Ingénierie et contrôle fiables des circuits génétiques optogénétiques stables dans les cellules de mammifères

Summary

Le contrôle fiable des cellules de mammifères sensibles à la lumière nécessite la normalisation des méthodes optogénétiques. Pour atteindre cet objectif, cette étude décrit un pipeline de construction de circuits géniques, d’ingénierie cellulaire, de fonctionnement de l’équipement optogénétique et de tests de vérification pour normaliser l’étude de l’expression des gènes induite par la lumière en utilisant un circuit génique optogénétique à rétroaction négative comme étude de cas.

Abstract

Un contrôle fiable de l’expression génique dans les cellules de mammifères nécessite des outils avec un changement de pli élevé, un faible bruit et des fonctions de transfert d’entrée en sortie déterminées, quelle que soit la méthode utilisée. Pour atteindre cet objectif, les systèmes d’expression génique optogénétique ont attiré beaucoup d’attention au cours de la dernière décennie pour le contrôle spatio-temporel des niveaux de protéines dans les cellules de mammifères. Cependant, la plupart des circuits existants contrôlant l’expression des gènes induits par la lumière varient dans l’architecture, sont exprimés à partir de plasmides et utilisent un équipement optogénétique variable, ce qui crée un besoin d’explorer la caractérisation et la normalisation des composants optogénétiques dans les lignées cellulaires stables. Ici, l’étude fournit un pipeline expérimental de construction, d’intégration et de caractérisation fiables de circuits géniques pour contrôler l’expression génique inductible par la lumière dans les cellules de mammifères, en utilisant un circuit optogénétique à rétroaction négative comme exemple de cas. Les protocoles illustrent également comment la normalisation de l’équipement optogénétique et des régimes lumineux peut révéler de manière fiable les caractéristiques du circuit génique telles que le bruit d’expression des gènes et l’ampleur de l’expression des protéines. Enfin, cet article peut être utile pour les laboratoires peu familiers avec l’optogénétique qui souhaitent adopter une telle technologie. Le pipeline décrit ici devrait s’appliquer à d’autres circuits optogénétiques dans les cellules de mammifères, permettant une caractérisation et un contrôle plus fiables et détaillés de l’expression des gènes au niveau transcriptionnel, protéomique et, en fin de compte, phénotypique dans les cellules de mammifères.

Introduction

À l’instar d’autres disciplines de l’ingénierie, la biologie synthétique vise à normaliser les protocoles, permettant d’utiliser des outils aux fonctions hautement reproductibles pour explorer des questions pertinentes pour les systèmes ^{biologiques1,2}. Un domaine de la biologie synthétique où de nombreux systèmes de contrôle ont été construits est le domaine de la régulation de l’expression ^{des gènes3,4}. Le contrôle de l’expression génique peut cibler à la fois les niveaux de protéines et la variabilité (bruit ou coefficient de variation, CV = σ/μ, mesuré comme l’écart-type par rapport à la moyenne), qui sont des caractéristiques cellulaires cruciales en raison de leur rôle dans les états cellulaires physiologiques et ^{pathologiques5,6,7,8}. De nombreux systèmes synthétiques capables de contrôler les niveaux de protéines et le bruit4,9,10,11,12 ont été conçus, créant des opportunités de normalisation des protocoles à travers les outils.

Un nouvel ensemble d’outils capables de contrôler les réseaux de gènes qui a récemment émergé est l’optogénétique, permettant l’utilisation de la lumière pour contrôler l’expression des gènes13,14,15,16,17. Semblables à leurs prédécesseurs chimiques, les circuits géniques optogénétiques peuvent être introduits dans n’importe quel type de cellule, allant des bactéries aux mammifères, permettant l’expression de tout gène d’intérêt en ^aval18,19. Cependant, en raison de la génération rapide de nouveaux outils optogénétiques, de nombreux systèmes ont émergé qui varient dans l’architecture des circuits génétiques, le mécanisme d’expression (par exemple, l’intégration à base de plasmides par rapport à l’intégration virale) et l’équipement de contrôle fournissant de la ^{lumière11,16,20,21,22,23,24,25} . Par conséquent, cela laisse place à la normalisation des caractéristiques optogénétiques telles que la construction et l’optimisation des circuits géniques, la méthode d’utilisation du système (par exemple, l’intégration par rapport à l’expression transitoire), les outils expérimentaux utilisés pour l’induction et l’analyse des résultats.

Pour progresser dans la normalisation des protocoles optogénétiques dans les cellules de mammifères, ce protocole décrit un pipeline expérimental pour concevoir des systèmes optogénétiques dans les cellules de mammifères en utilisant un circuit de gène à rétroaction négative (NF) intégré dans les cellules HEK293 (lignée cellulaire du rein embryonnaire humain) à titre d’exemple. NF est un système idéal pour démontrer la normalisation car il est très ^{abondant26,27,28} dans la nature, ce qui permet d’ajuster les niveaux de protéines et de minimiser le bruit. En bref, nf permet un contrôle précis de l’expression des gènes par un répresseur réduisant sa propre expression suffisamment rapidement, limitant ainsi tout changement par rapport à un état stable. L’état d’équilibre peut être modifié par un inducteur qui inactive ou élimine le répresseur pour permettre plus de production de protéines jusqu’à ce qu’un nouvel état d’équilibre soit atteint pour chaque concentration d’inducteur. Récemment, un système optogénétique NF a été créé qui peut produire une réponse dynamique à grande échelle de l’expression des gènes, maintenir un faible bruit et répondre aux stimuli lumineux, ce qui permet un contrôle spatial de l’expression des ^gènes11. Ces outils, connus sous le nom de tuners inductibles par la lumière (LITers), ont été inspirés par des systèmes antérieurs qui permettaient le contrôle de l’expression génique dans les cellules vivantes4,10,29,30 et ont été intégrés de manière stable dans les lignées cellulaires humaines pour assurer un contrôle à long terme de l’expression des gènes.

Ici, en utilisant le LITer comme exemple, un protocole est décrit pour créer des circuits de gènes sensibles à la lumière, induire l’expression des gènes avec un appareil à plaque lumineuse (LPA, un matériel d’induction optogénétique)³¹, et analyser les réponses des lignées cellulaires modifiées et contrôlables optogénétiquement aux stimuli lumineux personnalisés. Ce protocole permet aux utilisateurs d’utiliser les outils LITer pour n’importe quel gène fonctionnel qu’ils souhaitent explorer. Il peut également être adapté à d’autres systèmes optogénétiques avec diverses architectures de circuits (par exemple, rétroaction positive, régulation négative, etc.) en intégrant les méthodes et l’équipement optogénétique décrits ci-dessous. Semblables à d’autres protocoles de biologie synthétique, les enregistrements vidéo et les protocoles optogénétiques décrits ici peuvent être appliqués dans des études unicellulaires dans divers domaines, y compris, mais sans s’y limiter, la biologie du cancer, le développement embryonnaire et la différenciation tissulaire.

Protocol

1. Conception de circuits génétiques

1. Sélectionner les composants génétiques à combiner en un seul circuit génique/plasmide (p. ex., motifs de séquence d’intégration de l’ADN de ^mammifère32, éléments sensibles à la ^lumière33 ou gènes ^{fonctionnels34}).
2. À l’aide de tout logiciel de génie génétique et/ou de clonage moléculaire, stockez les séquences d’ADN pour une utilisation et une référence ultérieures, annotez chaque séquence et examinez toutes les caractéristiques nécessaires (p. ex., codons START, séquences régulatrices ou traduites)³⁵.
3. Développer ou adopter des parties en fonction de la conception globale du circuit ^{génétique36}. À titre d’exemple, pour les répresseurs optogénétiques comme dans les LITers11, fusionner une séquence de gènes codant pour un domaine capable de dégradation inductible par la ^{lumière37,38} ou d’inactivation de la capacité de liaison à l’ADN d’un répresseur39, adjacente et dans le cadre du gène répresseur (par exemple, TetR)⁴.
   1. Pour les activateurs optogénétiques, assurez-vous de la présence d’un domaine ^activateur40 qui favorise l’expression des gènes lors de la liaison à l’ADN induite par la ^lumière41. Pour une autorégulation négative ou positive, assurez-vous de la présence d’un site de liaison régulateur dans ou en amont du promoteur du gène régulateur (p. ex., des sites tetO dans ou en amont du promoteur exprimant TetR)⁴².
4. Concevoir les amorces pour l’amplification de la séquence d’ADN ou le séquençage du plasmide à l’aide du logiciel de clonage moléculaire pour chaque circuit de gène.
5. Valider les amorces par calcul pour la construction de plasmides grâce aux festins intégrés d’un logiciel de clonage moléculaire (par exemple, l’alignement de séquence).
6. Commandez des amorces d’oligonucléotides auprès du fabricant. Les plasmides construits et utilisés dans ce travail peuvent être trouvés dans le matériau de support ^original11 avec les amorces conçues et utilisées.
7. Diluer les amorces à une concentration de stock de 100 mM dans de l’eau double distillée (_ddH2O).
8. Diluer le stock d’amorces de 100 mM à une concentration de 10 mM pour la PCR.
9. Préparer le mélange PCR avec 1 μL d’amorce avant, 1 μL d’amorce inverse, 1 μL d’ADN modèle à une masse totale de 0,5 à 500 ng pour la génomique ou 0,5 pg-5 ng pour l’ADN plasmidique ou viral, 12,5 μL d’ADN polymérase 2x mélange maître (ou le volume qui satisfait le facteur de dilution du fabricant) et 9,5 μL de _ddH2O pour un volume de réaction total de 25 μL.
10. Incuber le mélange PCR dans un thermocycleur à des réglages appropriés en fonction de l’enzyme ^choisie43. Les cycles de réaction suggérés comprennent :
    Étape 1 : Un cycle de 30 s d’étape de dénaturation initiale à 95 °C.
    Étape 2 : 40 cycles de 5 s d’étape de dénaturation à 98 °C.
    Étape 3 : Un cycle de 30 s d’étape de recuit à 65 °C (déterminé par des amorces conçues plus tôt).
    Étape 4 : Un cycle de 1 min d’extension à 72 °C (~1 kilobase (kb) longueur du fragment de gabarit).
    Étape 5 : Un cycle d’une extension de 2 min à 72 °C.
    Maintenez la réaction à 4 °C jusqu’à ce qu’elle puisse être testée par électrophorèse sur gel. Ce protocole varie en fonction des réactifs utilisés (p. ex. polymérase et tampons).
11. Répétez l’étape 1.9 pour amplifier tous les fragments à utiliser dans une réaction d’assemblage d’ADN nécessaire pour relier les produits de PCR linéaire en un seul vecteur d’ADN circulaire.
12. Exécutez les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% suivi de la purification des bandes de la longueur souhaitée.
13. Préparer le mélange maître pour une réaction d’assemblage d’ADN (tableau 1).
    Remarque : Dans cet exemple, le vecteur-mère est divisé en deux fragments pour augmenter l’efficacité des étapes de PCR sans entraîner de modifications significatives du résultat global de l’assemblage.
14. Incuber le mélange maître de la réaction d’assemblage de l’ADN dans un thermocycleur à 50 °C pendant 1 h (sauf indication contraire dans le protocole du réactif d’assemblage de l’ADN) et stocker la réaction à 4 °C pour utiliser le produit de réaction pour la transformation bactérienne.
15. Mettre en place une transformation bactérienne (chimique ou électroporation) à l’aide de cellules E. coli (Escherichia coli) compétentes et du protocole de transformation bactérienne correspondant. Après la transformation, utilisez les plaques de gélose bactériennes Luria-Bertani (LB) contenant le marqueur de sélection bactérienne choisi (par exemple, l’ampicilline) pour plaquer le mélange de transformation. Incuber les plaques à 37 °C pendant la ^nuit44.
16. Vérifiez les plaques le lendemain. Pour inoculer les colonies, choisissez des colonies individuelles dans les plaques et remettez-les en suspension dans un bouillon LB liquide avec le marqueur de sélection bactérienne correspondant dans des tubes de culture. Incuber dans un incubateur agitateur à 37 °C, 300 tr/min pendant la nuit.
17. Effectuer un protocole de préparation de plasmides pour extraire l’ADN plasmidique de la culture bactérienne.
18. Validez le circuit en deux étapes. Tout d’abord, effectuez une digestion d’essai en utilisant des enzymes de restriction comme vérification brute pour voir si le produit plasmidique approximatif a été obtenu. Deuxièmement, si la digestion d’essai est réussie/confirmée, soumettez le plasmide à une installation de séquençage de Sanger (ou à un procédé utilisant l’équipement disponible) pour obtenir la séquence d’ADN précise afin de la comparer ultérieurement à la séquence attendue dans le logiciel de conception.
    1. Pour effectuer la digestion de test, sélectionnez au moins deux enzymes de restriction qui produisent au moins deux fragments, en fonction du logiciel de clonage moléculaire utilisé. Une fois les enzymes sélectionnées, préparez les échantillons d’essai en ajoutant 1 μL de chaque enzyme, 5 μL de l’ADN généré et 13 μL d’eau avec des sels et des tampons appropriés en fonction des enzymes utilisées. Incuber la réaction à 37 °C pendant 1 h, ou comme le suggère le fabricant de l’enzyme. Exécutez les produits de digestion d’essai sur un gel d’agarose à 1% et déterminez si les bandes sont correctes.
       REMARQUE: Si les bandes sont correctes, passez au séquençage.
    2. Pour effectuer le séquençage, générez des amorces basées sur l’ADN stocké dans le logiciel de sorte que les régions de recuit des amorces soient distantes d’environ 500 bp (paires de bases) et couvrent le fragment d’intérêt (composant du circuit génique) ou le plasmide complet. Diluer les amorces avec de l’eau pure sans nucléase (_NF-H2O) à une concentration de 10 mM. Préparer les échantillons de séquençage en ajoutant 1 μL d’ADN de 10 ng/μL, 1 μL d’amorce et 8 μL de _NF-H2O à un tube de 0,2 mL. Répétez cette opération pour chaque amorce.
       REMARQUE: Lorsque les échantillons sont préparés, déposez-les à l’installation de séquençage et comparez les résultats avec la séquence plasmidique à l’aide d’un logiciel de clonage moléculaire.
19. À cette étape, générez environ 100 à 1000 ng/μL d’échantillon d’ADN pour intégrer les plasmides contenant des circuits géniques dans la lignée cellulaire appropriée.

2. Ingénierie stable des lignées cellulaires

1. Ordonner une lignée cellulaire de mammifères conçue pour la génération rapide de sous-lignées stables qui assurent une expression de haut niveau de la protéine d’intérêt à partir d’un vecteur d’expression de mammifère. Le type de cellule et la facilité d’ingénierie des lignées cellulaires peuvent varier en fonction de ce que les utilisateurs préfèrent ou visent à atteindre.
   1. Par exemple, si les utilisateurs préfèrent l’ingénierie des lignées cellulaires avec un minimum d’étapes intermédiaires, ordonnez les cellules qui contiennent un seul site d’intégration stable (par exemple, FRT) à un locus génomique transcriptionnellement actif. Si l’on préfère une ingénierie cellulaire plus nuancée, créez des sites d’intégration à des endroits privilégiés à l’aide d’outils de génie génétique tels que CRISPR/Cas9.
2. Cultiver des cellules avec 5 % de _CO2 dans de l’air humidifié à 37 °C. Ajuster les conditions de croissance au besoin pour le type de cellule.
3. Transfecter les circuits de gènes conçus ci-dessus dans les cellules souhaitées obtenues à partir des étapes précédentes pour commencer un processus de génération de lignée cellulaire stable. Pour ce faire, utilisez un mélange de ^liposomes45 de l’ADN du circuit génique avec une recombinase appropriée (par exemple, Flp-recombinase pour la recombinaison Flp-FRT) ou par d’autres méthodes telles que l’électroporation.
4. Deux jours après la transfection, divisez les cellules à 25% de confluence.
5. Six heures après la division des cellules, commencez la sélection des antibiotiques en échangeant le milieu contre un milieu frais contenant 50 μg/mL d’antibiotique hygromycine (ou un autre agent antibiotique correspondant au gène de résistance aux antibiotiques des mammifères choisi lors de la construction du plasmide).
   REMARQUE: Il existe une variété de gènes de résistance aux antibiotiques de mammifères utilisés dans la construction de circuits géniques, chacun ayant une courbe de destruction différente. Par conséquent, quel que soit le gène de résistance aux antibiotiques des mammifères choisi pour la construction du circuit, une courbe de destruction appropriée doit être étudiée dans les cellules d’intérêt. Cette étape garantit que les cellules contenant la charge utile du circuit génétique sont enrichies tandis que celles qui n’ont pas le système sont tuées.
6. Laissez les cellules se développer dans le milieu de sélection des antibiotiques, passez à un milieu frais tous les 2-3 jours jusqu’à ce que la plaque ou la fiole ait quelques dizaines de foyers. Passage des cultures adhérentes lorsqu’elles sont dans la phase logarithmique avant d’atteindre la confluence.
7. Une fois qu’il y a suffisamment de foyers, trypsiniser les cellules avec 1 mL de trypsine à 0,25%, 0,1% d’EDTA dans la solution saline équilibrée (HBSS) de Hank sans bicarbonate de calcium, de magnésium et de sodium pendant plusieurs minutes. Neutraliser la trypsine avec un milieu frais et passer toutes les cellules dans un récipient frais.
8. Une fois que les cellules du récipient frais sont confluentes à 80% à 100%, congelez-les dans un mélange de 45% de vieux milieux, de 45% de milieux frais et de 10% de DMSO. Transférez les cellules restantes dans un tube stérile et effectuez un tri unicellulaire pour isoler les cellules monoclonales dans une plaque de 96 puits.
9. Environ 2 à 3 semaines après le tri monoclonal, les puits dans la plaque de 96 puits devraient avoir des foyers. Lorsqu’environ 50% à 60% de confluent, divisez les cellules en une plaque de 12 puits.
10. Une fois que la plaque de 12 puits est confluente à 80% à 100%, divisée en une fiole T-25 traitée par culture tissulaire. Une fois que les cellules de la fiole T-25 sont confluentes à 80% à 100%, congelez les cellules et maintenez un passage pour la caractérisation et le test des lignées cellulaires monoclonales.
    1. Caractériser les lignées cellulaires monoclonales par microscopie et tests de cytométrie en flux pour rapporter les profils d’expression génique basés sur la production induite de rapporteur fluorescent. Vérifier la production fonctionnelle de protéines par marquage d’anticorps fluorescents et test d’immunofluorescence. Testez l’induction de l’expression génique au niveau transcriptionnel via une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). Valider la séquence génétique et la précision de l’intégration via le séquençage local et du génome entier des clones.

3. Essais d’induction d’appareils à plaques lumineuses

1. Construire un dispositif ^LPA31,46 à utiliser pour l’induction lumineuse des cellules modifiées. En bref, plusieurs grandes étapes sont cruciales pour créer un LPA à utiliser pour contrôler l’expression des gènes. Il s’agit notamment de l’impression 3D de composants de cadre LPA, de la construction de cartes de circuits imprimés, de la programmation du circuit via un programmeur de microcontrôleur, de l’assemblage des composants en un LPA final, de la programmation de la carte mémoire via le logiciel IRIS et de l’étalonnage du périphérique fini. Pour une explication plus complète, reportez-vous aux références ci-dessus.
   1. Imprimez les pièces 3D comme indiqué dans Gerhardt et al. (2016 et 2019)^31,46.
   2. Assemblez la carte de circuit imprimé comme indiqué dans Gerhardt et al. (2016 et 2019)^31,46.
   3. Ajoutez le micrologiciel au circuit LPA assemblé à l’aide d’un programmateur de microcontrôleur, comme indiqué dans Gerhardt et al. (2016 et 2019)^31,46.
   4. Combinez des pièces imprimées en 3D et la carte de circuit imprimé assemblée comme indiqué dans Gerhardt et al. (2016 et 2019)^31,46. Cela comprend la prise de la plaque de montage, de la carte de circuit imprimé, de l’entretoise à LED (diodes électroluminescentes), de l’adaptateur de plaque, d’une plaque à 24 puits, d’un couvercle de plaque, de boulons de montage, d’écrous d’aile et de composants d’empilage, comme le montrent la vidéo filmée et la figure 2.
   5. Pour la programmation de la carte mémoire et l’étalonnage de l’appareil, suivez les étapes décrites ci-dessous.
2. Utilisez le logiciel IRIS disponible sur le site Web du Tabor ^Lab47 pour programmer une carte SD pour l’appareil à plaques lumineuses (LPA)³¹ et explorer les conditions d’éclairage appropriées nécessaires pour commencer une expérience optogénétique.
   REMARQUE: Le logiciel IRIS est une application Web pour la programmation du matériel électronique optogénétique, connu sous le nom de LPA, développé par le tabor Lab. Le logiciel permet de programmer des valeurs IRIS relatives qui contrôlent les diodes électroluminescentes (LED) individuelles dans chaque puits du matériel LPA.
3. Choisissez l’option déroulante LPA (4 x 6), puis cliquez sur l’approche d’éclairage appropriée (État stable, Dynamique, Avancé).
   NOTE: Pour ce manuscrit, tous les tests se concentreront sur les exemples à l’état d’équilibre. Cependant, les exemples de réglages avancés peuvent être utilisés pour les durées d’impulsion et les régimes de rapport cyclique.
4. Choisissez si les LED du haut ou du bas seront éclairées en entrant des valeurs dans les cellules correspondant aux puits de la plaque. Pour les APL utilisés dans ce travail, des LED bleues placées en position supérieure ont été utilisées dans toutes les expériences. Chaque LED, une fois programmée, peut fournir une exposition continue à la lumière avec une intensité lumineuse constante. Le logiciel IRIS permet d’obtenir 4096 niveaux d’intensité qui peuvent être programmés.
5. Une fois les emplacements des LED choisis, entrez les valeurs d’intensité pour le contour expérimental souhaité. Par exemple, entrez 8 intensités lumineuses différentes (ou durées d’impulsion ou cycles de service) avec trois répétitions techniques par plaque (tableau 2). G.s. fait référence aux unités en niveaux de gris- les valeurs de mesure du niveau d’intensité lumineuse utilisées pour la programmation LPA dans le logiciel IRIS.
   1. Lors de la conception des fichiers expérimentaux IRIS, gardez à l’esprit les effets de bord des puits adjacents sur le dispositif LPA, la toxicité de la lumière due à l’augmentation des intensités d’exposition à la lumière bleue et la détermination du type de dose-réponse souhaité (par exemple, monotone vs non monotone).
   2. Si les utilisateurs programment des cellules dans le LPA dans l’ordre croissant/décroissant d’un paramètre de lumière particulier (par exemple, l’intensité), les puits peuvent produire des effets de bord de diaphonie lumineuse ou même de chaleur qui peuvent influencer les puits adjacents. Cela peut influencer par inadvertance le résultat des extrants mesurés lorsque les expériences sont terminées. Pour atténuer ce problème, les utilisateurs peuvent implémenter une matrice de randomisation sur le logiciel IRIS pour brouiller les emplacements des puits, minimisant ainsi les effets de bord. Un exemple est décrit dans les résultats représentatifs ci-dessous (figure 4A-B).
   3. En outre, des intensités plus élevées de lumière bleue ont été trouvées pour interférer avec la croissance cellulaire et la ^viabilité48. Par conséquent, pour atténuer la toxicité de la lumière, il est important de produire une courbe d’intensité lumineuse, de durée d’impulsion ou de réponse du rapport cyclique en fonction de la modalité étudiée.
      1. Par exemple, programmez 8 valeurs d’intensité lumineuse avec trois répétitions par plaque de 24 puits, avec une plage allant de l’absence de lumière à une intensité maximale de la LPA. Ensuite, exécutez ces échantillons sur un cytomètre en flux avec une porte SSC-FSC ou une coloration vivante telle que l’iodure de propidium pour quantifier la survie des cellules de population (cellules vivantes par rapport aux événements totaux, y compris les cellules mortes / débris cellulaires) à chaque valeur lumineuse.
      2. Ensuite, déterminez la quantité idéale de survie de la population pour la configuration expérimentale, car tout stimulus peut nuire à la prolifération, à l’expression des gènes ou à la survie (par exemple, définir une survie cellulaire de 80% comme compromis approprié). Par exemple, dans ce travail, une fois étalonné, l’intensité ne dépassait pas 3000 g.s. unités (~3/4 de l’intensité maximale du dispositif LPA). Un exemple de ceci est décrit dans les résultats représentatifs ci-dessous.
   4. En plus de restreindre les valeurs lumineuses en raison de la toxicité, les utilisateurs peuvent souhaiter restreindre les valeurs lumineuses pour caractériser une partie particulière de la dose-réponse, telle que la plage de la réponse monotone.
      1. Pour ce faire, scannez d’abord une large gamme d’intensités lumineuses, de durées d’impulsion ou de cycles d’utilisation en fonction de la modalité analysée lors de la détermination de la dose-réponse souhaitée (tableau 2) pour affiner le régime de lumière d’intérêt, par exemple, où l’expression des gènes est en corrélation positive avec l’augmentation des valeurs lumineuses pour une dose-réponse monotone.
      2. Pour déterminer la plage d’intérêt de la lumière, programmez un seul LPA avec jusqu’à 24 puits d’intensité/durée d’impulsion/rapport cyclique/etc. différents ou plusieurs puits (p. ex., 48, 72, 96, etc.) selon que plusieurs APL sont étalonnés pour fournir des quantités de lumière équivalentes et procéder aux travaux de culture cellulaire ou aux essais décrits ci-dessous. Par conséquent, commencez la caractérisation d’un système optogénétique avec une large gamme de doses de stimuli lumineux pour déterminer l’intervalle de gamme qui donne l’expression génique souhaitée et effectuez ensuite des expériences dans cette gamme de doses raffinées.
      3. Par exemple, dans ce travail, une fois que 3000 unités de g.s. ont été déterminées comme seuil d’intensité lumineuse toxique; ce seuil a été utilisé comme limite supérieure de la lumière pour les essais décrits ci-dessous (p. ex., immunofluorescence).
         REMARQUE: Les étapes ci-dessus sont indépendantes de l’étalonnage optique de la LPA et se réfèrent à un étalonnage au niveau moléculaire pour chaque système optogénétique.
6. Une fois les valeurs d’intensité lumineuse appropriées programmées dans IRIS, insérez une carte mémoire avec la prise USB 3.0 dans le LPA pour télécharger et transférer les fichiers.
7. Si l’étalonnage du LPA est ^terminé31, procéder aux travaux de culture cellulaire pour l’initiation du test d’induction lumineuse. Si l’étalonnage n’a pas été effectué, calibrez le LPA à l’aide d’une méthode d’analyse d’image (étapes 3.7.1 à 3.7.3) une fois que le LPA est programmé avec le programmeur du microcontrôleur.
   1. Programmez brièvement l’APL pour qu’il ait le même niveau d’IRIS que celui décrit par Gerhardt et al. (2016)³¹.
      REMARQUE: Pour l’étalonnage, le LPA a été programmé pour avoir une valeur de 2000 g.s.
   2. Une fois que l’appareil est programmé avec la carte mémoire et que le bouton de réinitialisation (bouton physique sur le LPA) est enfoncé, acquérez une image de l’ensemble de l’appareil (par exemple, imageur de station de gel, appareil de scanner, etc.). Pour l’étalonnage, acquérez deux images avec l’appareil pivoté de 180°.
   3. Ensuite, utilisez un logiciel open source conçu par Gerhardt et al. (2016)³¹ pour montrer la variabilité de l’intensité des LED sur la plaque LPA et calculer les valeurs de compensation des LED pour rendre l’intensité égale entre les puits. Un exemple de ceci est décrit dans les résultats représentés ci-dessous (Figure 3). Une fois cet étalonnage terminé, passez au travail de culture cellulaire pour l’initiation du test d’induction lumineuse.
8. Obtenir des flacons de cellules monoclonales modifiées de la section précédente pour étudier les effets de l’induction de la lumière sur l’expression des gènes.
9. Retirez l’ancien support de la fiole.
10. Ajouter 1 mL de trypsine aux cellules et incuber pendant 5 min.
11. Après 5 min, neutraliser la trypsine en ajoutant 4 mL de milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM ou autre milieu souhaité) complété par les produits chimiques nécessaires (ce travail a utilisé 50 μg/mL d’hygromycine, 1 % de solution de pénicilline/streptomycine, 10 % de sérum fœtal bovin, FBS).
12. Ajouter environ 75 000 cellules par puits dans une plaque noire de 24 puits dans un volume total de 500 μL. Le nombre de cellules ensemencées peut varier en fonction de la durée de l’expérience souhaitée et du type de cellule utilisé.
    REMARQUE: De plus, notez que la densité d’ensemencement cellulaire affecte le maintien de la culture et potentiellement la durée de l’expérience. Commencer à un nombre inférieur de cellules par puits garantit des durées plus longues avant que la culture n’atteigne la confluence. De plus, le type de composants optogénétiques intégrés dans les circuits géniques d’intérêt influencera le moment où l’expression des gènes atteindra un état stable et affectera donc la durée des expériences. D’autres facteurs peuvent être pris en compte sont les taux de croissance propres à la lignée cellulaire, la composition des milieux et les effets conditionnels de la croissance (c.-à-d. la lumière).
13. Après le placage, placez les cellules dans un incubateur humidifié avec 5% de _CO2 pour leur permettre de se déposer pendant 2 à 6 h.
14. Après l’incubation, transférer les cellules dans une hotte de culture tissulaire, retirer le couvercle en plastique et ajouter une bande de film adhésif sur le dessus de la plaque (Figure 2D). Cette étape permet un transfert de lumière minimal entre les puits, car le haut et les côtés des puits sont revêtus, et la lumière ne peut maintenant entrer que par le bas du puits où la LED est placée.
15. Placez la plaque dans les parties 3D ajustées du LPA. Ensuite, couvrez la plaque avec le couvercle LPA imprimé en 3D, qui s’adapte sur les vis de l’appareil à chaque coin.
16. Branchez l’appareil à la source d’alimentation et appuyez sur le bouton de réinitialisation du périphérique LPA pour vous assurer que les paramètres d’expérience LPA mis à jour sont appliqués.
17. Incuber les cellules dans le système expérimental pendant une durée appropriée, en fonction de la densité d’ensemencement d’origine, de la vitesse de croissance spécifique à la lignée cellulaire et des conditions de croissance. Dans cet exemple, les lignées cellulaires ont été induites pendant 3 jours en continu pour que l’expression des gènes atteigne un état stable. Cependant, il convient de noter que de nombreux systèmes optogénétiques (p. ex., VVD) peuvent atteindre l’expression des gènes à l’état d’équilibre beaucoup plus tôt (p. ex., 24 h) et que, par conséquent, les temps d’induction expérimentale peuvent être réduits ou prolongés au besoin.
18. À la fin de l’expérience d’induction lumineuse, utilisez les échantillons pour l’un des quatre essais suivants afin de caractériser les lignées cellulaires modifiées (sections 4 à 7).

4. Microscopie à fluorescence de cellules modifiées induites par la lumière

1. 24-72 h après l’induction, retirez les cellules du LPA de l’incubateur et placez-les dans une hotte de culture tissulaire.
2. Retirez la bande de papier d’aluminium et laissez la plaque reposer pendant 1-2 min. Cela empêche la formation de condensation sur le couvercle en plastique, s’il est placé immédiatement sur la plaque.
3. Après 1-2 min de séance, remettez le couvercle en plastique d’origine sur l’assiette.
4. Imagez les cellules avec le microscope à contraste de phase ou à fluorescence approprié.
5. Selon l’instrument, ajustez le temps d’exposition, l’intensité de la source lumineuse et le gain pour l’affichage des cellules modifiées. Dans cette expérience, les paramètres suivants ont été appliqués : 50 ms pour le temps d’exposition à la source lumineuse FITC/GFP (protéine fluorescente verte) et 1 à 5 ms pour le temps d’exposition au contraste de phase à une intensité de 100 % pour chacun.
   REMARQUE: Il convient de noter que les temps d’exposition optimaux, les niveaux de gain et les intensités des sources lumineuses sont souvent dérivés empiriquement de l’expérience de ce travail pour minimiser la sursaturation dans le rapporteur de fluorescence, minimiser les dommages cellulaires et capturer des images adéquates pour une analyse qualitative et quantitative. Lors de la détermination des niveaux de chacun de ces paramètres, les aspects à garder à l’esprit comprennent la maximisation des rapports signal/bruit, la minimisation de la phototoxicité, la minimisation de la sursaturation des signaux de fluorescence et l’augmentation de la capacité à amplifier les signaux de fluorescence faibles.
   1. Optimiser ces paramètres de manière grossièrement ad hoc; toutefois, les valeurs expérimentales antérieures (p. ex., l’intensité de la source lumineuse causant une sursaturation du rapporteur de fluorescence) peuvent guider les futurs paramètres expérimentaux, le cas échéant. Par exemple, les paramètres de gain, les temps d’exposition et les valeurs initiales d’intensité lumineuse d’un circuit (LITer1.0) ou d’une configuration expérimentale (par exemple, intensité lumineuse) peuvent être utilisés comme point de départ lors du passage à un circuit génétique similaire mais différent (LITer2.0)¹¹ ou à une modalité lumineuse différente (par exemple, cycle d’utilisation légère).
6. Rationalisez l’imagerie des plaques à l’aide d’un modèle de coordonnées programmé dans le logiciel de microscopie, ce qui permet à toute la taille de la plaque (par exemple, 24 puits) d’avoir une acquisition d’image automatisée à partir de plusieurs emplacements d’image par puits.

5. Cytométrie en flux de cellules modifiées induites par la lumière

1. 24-72 h après l’induction, retirez les cellules de la LPA dans l’incubateur ou du microscope après l’imagerie et placez-les dans la cagoule de culture tissulaire.
2. Si elle est retirée directement du LPA, retirez la bande de papier d’aluminium et laissez la plaque reposer pendant une minute ou deux.
3. Aspirer le milieu de chaque puits (de l’ensemble de la plaque de 24 puits si tous les puits sont utilisés).
4. Ajouter 100 μL de 0,25% de trypsine à chaque puits, couvrir la plaque avec un couvercle en plastique et la replacer dans l’incubateur.
5. Laissez les cellules intactes dans l’incubateur pendant 5 min.
6. Après 5 min, retirez la plaque et retournez-la dans la hotte de culture tissulaire.
7. Neutraliser chaque trypsinisé avec 400 μL de DMEM.
8. Étiqueter un tube à fond rond en polystyrène de 5 mL avec une passoire cellulaire (ou un tube de cytométrie en flux approprié qui peut être filtré pour éliminer de gros amas de cellules non entièrement trypsinisées) avec un nom correspondant à chaque puits.
9. Utilisez une pipette P1000 pour pipeter le contenu de chaque puits de haut en bas 6 à 8 fois pour briser les amas de cellules et créer des échantillons unicellulaires pour la cytométrie en ^flux49.
10. Transférer tout le contenu de chaque puits (~500 μL) dans les tubes étiquetés avec la crépine.
11. Amenez les cellules à l’instrument de cytométrie en flux approprié avec des lasers des longueurs d’onde correctes (peut apporter des tubes avec des cellules sur ou hors glace).
    REMARQUE : Le cytomètre en flux utilisé dans ce travail faisait partie d’un établissement de base situé à l’hôpital universitaire.
12. Créez une porte de diffusion vers l’avant et latérale (FSC et SSC, respectivement) pour capturer les cellules individuelles de la taille et de la granularité appropriées afin d’exclure les débris et les amas cellulaires sur le logiciel de cytométrie en flux.
13. Une fois la porte définie, capturez environ 10 000 cellules avec la porte appropriée. Ajustez ce nombre en fonction de la quantité de données cellulaires recherchées par les utilisateurs. Répétez l’opération pour chaque tube contenant les cellules de l’expérience.
14. Une fois l’expérience terminée, importez les données dans le logiciel de cytométrie en flux disponible pour analyse.
15. Créez une porte FSC-SSC (comme auparavant lors de l’acquisition) et appliquez-la à chaque lot de données expérimentales. Un puits de référence de la population cellulaire non induite est utilisé pour créer cette porte dans ce manuscrit, mais d’autres mesures pour la création de portes existent, telles que les portes basées sur la densité.
16. Avec les conditions expérimentales fermées par une porte FSC-SSC, tracez les données de cytométrie en flux sous forme d’histogrammes ou représentez-les d’une autre manière pour illustrer les modèles d’expression obtenus. Dans cette expérience, la fluorescence a été capturée par les canaux GFP/FITC ou PE/TexasRed.

6. Extraction de l’ARN et PCR quantitative des composants du circuit génique

1. 24-72 h après l’induction, retirez les cellules de la LPA dans l’incubateur ou du microscope après l’imagerie et placez-les dans la cagoule de culture tissulaire.
2. Si elle est retirée directement du LPA, retirez la bande de papier d’aluminium et laissez la plaque reposer pendant une minute ou deux.
3. Aspirer le milieu de chaque puits (de l’ensemble de la plaque de 24 puits si tous les puits sont utilisés).
4. Procédez à l’extraction de l’ARN des cellules à l’aide du kit d’extraction d’ARN approprié.
5. Une fois l’extraction de l’ARN terminée, effectuer une réaction de transcription inverse de chaque échantillon (tableau 3).
6. De plus, effectuer une PCR quantitative de chaque échantillon (tableau 4). Utilisez une ADN polymérase et un protocole associé pour mettre en place des réactions PCR. Pour cette étape, mettez en place une réaction multiplexée avec un gène d’entretien ménager et un gène d’intérêt, ou créez des réactions distinctes. Dans cet exemple, les niveaux de GFP, de KRAS et de glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) ont été sondés. Après avoir terminé l’expérience qRT-PCR, procédez à l’analyse via le logiciel disponible pour illustrer le changement de pli du circuit génique au niveau de l’ARN.

7. Immunofluorescence des composants du circuit génique

1. Utilisez un bain de glace ou un congélateur pour refroidir le méthanol.
2. 24-72 h après l’induction, retirez les cellules de la LPA dans l’incubateur ou du microscope après l’imagerie et placez-les dans la cagoule de culture tissulaire.
3. Si elle est retirée directement du LPA, retirez la bande de papier d’aluminium et laissez la plaque reposer pendant 1 à 2 minutes.
4. Aspirer le milieu de chaque puits (de l’ensemble de la plaque de 24 puits si tous les puits sont utilisés).
5. Ajouter 100 μL de 0,25% de trypsine à chaque puits, couvrir la plaque avec un couvercle en plastique et la replacer dans l’incubateur.
6. Laissez les cellules intactes dans l’incubateur pendant 5 min.
7. Après 5 min, retirez la plaque et retournez-la dans la hotte de culture tissulaire.
8. Neutraliser chaque trypsinisé avec 400 μL de DMEM.
9. Étiquetez les tubes mini-centrifuges avec des noms correspondant à chaque puits.
10. Utilisez une pipette P1000 et pipettez le contenu de chaque puits de haut en bas 6 à 8 fois pour briser les amas de cellules.
11. Transférer tout le contenu de chaque puits (~500 μL) dans les tubes étiquetés.
12. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g.
13. Une fois terminé, jetez le surnageant et déplacez les échantillons vers une hotte chimique.
14. Remettez en suspension les cellules (utilisez une pipette P1000 et une pipette de haut en bas 6 à 8 fois dans chaque tube pour briser les amas cellulaires) dans 750 à 1000 μL de paraformaldéhyde à 4% (dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate, PBS).
15. Laissez les cellules reposer pendant 15 minutes à température ambiante.
16. Après l’incubation, ajouter 750-1000 μL de PBS. Pipette de haut en bas plusieurs fois.
17. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g.
18. Une fois terminé, jetez le surnageant et déplacez les échantillons vers une hotte chimique.
19. Remettez en suspension les cellules (utilisez une pipette P1000 et une pipette de haut en bas 6 à 8 fois dans chaque tube pour briser les amas de cellules) dans 750 à 1000 μL de méthanol glacé.
20. Laissez les cellules reposer pendant 30 minutes sur de la glace ou dans un congélateur à -20 °C.
21. Après l’incubation, ajouter 750-1000 μL de PBS. Pipette de haut en bas plusieurs fois.
22. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g.
23. Une fois terminé, jetez le surnageant et déplacez les échantillons vers une hotte chimique.
24. Selon le type d’anticorps utilisés, modifiez le protocole à partir de ce moment. Suivez les étapes 7.24.1 à 7.24.14 ou 7.24.15 à 7.24.22.
    1. Si vous utilisez un anticorps primaire et secondaire, remettez en suspension les cellules à l’aide d’une pipette P1000/P200 et d’une pipette de haut en bas 6 à 8 fois dans chaque tube pour briser les amas cellulaires dans 100 μL d’anticorps primaire. Dans ce cas, une dilution de 1:800 pour les anticorps de base a été faite, y compris l’anticorps KRAS ou l’anticorps ERK, et a été laissée reposer pendant 1 h à température ambiante. Les anticorps ont été dilués dans un tampon d’incubation fabriqué à partir de 1x PBS avec 0,5 g de BSA.
       REMARQUE: Déterminez empiriquement la dilution exacte de l’anticorps en créant une courbe standard des dilutions d’anticorps par rapport à l’antigène d’intérêt.
    2. Après avoir ajouté des anticorps, recouvrir les tubes d’une feuille pour éviter les effets légers sur les anticorps marqués.
    3. Après l’incubation, ajouter 750-1000 μL du tampon d’incubation. Pipette de haut en bas plusieurs fois.
    4. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g.
    5. Une fois terminé, jetez le surnageant et déplacez les échantillons vers une hotte chimique.
    6. Remettez en suspension les cellules à l’aide d’une pipette P1000/P200 et d’une pipette de haut en bas 6 à 8 fois dans chaque tube pour briser les amas cellulaires dans 100 μL d’anticorps secondaires. Dans ce cas, les cellules ont été remises en suspension dans un anticorps secondaire de 100 μL à une dilution de 1:800 pour l’anticorps KRAS ou de 1:2000 pour l’anticorps ERK et laissées reposer pendant 30 min à température ambiante. Semblable aux anticorps primaires, diluez les anticorps secondaires dans le tampon d’incubation comme décrit ci-dessus. Déterminer les dilutions des anticorps secondaires en fonction des résultats empiriques d’une courbe standard.
    7. Après avoir ajouté des anticorps, recouvrir les tubes d’une feuille pour éviter les effets de la lumière sur les anticorps marqués.
    8. Après l’incubation, ajouter 750-1000 μL du tampon d’incubation. Pipette de haut en bas plusieurs fois.
    9. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g.
    10. Une fois terminé, jetez le surnageant et déplacez les échantillons vers une hotte chimique.
    11. Remettez en suspension les cellules à l’aide d’une pipette P1000 et d’une pipette de haut en bas 6 à 8 fois dans chaque tube pour briser les amas de cellules dans 500 μL de PBS.
    12. Transférer tout le contenu de chaque tube (~500 μL) dans les tubes étiquetés avec des crépines.
    13. Amenez les cellules à des instruments de cytométrie en flux appropriés avec des lasers des longueurs d’onde correctes (peuvent amener des tubes avec des cellules sur ou hors glace).
        REMARQUE: Il convient de noter que le fait d’avoir plusieurs témoins est important pour progresser dans la mesure et l’analyse de la cytométrie en flux de l’expression des gènes cellulaires modifiés. Par exemple, avoir des cellules complètement non colorées, des cellules colorées avec un anticorps primaire seul et des cellules colorées avec un anticorps secondaire seul peut être utile pour comparer les résultats avec les signaux de fond des anticorps.
    14. Ensuite, procédez à l’analyse décrite à la section 5.
    15. Si vous n’utilisez qu’un anticorps primaire, remettez en suspension les cellules à l’aide d’une pipette P1000/P200 et d’une pipette de haut en bas 6 à 8 fois dans chaque tube pour briser les amas cellulaires dans 100 μL d’anticorps primaire marqué. Déterminer la dilution appropriée des anticorps et incuber pendant 1 h à température ambiante. Déterminez empiriquement la dilution de l’anticorps à partir de la courbe standard.
    16. Après avoir ajouté des anticorps, recouvrir les tubes d’une feuille pour éviter les effets légers sur les anticorps marqués.
    17. Après l’incubation, ajouter 750-1000 μL du tampon d’incubation. Pipette de haut en bas plusieurs fois.
    18. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g.
    19. Remettez en suspension les cellules à l’aide d’une pipette P1000 et d’une pipette de haut en bas 6 à 8 fois dans chaque tube pour briser les amas de cellules dans 500 μL de PBS.
    20. Transférer tout le contenu de chaque tube (~500 μL) dans des tubes étiquetés avec des crépines.
    21. Amenez les cellules à des instruments de cytométrie en flux appropriés avec des lasers des longueurs d’onde correctes (peuvent amener des tubes avec des cellules sur ou hors glace).
        REMARQUE: Il convient de noter que le fait d’avoir plusieurs témoins est important pour progresser dans la mesure et l’analyse de la cytométrie en flux de l’expression des gènes cellulaires modifiés. Avoir des cellules complètement non colorées et des cellules colorées avec des anticorps primaires seuls est utile pour comparer les résultats avec les signaux de fond des anticorps.
    22. À partir de ce moment, procédez à l’analyse décrite à la section 5.

Representative Results

L’assemblage du circuit génique et la génération de lignées cellulaires stables dans cet article étaient basés sur des cellules HEK-293 modifiées commerciales contenant un site FRT unique et stable transcriptionnellement actif (Figure 1). Les circuits géniques ont été construits en vecteurs qui avaient des sites FRT dans le plasmide, permettant l’intégration Flp-FRT dans le génome cellulaire HEK-293. Cette approche ne se limite pas aux cellules Flp-In, car les sites FRT peuvent être ajoutés à n’importe quelle lignée cellulaire d’intérêt n’importe où dans le génome en utilisant une technologie d’édition de l’ADN telle que CRISPR / ^Cas950.

Une fois que les lignées cellulaires appropriées ont été construites et validées pour l’insertion correcte, les logiciels LPA et IRIS ont été choisis comme protocole normalisé pour l’induction lumineuse de l’expression ^{génique31,51}. Le système LPA permet de programmer 24 puits pour l’induction de cellules de mammifères dans de multiples conditions expérimentales en fonction de l’intensité lumineuse, de la durée de l’impulsion et du rapport cyclique (Figure 2). Dans cet article, l’intensité lumineuse, la durée de l’impulsion et le rapport cyclique uniformes dans l’espace ont été priorisés. Cependant, les chercheurs peuvent utiliser le logiciel IRIS et le LPA pour une programmation plus avancée des modèles d’ondes lumineuses temporelles.

Un aspect crucial de la LPA à aborder avant de commencer les expériences est l’étalonnage optique qui peut être effectué pour un ou plusieurs appareils. La méthode d’analyse d’image décrite ^{précédemment31} utilisée pour l’étalonnage nécessite une image de l’ensemble du LPA avec toutes les LED d’intérêt activées, qui peuvent être acquises à partir d’une variété de ^sources52, y compris un imageur de gel. Ici, un scanner informatique a été utilisé pour l’acquisition d’images (Figure 3A). Une fois l’image acquise, le logiciel open source créé par Gerhardt et al. (2016)³¹ a été utilisé pour calculer les valeurs de compensation pour chaque LED afin de s’assurer que chaque LPA émet la même intensité à une valeur de niveaux de gris donnée. Le logiciel soustrait le signal d’arrière-plan, découpe l’image dans une catégorie binaire et calcule l’intensité des pixels (Figure 3B). D’après l’étalonnage, une variation minime entre les LED a été trouvée, avec un CV de 0,04 entre 96 puits (ou 4 plaques étalonnées, Figure 3C). Enfin, l’utilisation du logiciel d’étalonnage a démontré la variation de la LED par emplacement (Figure 3D) et créé un réglage en niveaux de gris (Figure 3E) afin que chaque LED soit normalisée à la même intensité.

En plus de l’étalonnage, d’autres aspects importants de l’utilisation de la LPA comprennent l’intégration de plusieurs contrôles dans le pipeline expérimental qui peuvent minimiser les erreurs systémiques en limitant les variables confondantes telles que les effets de toxicité de la lumière et les limites de conception basées sur les matériaux expérimentaux. Par exemple, la figure 4 illustre deux configurations différentes pour la programmation de différentes intensités lumineuses dans les puits LPA. Le premier sous-panneau de la figure 4A montre une organisation ascendante de l’intensité lumineuse. Cela peut faciliter la programmation et l’analyse des données, mais peut produire des effets de bord là où la rangée inférieure du LPA a l’intensité lumineuse la plus élevée et peut potentiellement provoquer une chaleur indésirable et une induction de lumière des puits voisins. De même, dans le deuxième sous-panneau de la figure 4A, une matrice de randomisation a été appliquée au logiciel IRIS, créant diverses intensités lumineuses dans des positions aléatoires. Cela peut minimiser les influences systémiques des effets de bord. Une matrice désembrée (Figure 4B) est créée avec le logiciel IRIS, qui peut ensuite être utilisée pour déterminer les conditions expérimentales après la fin de l’expérience et pendant l’analyse. À l’instar de la randomisation des puits, les utilisateurs doivent également être conscients des effets de toxicité de la lumière qui peuvent survenir (lumière bleue dans ce travail). Dans la figure 4C, deux intensités lumineuses différentes utilisées pour l’induction de circuits géniques sont montrées avec la même porte FSC-SSC basée sur la population non induite de cellules modifiées. À ce titre, les utilisateurs devraient effectuer une dose-réponse sur la modalité lumineuse d’intérêt (p. ex., impulsion, rapport cyclique, etc.) afin de déterminer les effets de la toxicité de la lumière qui peuvent survenir à l’extrémité supérieure de l’exposition (figure 4D). Ici, l’augmentation des niveaux de lumière bleue a provoqué des débris cellulaires dose-dépendants, des cellules mortes et des amas par rapport aux cellules non stimulées. En tant que tel, l’intensité lumineuse continue a été limitée à environ 3/4 de l’intensité maximale de LPA (~ 3000 g.s. unités).

Une fois l’équipement approprié mis en place, l’expression des gènes a ensuite été induite dans des circuits de gènes LITer modifiés par microscopie à fluorescence (Figure 5). Les cellules ont été induites à différentes durées d’impulsion lumineuse sur le LPA, ce qui a donné une légère dose-réponse de l’expression des gènes au niveau de la population. Les cellules de ce travail ont été imagées pour l’expression GFP en utilisant 50 ms pour le temps d’exposition à la source lumineuse FITC / GFP et pour l’imagerie en champ lumineux en utilisant 1-5 ms pour le temps d’exposition au contraste de phase. Compte tenu de la robustesse de ce protocole d’ingénierie de lignée cellulaire, n’importe quel marqueur de fluorescence pourrait être utilisé à la place de GFP. Les cellules peuvent être induites avec plusieurs régimes lumineux et produire une large gamme de réponses (Figure 5). Ce dernier est bénéfique pour contrôler davantage l’expression des gènes fonctionnels (par exemple, l’oncogène KRAS (G12V) dans le travail ^original53).

Immédiatement après la microscopie à fluorescence, les cellules ont pu être analysées dans une variété de protocoles expérimentaux, y compris la cytométrie en flux, la qRT-PCR et l’immunofluorescence. Dans ce travail, la cytométrie en flux a été réalisée comme première procédure de validation et réalisée selon les méthodes décrites ci-dessus (Figure 6). À l’instar de la microscopie, les cellules ont été induites à différentes valeurs de longueur d’impulsion et ont montré une dose-réponse de l’expression des gènes plus de quatre fois plus importante par rapport aux états non induits au niveau de la population (figure 6A-B). De même, la réduction du bruit d’expression génique peut être démontrée en comparant diverses valeurs d’intensité lumineuse (Figure 6C-D) pour le système LITer par rapport à un système de régulation positive (sans rétroaction) tel que le VVD/^LightOn54. En comparant le LITer avec le système VVD, la rétroaction négative permet de réduire le bruit de l’expression génique plus de cinq fois. Les mêmes cellules pré-induites imagées en microscopie pourraient également être analysées par qRT-PCR (Figure 7). Semblables à la cytométrie en flux, les cellules LITer modifiées pourraient exprimer les niveaux d’ARN d’une manière sensible à la dose (induction plus de 10 fois à partir d’états non induits), correspondant à la dose-réponse des niveaux de protéines quantifiés par l’expression de GFP sur la cytométrie en flux. Les données de microscopie à fluorescence et de cytométrie en flux mentionnées peuvent être étalonnées à l’aide de cellules non fluorescentes, exprimant de manière constitutive des cellules fluorescentes, et de billes fluorescentes de validation de 6 à 8 pics (p. ex., vert à canal FL1, perles fluorescentes). Chacun de ces composants peut permettre la normalisation de l’expression des gènes en une seule expérience. Cependant, ces facteurs peuvent également permettre la normalisation des circuits et des cellules modifiées à travers différentes plaques expérimentales, conditions expérimentales et jours pour permettre la comparaison et la normalisation des données d’expression génique.

Enfin, les circuits du gène LITer peuvent être conçus pour exprimer des gènes fonctionnels, tels que le KRAS (G12V, Figure 8). La polyvalence de ce pipeline permet aux utilisateurs d’utiliser l’architecture LITer avec l’ingénierie cellulaire pour tout gène fonctionnel d’intérêt, en incorporant éventuellement des architectures supplémentaires telles que des commentaires positifs. Le LITer a montré des quantités croissantes de lumière bleue qui ont entraîné une augmentation des niveaux de sortie du circuit génique (niveaux de protéines KRAS (G12V)) et, par conséquent, des niveaux d’ERK phosphorylés, qui peuvent tous deux être quantifiés par des tests d’immunofluorescence.

Fragment	Ratio	Taille (pb)	Concentration pondérale des fragments d’ADN (ng/μL)	Concentration molaire de fragments d’ADN (fmol/μL)	Volume (μL)	Masse molaire d’ADN résultante (fmol)
Fragment de vecteur mère 1	1	3414.00	18.20	8.63	4.09	35.29
Fragment de vecteur mère 2	1	4642.00	18.10	6.31	5.59	35.29
Gène d’intérêt	1	549.00	37.90	111.70	0.32	35.29
Total					10.00	105.87

Tableau 1 : Calcul du mélange maître de réaction d’assemblage d’ADN (étape 1.13). Les colonnes 2 et 3 sont basées sur la taille des fragments d’ADN assemblés et la concentration de ces fragments après amplification PCR et extraction du gel d’agarose (étape 1.11). La cellule inférieure de la ^4ème colonne (volume total de réaction) peut être modifiée; toutefois, le volume indiqué est recommandé. Les cellules non ombrées sont générées automatiquement.

0	100	200	400	500	750
1500	3000	0	100	200	400
500	750	1500	3000	0	100
200	400	500	750	1500	3000

Tableau 2 : Programmation IRIS des intensités lumineuses (g.s.) pour l’expérience d’induction lumineuse dans une plaque de 24 puits avec trois réplicats (étape 3.4). Distribution d’intensités lumineuses allant de 0 à 3000 g.s. G.s.-unités d’échelles de gris. Cela peut être randomisé par le logiciel IRIS selon les besoins.

	Exemple 1	Exemple 2	Exemple 3
Volume du mélange principal de transcriptase inverse (μL)	4.00	4.00	4.00
Modèle d’ARN (1000 ng) Volume (μL)	2.00	3.00	4.00
Volume NF-H20 (μL)	14.00	13.00	12.00
Volume total (μL)	20.00	20.00	20.00

Tableau 3 : Calcul du mélange maître de transcription inverse (étape 6.5). Le volume total recommandé par la réaction est de 20 μL et ses composants sont le mélange maître d’enzymes de transcriptase inverse (ici: 5x), le modèle d’ARN et l’eau sans nucléase. Dans cet exemple, les concentrations d’ARN des échantillons 1, 2 et 3 sont respectivement de 500, 333 et 250 ng/μL.

	Exemple 1	Exemple 2	Échantillon 1 & 2 Multiplexé
Volume de sonde GFP (μL)	1	-----	1
Volume de la sonde GAPDH (μL)	------	1	1
DNA polymérase Master Mix Volume (μL)	10	10	10
ADNc (100 ng) Volume (μL)	2	2	2
Volume NF-H20 (μL)	7	7	7
Volume total (μL)	20	20	20

Tableau 4 : Calcul quantitatif du mélange principal de PCR (étape 6.6). Le volume total recommandé par la réaction est de 20 μL et ses composants sont le mélange maître de l’enzyme ADN polymérase (ici: 2x), les sondes GFP et / ou GAPDH, l’ADNc (100 ng au total) et l’eau sans nucléase (_NF-H20).

Figure 1 : Conception de circuits et ingénierie des cellules. (A) Outils d’ingénierie cellulaire, y compris le circuit de gènes synthétiques LITer avec des sites d’intégration FRT, l’enzyme recombinase (Flp recombinase) pour l’intégration de circuits, le médicament utilisé pour la sélection de clones génétiques appropriés et la lignée cellulaire d’intérêt utilisée pour créer les lignées cellulaires de mammifères optogénétiques souhaitées. (B) Les systèmes génétiques modifiés peuvent être intégrés à un site spécifique de TRF contenant du locus dans le génome humain. Ces loci génomiques peuvent alors exprimer une résistance aux antibiotiques spécifique ou des gènes rapporteurs fluorescents pour la sélection de cassettes génétiques correctement intégrées. L’intégration du circuit génique peut être initiée avec l’utilisation de recombinases qui reconnaissent des sites spécifiques dans la cassette génétique originale. Cela introduit un nouveau gène de sélection de la résistance aux médicaments qui peut assurer la génération de cellules correctement modifiées avec le circuit génétique souhaité. Au bas du panneau B se trouve l’architecture du circuit génique pour le système de rétroaction négative optogénétique, LITer2.0. Ce circuit est composé d’une protéine TetR auto-répressive fusionnée avec un domaine de détection lumière-oxygène-tension (LOV2), d’une séquence de liaison P2A qui permet une transcription multicistronique et GFP. Lorsque la lumière bleue est appliquée, la séquence TIP s’ouvre à partir du domaine LOV2, inhibant la protéine TetR et permettant une transcription accrue et sensible à la dose de TetR et du rapporteur GFP. La protéine TetR inhibée est incapable de se lier et de réprimer le site de l’opérateur de l’ADN, augmentant ainsi la transcription. Cette rétroaction négative maintient le bruit d’expression des gènes bas et permet un changement élevé de l’expression des gènes. FRT - cible de reconnaissance flip, HygR - résistance à l’hygromycine, LacZ - β-galactosidase, ZeoR - résistance à la zéocine, T - TetR, protéine répressrice de tétracycline, D2ir est un promoteur à base de CMV avec des sites TwtO, LOV2 est un domaine de détection de la tension de l’oxygène de la lumière, TIP est un peptide inhibiteur du tet qui inhibe la protéine TetR. Ce chiffre a été modifié par rapport à Guinn et Balázsi (2020)⁵⁵. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Programmation expérimentale de l’APL. (A) Les expériences peuvent être programmées à l’aide des outils répertoriés sur le site Web du laboratoire ^Tabor47 avec une flexibilité pour la programmation LPA stable, dynamique ou ^avancée31. En outre, les fichiers électroniques peuvent être sauvegardés pour une utilisation future pour des répliques techniques ou l’induction expérimentale de lignées cellulaires alternatives. (B) Dispositif LPA avec les composants principaux vus du haut et du côté (C). (D) Images de plaques scellées en feuille d’aluminium devant résider sur LPA. LPA - Appareil à plaque lumineuse, LED - diode électroluminescente. Des éléments de cette figure ont été modifiés par rapport à Guinn (2019)¹¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Étalonnage de l’appareil à plaques lumineuses. (A) Image représentative du LPA pour les LED réglées sur 2000 g.s. sur la base du logiciel IRIS. (B) Image du panneau (A) avec arrière-plan soustrait et seuil utilisé pour binariser l’image afin de calculer l’intensité en pixels de chaque LED. (C) Histogramme des intensités de pixels (déterminées par l’analyse d’images MATLAB) de 96 LED (4 plaques LPA) réglées sur la même valeur logicielle IRIS (par exemple, 2000 g.s.). La ligne rouge représente l’intensité moyenne des pixels LED et CV dans le panneau représente le coefficient de variation pour les 96 puits. (D) Carte thermique montrant les intensités LED de l’image LPA dans le panneau (A) normalisées à l’intensité maximale LED. (E) Carte thermique de la valeur d’étalonnage déterminée pour l’image LPA dans le panneau (A) afin de créer une production d’intensité égale pour chaque LED lorsqu’elle est programmée pour la LPA. LPA - Appareil à plaque lumineuse, LED - diode électroluminescente, CV - coefficient de variation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Randomisation des effets LPA et de la toxicité lumineuse. (A) Image représentative de deux configurations LED LPA programmables réglées de 25 à 4000 g.s, sur la base du logiciel IRIS. La première configuration est plus susceptible de permettre le passage d’erreurs systématiques telles que les effets de bord de la chaleur et de la lumière (par exemple, la rangée inférieure de la LPA affectant la ^2e rangée la plus basse). La deuxième image randomise l’emplacement des intensités, minimisant ainsi l’erreur systématique (biais) causée par les effets de bord. (B) Matrice montrant l’emplacement de randomisation des intensités lumineuses dans le LPA montré dans le panneau (A), qui peut être utilisé pour déterminer les résultats dépendant de l’intensité d’une expérience donnée. (C) Données de cytométrie en flux pour deux intensités lumineuses différentes (1250 et 4000 g.s.) pour 3 jours d’induction à l’éclairage continu. La porte noire est basée sur des cellules non induites. (D) Graphique à barres montrant des données de cytométrie en flux telles que le panneau (C) mais pour une large gamme d’intensités lumineuses. LPA - Light Plate Apparatus, FSC - diffusion vers l’avant, SSC - diffusion latérale, g.s. - valeur d’intensité lumineuse mesurée en niveaux de gris. Les cellules ^LITer11 ont présenté une diminution de la survie cellulaire sensible à la dose qui était statistiquement significative à l’aide du test ANOVA à 1 queue avec une valeur de p de 0,0022. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Images microscopiques représentatives de lignées cellulaires optogénétiques modifiées. Les cellules ont été photographiées sur un microscope inversé avec une caméra (14 bits) pour acquérir l’imagerie par contraste de phase et fluorescence. Les cellules ont été exposées pendant 5 ms pour le contraste de phase (panneau A, image représentative en champ lumineux) et 50 ms pour l’acquisition GFP/FITC (panneau B) à une intensité de source lumineuse de 100 %. Les cellules peuvent être imagées à différents moments en fonction de l’acquisition à l’état d’équilibre souhaitée ou de la réponse dynamique, ce qui conduit à un état stable. Les cellules représentent ici un titrage de durée d’impulsion à intensité fixe (1000 g.s.) allant de l’absence d’exposition à la lumière à 3 jours d’exposition à la lumière. L’unité g.s représente une valeur d’intensité lumineuse mesurée en niveaux de gris. Ce chiffre a été modifié par rapport à Guinn (2019)¹¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Cytométrie en flux de lignées cellulaires optogénétiques modifiées. Les cellules ont été analysées sur un cytomètre en flux BD LSRFortessa, avec environ 10 000 cellules recueillies dans une porte SSC-FSC (diffusion latérale vers l’avant). Les cellules ont ensuite été analysées avec le logiciel FCS Express. Des histogrammes ou des nuages de points pourraient être générés pour quantifier l’expression du gène d’intérêt (p. ex., GFP). (A) Cellules d’ingénierie tracées sur des axes SSC-FSC pour le contrôle à l’intérieur de la ligne noire. (B) Cellules LITer représentatives induites avec une durée variable d’impulsions lumineuses à 1000 g.s. jusqu’à 72 h d’induction, illustrant la dose-réponse de l’expression génique. (C) Données dose-réponse représentatives pour le titrage de l’intensité lumineuse comparant le circuit du gène LITer (système basé sur TIP) au système VVD ou ^LightOn40, qui est un système de régulation positive sans rétroaction. (D) Histogramme correspondant au système VVD, illustrant une distribution plus large (et donc un bruit d’expression génique plus élevé) par rapport au système LITer. CV est le coefficient de variation, une métrique du bruit d’expression génique. FSC - diffusion vers l’avant, SSC - diffusion latérale, FITC - isothiocyanate de fluorescéine, g.s. - valeur d’intensité lumineuse mesurée en niveaux de gris. Ce chiffre a été modifié par rapport à Guinn (2019)¹¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : PCR quantitative en temps réel de lignées cellulaires optogénétiques modifiées. Données représentatives montrant que plusieurs niveaux d’expression génique peuvent être induits et quantifiés en utilisant la lumière comme stimulus. L’unité Rq représente la quantification relative du changement de pli d’expression par rapport au contrôle. Les cellules ^LITer11 ont présenté une augmentation sensible à la dose de l’expression de l’ARN qui était statistiquement significative en utilisant le test ANOVA à 1 queue avec une valeur de p de 0,0352 et 0,0477 pour les niveaux de GFP et de KRAS, respectivement. Ce chiffre a été modifié par rapport à Guinn (2019)¹¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Immunofluorescence des lignées cellulaires optogénétiques modifiées. Données représentatives montrant des estimations du niveau de protéines basées sur l’immunofluorescence. (A) Niveaux protéiques de KRAS(G12V) et (B) niveaux de protéines d’ERK phosphorylé, que le circuit du gène LITer induit en fonction de quantités de lumière croissantes directement et indirectement, respectivement. Les données présentées en barres sont des valeurs moyennes, les barres d’erreur sont des écarts-types (n = 3). A.u. - unités arbitraires, g.s. - valeur d’intensité lumineuse mesurée en niveaux de gris. Les cellules ^LITer11 ont présenté une augmentation sensible à la dose des niveaux de protéines qui était statistiquement significative en utilisant le test ANOVA à 1 queue avec une valeur de p de 2,79E-04 et 0,016 pour les niveaux de KRAS et d’ERK phosphorylé, respectivement. Ce chiffre a été modifié par rapport à Guinn (2019)¹¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les lecteurs de cet article peuvent avoir un aperçu des étapes essentielles à la caractérisation des circuits de gènes optogénétiques (ainsi que d’autres systèmes d’expression génique), y compris 1) la conception, la construction et la validation de circuits de gènes; 2) l’ingénierie cellulaire pour l’introduction de circuits géniques dans des lignées cellulaires stables (p. ex., recombinaison Flp-FRT); 3) l’induction des cellules modifiées avec une plate-forme à base de lumière telle que le LPA; 4) caractérisation initiale des essais d’induction lumineuse par microscopie à fluorescence; et 5) la caractérisation finale de l’expression génique avec une variété de tests, y compris la cytométrie en flux, la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) ou les tests d’immunofluorescence.

De plus, les méthodes décrites ci-dessus sont hautement modulaires pour pratiquement toute architecture de circuit génique exprimant des gènes d’intérêt, avec les principales modifications potentielles du protocole à l’étape de construction du circuit et les essais effectués. Dans le cas de la construction de circuits géniques, la flexibilité du clonage moléculaire permet d’échanger ou de co-exprimer tout gène d’intérêt avec un marqueur de fluorescence avec des modifications mineures à la conception de l’amorce ou aux protocoles d’assemblage. De plus, alors que les procédures décrites ici se concentrent principalement sur la conception d’un circuit génique NF pour un contrôle précis (à faible bruit) de l’expression génique, d’autres architectures telles que la régulation positive ou la rétroaction positive (PF) peuvent être mises en œuvre pour obtenir différentes caractéristiques telles qu’un changement de pli élevé ou un bruit d’expression génique élevé, ^{respectivement56,57} . L’utilisation d’une variété d’architectures de circuits géniques (p. ex., PF, NF, etc.) peut permettre aux chercheurs d’explorer diverses questions biologiques telles que les rôles que jouent les magnitudes des niveaux de protéines et le bruit dans la résistance aux médicaments ou les métastases58. Les protocoles énumérés ici se concentrent également sur diverses méthodes de quantification de l’expression génique, mais un certain nombre de tests fonctionnels (par exemple, la motilité cellulaire, la cicatrisation des plaies, la prolifération, etc.) peuvent être ajoutés après l’acquisition par microscopie avec peu ou pas d’effet sur les méthodes précédentes. Ceci est particulièrement pertinent pour les études unicellulaires où l’optogénétique peut utiliser l’induction spatio-temporelle pour étudier des comportements tels que la dynamique d’expression ^pulsatile59.

En complément de la modularité de la méthode, le dépannage est une autre caractéristique importante de chaque protocole principal. Pour la construction de circuits, les principales différences résident dans la conception appropriée de l’amorce spécifique au circuit, tandis que les méthodes ultérieures telles que l’assemblage et l’amplification plasmidique via la croissance bactérienne sont plus standardisées et incluent généralement leurs propres procédures de dépannage étendues. L’ingénierie cellulaire peut être modifiée avec des courbes de titrage des médicaments en fonction de la lignée cellulaire utilisée. De plus, si une lignée cellulaire commerciale est utilisée, des guides de dépannage peuvent être obtenus directement auprès du fabricant de la lignée cellulaire. En outre, les effets de lumière involontaires sont importants à quantifier sur les lignées cellulaires modifiées. Par exemple, en raison des effets phototoxiques de la lumière de 470 nm, une courbe d’intensité lumineuse devrait être créée pour étudier l’induction de la mort ou des dommages dans une population. Une fois qu’une variété de valeurs de lumière sont testées, les utilisateurs peuvent créer une porte FSC-SSC ou utiliser une méthode telle que la coloration à l’iodure de propidium pour quantifier les cellules mortes / endommagées et, par conséquent, servir d’outil pour déterminer les plages de lumière appropriées à utiliser expérimentalement.

Pour le dépannage LPA, les LED peuvent produire des effets de bord de la lumière et de la diaphonie thermique avec les puits adjacents. Par exemple, les puits de haute intensité peuvent provoquer une certaine induction dans les puits adjacents s’il y a une mauvaise étanchéité ou un grand gradient de chaleur et de lumière entre les puits. Ces effets peuvent être maximaux si le LPA est programmé dans un ordre particulier (par exemple, ascendant/descendant) d’un paramètre de lumière. Pour lutter contre cela, le logiciel IRIS permet aux utilisateurs d’utiliser une matrice de randomisation pour randomiser les intensités de puits et donc réduire les erreurs systématiques. Pour résoudre les aspects de la microscopie à fluorescence, le temps d’exposition, les paramètres de gain (contrôle de la sensibilité de la caméra) et l’intensité de la source lumineuse sont les principaux paramètres qui peuvent être ajustés. Le réglage de ces paramètres peut permettre une production d’image optimale et des rapports signal/bruit idéaux, tout en évitant la sursaturation et la phototoxicité.

Pour le dépannage de la cytométrie en flux, les tensions des tubes photomultiplicateurs et le contrôle cellulaire sont les principaux aspects qui peuvent être ajustés. Le réglage de ces paramètres peut permettre des comparaisons idéales entre les conditions expérimentales et les échantillons de contrôle, l’acquisition correcte de signaux pour les signaux de fluorescence faibles ou forts, et l’exclusion des débris cellulaires ou des populations de cellules indésirables. Il convient de noter que les tensions de cytométrie en flux sont idéalement maintenues constantes d’une expérience à l’autre pour permettre des comparaisons appropriées. De plus, pour les systèmes optogénétiques nécessitant plusieurs sorties de fluorescence (p. ex., FITC et PE), les utilisateurs devront être conscients de la compensation de fluorescence étant donné la diaphonie entre les fluorophores. Dans de tels scénarios, les contrôles sont cruciaux pour déterminer les signaux de fluorescence appropriés. Les contrôles qui seront nécessaires pour que les utilisateurs puissent effectuer comprennent des billes fluorescentes, des cellules colorées avec le marqueur d’intérêt ou des cellules exprimant constitutivement la protéine de fluorescence qui peut être utilisée pour créer une matrice de compensation dans le logiciel de cytométrie en flux d’intérêt. De plus, que ce soit en utilisant un marqueur de fluorescence ou plus, tous les utilisateurs doivent mesurer régulièrement les signaux de fluorescence de chaque marqueur pour les cellules non fluorescentes, qui produisent des signaux d’autofluorescence / arrière-plan. Le dépannage qRT-PCR comprend des quantités d’ADNc variables et la conception de la sonde, qui sont souvent spécifiques au projet. Enfin, pour le dépannage de l’immunofluorescence, les concentrations d’anticorps sont la plus grande variable pour la quantification des tests, nécessitant une détermination optimale de la concentration.

Un aspect de dépannage qui est pertinent pour la plupart des méthodes ci-dessus est l’effet d’isolation de l’utilisation d’une plaque scellée avec des cellules recouvertes de papier d’aluminium. Cette méthode peut entraver l’échange de gaz carbonique nécessaire à la bonne croissance de diverses lignées cellulaires. D’après l’expérience expérimentale antérieure, ce n’était pas un obstacle significatif à la croissance cellulaire pour une expérience de 3 à 5 jours utilisant les lignées cellulaires modifiées dans ce manuscrit, mais cela pourrait devenir important pour d’autres lignées cellulaires ou durées expérimentales. Pour répondre à cette préoccupation, une adaptation mise en œuvre avec les plaques scellées comprend l’utilisation de milieux indépendants du dioxyde de carbone, ce qui n’a pas affecté la croissance des cellules utilisées dans cette étude. Il convient de noter que pour d’autres tests ou lignées cellulaires où le métabolisme, les niveaux de pH et les densités cellulaires sont importants, d’autres interventions peuvent être nécessaires, telles que le changement de milieu ou de nutriments plus fréquemment.

Les limites des méthodes décrites ici résident dans le circuit génétique utilisé, la précision de la technologie optogénétique et l’interface LPA avec d’autres équipements tels que les microscopes à fluorescence. La technologie décrite ici est abordable, rapide à construire et facile à ^valider46 pour les populations de cellules optogénétiquement modifiées. Cependant, il existe certaines limitations spatiales, telles que l’incapacité de contrôler des cellules individuelles sans modifications de la configuration d’induction lumineuse, telles que l’utilisation de dispositifs de miroir numérique (DMD), avec des avantages récemment démontrés dans les cellules ^{vivantes60,61}. En outre, les méthodes décrites ici sont limitées dans le suivi des cellules vivantes pendant la stimulation optogénétique, ne permettant que l’acquisition de données finales de l’ensemble du cours temporel expérimental.

Malgré ces limites, les méthodes optogénétiques décrites ici sont complémentaires à la technologie existante telle que les DMD, qui ont la flexibilité de contrôler des cellules individuelles en temps réel mais sont limitées par le nombre d’échantillons que l’on peut stimuler. En outre, les méthodes d’ingénierie des lignées cellulaires stables discutées ici contrastent avec les méthodes de biologie synthétique existantes qui caractérisent souvent les systèmes génétiques modifiés par des transfections transitoires. Les approches de transfection transitoire sont intrinsèquement plus bruyantes en raison de la plus grande variation du nombre de copies du circuit génique entre les cellules. En revanche, les méthodes présentées ici impliquent des variantes de cellules monoclonales, chacune contenant une copie de circuit de gène. Les lignées cellulaires stables permettent d’explorer les aspects cellulaires tels que la variation de l’expression des gènes, les effets du niveau de protéines sur les paysages phénotypiques et les méthodes unicellulaires avec une précision plus fine, car il y a une plus grande confiance que chaque cellule est identique à ses voisines.

Le travail démontre ici une plate-forme pour concevoir tout circuit de gène optogénétique intégré génomiquement d’intérêt, induire de tels systèmes avec des outils expérimentaux fiables, et les caractériser avec une variété d’expression génique et de tests fonctionnels / phénotypiques d’une manière standardisée. Les améliorations futures de ces protocoles pourraient inclure l’intégration de ces méthodes avec le suivi des cellules vivantes à l’aide d’autres technologies optogénétiques telles que les DMD, qui permettront un contrôle spatio-temporel de l’expression des gènes et des applications fonctionnelles au niveau de la cellule unique. De telles avancées permettront l’utilisation de la lumière pour produire le modèle d’expression génique d’intérêt dans les cellules individuelles, établir la dynamique de transcription / traduction, quantifier les niveaux de protéines et étudier leur rôle dans divers processus biologiques, y compris la migration cellulaire, la prolifération, les métastases et la différenciation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes	Eppendorf	951010006	reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X	Thermo Fisher Scientific	MT25053CI	reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000020	tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000055	tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap	Corning	352235	reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V	Eppendorf	22628113	equipment for mammalian culture work
Agarose	Denville Scientific	GR140-500	reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates	VWR®	60941-126	tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9518-5G	reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365PR	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140010	reagent for growing bacteria
BD LSRAria	BD	656700	tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa	BD	649225	tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine	Government Scientific Source	SIGA4919-1G	reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC	Corning	353043	plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge	VWR	22628113	instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood	N/A	N/A	instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid	BD	353047	plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask	USA Scientific	CC7682-4825	container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fischer Scientific	BP231-100	reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide	Thermo Fisher Scientific	15-585-011	reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid	Corning	353072	container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express	De Novo Software:	N/A	software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL	Corning	35-010-CV	reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose	Thermo Fisher Scientific	11-965-092	reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL	Life Technologies	10687-010	reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix	Bio-Rad Laboratories	1708890	reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C	VWR	76210-392	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U74VC	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C	VWR	76359-220	equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg	Sigma-Aldrich	L3022-250G	reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000	Life Technologies	L3000008	reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019	MathWorks	N/A	software for analyzing experimental data
Methanol	Acros Organics	413775000	reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL	VWR	20170-333	plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
MultiTherm Shaker	Benchmark Scientific	H5000-HC	equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-NDL-US-CAN	equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix	NEB	M0492S	reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)	New England Biolabs (NEB)	C3019H	bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs (NEB)	E2621L	reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera	Nikon Instruments Inc.	N/A	instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements	Nikon Instruments Inc.	N/A	software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides	IDT	N/A	reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control	Panasonic	MCO-170AICUVHL-PA	instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade	Electron Microscopy Sciences	15710-S	reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)	Invitrogen	14190144	reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x	Fisher Scientific	15140-122	reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody	Cell Signaling Technology	4370S	primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody	Sigma-Aldrich	WH0003845M1	primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System	Eppendorf	A28137	equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App	Thermo Fisher Scientific	N/A	software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody	Cell Signaling Technology	8889S	secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody	Invitrogen	A11005	secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL	Olympus Plastics	12-102	reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System	Major Science	UVCI-1200	tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene	SnapGene	N/A	software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator	Tokai Hit	INU-TIZ	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444557	reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn	Life Technologies	4326317E	qPCR Probe
Thermocycler	Bio-Rad	1851148	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated	PerkinElmer	1450-605	plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm	VWR	14673-010	reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System	VWR	89032-290	equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293	Thermo Fisher Scientific	R75007	Engineered cell line with FRT site