picos (por ejemplo, verdes de canal FL1, perlas fluorescentes). Cada uno de estos componentes puede permitir la normalización de la expresión génica en un solo experimento. Sin embargo, estos factores también pueden permitir la normalización de circuitos y células modificadas a través de diferentes placas experimentales, condiciones experimentales y días para permitir la comparación y estandarización de los datos de expresión génica.

Por último, los circuitos del gen LITer pueden diseñarse para expresar genes funcionales, como el KRAS (G12V, Figura 8). La versatilidad de esta tubería permite a los usuarios utilizar la arquitectura LITer con ingeniería celular para cualquier gen funcional de interés, posiblemente incorporando arquitecturas adicionales como la retroalimentación positiva. El LITer mostró cantidades crecientes de luz azul que resultaron en un aumento de los niveles de la salida del circuito génico (niveles de proteína KRAS (G12V)) y, en consecuencia, niveles de ERK fosforilado, los cuales se pueden cuantificar a través de ensayos de inmunofluorescencia.

Fragmento	Proporción	Tamaño (bp)	Concentración en peso del fragmento de ADN (ng/μL)	Concentración molar del fragmento de ADN (fmol/μL)	Volumen (μL)	Masa molar de ADN resultante (fmol)
Fragmento del vector madre 1	1	3414.00	18.20	8.63	4.09	35.29
Fragmento del vector madre 2	1	4642.00	18.10	6.31	5.59	35.29
Gen de interés	1	549.00	37.90	111.70	0.32	35.29
Total					10.00	105.87

Tabla 1: Cálculo de la mezcla maestra de reacción de ensamblaje de ADN (paso 1.13). Las columnas 2 y 3 se basan en el tamaño de los fragmentos de ADN ensamblados y la concentración de estos fragmentos después de la amplificación por PCR y la extracción en gel de agarosa (paso 1.11). La celda inferior de la ^4ª columna (volumen total de reacción) se puede modificar; sin embargo, se recomienda el volumen indicado. Las celdas sin sombra se generan automáticamente.

0	100	200	400	500	750
1500	3000	0	100	200	400
500	750	1500	3000	0	100
200	400	500	750	1500	3000

Tabla 2: Programación IRIS de intensidades de luz (g.s.) para el experimento de inducción de luz en una placa de 24 pocillos con tres réplicas (paso 3.4). Distribución de intensidades de luz que van de 0 a 3000 g.s. G.s.-unidades de escala de grises. Esto puede ser aleatorizado por el software IRIS según sea necesario.

	Ejemplo 1	Ejemplo 2	Ejemplo 3
Volumen de mezcla maestra de transcriptasa inversa (μL)	4.00	4.00	4.00
Plantilla de ARN (1000 ng) Volumen (μL)	2.00	3.00	4.00
NF-H20 Volumen (μL)	14.00	13.00	12.00
Volumen total (μL)	20.00	20.00	20.00

Tabla 3: Cálculo de la mezcla maestra de transcripción inversa (paso 6.5). El volumen total recomendado de reacción es de 20 μL, y sus componentes son la mezcla maestra de enzimas de transcriptasa inversa (aquí: 5x), plantilla de ARN y agua libre de nucleasas. En este ejemplo, las concentraciones de ARN de las muestras 1, 2 y 3 son 500, 333 y 250 ng/μL, respectivamente.

	Ejemplo 1	Ejemplo 2	Muestra 1 y 2 multiplexada
Volumen de la sonda GFP (μL)	1	-----	1
Volumen de la sonda GAPDH (μL)	------	1	1
Volumen de mezcla maestra de ADN polimerasa (μL)	10	10	10
cDNA (100 ng) Volumen (μL)	2	2	2
NF-H20 Volumen (μL)	7	7	7
Volumen total (μL)	20	20	20

Tabla 4: Cálculo cuantitativo de la mezcla maestra de PCR (paso 6.6). El volumen total recomendado de reacción es de 20 μL y sus componentes son la mezcla maestra de enzimas ADN polimerasa (aquí: 2x), sondas GFP y/o GAPDH, aDNc (100 ng en total) y agua libre de nucleasa (_NF-H20).

Figura 1: Diseño de circuitos e ingeniería de celdas. (A) Herramientas de ingeniería celular, incluido el circuito de genes sintéticos LITer con sitios de integración FRT, la enzima recombinasa (Flp recombinase) para la integración de circuitos, el fármaco utilizado para la selección de clones genéticos apropiados y la línea celular de interés utilizada para crear líneas celulares de mamíferos optogenéticas deseadas. (B) Los sistemas genéticos de ingeniería pueden integrarse en un sitio específico de FRT que contiene locus dentro del genoma humano. Estos loci genómicos pueden expresar resistencia específica a los antibióticos o genes reporteros fluorescentes para la selección de casetes genéticos correctamente integrados. La integración del circuito genético se puede iniciar con el uso de recombinasas que reconocen sitios específicos dentro del casete genético original. Esto introduce un nuevo gen de selección de resistencia a los medicamentos que puede garantizar la generación de células correctamente modificadas con el circuito genético deseado. En la parte inferior del panel B se encuentra la arquitectura del circuito génico para el sistema de retroalimentación negativa optogenética, LITer2.0. Este circuito está compuesto por una proteína TetR auto-reprimida fusionada con un dominio de detección de voltaje de luz-oxígeno (LOV2), una secuencia enlazadora P2A que permite una transcripción multicistrónica, y GFP. Cuando se aplica luz azul, la secuencia TIP se abre desde el dominio LOV2, inhibiendo la proteína TetR y permitiendo una mayor transcripción sensible a la dosis tanto de TetR como del informador GFP. La proteína TetR inhibida es incapaz de unirse y reprimirse en el sitio operador del ADN, aumentando así la transcripción. Esta retroalimentación negativa mantiene bajo el ruido de expresión génica y permite un cambio alto de la expresión génica. FRT - objetivo de reconocimiento de volteo, HygR - resistencia a la higromicina, LacZ - β-galactosidasa, ZeoR - resistencia a la zeocina, T - TetR, proteína represora de tetraciclina, D2ir es un promotor basado en CMV con sitios TwtO, LOV2 es un dominio sensible a la luz-oxígeno-voltaje, TIP es un péptido inhibidor de tet que inhibe la proteína TetR. Esta cifra ha sido modificada a partir de Guinn y Balázsi (2020)⁵⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Programación experimental LPA. (A) Los experimentos se pueden programar utilizando las herramientas enumeradas en el sitio web del laboratorio ^Tabor47 con flexibilidad para la programación LPA en estado estacionario, dinámica o ^avanzada31. Además, los archivos electrónicos se pueden guardar para su uso futuro para réplicas técnicas o inducción experimental de líneas celulares alternativas. (B) Dispositivo LPA con componentes principales vistos desde la parte superior y lateral (C). (D) Imágenes de placas selladas con láminas para residir en LPA. LPA - Light Plate Apparatus, LED - diodo emisor de luz. Los elementos de esta figura han sido modificados a partir de Guinn (2019)¹¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Calibración del aparato de placas de luz. (A) Imagen representativa de LPA para LEDs ajustados a 2000 g.s. basados en el software IRIS. (B) Imagen del panel (A) con el fondo restado y el umbral utilizado para binarizar la imagen para calcular la intensidad de píxeles de cada LED. (C) Histograma de intensidades de píxeles (determinado por el análisis de imágenes de MATLAB) de 96 LED (4 placas LPA) establecidos en el mismo valor del software IRIS (por ejemplo, 2000 g.s.). La línea roja representa la intensidad media de píxeles LED, y CV en el panel representa el coeficiente de variación para los 96 pozos. (D) Mapa de calor que muestra las intensidades LED de la imagen LPA en el panel (A) normalizado al LED de máxima intensidad. (E) Mapa de calor de valor de calibración determinado para la imagen LPA en el panel (A) para crear una producción de igual intensidad para cada LED cuando se programa para el LPA. LPA - Light Plate Apparatus, LED - diodo emisor de luz, CV - coeficiente de variación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Aleatorización de LPA y efectos de toxicidad lumínica. (A) Imagen representativa de dos configuraciones programables de LPA LED establecidas de 25 a 4000 g.s, basadas en el software IRIS. Es más probable que la primera configuración permita que errores sistemáticos, como los efectos de borde del calor y la luz, se crucen (por ejemplo, la fila inferior del LPA que afecta a la ^2ª fila más baja). La segunda imagen aleatoriza la ubicación de las intensidades, minimizando así el error sistemático (sesgo) causado por los efectos de borde. (B) Matriz que muestra la ubicación de aleatorización para las intensidades de luz en el LPA que se muestra en el panel (A), que se puede utilizar para determinar los resultados dependientes de la intensidad de un experimento dado. (C) Datos de citometría de flujo para dos intensidades de luz diferentes (1250 y 4000 g.s.) durante 3 días de inducción a iluminación continua. La puerta negra se basa en células no inducidas. (D) Gráfico de barras que muestra datos de citometría de flujo como el panel (C) pero para una amplia gama de intensidades de luz. LPA - Light Plate Apparatus, FSC - dispersión hacia adelante, SSC - dispersión lateral, g.s. - valor de intensidad de luz medido en escala de grises. Las células ^LITer11 tuvieron una disminución sensible a la dosis en la supervivencia celular que fue estadísticamente significativa utilizando la prueba de cola ANOVA 1 con un valor p de 0,0022. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Imágenes de microscopía representativas de líneas celulares optogenéticas diseñadas. Las células fueron fotografiadas en un microscopio invertido con una cámara (14 bits) para adquirir imágenes de contraste de fase y fluorescencia. Las células se expusieron durante 5 ms para contraste de fase (Panel A, imagen representativa de campo brillante) y 50 ms para adquisición de GFP / FITC (Panel B) a una intensidad de fuente de luz del 100%. Las células se pueden visualizar en varios puntos de tiempo dependiendo de la adquisición de estado estacionario deseada o la respuesta dinámica, lo que lleva a un estado estacionario. Las células aquí representan una titulación de duración de pulso a intensidad fija (1000 g.s.) que va desde ninguna exposición a la luz hasta 3 días de exposición a la luz. La unidad g.s representa un valor de intensidad de luz medido en escala de grises. Esta cifra ha sido modificada a partir de Guinn (2019)¹¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Citometría de flujo de líneas celulares optogenéticas diseñadas. Las células se analizaron en un citómetro de flujo BD LSRFortessa, con aproximadamente 10,000 células recolectadas dentro de una puerta SSC-FSC (dispersión lateral de dispersión hacia adelante). Las células se analizaron con el software FCS Express. Se podrían generar histogramas o diagramas de dispersión para cuantificar la expresión del gen de interés (por ejemplo, GFP). (A) Células de ingeniería trazadas en ejes SSC-FSC para su cierre dentro de la línea negra. (B) Células LITer representativas inducidas con una duración variable de pulsos de luz a 1000 g.s. hasta 72 h de inducción, lo que ilustra la dosis-respuesta de la expresión génica. (C) Datos representativos de dosis-respuesta para la titulación de la intensidad de la luz comparando el circuito del gen LITer (sistema basado en TIP) versus el sistema VVD o ^LightOn40, que es un sistema de regulación positiva sin retroalimentación. (D) Histograma correspondiente al sistema VVD, que ilustra una distribución más amplia (y, por lo tanto, un mayor ruido de expresión génica) en comparación con el sistema LITer. CV es el coeficiente de variación, una métrica para el ruido de expresión génica. FSC - dispersión hacia adelante, SSC - dispersión lateral, FITC - isotiocianato de fluoresceína, g.s. - valor de intensidad de luz medido en escala de grises. Esta cifra ha sido modificada a partir de Guinn (2019)¹¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: PCR cuantitativa en tiempo real de líneas celulares optogenéticas diseñadas. Datos representativos que muestran que se pueden inducir y cuantificar múltiples niveles de expresión génica utilizando la luz como estímulo. La unidad Rq representa la cuantificación relativa del cambio de pliegue de expresión en comparación con el control. Las células ^LITer11 tuvieron un aumento sensible a la dosis en la expresión de ARN que fue estadísticamente significativo utilizando la prueba de cola ANOVA 1 con un valor p de 0,0352 y 0,0477 para los niveles de GFP y KRAS, respectivamente. Esta cifra ha sido modificada a partir de Guinn (2019)¹¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Inmunofluorescencia de líneas celulares optogenéticas modificadas. Datos representativos que muestran estimaciones a nivel de proteínas basadas en inmunofluorescencia. (A) Niveles de proteínas de kras (G12V) y (B) niveles de proteínas fosforiladas-ERK, que el circuito del gen LITer induce de acuerdo con el aumento de las cantidades de luz directa e indirectamente, respectivamente. Los datos que se muestran en las barras son valores medios, las barras de error son desviaciones estándar (n = 3). A.u. - unidades arbitrarias, g.s. - valor de intensidad de luz medido en escala de grises. Las células ^LITer11 tuvieron un aumento sensible a la dosis en los niveles de proteínas que fue estadísticamente significativo utilizando la prueba de cola ANOVA 1 con un valor p de 2.79E-04 y 0.016 para los niveles de KRAS y ERK fosforilado, respectivamente. Esta cifra ha sido modificada a partir de Guinn (2019)¹¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los lectores de este artículo pueden obtener información sobre los pasos vitales para caracterizar los circuitos genéticos optogenéticos (así como otros sistemas de expresión génica), incluidos 1) el diseño, la construcción y la validación de circuitos genéticos; 2) ingeniería celular para introducir circuitos genéticos en líneas celulares estables (por ejemplo, recombinación Flp-FRT); 3) inducción de las células diseñadas con una plataforma basada en la luz como el LPA; 4) caracterización inicial de ensayos de inducción de luz mediante microscopía de fluorescencia; y 5) caracterización final de la expresión génica con una variedad de ensayos, incluyendo citometría de flujo, PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) o ensayos de inmunofluorescencia.

Además, los métodos descritos anteriormente son altamente modulares para esencialmente cualquier arquitectura de circuito genético que exprese genes de interés, con las principales modificaciones potenciales del protocolo en el paso de construcción del circuito y los ensayos realizados. En el caso de la construcción de circuitos genéticos, la flexibilidad de la clonación molecular permite que cualquier gen de interés se intercambie o coexprese con un marcador de fluorescencia con modificaciones menores en el diseño de imprimación o los protocolos de ensamblaje. Además, mientras que los procedimientos descritos aquí se centran principalmente en un diseño de circuito génico NF para un control preciso (bajo en ruido) de la expresión génica, se pueden implementar otras arquitecturas como la regulación positiva o la retroalimentación positiva (PF) para lograr diferentes características, como el cambio de pliegue alto o el ruido de alta expresión génica, ^{respectivamente56,57} . El uso de una variedad de arquitecturas de circuitos genéticos (por ejemplo, PF, NF, etc.) puede permitir a los investigadores explorar diversas cuestiones biológicas, como los roles que desempeñan las magnitudes de nivel de proteínas y el ruido en la resistencia a los medicamentos o la metástasis58. Los protocolos enumerados aquí también se centran en varias formas de cuantificación de la expresión génica, pero cualquier número de ensayos funcionales (por ejemplo, motilidad celular, cicatrización de heridas, proliferación, etc.) se pueden agregar después de la adquisición de microscopía con poco o ningún efecto sobre los métodos anteriores. Esto es especialmente relevante para estudios unicelulares donde la optogenética puede utilizar la inducción espaciotemporal para estudiar comportamientos como la dinámica de expresión pulsátil59.

Complementando la modularidad del método, la solución de problemas es otra característica importante de cada protocolo principal. Para la construcción de circuitos, las principales diferencias residen en el diseño de imprimación específico del circuito apropiado, mientras que los métodos posteriores, como el ensamblaje y la amplificación de plásmidos a través del crecimiento bacteriano, están más estandarizados y generalmente incluyen sus propios procedimientos extensos de solución de problemas. La ingeniería celular se puede modificar con curvas de titulación de fármacos dependiendo de la línea celular utilizada. Además, si se utiliza una línea celular comercial, las guías de solución de problemas se pueden obtener directamente del fabricante de la línea celular. Además, los efectos de luz no deseados son importantes para cuantificar en las líneas celulares diseñadas. Por ejemplo, debido a los efectos fototóxicos de la luz de 470 nm, se debe crear una curva de intensidad de luz para investigar la inducción de muerte o daño en una población. Una vez que se prueba una variedad de valores de luz, los usuarios pueden crear una puerta FSC-SSC o utilizar un método como la tinción de yoduro de propidio para cuantificar las células muertas / dañadas y, por lo tanto, servir como una herramienta para determinar los rangos de luz apropiados para usar experimentalmente.

Para la solución de problemas de LPA, los LED pueden producir efectos de borde de luz y diafonía de calor con pozos adyacentes. Por ejemplo, los pozos de alta intensidad pueden causar cierta inducción en los pozos adyacentes si hay un sello inadecuado o un gran gradiente de calor / luz entre los pozos. Estos efectos pueden ser máximos si el LPA se programa en un orden particular (por ejemplo, ascendente / descendente) de un parámetro de luz. Para combatir esto, el software IRIS permite a los usuarios emplear una matriz de aleatorización para aleatorizar las intensidades del pozo y, por lo tanto, reducir el error sistemático. Para la solución de problemas de aspectos de la microscopía de fluorescencia, el tiempo de exposición, la configuración de ganancia (control de la sensibilidad de la cámara) y la intensidad de la fuente de luz son los principales parámetros que se pueden ajustar. Ajustar estos parámetros puede permitir una producción de imágenes óptima y una relación señal-ruido ideal, así como evitar la sobresaturación y la fototoxicidad.

Para la solución de problemas de citometría de flujo, los voltajes del tubo fotomultiplicador y la compuerta celular son los principales aspectos que se pueden ajustar. Ajustar estos parámetros puede permitir comparaciones ideales entre las condiciones experimentales y las muestras de control, la adquisición adecuada de señales para señales de fluorescencia débiles o fuertes y la exclusión de desechos celulares o poblaciones celulares no deseadas. Cabe señalar que los voltajes de citometría de flujo se mantienen idealmente constantes en todos los experimentos para permitir comparaciones adecuadas. Además, para los sistemas optogenéticos que requieren múltiples salidas de fluorescencia (por ejemplo, FITC y PE), los usuarios deberán ser conscientes de la compensación de fluorescencia dada la diafonía entre los fluoróforos. En tales escenarios, los controles son cruciales para determinar las señales de fluorescencia adecuadas. Los controles que serán necesarios para que los usuarios realicen incluyen perlas fluorescentes, células teñidas con el marcador de interés o células que expresan constitutivamente la proteína de fluorescencia que se puede utilizar para crear una matriz de compensación en el software de citometría de flujo de interés. Además, ya sea que usen un marcador de fluorescencia o más, todos los usuarios deben medir rutinariamente las señales de fluorescencia de cada marcador para células no fluorescentes, que producen señales de autofluorescencia / fondo. La solución de problemas de qRT-PCR incluye diferentes cantidades de ADNc y diseño de sonda, que a menudo son específicos del proyecto. Por último, para la solución de problemas de inmunofluorescencia, las concentraciones de anticuerpos son la variable más importante para la cuantificación del ensayo, lo que requiere una determinación óptima de la concentración.

Un aspecto de solución de problemas que es relevante para la mayoría de los métodos anteriores es el efecto de aislamiento del uso de una placa sellada con celdas cubiertas con papel de aluminio. Este método puede impedir el intercambio de gases de dióxido de carbono necesario para el crecimiento adecuado de varias líneas celulares. A partir de la experiencia experimental previa, esto no fue un impedimento significativo para el crecimiento celular para un experimento de 3-5 días utilizando las líneas celulares diseñadas dentro de este manuscrito, pero puede llegar a ser importante para otras líneas celulares o duraciones experimentales. Para abordar esta preocupación, una adaptación implementada con las placas selladas incluye el uso de medios independientes de dióxido de carbono, que no ha afectado el crecimiento de las células utilizadas en este estudio. Cabe señalar que para otros ensayos o líneas celulares donde el metabolismo, los niveles de pH y las densidades celulares son importantes, pueden ser necesarias otras intervenciones, como cambiar los medios o los nutrientes con mayor frecuencia.

Los límites de los métodos descritos aquí residen en el circuito genético utilizado, la precisión de la tecnología optogenética y la interfaz LPA con otros equipos como los microscopios de fluorescencia. La tecnología descrita aquí es asequible, rápida de construir y fácil de ^validar46 para poblaciones de células diseñadas optogenéticamente. Sin embargo, existen ciertas limitaciones espaciales, como la incapacidad de controlar células individuales sin modificaciones en la configuración de inducción de luz, como la utilización de dispositivos espejo digital (DMD), con beneficios recientemente demostrados en células ^vivas60,61. Además, los métodos descritos aquí están limitados en el seguimiento de células vivas durante la estimulación optogenética, lo que permite solo la adquisición de datos de punto final de todo el curso de tiempo experimental.

A pesar de estos límites, los métodos optogenéticos descritos aquí son complementarios a la tecnología existente, como los DMD, que tienen la flexibilidad de controlar células individuales en tiempo real, pero están limitados por el número de muestras que se pueden estimular. Además, los métodos de ingeniería de líneas celulares estables discutidos aquí contrastan con los métodos de biología sintética existentes que a menudo caracterizan los sistemas genéticos modificados a través de transfecciones transitorias. Los enfoques de transfección transitoria son inherentemente más ruidosos debido a la mayor variación del número de copias del circuito génico entre las células. En contraste, los métodos presentados aquí involucran variantes de células monoclonales, cada una de las cuales contiene una copia del circuito genético. Las líneas celulares estables permiten explorar aspectos celulares como la variación de la expresión génica, los efectos a nivel de proteína en paisajes fenotípicos y los métodos unicelulares con mayor precisión, ya que existe una mayor confianza en que cada célula es idéntica a sus vecinas.

El trabajo aquí demuestra una plataforma para diseñar cualquier circuito genético optogenético integrado genómicamente de interés, inducir dichos sistemas con herramientas experimentales confiables y caracterizarlos con una variedad de ensayos de expresión génica y funcionales / fenotípicos de manera estandarizada. Las mejoras futuras de estos protocolos pueden incluir la integración de estos métodos con el seguimiento de células vivas utilizando otras tecnologías optogenéticas como las DMD, que permitirán el control espaciotemporal de la expresión génica y las aplicaciones funcionales a nivel de una sola célula. Tales avances permitirán la utilización de la luz para producir el patrón de expresión génica de interés en células individuales, establecer dinámicas de transcripción / traducción, cuantificar los niveles de proteínas y estudiar su papel en diversos procesos biológicos, incluida la migración celular, la proliferación, la metástasis y la diferenciación.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes	Eppendorf	951010006	reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X	Thermo Fisher Scientific	MT25053CI	reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000020	tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000055	tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap	Corning	352235	reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V	Eppendorf	22628113	equipment for mammalian culture work
Agarose	Denville Scientific	GR140-500	reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates	VWR®	60941-126	tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9518-5G	reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365PR	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140010	reagent for growing bacteria
BD LSRAria	BD	656700	tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa	BD	649225	tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine	Government Scientific Source	SIGA4919-1G	reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC	Corning	353043	plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge	VWR	22628113	instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood	N/A	N/A	instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid	BD	353047	plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask	USA Scientific	CC7682-4825	container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fischer Scientific	BP231-100	reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide	Thermo Fisher Scientific	15-585-011	reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid	Corning	353072	container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express	De Novo Software:	N/A	software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL	Corning	35-010-CV	reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose	Thermo Fisher Scientific	11-965-092	reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL	Life Technologies	10687-010	reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix	Bio-Rad Laboratories	1708890	reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C	VWR	76210-392	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U74VC	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C	VWR	76359-220	equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg	Sigma-Aldrich	L3022-250G	reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000	Life Technologies	L3000008	reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019	MathWorks	N/A	software for analyzing experimental data
Methanol	Acros Organics	413775000	reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL	VWR	20170-333	plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
MultiTherm Shaker	Benchmark Scientific	H5000-HC	equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-NDL-US-CAN	equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix	NEB	M0492S	reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)	New England Biolabs (NEB)	C3019H	bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs (NEB)	E2621L	reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera	Nikon Instruments Inc.	N/A	instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements	Nikon Instruments Inc.	N/A	software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides	IDT	N/A	reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control	Panasonic	MCO-170AICUVHL-PA	instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade	Electron Microscopy Sciences	15710-S	reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)	Invitrogen	14190144	reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x	Fisher Scientific	15140-122	reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody	Cell Signaling Technology	4370S	primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody	Sigma-Aldrich	WH0003845M1	primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System	Eppendorf	A28137	equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App	Thermo Fisher Scientific	N/A	software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody	Cell Signaling Technology	8889S	secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody	Invitrogen	A11005	secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL	Olympus Plastics	12-102	reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System	Major Science	UVCI-1200	tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene	SnapGene	N/A	software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator	Tokai Hit	INU-TIZ	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444557	reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn	Life Technologies	4326317E	qPCR Probe
Thermocycler	Bio-Rad	1851148	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated	PerkinElmer	1450-605	plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm	VWR	14673-010	reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System	VWR	89032-290	equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293	Thermo Fisher Scientific	R75007	Engineered cell line with FRT site