Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

Summary

Işığa duyarlı memeli hücrelerini güvenilir bir şekilde kontrol etmek, optogenetik yöntemlerin standardizasyonunu gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, bu çalışma, negatif geri beslemeli bir optogenetik gen devresini vaka çalışması olarak kullanarak ışığa bağlı gen ekspresyonunun çalışmasını standartlaştırmak için gen devresi yapımı, hücre mühendisliği, optogenetik ekipman çalışması ve doğrulama testlerinin bir boru hattını özetlemektedir.

Abstract

Memeli hücrelerinde güvenilir gen ekspresyon kontrolü, kullanılan yöntemden bağımsız olarak, yüksek katlama değişimi, düşük gürültü ve belirlenmiş giriş-çıkış transfer işlevlerine sahip aletler gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, optogenetik gen ekspresyon sistemleri, memeli hücrelerinde protein seviyelerinin mekansal zamansal kontrolü için son on yılda çok dikkat çekmiştir. Bununla birlikte, ışık kaynaklı gen ekspresyonunu kontrol eden mevcut devrelerin çoğu mimaride farklılık gösterir, plazmidlerden eksprese edilir ve değişken optogenetik ekipman kullanır, bu da kararlı hücre hatlarında optogenetik bileşenlerin karakterizasyonunu ve standardizasyonunu keşfetme ihtiyacı yaratır. Burada, çalışma, memeli hücrelerinde ışıkla indüklenebilir gen ekspresyonunu kontrol etmek için güvenilir gen devresi yapımı, entegrasyonu ve karakterizasyonunun deneysel bir boru hattını sunarak, bir vaka örneği olarak negatif geri beslemeli optogenetik devre kullanmaktadır. Protokoller ayrıca, optogenetik ekipmanın ve ışık rejimlerinin standartlaştırılmasının, gen ekspresyon gürültüsü ve protein ekspresyon büyüklüğü gibi gen devresi özelliklerini nasıl güvenilir bir şekilde ortaya çıkarabileceğini göstermektedir. Son olarak, bu makale optogenetiğe aşina olmayan ve bu teknolojiyi benimsemek isteyen laboratuvarlar için yararlı olabilir. Burada tarif edilen boru hattı, memeli hücrelerindeki diğer optogenetik devreler için geçerli olmalı ve memeli hücrelerinde transkripsiyonel, proteomik ve nihayetinde fenotipik düzeyde gen ekspresyonunun daha güvenilir, ayrıntılı karakterizasyonuna ve kontrolüne izin vermelidir.

Introduction

Diğer mühendislik disiplinlerine benzer şekilde, sentetik biyoloji de protokolleri standartlaştırmayı ve biyolojik sistemlerle ilgili soruları araştırmak için yüksek oranda tekrarlanabilir işlevlere sahip araçların kullanılmasına izin vermeyi ^{amaçlamaktadır1,2}. Sentetik biyolojide birçok kontrol sisteminin inşa edildiği alanlardan biri de gen ekspresyon regülasyonu ^{alanıdır3,4}. Gen ekspresyon kontrolü, fizyolojik ve patolojik hücresel durumlardaki rolleri nedeniyle çok önemli hücresel özellikler olan hem protein seviyelerini hem de değişkenliği (gürültü veya varyasyon katsayısı, CV = σ / μ, ortalamanın standart sapması olarak ölçülür) hedefleyebilir5,6,7,8. Protein seviyelerini ve gürültüyü kontrol edebilen birçok sentetik sistem4,9,10,11,12 tasarlanmış ve araçlar arasında protokolleri standartlaştırmak için fırsatlar yaratılmıştır.

Son zamanlarda ortaya çıkan gen ağlarını kontrol edebilen yeni bir araç seti optogenetiktir ve gen ekspresyonunu kontrol etmek için ışığın kullanılmasını sağlar13,14,15,16,17. Kimyasal öncüllerine benzer şekilde, optogenetik gen devreleri, bakterilerden memelilere kadar herhangi bir hücre tipine sokulabilir ve ilgilenilen herhangi bir aşağı akış geninin ekspresyonuna izin ^verir18,19. Bununla birlikte, yeni optogenetik araçların hızlı bir şekilde üretilmesi nedeniyle, genetik devre mimarisinde, ekspresyon mekanizmasında (örneğin, plazmid bazlı ve viral entegrasyon) ve ışık sağlayan kontrol ekipmanlarında farklılık gösteren birçok sistem ortaya çıkmıştır11,16,20,21,22,23,24,25 . Bu nedenle, bu, gen devresi yapımı ve optimizasyonu, sistem kullanım yöntemi (örneğin, entegrasyon ve geçici ifade), indüksiyon için kullanılan deneysel araçlar ve sonuçların analizi gibi optogenetik özelliklerin standardizasyonu için yer bırakmaktadır.

Memeli hücrelerinde optogenetik protokollerin standartlaştırılmasında ilerleme kaydetmek için, bu protokol, örnek olarak HEK293 hücrelerine (insan embriyonik böbrek hücresi hattı) entegre edilmiş bir negatif geri besleme (NF) gen devresi kullanarak memeli hücrelerinde optogenetik sistemlerin mühendisliğini yapmak için deneysel bir boru hattını açıklamaktadır. NF, standardizasyonu göstermek için ideal bir sistemdir, çünkü doğada oldukça bol miktarda bulunur26,27,28^, protein seviyelerinin ayarlanmasına ve gürültünün en aza indirilmesine izin verir. Kısacası, NF, bir baskılayıcı tarafından kendi ekspresyonunu yeterince hızlı bir şekilde azaltarak hassas gen ekspresyon kontrolüne izin verir, böylece herhangi bir değişikliği kararlı bir durumdan uzaklaştırır. Kararlı durum, her bir indükleyici konsantrasyonu için yeni bir kararlı duruma ulaşılana kadar daha fazla protein üretimine izin vermek için baskılayıcıyı inaktive eden veya ortadan kaldıran bir indükleyici tarafından değiştirilebilir. Son zamanlarda, gen ekspresyonunun geniş dinamik bir tepkisini üretebilen, düşük gürültüyü koruyabilen ve mekansal gen ekspresyon kontrolü potansiyeline izin veren ışık uyaranlarına cevap verebilen mühendislik ürünü bir NF optogenetik sistemi ^{oluşturuldu11}. Işık kaynaklı tunerler (LITers) olarak bilinen bu araçlar, canlı hücrelerde gen ekspresyon kontrolüne izin veren daha önceki sistemlerden esinlenmiştir4,10,29,30 ve uzun süreli gen ekspresyon kontrolünü sağlamak için insan hücre hatlarına istikrarlı bir şekilde entegre edilmiştir.

Burada, LITer'i örnek olarak kullanarak, ışığa duyarlı gen devreleri oluşturmak, bir Işık Plakası Aparatı (LPA, bir optogenetik indüksiyon donanımı)³¹ ile gen ekspresyonunu indüklemek ve mühendislik yapılmış, optogenetik olarak kontrol edilebilir hücre hatlarının özel ışık uyaranlarına tepkilerini analiz etmek için bir protokol özetlenmiştir. Bu protokol, kullanıcıların keşfetmek istedikleri herhangi bir işlevsel gen için LITer araçlarını kullanmalarını sağlar. Ayrıca, aşağıda özetlenen yöntemleri ve optogenetik ekipmanı entegre ederek çeşitli devre mimarilerine (örneğin, olumlu geri bildirim, negatif düzenleme vb.) sahip diğer optogenetik sistemler için uyarlanabilir. Diğer sentetik biyoloji protokollerine benzer şekilde, burada özetlenen video kayıtları ve optogenetik protokoller, kanser biyolojisi, embriyonik gelişim ve doku farklılaşması dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli alanlarda tek hücreli çalışmalarda uygulanabilir.

Protocol

1. Gen devresi tasarımı

1. Tek bir gen devresinde/plazmidinde birleştirilecek genetik bileşenleri seçin (örneğin; memeli DNA entegrasyon dizisi motifleri32, ışığa duyarlı elementler33 veya fonksiyonel ^genler34).
2. Herhangi bir genetik mühendisliği ve/veya moleküler klonlama yazılımı kullanarak, DNA dizilerini daha sonra kullanmak ve referans almak üzere saklayın, her diziye açıklama ekleyin ve gerekli tüm özellikleri inceleyin (örneğin, START kodonları, düzenleyici veya çevrilmiş diziler)³⁵.
3. Genel gen devresi tasarımına göre parçaları geliştirin veya ^benimseyin36. Örnek olarak, LITers11'de olduğu gibi optogenetik baskılayıcılar için, ışığa bağlı bozunma37,38 veya bir baskılayıcının DNA bağlanma ^{yeteneğinin39} inaktivasyonu yapabilen bir alan için kodlayan bir gen dizisini birleştirin, baskılayıcı genin bitişiğinde ve çerçevesinde^, (örneğin^, TetR)⁴.
   1. Optogenetik aktivatörler için, ışık kaynaklı DNA bağlanması üzerine gen ekspresyonunu destekleyen bir aktivatör ^alanının40 varlığından emin ^olun41. Negatif veya pozitif otoregülasyon için, regülatör genin promotörünün içinde veya yukarısında düzenleyici bir bağlayıcı bölgenin varlığından emin olun (örneğin, TetR'yi ifade eden promotörün içindeki veya yukarısındaki tetO siteleri)⁴².
4. Her gen devresi için moleküler klonlama yazılımını kullanarak DNA dizisi amplifikasyonu veya plazmidin dizilimi için primerleri tasarlayın.
5. Moleküler klonlama yazılımının yerleşik özellikleri (örneğin, dizi hizalaması) aracılığıyla plazmid yapımı için primerleri hesaplamalı olarak doğrulayın.
6. Üreticiden oligonükleotid astarları sipariş edin. Bu çalışmada inşa edilen ve kullanılan plazmidler, tasarlanan ve kullanılan astarlarla birlikte orijinal destekleyici ^malzemede11 bulunabilir.
7. Astarları çift damıtılmış suda (_ddH2O) 100 mM stok konsantrasyonuna kadar seyreltin.
8. PCR için 100 mM stok astarlarının stokunu 10 mM konsantrasyona seyreltin.
9. PCR karışımını 1 μL ileri astar, 1 μL ters astar, genomik için toplam 0.5-500 ng kütleye 1 μL şablon DNA veya plazmid veya viral DNA için 0.5 pg-5 ng, 12.5 μL DNA polimeraz 2x ana karışımı (veya üreticinin seyreltme faktörünü karşılayan hacim) ve toplam 25 μL'lik reaksiyon hacmi için 9.5 μL _ddH2O ile hazırlayın.
10. PCR karışımını seçilen enzime bağlı olarak uygun ayarlarda bir termosikler içinde inkübe ^edin43. Önerilen reaksiyon döngüleri şunları içerir:
    Adım 1: 95 °C'de 30 s ilk denatürasyon adımının bir döngüsü.
    Adım 2: 98 °C'de 5 sn denatürasyon adımının 40 döngüsü.
    Adım 3: 65 ° C'de 30 sn'lik tavlama adımının bir döngüsü (daha önce tasarlanan astarlar tarafından belirlenir).
    Adım 4: 72 ° C'de 1 dakikalık bir uzatma döngüsü (~ 1 kilobase (kb) şablon parçası uzunluğu).
    Adım 5: 72 ° C'de 2 dakikalık bir uzatmanın bir döngüsü.
    Jel elektroforezi ile test edilene kadar reaksiyonu 4 ° C'de tutun. Bu protokol, kullanılan reaktiflere (örneğin, polimeraz ve tamponlar) bağlı olarak değişecektir.
11. Lineer PCR ürünlerini tek bir dairesel DNA vektörüne bağlamak için gerekli olan bir DNA montaj reaksiyonunda kullanılacak tüm parçaları yükseltmek için adım 1.9'u tekrarlayın.
12. PCR ürünlerini% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın, ardından istenen uzunluktaki bantları saflaştırın.
13. Ana karışımı bir DNA montaj reaksiyonu için hazırlayın (Tablo 1).
    NOT: Bu örnekte, ana vektör, genel montaj sonuçlarında önemli değişikliklere neden olmadan PCR adımlarının verimliliğini artırmak için iki parçaya ayrılmıştır.
14. DNA montaj reaksiyonu ana karışımını 1 saat boyunca 50 ° C'de bir termosikler içinde inkübe edin (DNA montaj reaktif protokolünde aksi belirtilmedikçe) ve reaksiyon ürününü bakteriyel transformasyon için kullanmak üzere reaksiyonu 4 ° C'de saklayın.
15. Yetkili E. coli (Escherichia coli) hücrelerini ve ilgili bakteriyel dönüşüm protokolünü kullanarak bakteriyel transformasyonu (kimyasal veya elektroporasyon) ayarlayın. Transformasyondan sonra, dönüşüm karışımını plakalamak için seçilen bakteriyel seçim belirtecini (örneğin, Ampisilin) içeren bakteriyel Luria-Bertani (LB) agar plakalarını kullanın. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe ^edin44.
16. Ertesi gün plakaları kontrol edin. Kolonileri aşılamak için, plakalardan bireysel kolonileri seçin ve bunları kültür tüplerinde karşılık gelen bakteri seçim belirteci ile sıvı bir LB suyunda yeniden askıya alın. Bir çalkalayıcı inkübatörde 37 ° C'de, gece boyunca 300 rpm'de inkübe edin.
17. Plazmid DNA'sını bakteri kültüründen çıkarmak için plazmid hazırlama protokolünü gerçekleştirin.
18. Devreyi iki adımda doğrulayın. İlk olarak, yaklaşık plazmid ürününün elde edilip edilmediğini görmek için kısıtlama enzimlerini ham doğrulama olarak kullanarak bir test sindirimi gerçekleştirin. İkincisi, test sindirimi geçilirse / onaylanırsa, plazmidi daha sonra tasarım yazılımında beklenen dizilimle karşılaştırmak üzere kesin DNA dizisini elde etmek için bir Sanger dizileme tesisine (veya mevcut ekipmanı kullanarak işleme) gönderin.
    1. Test sindirimini gerçekleştirmek için, kullanılan moleküler klonlama yazılımına dayanarak en az iki parça üreten en az iki kısıtlama enzimi seçin. Enzimler seçildikten sonra, kullanılan enzimlere bağlı olarak her enzimden 1 μL, üretilen DNA'nın 5 μL'si ve uygun tuzlar ve tamponlarla 13 μL su ekleyerek test örneklerini hazırlayın. Reaksiyonu 1 saat boyunca 37 ° C'de veya enzim üreticisinin önerdiği gibi inkübe edin. Test sindirim ürünlerini% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın ve bantların doğru olup olmadığını belirleyin.
       NOT: Bantlar doğruysa, sıralamaya geçin.
    2. Dizileme yapmak için, yazılımda depolanan DNA'ya dayalı primerler üretin, böylece primerlerin tavlama bölgeleri yaklaşık 500 bp (baz çiftleri) birbirinden ayrılır ve ilgilenilen parçayı (gen devresi bileşeni) veya tam plazmidi kapsar. Astarları saf nükleaz içermeyen su (_NF-H2O) ile 10 mM konsantrasyona kadar seyreltin. 0,2 mL'lik bir tüpe 1 μL 10 ng / μL DNA, 1 μL astar ve 8 μL _NF-H2O ekleyerek dizileme örneklerini hazırlayın. Bunu her astar için tekrarlayın.
       NOT: Numuneler hazırlandığında, bunları dizileme tesisine bırakın ve sonuçları moleküler klonlama yazılımı kullanarak plazmid dizisi ile karşılaştırın.
19. Bu adımda, gen devrelerini içeren plazmidleri uygun hücre hattına entegre etmek için yaklaşık 100-1000 ng / μL DNA örneği üretin.

2. Kararlı hücre hattı mühendisliği

1. Bir memeli ekspresyon vektöründen ilgilenilen proteinin yüksek düzeyde ekspresyonunu sağlayan kararlı alt çizgilerin hızlı bir şekilde üretilmesi için tasarlanmış bir memeli hücre hattı sipariş edin. Hücre tipi ve hücre hattı mühendisliğinin kolaylığı, kullanıcıların neyi tercih ettiğine veya neyi başarmayı amaçladığına bağlı olarak değişebilir.
   1. Örneğin, kullanıcılar minimum ara adımlarla hücre hattı mühendisliğini tercih ederse, transkripsiyonel olarak aktif bir genomik lokusta tek bir kararlı entegrasyon bölgesi (örneğin, FRT) içeren hücreleri sıralayın. Daha nüanslı hücre mühendisliği tercih edilirse, CRISPR / Cas9 gibi genetik mühendisliği araçlarını kullanarak tercih edilen yerlerde entegrasyon siteleri oluşturun.
2. 37 °C'de nemlendirilmiş havada %5 _CO2 içinde hücre yetiştirin. Büyüme koşullarını hücre tipi için gerektiği gibi ayarlayın.
3. Yukarıda tasarlanan gen devrelerini transfekte etmek istenen hücrelerden elde edilen önceki adımlarda kararlı bir hücre-hat üretim sürecine başlanır. Bunu başarmak için, uygun rekombinaz (örneğin, Flp-FRT rekombinasyonu için Flp-rekombinaz) veya elektroporasyon gibi diğer yöntemlerle gen devresi DNA'sının bir lipozom ^{karışımını45} kullanın.
4. Transfeksiyondan iki gün sonra, hücreleri% 25 akıcılığa bölün.
5. Hücreleri parçaladıktan altı saat sonra, medyayı 50 μg / mL higromisin antibiyotik (veya plazmid yapımı sırasında seçilen memeli antibiyotik direnç genine karşılık gelen başka bir antibiyotik ajanı) içeren taze bir ortamla değiştirerek antibiyotik seçimine başlayın.
   NOT: Gen devresi yapımında kullanılan ve her biri farklı bir öldürme eğrisine sahip olan çeşitli memeli antibiyotik direnç genleri vardır. Bu nedenle, devre yapımı için hangi memeli antibiyotik direnç geni seçilirse seçilsin, ilgili hücrelerde uygun bir öldürme eğrisi çalışılmalıdır. Bu adım, gen devresi yükünü içeren hücrelerin zenginleştirilmesini sağlarken, sisteme sahip olmayanlar öldürülür.
6. Hücrelerin antibiyotik seçim ortamında büyümesine izin verin, plaka veya şişe birkaç düzine odağa sahip olana kadar her 2-3 günde bir taze ortama geçin. Yapışkan kültürleri, birleşime ulaşmadan önce kütük aşamasındayken geçiş.
7. Yeterince fazla odak olduğunda, hücreleri Kalsiyum, Magnezyum ve Sodyum Bikarbonat olmadan Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) 1 mL% 0.25 tripsin,% 0.1 EDTA ile% 0.1 EDTA ile birkaç dakika boyunca tripsinize edin. Tripsini taze ortamlarla nötralize edin ve tüm hücreleri taze bir kaba geçirin.
8. Taze kaptaki hücreler% 80 -% 100 birleştiğinde,% 45 eski ortam,% 45 taze ortam ve% 10 DMSO karışımında dondurun. Kalan hücreleri steril bir tüpe aktarın ve monoklonal hücreleri 96 delikli bir plakaya izole etmek için tek hücreli sıralama yapın.
9. Monoklonal sıralamadan yaklaşık 2-3 hafta sonra, 96 delikli plaka içindeki kuyucuklarda odaklar bulunmalıdır. Yaklaşık% 50 -% 60 birleştiğinde, hücreleri 12 delikli bir plakaya bölün.
10. 12 delikli plaka% 80 -% 100 birleştiğinde, T-25 şişesi ile tedavi edilen bir doku kültürüne bölünür. T-25 şişesindeki hücreler% 80 -% 100 birleştiğinde, hücreleri dondurun ve monoklonal hücre hatlarının karakterizasyonu ve testi için bir geçiş sağlayın.
    1. Monoklonal hücre hatlarını, indüklenen floresan muhabir üretimine dayalı gen ekspresyon profillerini raporlamak için mikroskopi ve akış sitometri testleri ile karakterize edin. Floresan antikor etiketleme ve immünofloresan testi ile fonksiyonel protein üretimini doğrulayın. Transkripsiyonel seviyedeki gen ekspresyon indüksiyonunu kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ile test edin. Klonların yerel ve tüm genom dizilimi yoluyla genetik dizilimi ve entegrasyon doğruluğunu doğrulayın.

3. Işık plakası aparatı indüksiyon tahlilleri

1. Mühendislik hücrelerinin ışık indüksiyonu için kullanılacak bir LPA ^cihazı31,46 oluşturun. Kısaca, gen ekspresyonunu kontrol etmek için kullanılacak LPA'yı oluşturmak için birkaç geniş adım çok önemlidir. Bunlar arasında 3D baskı LPA çerçeve bileşenleri, devre kartı yapımı, mikrodenetleyici programcısı aracılığıyla devreyi programlama, bileşenleri son LPA'ya monte etme, hafıza kartını IRIS yazılımı ile programlama ve bitmiş cihazı kalibre etme sayılabilir. Daha kapsamlı bir açıklama için, yukarıdaki referanslara bakın.
   1. 3D parçaları Gerhardt et al. (2016 ve 2019) ^31,46'da belirtildiği gibi yazdırın.
   2. Devre kartını Gerhardt et al. (2016 ve 2019) ^31,46'da belirtildiği gibi monte edin.
   3. Ürün yazılımını, Gerhardt et al. (2016 ve 2019) 31,46'da belirtildiği gibi mikrodenetleyici programcısını kullanarak birleştirilmiş LPA ^devresine ekleyin.
   4. 3D baskılı parçaları ve monte edilmiş devre kartını Gerhardt et al. (2016 ve 2019) ^31,46'da belirtildiği gibi birleştirin. Bu, montaj plakasını, devre kartını, LED (ışık yayan diyotlar) ara parçasını, plaka adaptörünü, 24 delikli bir plakayı, bir plaka kapağını, montaj cıvatalarını ve kanat somunlarını ve istifleme bileşenlerini filme alınan videoda ve Şekil 2'de gösterildiği gibi almayı içerir.
   5. Hafıza kartı programlaması ve cihazın kalibrasyonu için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
2. Işık Plakası Aparatı (LPA)³¹ için bir SD kart programlamak ve bir optogenetik deneye başlamak için gereken uygun ışık koşullarını keşfetmek için Tabor Lab web ^sitesinde47 bulunan IRIS yazılımını kullanın.
   NOT: IRIS yazılımı, Tabor Lab tarafından geliştirilen LPA olarak bilinen optogenetik elektronik donanımı programlamak için web tabanlı bir uygulamadır. Yazılım, LPA donanımının her bir kuyucuğundaki bireysel ışık yayan diyotları (LED'ler) kontrol eden göreceli IRIS değerlerinin programlanmasına izin verir.
3. LPA (4 x 6) açılır seçeneğini belirleyin ve ardından uygun aydınlatma yaklaşımını (Sabit Durum, Dinamik, Gelişmiş) tıklayın.
   NOT: Bu makale için, tüm tahliller kararlı durum örneklerine odaklanacaktır. Bununla birlikte, gelişmiş ayar örnekleri, darbe süreleri ve görev döngüsü rejimleri için kullanılabilir.
4. Üst veya alt LED'lerin, plakanın kuyularına karşılık gelen hücrelere değerler girerek aydınlatılıp aydınlatılmayacağını seçin. Bu çalışmada kullanılan LPA'lar için tüm deneylerde üst konuma yerleştirilen mavi LED'ler kullanılmıştır. Her LED, bir kez programlandıktan sonra, sabit bir ışık yoğunluğu ile sürekli ışığa maruz kalma sağlayabilir. IRIS yazılımı, programlanabilen 4096 yoğunluk seviyesine izin verir.
5. LED konumları seçildikten sonra, istenen deneysel anahat için yoğunluk değerlerini girin. Örneğin, plaka başına üç teknik kopya ile 8 farklı ışık yoğunluğu (veya darbe süreleri veya görev döngüsü) girin (Tablo 2). G.s., IRIS yazılımında LPA programlaması için kullanılan ışık yoğunluğu seviyesi ölçüm değerleri olan gri tonlamalı birimleri ifade eder.
   1. IRIS deney dosyalarını tasarlarken, LPA cihazındaki bitişik kuyucuklardan gelen kenar etkilerini, mavi ışığa maruz kalma yoğunluğunun artmasından kaynaklanan ışık toksisitesini ve istenen doz-yanıt türünü (örneğin, monotonik ve monotonik olmayan) belirlemeyi unutmayın.
   2. Kullanıcılar LPA'daki hücreleri belirli bir ışık parametresinin artan / azalan sırasına göre programlarsa (örneğin, yoğunluk), kuyular ışık çapraz konuşmasının kenar etkilerini veya hatta bitişik kuyuları etkileyebilecek ısıyı üretebilir. Bu, deneyler tamamlandığında ölçülen çıktıların sonucunu yanlışlıkla etkileyebilir. Bunu hafifletmek için, kullanıcılar kenar etkilerini en aza indirgeyerek kuyu konumlarını karıştırmak için IRIS yazılımında bir randomizasyon matrisi uygulayabilirler. Aşağıdaki Temsili Sonuçlar'da bir örnek açıklanmıştır (Şekil 4A-B).
   3. Ek olarak, mavi ışığın daha yüksek yoğunluklarının hücresel büyümeye ve canlılığa müdahale ettiği ^{bulunmuştur48}. Bu nedenle, ışık toksisitesini azaltmak için, araştırılan modaliteye bağlı olarak bir ışık yoğunluğu, darbe süresi veya görev döngüsü yanıt eğrisi üretmek önemlidir.
      1. Örneğin, 24 delikli plaka başına üç kopya ile 8 ışık yoğunluğu değerini, ışıksızlıktan LPA'nın maksimum yoğunluğuna kadar bir aralıkta programlayın. Daha sonra, bu örnekleri, her ışık değerinde popülasyon hücresi sağkalımını (ölü hücreler / hücresel enkaz dahil toplam olaylarla karşılaştırıldığında canlı hücreler) ölçmek için bir SSC-FSC kapısı veya propidium iyodür gibi canlı bir leke içeren bir akış sitometresinde çalıştırın.
      2. Daha sonra, deney düzeni için ideal popülasyon sağkalım miktarını belirleyin, çünkü herhangi bir uyaran proliferasyonu, gen ekspresyonunu veya hayatta kalmayı olumsuz yönde etkileyebilir (örneğin, uygun bir ödünleşim olarak% 80 hücre sağkalımını ayarlamak). Örneğin, bu çalışmada, kalibre edildikten sonra, yoğunluk 3000 g.s. birimini (LPA cihazının maksimum yoğunluğunun ~ 3/4'ü) geçmedi. Bunun bir örneği aşağıdaki Temsili Sonuçlar'da açıklanmıştır.
   4. Toksisite nedeniyle ışık değerlerini kısıtlamaya ek olarak, kullanıcılar monoton yanıtın aralığı gibi doz-yanıtın belirli bir bölümünü karakterize etmek için ışık değerlerini kısıtlamak isteyebilirler.
      1. Bunu başarmak için, başlangıçta, istenen doz-yanıtı belirlerken analiz edilen yönteme bağlı olarak çok çeşitli ışık yoğunluklarını, nabız sürelerini veya görev döngülerini tarayın (Tablo 2), örneğin gen ekspresyonunun monotonik bir doz-yanıt için artan ışık değerleriyle pozitif olarak ilişkili olduğu durumlarda.
      2. İlgilenilen ışık aralığını belirlemek için, birden fazla LPA'nın eşdeğer ışık miktarları sağlamak ve aşağıda özetlenen hücre kültürü çalışmalarına veya tahlillerine devam etmek için kalibre edilip edilmediğine bağlı olarak, farklı yoğunlukta / darbe süresinde / görev döngüsünde / vb. 24 kuyuya kadar veya daha fazla kuyucuk (örneğin, 48, 72, 96, vb.) Bu nedenle, istenen gen ekspresyonunu veren aralık aralığını belirlemek için geniş bir doz ışık uyaranı aralığına sahip bir optogenetik sistemin karakterizasyonuna başlayın ve daha sonra bu rafine doz aralığında deneyler yapın.
      3. Örneğin, bu çalışmada, bir kez 3000 g.s. birim toksik ışık yoğunluğu eşiği olarak belirlendi; Bu eşik, aşağıda özetlenen tahliller için ışığın üst sınırı olarak kullanılmıştır (örneğin, immünofloresan).
         NOT: Yukarıdaki adımlar, LPA'nın optik kalibrasyonundan bağımsızdır ve her optogenetik sistem için moleküler düzeyde kalibrasyona atıfta bulunur.
6. IRIS'te uygun ışık yoğunluğu değerleri programlandıktan sonra, dosyaları indirmek ve aktarmak için USB 3.0 çıkışlı bir hafıza kartını LPA'ya takın.
7. LPA'nın kalibrasyonu ^{tamamlanırsa31}, ışık indüksiyon testinin başlatılması için hücre kültürü çalışmasına geçin. Kalibrasyon yapılmadıysa, LPA mikrodenetleyici programcısı ile programlandıktan sonra bir Görüntü analiz yöntemi (adım 3.7.1-3.7.3) kullanarak LPA'yı kalibre edin.
   1. LPA'yı Gerhardt et al. (2016) 31 tarafından tanımlandığı gibi aynı IRIS seviyesine sahip olacak şekilde kısaca ^{programlayın}.
      NOT: Kalibrasyon için, LPA 2000 g.s. değerine sahip olacak şekilde programlanmıştır.
   2. Cihaz hafıza kartıyla programlandıktan ve sıfırlama düğmesine (LPA'daki fiziksel düğme) basıldıktan sonra, tüm cihazın bir görüntüsünü alın (örneğin, jel istasyon görüntüleyici, tarayıcı cihazı, vb.). Kalibrasyon için, cihaz 180° döndürülmüş olarak iki görüntü elde edin.
   3. Ardından, LPA plakasındaki LED yoğunluğundaki değişkenliği göstermek ve yoğunluğu kuyucuklar arasında eşit hale getirmek için LED kompanzasyon değerlerini hesaplamak için Gerhardt et al. (^2016)31 tarafından tasarlanan açık kaynaklı yazılımı kullanın. Bunun bir örneği aşağıda temsil edilen sonuçlarda açıklanmıştır (Şekil 3). Bu kalibrasyon tamamlandıktan sonra, ışık indüksiyon testinin başlatılması için hücre kültürü çalışmasına geçin.
8. Gen ekspresyonu üzerindeki ışık indüksiyon etkilerini araştırmak için önceki bölümden mühendislik monoklonal hücrelerinin şişelerini edinin.
9. Eski medyayı şişeden çıkarın.
10. Hücrelere 1 mL tripsin ekleyin ve 5 dakika boyunca inkübe edin.
11. 5 dakika sonra, gerekli kimyasallarla desteklenmiş 4 mL Dulbecco modifiye Eagle ortamı (DMEM veya diğer istenen ortamlar) ekleyerek tripsini nötralize edin (bu çalışmada 50 μg / mL higromisin,% 1 penisilin / streptomisin çözeltisi,% 10 fetal sığır serumu, FBS kullanılmıştır).
12. Toplam 500 μL hacimde 24 delikli siyah bir plakaya kuyucuk başına ~ 75.000 hücre ekleyin. Tohumlanan hücrelerin sayısı, istenen deneyin süresine ve kullanılan hücre tipine bağlı olarak değişebilir.
    NOT: Ek olarak, hücre tohumlama yoğunluğunun kültür bakımını ve potansiyel olarak deneyin süresini etkilediğini unutmayın. Kuyu başına daha az sayıda hücreden başlamak, kültürün akıcılığa ulaşmadan önce daha uzun zaman süreleri sağlar. Ayrıca, ilgilenilen gen devrelerine entegre edilen optogenetik bileşenlerin türü, gen ekspresyonunun kararlı bir duruma ulaşmasını etkileyecek ve bu nedenle deneylerin süresini etkileyecektir. Dikkate alınabilecek diğer faktörler hücre hattına özgü büyüme oranları, ortam bileşimi ve koşullu büyüme etkileridir (yani, ışık).
13. Kaplamadan sonra, hücreleri 2-6 saat boyunca yerleşmelerini sağlamak için% 5 _CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.
14. Kuluçkadan sonra, hücreleri bir doku kültürü başlığına aktarın, plastik kapağı çıkarın ve plakanın üstüne yapışkan bir folyo şerit ekleyin (Şekil 2D). Bu adım, kuyuların üst ve yanları kaplandığı için kuyular arasında minimum ışık aktarımına izin verir ve ışık artık yalnızca LED'in yerleştirildiği kuyunun altından girebilir.
15. Plakayı LPA'nın takılı 3B parçalarına yerleştirin. Ardından, plakayı, her köşedeki cihaz vidalarının üzerine oturan 3D baskılı LPA kapağıyla örtün.
16. Cihazı güç kaynağına takın ve güncelleştirilmiş LPA deneme ayarlarının uygulandığından emin olmak için LPA cihazındaki sıfırlama düğmesine basın.
17. Orijinal tohumlama yoğunluğuna, hücre hattına özgü büyüme hızına ve büyüme koşullarına bağlı olarak deney sistemi içindeki hücreleri uygun bir süre boyunca inkübe edin. Bu örnekte, hücre çizgileri, gen ekspresyonunun kararlı bir duruma ulaşması için sürekli olarak 3 gün boyunca indüklenmiştir. Bununla birlikte, birçok optogenetik sistemin (örneğin, VVD) kararlı durum gen ekspresyonuna çok daha erken (örneğin, 24 saat) ulaşabileceği ve bu nedenle deneysel indüksiyon sürelerinin gerektiğinde azaltılabileceği veya uzatılabileceği belirtilmelidir.
18. Işık indüksiyon deneyinin sonunda, mühendislik hücre hatlarını karakterize etmek için aşağıdaki dört tahlilden herhangi biri için örnekleri kullanın (bölüm 4-7).

4. Işık kaynaklı mühendislik hücrelerinin floresan mikroskopisi

1. İndüksiyondan 24-72 saat sonra, LPA'daki hücreleri inkübatörden çıkarın ve bir doku kültürü başlığına yerleştirin.
2. Folyo şeridini çıkarın ve plakayı 1-2 dakika bekletin. Bu, hemen plakaya yerleştirilirse, plastik kapak üzerinde yoğuşmanın oluşmasını önler.
3. 1-2 dakika oturduktan sonra, orijinal plastik kapağı tekrar tabağa koyun.
4. Hücreleri uygun faz kontrastı veya floresan mikroskobu ile görüntüleyin.
5. Cihaza bağlı olarak, pozlama süresini, ışık kaynağı yoğunluğunu ve mühendislik hücrelerini görüntülemek için kazancı ayarlayın. Bu deneyde, aşağıdaki parametreler uygulanmıştır: FITC/GFP (yeşil floresan proteini) ışık kaynağına maruz kalma süresi için 50 ms ve her biri için% 100 yoğunlukta faz-kontrast maruz kalma süresi için 1-5 ms.
   NOT: Optimal maruz kalma sürelerinin, kazanç seviyelerinin ve ışık kaynağı yoğunluklarının, floresan muhabirindeki aşırı doygunluğu en aza indirmek, hücresel hasarı en aza indirmek ve nitel ve nicel analiz için yeterli görüntüleri yakalamak için genellikle bu çalışmanın deneyiminden ampirik olarak türetildiğine dikkat edilmelidir. Bu parametrelerin her birinin seviyelerini belirlerken, akılda tutulması gereken hususlar, sinyal-gürültü oranlarını en üst düzeye çıkarmak, fototoksisiteyi en aza indirmek, floresan sinyallerinin aşırı doygunluğunu en aza indirmek ve zayıf floresan sinyallerini yükseltme yeteneğini arttırmayı içerir.
   1. Bu parametreleri büyük ölçüde geçici olarak optimize edin; Bununla birlikte, önceki deneysel değerler (örneğin, floresan muhabirinin aşırı doygunluğuna neden olan ışık kaynağı yoğunluğu), uygun olduğunda gelecekteki deneysel ayarlara rehberlik edebilir. Örneğin, bir devreden (LITer1.0) veya deney kurulumundan (örneğin, ışık yoğunluğu) kazanç ayarları, maruz kalma süreleri ve ışık yoğunluğu başlangıç değerleri, benzer ancak farklı bir gen devresine (LITer2.0) ¹¹ veya farklı bir ışık modalitesine (örneğin, hafif hizmet döngüsü) geçerken başlangıç noktası olarak kullanılabilir.
6. Mikroskopi yazılımına programlanmış bir koordinat şablonuyla plaka görüntülemeyi kolaylaştırın, böylece tüm plaka boyutu (örneğin, 24 kuyu) kuyu başına birden fazla görüntü konumundan otomatik görüntü alımına sahip olun.

5. Işık kaynaklı mühendislik hücrelerinin akış sitometrisi

1. İndüksiyondan 24-72 saat sonra, hücreleri inkübatördeki LPA'dan veya görüntülemeden sonra mikroskoptan çıkarın ve doku kültürü başlığına yerleştirin.
2. Doğrudan LPA'dan çıkarılırsa, folyo şeridini çıkarın ve plakanın bir veya iki dakika oturmasını bekleyin.
3. Ortamı her bir kuyucuktan aspire edin (tüm kuyular kullanılıyorsa tüm 24 delikli plakadan).
4. Her bir oyuğa 100 μL% 0.25 tripsin ekleyin, plakayı plastik bir kapakla örtün ve inkübatöre geri yerleştirin.
5. Hücreleri inkübatörde 5 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
6. 5 dakika sonra, plakayı çıkarın ve doku kültürü başlığına geri koyun.
7. Her tripsinizli her birini 400 μL DMEM ile iyice nötralize edin.
8. 5 mL'lik bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpü, hücre süzgeci (veya tamamen tripsinize edilmemiş büyük hücre kümelerini çıkarmak için filtrelenebilen uygun akış sitometri tüpü) ile her bir kuyucuğa karşılık gelen bir adla etiketleyin.
9. Hücre kümelerini kırmak ve akış sitometrisi için tek hücreli numuneler oluşturmak üzere her bir kuyucuğun içeriğini 6-8 kez yukarı ve aşağı pipetlemek için bir P1000 pipet ^kullanın49.
10. Her bir kuyucuğun tüm içeriğini (~ 500 μL) süzgeçle etiketli tüplere aktarın.
11. Hücreleri doğru dalga boylarındaki lazerlerle uygun akış sitometri cihazına getirin (buzda veya buzda hücrelere sahip tüpleri getirebilir).
    NOT: Bu çalışmada kullanılan akış sitometresi, üniversite hastanesinde bulunan çekirdek bir tesisin parçasıydı.
12. Akış sitometrisi yazılımındaki kalıntıları ve hücresel kümeleri dışlamak için uygun boyut ve ayrıntı düzeyindeki tek hücreleri yakalamak için bir ileri ve yan saçılma kapısı (sırasıyla FSC ve SSC) oluşturun.
13. Kapı ayarlandıktan sonra, uygun kapıyla yaklaşık 10.000 hücreyi yakalayın. Bu sayıyı, kullanıcıların aradığı hücresel veri miktarına bağlı olarak ayarlayın. Deneydeki hücreleri içeren her tüp için tekrarlayın.
14. Deney tamamlandıktan sonra, verileri analiz için mevcut akış sitometrisi veri yazılımına aktarın.
15. Bir FSC-SSC kapısı oluşturun (edinme sırasında daha önce olduğu gibi) ve bunu her deneysel veri grubuna uygulayın. Bu makalede bu kapıyı oluşturmak için indüklenmemiş hücre popülasyonunun bir referans kuyusu kullanılmıştır, ancak yoğunluğa dayalı kapılar gibi kapı oluşturma için başka metrikler de mevcuttur.
16. FSC-SSC kapısı ile çevrili deneysel koşullarla, akış sitometrisi verilerini histogram olarak çizin veya elde edilen ekspresyon modellerini göstermek için başka şekillerde temsil edin. Bu deneyde, floresan GFP / FITC veya PE / TexasRed kanalları tarafından yakalandı.

6. RNA ekstraksiyonu ve gen devresi bileşenlerinin kantitatif PCR'si

1. İndüksiyondan 24-72 saat sonra, hücreleri inkübatördeki LPA'dan veya görüntülemeden sonra mikroskoptan çıkarın ve doku kültürü başlığına yerleştirin.
2. Doğrudan LPA'dan çıkarılırsa, folyo şeridini çıkarın ve plakayı bir veya iki dakika bekletin.
3. Ortamı her bir kuyucuktan aspire edin (tüm kuyular kullanılıyorsa tüm 24 delikli plakadan).
4. Uygun RNA ekstraksiyon kitini kullanarak hücrelerden RNA çıkarmaya devam edin.
5. RNA ekstraksiyonu tamamlandıktan sonra, her numunenin ters transkripsiyon reaksiyonunu gerçekleştirin (Tablo 3).
6. Ayrıca, her numunenin kantitatif PCR'sini gerçekleştirin (Tablo 4). PCR reaksiyonlarını ayarlamak için bir DNA polimeraz ve ilişkili protokol kullanın. Bu adım için, bir temizlik geni ve ilgilenilen bir gen ile çoklanmış bir reaksiyon oluşturun veya ayrı reaksiyonlar oluşturun. Bu örnekte, GFP, KRAS ve gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) seviyeleri araştırılmıştır. qRT-PCR deneyini tamamladıktan sonra, RNA seviyesindeki gen devresi kıvrım değişimini göstermek için mevcut yazılım aracılığıyla analize devam edin.

7. Gen devre bileşenlerinin immünofloresansı

1. Metanolü soğutmak için bir buz banyosu veya dondurucu kullanın.
2. İndüksiyondan 24-72 saat sonra, hücreleri inkübatördeki LPA'dan veya görüntülemeden sonra mikroskoptan çıkarın ve doku kültürü başlığına yerleştirin.
3. Doğrudan LPA'dan çıkarılırsa, folyo şeridini çıkarın ve plakayı 1-2 dakika bekletin.
4. Ortamı her bir kuyucuktan aspire edin (tüm kuyular kullanılıyorsa tüm 24 delikli plakadan).
5. Her bir oyuğa 100 μL% 0.25 tripsin ekleyin, plakayı plastik bir kapakla örtün ve inkübatöre geri yerleştirin.
6. Hücreleri inkübatörde 5 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
7. 5 dakika sonra, plakayı çıkarın ve doku kültürü başlığına geri koyun.
8. Her tripsinizli her birini 400 μL DMEM ile iyice nötralize edin.
9. Mini santrifüj tüplerini her bir kuyucuğa karşılık gelen isimlerle etiketleyin.
10. Bir P1000 pipet kullanın ve hücre kümelerini kırmak için her bir kuyucuğun içeriğini 6-8 kez yukarı ve aşağı pipet kullanın.
11. Her bir kuyucuğun tüm içeriğini (~ 500 μL) etiketli tüplere aktarın.
12. Hücreleri 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
13. Tamamlandığında, süpernatantı atın ve numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın.
14. 750-1000 μL% 4 paraformaldehit (fosfat tamponlu salin, PBS ile seyreltilmiş) içinde hücreleri yeniden askıya alın (hücre kümelerini kırmak için her tüpte 6-8 kez yukarı ve aşağı bir P1000 pipet ve pipet kullanın).
15. Hücrelerin oda sıcaklığında 15 dakika oturmasına izin verin.
16. Kuluçkadan sonra, 750-1000 μL PBS ekleyin. Pipetleri birkaç kez yukarı ve aşağı doğru yapın.
17. Hücreleri 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
18. Tamamlandığında, süpernatantı atın ve numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın.
19. 750-1000 μL buz gibi soğuk metanol içinde hücreleri yeniden askıya alın (hücre kümelerini kırmak için her tüpte 6-8 kez yukarı ve aşağı bir P1000 pipet ve pipet kullanın).
20. Hücrelerin buz üzerinde veya -20 ° C'lik bir dondurucuda 30 dakika oturmasına izin verin.
21. Kuluçkadan sonra, 750-1000 μL PBS ekleyin. Pipetleri birkaç kez yukarı ve aşağı doğru yapın.
22. Hücreleri 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
23. Tamamlandığında, süpernatantı atın ve numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın.
24. Kullanılan antikorların türüne bağlı olarak, protokolü bu noktadan itibaren değiştirin. 7.24.1-7.24.14 veya 7.24.15-7.24.22 adımlarından birini izleyin.
    1. Birincil ve ikincil bir antikor kullanıyorsanız, 100 μL primer antikordaki hücre kümelerini kırmak için her tüpte bir P1000 / P200 pipet ve pipet kullanarak hücreleri 6-8 kez yukarı ve aşağı doğru askıya alın. Bu durumda, KRAS antikoru veya ERK antikoru da dahil olmak üzere stok antikorları için 1:800'lük bir seyreltme yapıldı ve oda sıcaklığında 1 saat oturmasına izin verildi. Antikorlar, 0.5 g BSA ile 1x PBS'den yapılmış bir inkübasyon tamponunda seyreltildi.
       NOT: İlgilenilen antijene karşı standart bir antikor seyreltme eğrisi oluşturarak antikorun tam seyreltmesini ampirik olarak belirleyin.
    2. Antikor ekledikten sonra, etiketli antikorlar üzerindeki ışık etkilerini önlemek için tüpleri bir folyo ile örtün.
    3. Kuluçkadan sonra, inkübasyon tamponunun 750-1000 μL'sini ekleyin. Pipetleri birkaç kez yukarı ve aşağı doğru yapın.
    4. Hücreleri 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    5. Tamamlandığında, süpernatantı atın ve numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın.
    6. 100 μL sekonder antikordaki hücre kümelerini kırmak için bir P1000/P200 pipet ve pipet kullanarak hücreleri her tüpte 6-8 kez yukarı ve aşağı doğru yeniden askıya alın. Bu durumda, hücreler KRAS antikoru için 1:800 veya ERK antikoru için 1:2000 seyreltmede 100 μL sekonder antikorda yeniden askıya alındı ve oda sıcaklığında 30 dakika oturmalarına izin verildi. Birincil antikorlara benzer şekilde, inkübasyon tamponundaki ikincil antikorları yukarıda açıklandığı gibi seyreltin. Standart bir eğrinin ampirik bulgularına dayanarak ikincil antikorların seyreltmelerini belirleyin.
    7. Antikor ekledikten sonra, etiketli antikorlar üzerindeki ışık etkilerini önlemek için tüpleri bir folyo ile örtün.
    8. Kuluçkadan sonra, inkübasyon tamponunun 750-1000 μL'sini ekleyin. Pipetleri birkaç kez yukarı ve aşağı doğru yapın.
    9. Hücreleri 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    10. Tamamlandığında, süpernatantı atın ve numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın.
    11. 500 μL PBS'deki hücre kümelerini kırmak için bir P1000 pipet ve pipet kullanarak hücreleri her tüpte 6-8 kez yukarı ve aşağı doğru yeniden askıya alın.
    12. Her tüpün tüm içeriğini (~ 500 μL) süzgeçlerle etiketli tüplere aktarın.
    13. Hücreleri, doğru dalga boylarındaki lazerlerle uygun akış sitometri cihazlarına getirin (buzda veya buzda hücrelere sahip tüpleri getirebilir).
        NOT: Birkaç kontrole sahip olmanın, akış sitometrisi ölçümü ve mühendislik hücre gen ekspresyonunun analizi ile ilerlemek için önemli olduğu unutulmamalıdır. Örneğin, tamamen lekesiz hücrelere sahip olmak, yalnızca birincil antikor ile boyanmış hücreler ve yalnızca ikincil antikor ile boyanmış hücreler, sonuçları antikorlardan gelen arka plan sinyalleri ile karşılaştırmak için yararlı olabilir.
    14. Ardından, bölüm 5'te açıklandığı gibi analize devam edin.
    15. Sadece birincil bir antikor kullanıyorsanız, 100 μL etiketli primer antikor içindeki hücre kümelerini kırmak için bir P1000 / P200 pipet ve pipet kullanarak hücreleri her tüpte 6-8 kez yukarı ve aşağı doğru askıya alın. Uygun antikor seyreltmesini belirleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Standart eğriden antikor seyreltmesini ampirik olarak belirleyin.
    16. Antikor ekledikten sonra, etiketli antikorlar üzerindeki ışık etkilerini önlemek için tüpleri bir folyo ile örtün.
    17. Kuluçkadan sonra, inkübasyon tamponunun 750-1000 μL'sini ekleyin. Pipetleri birkaç kez yukarı ve aşağı doğru yapın.
    18. Hücreleri 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    19. 500 μL PBS'deki hücre kümelerini kırmak için bir P1000 pipet ve pipet kullanarak hücreleri her tüpte 6-8 kez yukarı ve aşağı doğru yeniden askıya alın.
    20. Her tüpün tüm içeriğini (~ 500 μL) süzgeçli etiketli tüplere aktarın.
    21. Hücreleri, doğru dalga boylarındaki lazerlerle uygun akış sitometri cihazlarına getirin (buzda veya buzda hücrelere sahip tüpleri getirebilir).
        NOT: Birkaç kontrole sahip olmanın, akış sitometrisi ölçümü ve mühendislik hücre gen ekspresyonunun analizi ile ilerlemek için önemli olduğu unutulmamalıdır. Tamamen lekesiz hücrelere ve tek başına birincil antikor ile boyanmış hücrelere sahip olmak, sonuçları antikorlardan gelen arka plan sinyalleriyle karşılaştırmak için yararlıdır.
    22. Bu noktadan sonra, bölüm 5'te açıklandığı gibi analize devam edin.

Representative Results

Bu makalede yer alan gen devresi montajı ve kararlı hücre hattı üretimi, transkripsiyonel olarak aktif, tek kararlı FRT bölgesi içeren ticari, modifiye HEK-293 hücrelerine dayanmaktadır (Şekil 1). Gen devreleri, plazmid içinde FRT bölgelerine sahip vektörler halinde inşa edildi ve HEK-293 hücre genomuna Flp-FRT entegrasyonuna izin verdi. Bu yaklaşım Flp-In hücreleriyle sınırlı değildir, çünkü FRT siteleri, CRISPR / ^Cas950 gibi DNA düzenleme teknolojisi kullanılarak genomun herhangi bir yerinde ilgilenilen herhangi bir hücre hattına eklenebilir.

Doğru yerleştirme için uygun hücre hatları oluşturulduktan ve doğrulandıktan sonra, LPA ve IRIS yazılımı, gen ekspresyonunun ışık indüksiyonu için standartlaştırılmış bir protokol olarak ^{seçildi31,51}. LPA sistemi, ışık yoğunluğuna, nabız süresine ve görev döngüsüne bağlı olarak çoklu deney koşullarında memeli hücrelerinin indüksiyonu için 24 kuyucuğun programlanmasına izin verir (Şekil 2). Bu makalede, mekansal olarak homojen ışık yoğunluğu, darbe süresi ve görev döngüsü önceliklendirilmiştir. Bununla birlikte, araştırmacılar IRIS yazılımını ve LPA'yı zamansal ışık dalgası modellerinin daha gelişmiş programlaması için kullanabilirler.

LPA ile ilgili deneylere başlamadan önce ele alınması gereken önemli bir husus, tek veya birden fazla cihaz için gerçekleştirilebilen optik kalibrasyondur. Kalibrasyon için kullanılan daha önce açıklanan görüntü analizi ^yöntemi31 , bir jel görüntüleyici de dahil olmak üzere çeşitli ^{kaynaklardan52} elde edilebilen, ilgilenilen tüm LED'lerin açık olduğu tüm LPA'nın bir görüntüsünü gerektirir. Burada görüntü elde etmek için bir bilgisayar tarayıcısı kullanılmıştır (Şekil 3A). Görüntü elde edildikten sonra, Gerhardt et al. (2016)³¹ tarafından oluşturulan açık kaynaklı yazılım, her LPA'nın belirli bir gri tonlama değerinde aynı yoğunluğu yaymasını sağlamak için her LED için tazminat değerlerini hesaplamak için kullanıldı. Yazılım, arka plan sinyalini çıkarır, görüntüyü ikili bir kategoriye eşik eder ve piksel yoğunluğunu hesaplar (Şekil 3B). Kalibrasyondan, LED'ler arasında minimum bir varyasyon bulundu, 96 kuyucuk arasında 0.04'lük bir CV (veya kalibre edilmiş 4 plaka, Şekil 3C). Son olarak, kalibrasyon yazılımını kullanarak konuma göre LED varyasyonu gösterildi (Şekil 3D) ve her LED'in aynı yoğunluğa normalleştirilmesi için gri tonlamalı bir ayarlama (Şekil 3E) oluşturuldu.

Kalibrasyona ek olarak, LPA'yı kullanmanın diğer önemli yönleri, ışık toksisitesi etkileri ve deneysel materyallere dayalı tasarım sınırlamaları gibi kafa karıştırıcı değişkenleri sınırlayarak sistemik hataları en aza indirgeyebilen deneysel boru hattına çeşitli kontrollerin entegre edilmesini içerir. Örneğin, Şekil 4, LPA kuyularındaki farklı ışık yoğunluklarını programlamak için iki farklı konfigürasyonu göstermektedir. Şekil 4A'nın ilk alt paneli, ışık yoğunluğunun artan bir organizasyonunu göstermektedir. Bu, programlama ve veri analizi kolaylığı sağlayabilir, ancak LPA'nın alt sırasının en yüksek ışık yoğunluğuna sahip olduğu ve potansiyel olarak yakındaki kuyucukların istenmeyen ısı ve ışık indüksiyonuna neden olabileceği kenar efektleri üretebilir. Benzer şekilde, Şekil 4A'nın ikinci alt panelinde, IRIS yazılımına rastgele konumlarda çeşitli ışık yoğunlukları yaratan bir randomizasyon matrisi uygulanmıştır. Bu, kenar etkilerinin sistemik etkilerini en aza indirebilir. IRIS yazılımı ile çözülmüş bir matris (Şekil 4B) oluşturulur ve daha sonra deneyin tamamlanmasından sonra ve analiz sırasında deneysel koşulları belirlemek için kullanılabilir. Kuyuların randomizasyonuna benzer şekilde, kullanıcılar oluşabilecek ışık toksisitesi etkilerinin de farkında olmalıdır (bu çalışmada mavi ışık). Şekil 4C'de, gen devresi indüksiyonu için kullanılan iki farklı ışık yoğunluğu, mühendislik hücrelerinin indüklenmemiş popülasyonuna dayanan aynı FSC-SSC kapısı ile gösterilmiştir. Bu nedenle, kullanıcılar, maruziyetin üst ucunda ortaya çıkabilecek ışık toksisitesi etkilerini belirlemek için ilgilenilen ışık modalitesi (örneğin, nabız, görev döngüsü vb.) üzerinde bir doz-yanıt vermelidir (Şekil 4D). Burada, artan mavi ışık seviyeleri, uyarılmamış hücrelere kıyasla doza bağımlı hücresel enkaz, ölü hücreler ve kümelere neden oldu. Bu nedenle, sürekli ışık yoğunluğu, maksimum LPA yoğunluğunun yaklaşık 3 / 4'ü (~ 3000 g.s. birimleri) ile sınırlandırılmıştır.

Uygun ekipman kurulduktan sonra, floresan mikroskobu yoluyla mühendislik ürünü LITer gen devrelerinde gen ekspresyonu indüklendi (Şekil 5). Hücreler, LPA üzerinde farklı ışık darbesi sürelerinde indüklendi ve bu da popülasyon düzeyinde gen ekspresyonunun hafif bir doz-yanıtını verdi. Bu çalışmadaki hücreler, FITC/GFP ışık kaynağına maruz kalma süresi için 50 ms kullanılarak GFP ekspresyonu için ve faz-kontrast pozlama süresi için 1-5 ms kullanılarak parlak alan görüntüleme için görüntülendi. Bu hücre hattı mühendisliği protokolünün sağlamlığı göz önüne alındığında, GFP yerine herhangi bir floresan işaretleyici kullanılabilir. Hücreler çoklu ışık rejimleri ile indüklenebilir ve çok çeşitli tepkiler üretebilir (Şekil 5). İkincisi, fonksiyonel genlerin ekspresyonunu daha fazla kontrol etmede faydalıdır (örneğin, orijinal çalışmada KRAS (G12V) ^onkogeni53).

Floresan mikroskobundan hemen sonra, hücreler akış sitometrisi, qRT-PCR ve immünofloresan dahil olmak üzere çeşitli deneysel protokollerde analiz edilebilir. Bu çalışmada ilk validasyon prosedürü olarak flow sitometrisi uygulanmış ve yukarıda özetlenen yöntemler izlenerek gerçekleştirilmiştir (Şekil 6). Mikroskopiye benzer şekilde, hücreler farklı nabız uzunluğu değerlerinde indüklendi ve popülasyon düzeyinde indüklenmemiş durumlardan dört kattan fazla değişimin gen ekspresyonunun doz-yanıtını gösterdi (Şekil 6A-B). Benzer şekilde, gen ekspresyonu gürültü azaltma, LITer sistemi için çeşitli ışık yoğunluğu değerleri (Şekil 6C-D) ile VVD / ^LightOn54 gibi pozitif bir düzenleme (geri bildirim olmadan) sistemi karşılaştırılarak gösterilebilir. LITer'i VVD sistemi ile karşılaştırırken, negatif geri besleme beş kattan fazla gen ekspresyonu gürültü azaltma sağlar. Mikroskopi üzerinde görüntülenen aynı önceden indüklenmiş hücreler qRT-PCR ile de analiz edilebilir (Şekil 7). Akış sitometrisine benzer şekilde, mühendislik ürünü LITer hücreleri, RNA seviyelerini doza duyarlı bir şekilde (indüklenmemiş durumlardan 10 kattan fazla indüksiyon) eksprese edebilir ve akış sitometrisinde GFP ekspresyonu ile ölçülen protein seviyelerinin doz-yanıtını eşleştirebilir. Bahsedilen floresan mikroskobu ve akış sitometrisi verileri, floresan olmayan hücreler, floresan hücreleri yapısal olarak ifade eden ve floresan 6-8-tepe doğrulama boncukları (örneğin, FL1 kanallı yeşil, floresan boncuklar) kullanılarak kalibre edilebilir. Bu bileşenlerin her biri, tek bir deneyde gen ekspresyonunun normalleşmesine izin verebilir. Bununla birlikte, bu faktörler, gen ekspresyon verilerinin karşılaştırılmasına ve standardizasyonuna izin vermek için devrelerin ve mühendislik hücrelerinin farklı deney plakaları, deneysel koşullar ve günler boyunca normalleştirilmesine de izin verebilir.

Son olarak, LITer gen devreleri, KRAS gibi fonksiyonel genleri ifade etmek için tasarlanabilir (G12V, Şekil 8). Bu boru hattının çok yönlülüğü, kullanıcıların LITer mimarisini ilgilendikleri herhangi bir işlevsel gen için hücre mühendisliği ile kullanmalarına olanak tanır ve muhtemelen olumlu geri bildirim gibi ek mimariler içerir. LITer, gen devresi çıkışının (KRAS (G12V) protein seviyeleri) ve sonuç olarak, her ikisi de immünofloresan tahlilleri ile ölçülebilen fosforile edilmiş ERK seviyelerinin artmasına neden olan artan miktarda mavi ışık gösterdi.

Parça	Oran	Boyut (bp)	DNA fragmanı ağırlık konsantrasyonu (ng/μL)	DNA fragmanı molar konsantrasyonu (fmol/μL)	Ses seviyesi (μL)	Elde edilen DNA molar kütlesi (fmol)
Ana Vektör parçası 1	1	3414.00	18.20	8.63	4.09	35.29
Ana Vektör parçası 2	1	4642.00	18.10	6.31	5.59	35.29
İlgilenilen Gen	1	549.00	37.90	111.70	0.32	35.29
Toplam					10.00	105.87

Tablo 1: DNA montaj reaksiyonu ana karışım hesaplaması (adım 1.13). Sütun 2 ve 3, toplanan DNA fragmanlarının boyutuna ve PCR amplifikasyonu ve agaroz jeli ekstraksiyonundan sonra bu fragmanların konsantrasyonuna dayanmaktadır (adım 1.11). 4^. sütunun alt hücresi (toplam reaksiyon hacmi) değiştirilebilir; ancak, belirtilen birim önerilir. Gölgesiz hücreler otomatik olarak oluşturulur.

0	100	200	400	500	750
1500	3000	0	100	200	400
500	750	1500	3000	0	100
200	400	500	750	1500	3000

Tablo 2: Üç replikasyonlu 24 delikli bir plakada ışık indüksiyon deneyi için ışık yoğunluklarının (g.s.) IRIS programlanması (adım 3.4). 0 ila 3000 g.s. arasında değişen ışık yoğunluklarının dağılımı G.s.-gri tonlamalı birimler. Bu, gerektiğinde IRIS yazılımı tarafından rastgele seçilebilir.

	Örnek 1	Örnek 2	Örnek 3
Ters Transkriptaz Ana Karışım Hacmi (μL)	4.00	4.00	4.00
RNA Şablonu (1000 ng) Hacmi (μL)	2.00	3.00	4.00
NF-H20 Ses Seviyesi (μL)	14.00	13.00	12.00
Toplam Hacim (μL)	20.00	20.00	20.00

Tablo 3: Ters transkripsiyon ana karışım hesaplaması (adım 6.5). Önerilen reaksiyon toplam hacmi 20 μL'dir ve bileşenleri ters transkriptaz enzim ana karışımı (burada: 5x), RNA şablonu ve nükleaz içermeyen sudur. Bu örnekte, 1, 2 ve 3 numaralı örneklerin RNA konsantrasyonları sırasıyla 500, 333 ve 250 ng / μL'dir.

	Örnek 1	Örnek 2	Örnek 1 & 2 Çoğullanmış
GFP Prob Hacmi (μL)	1	-----	1
GAPDH Prob Hacmi (μL)	------	1	1
DNA polimeraz Ana Karışım Hacmi (μL)	10	10	10
cDNA (100 ng) Hacim (μL)	2	2	2
NF-H20 Ses Seviyesi (μL)	7	7	7
Toplam Hacim (μL)	20	20	20

Tablo 4: Kantitatif PCR ana karışım hesaplaması (adım 6.6). Önerilen reaksiyon toplam hacmi 20 μL'dir ve bileşenleri DNA polimeraz enzim ana karışımı (burada: 2x), GFP ve / veya GAPDH probları, cDNA (toplam 100 ng) ve nükleaz içermeyen sudur (_NF-H20).

Resim 1: Devre tasarımı ve hücre mühendisliği. (A) FRT entegrasyon bölgelerine sahip LITer sentetik gen devresi, devre entegrasyonu için rekombinaz enzimi (Flp rekombinazı), uygun genetik klonların seçimi için kullanılan ilaç ve istenen optogenetik memeli hücre hatlarını oluşturmak için kullanılan ilgi çekici hücre hattı dahil olmak üzere hücre mühendisliği araçları. (B) Mühendislik genetik sistemleri, insan genomu içinde lokus içeren belirli bir FRT bölgesine entegre edilebilir. Bu genomik lokuslar daha sonra uygun şekilde entegre edilmiş genetik kasetlerin seçimi için spesifik antibiyotik direncini veya floresan muhabir genlerini ifade edebilir. Gen devresi entegrasyonu, orijinal genetik kaset içindeki belirli bölgeleri tanıyan rekombinazların kullanılmasıyla başlatılabilir. Bu, istenen gen devresi ile doğru şekilde tasarlanmış hücrelerin üretilmesini sağlayabilen yeni bir ilaç direnci seçim geni sunar. B panelinin altında, optogenetik negatif geri besleme sistemi LITer2.0 için gen devresi mimarisi bulunur. Bu devre, bir Işık-oksijen-voltaj-algılama alanı (LOV2) ile kaynaşmış kendi kendini bastıran bir TetR proteini, multisistronik transkript sağlayan bir bağlayıcı dizisi P2A ve GFP'den oluşur. Mavi ışık uygulandığında, TIP dizisi LOV2 alanından açılır, TetR proteinini inhibe eder ve hem TetR'nin hem de GFP muhabirinin artmış, doza duyarlı transkripsiyonuna izin verir. İnhibe edilmiş TetR proteini, DNA operatör bölgesinde bağlanamaz ve bastırılamaz, böylece transkripsiyonu arttırır. Bu olumsuz geri bildirim, gen ekspresyon gürültüsünü düşük tutar ve gen ekspresyonunun yüksek kat değişmesine izin verir. FRT - flip tanıma hedefi, HygR - higromisin direnci, LacZ - β-galaktosidaz, ZeoR - zeosin direnci, T - TetR, tetrasiklin baskılayıcı protein, D2ir, TwtO bölgelerine sahip CMV bazlı bir promotördür, LOV2 Işık-oksijen-voltaj-algılama alanıdır, TIP, TetR proteinini inhibe eden tet-inhibe edici peptiddir. Bu rakam Guinn ve Balázsi (2020)^55'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: LPA deneysel programlama. (A) Deneyler, Tabor laboratuvarı web ^sitesinde47 listelenen araçlar kullanılarak, kararlı durum, dinamik veya gelişmiş LPA programlama esnekliği ile ^{programlanabilir31}. Ayrıca, elektronik dosyalar gelecekte teknik çoğaltmalar veya alternatif hücre hatlarının deneysel indüksiyonu için kullanılmak üzere kaydedilebilir. (B) Ana bileşenleri üstten ve yandan (C) görüntülenen LPA cihazı. (D) LPA üzerinde bulunacak folyo sızdırmaz plakaların görüntüleri. LPA - Işık Plakası Aparatı, LED - ışık yayan diyot. Bu figürün unsurları Guinn (2019)^11'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Işık plakası aparatının kalibrasyonu . (A) IRIS yazılımına göre 2000 g.s.'ye ayarlanmış LED'ler için LPA'nın temsili görüntüsü. (B) Arka planı çıkarılmış ve eşiği her LED'in piksel yoğunluğunu hesaplamak üzere görüntüyü ikilendirmek için kullanılan eşik değere sahip (A) panelden görüntü. (C) Aynı IRIS yazılım değerine (örneğin, 2000 g.s.) ayarlanmış 96 LED'in (4 LPA plakası) piksel yoğunluklarının histogramı (MATLAB görüntü analizi ile belirlenir). Kırmızı çizgi ortalama LED piksel yoğunluğunu temsil eder ve paneldeki CV, 96 kuyu için varyasyon katsayısını temsil eder. (D) LPA görüntüsünün LED yoğunluklarını panel (A) içinde gösteren ısı haritası, maksimum yoğunluktaki LED'e normalleştirilmiştir. (E) LPA için programlandığında her LED için eşit yoğunlukta üretim oluşturmak üzere (A) panelindeki LPA görüntüsü için belirlenen kalibrasyon değeri ısı haritası. LPA - Işık Plakası Aparatı, LED - ışık yayan diyot, CV - varyasyon katsayısı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: LPA ve ışık toksisitesi etkilerinin randomizasyonu. (A) IRIS yazılımına dayalı olarak 25 ila 4000 g.s arasında ayarlanmış iki programlanabilir LPA LED konfigürasyonunun temsili görüntüsü. İlk konfigürasyonun, ısı ve ışığın kenar etkileri gibi sistematik hataların üzerinden geçmesine izin verme olasılığı daha yüksektir (örneğin, ^{LPA'nın 2.} en düşük sırayı etkileyen alt sırası). İkinci görüntü, yoğunlukların konumunu rastgele hale getirir, böylece kenar efektlerinin neden olduğu sistematik hatayı (önyargı) en aza indirir. (B) Belirli bir deneyin yoğunluğa bağlı sonuçlarını belirlemek için kullanılabilecek panel (A)'da gösterilen LPA'daki ışık yoğunlukları için randomizasyon konumunu gösteren matris. (C) Sürekli aydınlatmada 3 günlük indüksiyon için iki farklı ışık yoğunluğu (1250 ve 4000 g.s.) için akış sitometri verileri. Siyah kapı, indüklenmemiş hücrelere dayanır. (D) Panel (C) gibi akış sitometrisi verilerini gösteren, ancak çok çeşitli ışık yoğunlukları için çubuk grafik. LPA - Işık Plakası Aparatı, FSC - ileri saçılma, SSC - yan saçılma, g.s. - gri tonlamalı olarak ölçülen ışık yoğunluğu değeri. LITer ^{hücreleri11,} hücre sağkalımında, 0.0022 p değerine sahip ANOVA 1 kuyruklu test kullanılarak istatistiksel olarak anlamlı olan doza duyarlı bir azalmaya sahipti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Tasarlanmış optogenetik hücre hatlarının temsili mikroskopi görüntüleri. Hücreler, faz kontrastı ve floresan görüntüleme elde etmek için bir kamera (14-bit) ile ters çevrilmiş bir mikroskopta görüntülendi. Hücreler %100 ışık kaynağı yoğunluğunda faz kontrastı (Panel A, temsili parlak alan görüntüsü) için 5 ms ve GFP/FITC alımı (Panel B) için 50 ms maruz bırakıldı. Hücreler, istenen kararlı durum edinimine veya dinamik tepkiye bağlı olarak çeşitli zaman noktalarında görüntülenebilir ve bu da kararlı bir duruma yol açar. Buradaki hücreler, ışığa maruz kalmamaktan 3 günlük ışığa maruz kalmaya kadar sabit yoğunlukta (1000 g.s.) bir darbe süresi titrasyonunu temsil eder. g.s birimi, gri tonlamalı olarak ölçülen bir ışık yoğunluğu değerini temsil eder. Bu rakam Guinn (2019)^11'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Tasarlanmış optogenetik hücre hatlarının akış sitometrisi. Hücreler bir BD LSRFortessa akış sitometresinde analiz edildi ve bir SSC-FSC (yan saçılma-ileri saçılma) kapısı içinde toplanan yaklaşık 10.000 hücre vardı. Hücreler daha sonra FCS Express yazılımı ile analiz edildi. İlgilenilen genin ekspresyonunu ölçmek için histogram veya dağılım grafikleri oluşturulabilir (örneğin, GFP). (A) Siyah çizgi içinde geçit için SSC-FSC eksenleri üzerinde çizilmiş mühendislik hücreleri. (B) Gen ekspresyonunun doz-yanıtını gösteren, 1000 g.s.'de 72 saate kadar indüksiyonda değişen süreli ışık darbeleri ile indüklenen temsili LITer hücreleri. (C) Işık yoğunluğu titrasyonu için LITer gen devresini (TIP tabanlı sistem) geri bildirimsiz pozitif bir regülasyon sistemi olan VVD veya LightOn ^system40 ile karşılaştıran temsili doz-yanıt verileri. (D) VVD sistemine karşılık gelen, LITer sistemine kıyasla daha geniş dağılımı (ve dolayısıyla daha yüksek gen ekspresyon gürültüsünü) gösteren histogram. CV, gen ekspresyon gürültüsü için bir metrik olan varyasyon katsayısıdır. FSC - ileri saçılma, SSC - yan saçılma, FITC - floresein izotiyosiyanat, g.s. - gri tonlamalı olarak ölçülen ışık yoğunluğu değeri. Bu rakam Guinn (2019)^11'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Tasarlanmış optogenetik hücre hatlarının kantitatif gerçek zamanlı PCR'si. Çoklu gen ekspresyon seviyelerinin, bir uyaran olarak ışık kullanılarak indüklenebileceğini ve ölçülebileceğini gösteren temsili veriler. Rq birimi, kontrole kıyasla ifade katlama değişiminin göreceli niceliğini temsil eder. LITer ^{hücreleri11,} GFP ve KRAS seviyeleri için sırasıyla 0.0352 ve 0.0477 p-değeri ile ANOVA 1 kuyruklu test kullanılarak istatistiksel olarak anlamlı olan RNA ekspresyonunda doza duyarlı bir artışa sahipti. Bu rakam Guinn (2019)^11'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Mühendislik optogenetik hücre hatlarının immünofloresansı. İmmünofloresana dayalı protein seviyesi tahminlerini gösteren temsili veriler. (A) LITer gen devresinin sırasıyla doğrudan ve dolaylı olarak artan ışık miktarlarına göre indüklediği fosforile edilmiş ERK'nin KRAS (G12V) ve (B) protein seviyelerinin protein seviyeleri. Çubuklarda gösterilen veriler ortalama değerlerdir, hata çubukları standart sapmadır (n = 3). A.u. - keyfi birimler, g.s. - gri tonlamalı olarak ölçülen ışık yoğunluğu değeri. LITer ^{hücreleri11,} KRAS ve fosforile ERK seviyeleri için sırasıyla 2.79E-04 ve 0.016 p-değeri ile ANOVA 1 kuyruklu test kullanılarak istatistiksel olarak anlamlı olan protein seviyelerinde doza duyarlı bir artışa sahipti. Bu rakam Guinn (2019)^11'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu makalenin okuyucuları, optogenetik gen devrelerini (ve diğer gen ekspresyon sistemlerini) karakterize etmek için hayati önem taşıyan adımlar hakkında fikir edinebilirler: 1) gen devresi tasarımı, yapımı ve doğrulanması; 2) gen devrelerini kararlı hücre hatlarına sokmak için hücre mühendisliği (örneğin, Flp-FRT rekombinasyonu); 3) mühendislik hücrelerinin LPA gibi ışık tabanlı bir platformla indüklenmesi; 4) floresan mikroskopi ile ışık indüksiyon tahlillerinin ilk karakterizasyonu; ve 5) akış sitometrisi, kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) veya immünofloresan testleri dahil olmak üzere çeşitli tahlillerle nihai gen ekspresyon karakterizasyonu.

Ek olarak, yukarıda özetlenen yöntemler, esas olarak ilgilenilen genleri ifade eden herhangi bir gen devresi mimarisi için, devre yapım adımındaki ana potansiyel protokol modifikasyonları ve yapılan analizler ile oldukça modülerdir. Gen devresi yapımı durumunda, moleküler klonlamanın esnekliği, ilgilenilen herhangi bir genin, primer tasarımında veya montaj protokollerinde küçük değişiklikler yapan bir floresan işaretleyici ile değiştirilmesine veya birlikte ifade edilmesine izin verir. Ek olarak, burada özetlenen prosedürler çoğunlukla hassas (düşük gürültülü) gen ekspresyon kontrolü için bir NF gen devresi tasarımına odaklanırken, sırasıyla yüksek kat değişimi veya yüksek gen ekspresyon gürültüsü gibi farklı özellikler elde etmek için pozitif düzenleme veya pozitif geri besleme (PF) gibi diğer mimariler ^{uygulanabilir56,57} . Çeşitli gen devresi mimarilerinin (örneğin, PF, NF, vb.) kullanılması, araştırmacıların protein seviyesi büyüklüklerinin ve gürültünün ilaç direncinde veya metastazda oynadığı roller gibi çeşitli biyolojik soruları keşfetmelerini ^{sağlayabilir58}. Burada listelenen protokoller ayrıca gen ekspresyonu niceliğinin çeşitli yollarına da odaklanmaktadır, ancak mikroskopi ediniminden sonra herhangi bir sayıda fonksiyonel tahlil (örneğin, hücre hareketliliği, yara iyileşmesi, proliferasyon vb.) önceki yöntemler üzerinde çok az veya hiç etkisi olmadan eklenebilir. Bu, özellikle optogenetiğin pulsatil ekspresyon dinamikleri gibi davranışları incelemek için spatiotemporal indüksiyonu kullanabileceği tek hücreli çalışmalarla ^ilgilidir59.

Yöntem modülerliğini tamamlayan sorun giderme, her ana protokolün bir diğer önemli özelliğidir. Devre yapımı için, temel farklılıklar uygun devreye özgü astar tasarımında bulunurken, bakteriyel büyüme yoluyla montaj ve plazmid amplifikasyonu gibi daha sonraki yöntemler daha standartlaştırılmıştır ve tipik olarak kendi kapsamlı sorun giderme prosedürlerini içerir. Hücre mühendisliği, kullanılan hücre hattına bağlı olarak ilaç titrasyon eğrileri ile değiştirilebilir. Ayrıca, ticari bir hücre satırı kullanılıyorsa, sorun giderme kılavuzları doğrudan hücre hattı üreticisinden alınabilir. Ayrıca, istenmeyen ışık efektleri, mühendislik hücre hatları üzerinde ölçmek için önemlidir. Örneğin, 470 nm ışığın fototoksik etkileri nedeniyle, bir popülasyonda ölüm veya hasarın indüksiyonunu araştırmak için bir ışık yoğunluğu eğrisi oluşturulmalıdır. Çeşitli ışık değerleri test edildikten sonra, kullanıcılar bir FSC-SSC kapısı oluşturabilir veya ölü / hasarlı hücreleri ölçmek için propidiyum iyodür boyama gibi bir yöntem kullanabilir ve bu nedenle deneysel olarak kullanılacak uygun ışık aralıklarını belirlemek için bir araç görevi görebilir.

LPA sorun giderme için, LED'ler bitişik kuyucuklarla ışık ve ısı çapraz etkileşiminin kenar etkilerini üretebilir. Örneğin, yüksek yoğunluklu kuyular, kuyular arasında uygun olmayan bir sızdırmazlık veya büyük bir ısı/ışık gradyanı varsa, bitişik kuyularda bazı indüksiyonlara neden olabilir. LPA, bir ışık parametresinin belirli bir sırasına göre (örneğin, artan / azalan) programlanmışsa, bu etkiler maksimum olabilir. Bununla mücadele etmek için, IRIS yazılımı, kullanıcıların kuyu yoğunluklarını rastgele hale getirmek ve dolayısıyla sistematik hatayı azaltmak için bir randomizasyon matrisi kullanmalarına izin verir. Floresan mikroskobunun sorunlarını gidermek için, pozlama süresi, kazanç ayarları (kamera hassasiyetini kontrol etme) ve ışık kaynağı yoğunluğu ayarlanabilen ana parametrelerdir. Bu parametrelerin ayarlanması, optimum görüntü üretimi ve ideal sinyal-gürültü oranlarının yanı sıra aşırı doygunluk ve fototoksisiteyi önleyebilir.

Akış sitometrisi sorun giderme için, fotoçarpan tüp voltajları ve hücresel geçit, ayarlanabilecek ana hususlardır. Bu parametrelerin ayarlanması, deneysel koşullar ve kontrol örnekleri arasında ideal karşılaştırmalara, hem zayıf hem de güçlü floresan sinyalleri için uygun sinyal alımına ve hücresel kalıntıların veya istenmeyen hücre popülasyonlarının dışlanmasına izin verebilir. Akış sitometri voltajlarının, uygun karşılaştırmalara izin vermek için deneyler boyunca ideal olarak sabit tutulduğu belirtilmelidir. Ek olarak, çoklu floresan çıkışları gerektiren optogenetik sistemler için (örneğin, FITC ve PE), kullanıcıların floroforlar arasında çapraz konuşma verilen floresan telafisi konusunda dikkatli olmaları gerekecektir. Bu tür senaryolarda, uygun floresan sinyallerini belirlemek için kontroller çok önemlidir. Kullanıcıların gerçekleştirmesi için gerekli olacak kontroller arasında floresan boncuklar, ilgilenilen belirteci olan lekeli hücreler veya ilgilenilen akış sitometri yazılımında bir telafi matrisi oluşturmak için kullanılabilecek floresan proteinini yapısal olarak ifade eden hücreler bulunur. Ek olarak, ister bir floresan işaretleyici ister daha fazla kullanın, tüm kullanıcılar floresan olmayan hücreler için her bir işaretleyicinin floresan sinyallerini rutin olarak ölçmelidir, bu da otofloresan / arka plan sinyalleri verir. qRT-PCR sorun giderme işlemi, genellikle projeye özgü olan çeşitli cDNA miktarlarını ve prob tasarımını içerir. Son olarak, immünofloresan sorun giderme için, antikor konsantrasyonları tahlil niceliği için en büyük değişkendir ve optimal konsantrasyon tayini gerektirir.

Yukarıdaki yöntemlerin çoğuyla ilgili bir sorun giderme yönü, folyo ile kaplı hücrelere sahip kapalı bir plaka kullanmanın izolasyon etkisidir. Bu yöntem, çeşitli hücre hatlarının düzgün büyümesi için gereken karbondioksit gazı değişimini engelleyebilir. Önceki deneysel deneyimlere göre, bu, bu makaledeki mühendislik hücre hatlarını kullanan 3-5 günlük bir deney için hücresel büyümeye önemli bir engel değildi, ancak diğer hücre hatları veya deneysel süreler için önemli hale gelebilir. Bu endişeyi gidermek için, kapalı plakalarla uygulanan bir adaptasyon, bu çalışmada kullanılan hücrelerin büyümesini etkilemeyen karbondioksitten bağımsız ortamların kullanılmasını içerir. Metabolizmanın, pH seviyelerinin ve hücre yoğunluklarının önemli olduğu diğer tahliller veya hücre hatları için not edilmelidir, medya veya besin maddelerinin daha sık değiştirilmesi gibi diğer müdahalelere ihtiyaç duyulabilir.

Burada özetlenen yöntemlerin sınırları, kullanılan gen devresinde, optogenetik teknoloji hassasiyetinde ve floresan mikroskopları gibi diğer ekipmanlarla LPA arayüzünde bulunur. Burada açıklanan teknoloji, optogenetik olarak tasarlanmış hücrelerin popülasyonları için uygun fiyatlı, hızlı inşa edilebilir ve doğrulanması ^kolaydır46. Bununla birlikte, dijital ayna cihazlarının (DMD'ler) kullanılması gibi ışık indüksiyon kurulumunda değişiklik yapılmadan tek hücrelerin kontrol edilememesi gibi bazı mekansal sınırlamalar vardır ve yakın zamanda canlı hücrelerde kanıtlanmış faydalar ^vardır60,61. Ayrıca, burada özetlenen yöntemler, optogenetik stimülasyon sırasında canlı hücre takibinde sınırlıdır ve yalnızca tüm deneysel zaman seyrinin son nokta verilerinin toplanmasına izin verir.

Bu sınırlara rağmen, burada özetlenen optogenetik yöntemler, tek hücreleri gerçek zamanlı olarak kontrol etme esnekliğine sahip olan DMD'ler gibi mevcut teknolojiyi tamamlayıcı niteliktedir, ancak uyarılabilecek örnek sayısı ile sınırlıdır. Ayrıca, burada tartışılan kararlı hücre hattı mühendisliği yöntemleri, genellikle geçici transfeksiyonlar yoluyla mühendislik genetik sistemlerini karakterize eden mevcut sentetik biyoloji yöntemlerini karşılaştırmaktadır. Geçici transfeksiyon yaklaşımları, hücreler arasındaki daha büyük gen devresi kopya sayısı varyasyonu nedeniyle doğal olarak daha gürültülüdür. Buna karşılık, burada sunulan yöntemler, her biri bir gen devresi kopyası içeren monoklonal hücre varyantlarını içerir. Kararlı hücre çizgileri, gen ekspresyon varyasyonu, fenotipik manzaralar üzerindeki protein seviyesi etkileri ve tek hücreli yöntemler gibi hücresel yönleri daha ince bir hassasiyetle keşfetmeye izin verir, çünkü her hücrenin komşularıyla aynı olduğuna dair daha yüksek güven vardır.

Buradaki çalışma, ilgilenilen herhangi bir genomik olarak entegre optogenetik gen devresini tasarlamak, bu tür sistemleri güvenilir deneysel araçlarla indüklemek ve bunları çeşitli gen ekspresyonu ve fonksiyonel / fenotipik tahlillerle standartlaştırılmış bir şekilde karakterize etmek için bir platform göstermektedir. Bu protokollerin gelecekteki gelişmeleri, bu yöntemlerin, DMD'ler gibi diğer optogenetik teknolojileri kullanarak canlı hücre izleme ile entegrasyonunu içerebilir; bu, gen ekspresyonunun ve fonksiyonel uygulamaların tek hücre düzeyinde mekansal zamansal kontrolüne izin verecektir. Bu tür ilerlemeler, ışığın tek hücrelere ilgi duyan gen ekspresyon modelini üretmesine, transkripsiyon / çeviri dinamikleri oluşturmasına, protein seviyelerini ölçmesine ve hücre göçü, proliferasyon, metastaz ve farklılaşma dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerdeki rollerini incelemesine izin verecektir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes	Eppendorf	951010006	reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X	Thermo Fisher Scientific	MT25053CI	reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000020	tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000055	tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap	Corning	352235	reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V	Eppendorf	22628113	equipment for mammalian culture work
Agarose	Denville Scientific	GR140-500	reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates	VWR®	60941-126	tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9518-5G	reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365PR	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140010	reagent for growing bacteria
BD LSRAria	BD	656700	tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa	BD	649225	tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine	Government Scientific Source	SIGA4919-1G	reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC	Corning	353043	plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge	VWR	22628113	instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood	N/A	N/A	instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid	BD	353047	plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask	USA Scientific	CC7682-4825	container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fischer Scientific	BP231-100	reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide	Thermo Fisher Scientific	15-585-011	reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid	Corning	353072	container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express	De Novo Software:	N/A	software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL	Corning	35-010-CV	reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose	Thermo Fisher Scientific	11-965-092	reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL	Life Technologies	10687-010	reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix	Bio-Rad Laboratories	1708890	reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C	VWR	76210-392	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U74VC	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C	VWR	76359-220	equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg	Sigma-Aldrich	L3022-250G	reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000	Life Technologies	L3000008	reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019	MathWorks	N/A	software for analyzing experimental data
Methanol	Acros Organics	413775000	reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL	VWR	20170-333	plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
MultiTherm Shaker	Benchmark Scientific	H5000-HC	equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-NDL-US-CAN	equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix	NEB	M0492S	reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)	New England Biolabs (NEB)	C3019H	bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs (NEB)	E2621L	reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera	Nikon Instruments Inc.	N/A	instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements	Nikon Instruments Inc.	N/A	software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides	IDT	N/A	reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control	Panasonic	MCO-170AICUVHL-PA	instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade	Electron Microscopy Sciences	15710-S	reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)	Invitrogen	14190144	reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x	Fisher Scientific	15140-122	reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody	Cell Signaling Technology	4370S	primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody	Sigma-Aldrich	WH0003845M1	primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System	Eppendorf	A28137	equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App	Thermo Fisher Scientific	N/A	software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody	Cell Signaling Technology	8889S	secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody	Invitrogen	A11005	secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL	Olympus Plastics	12-102	reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System	Major Science	UVCI-1200	tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene	SnapGene	N/A	software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator	Tokai Hit	INU-TIZ	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444557	reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn	Life Technologies	4326317E	qPCR Probe
Thermocycler	Bio-Rad	1851148	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated	PerkinElmer	1450-605	plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm	VWR	14673-010	reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System	VWR	89032-290	equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293	Thermo Fisher Scientific	R75007	Engineered cell line with FRT site