Summary
De beskrevne protokoller indeholder en guide til at visualisere og kvantificere aktiviteten af neutrofile proteaser i menneskeligt spyt. Anvendelsen af en sådan analyse spænder fra evaluering af antiinflammatoriske behandlinger til biomarkørvalidering, lægemiddelscreening og store kliniske kohorteundersøgelser.
Abstract
Proteaser er regulatorer af utallige fysiologiske processer, og den præcise undersøgelse af deres aktiviteter er fortsat en spændende biomedicinsk udfordring. Blandt de ~ 600 proteaser kodet af det menneskelige genom, neutrofile serin proteaser (NSP'er) undersøges grundigt for deres engagement i starten og progression af inflammatoriske tilstande, herunder luftvejssygdomme. Unikt udskilles NSP'er ikke kun diffus inden for ekstracellulære væsker, men også lokalisere til plasmamembraner. Under neutrofil ekstracellulær fælde (NETs) dannelse bliver NSP'er en integreret del af den udskillede kromatine. En sådan kompleks adfærd gør forståelsen af NSP'er patofysiologi til en udfordrende opgave. Her er detaljerede protokoller vist sig at visualisere, kvantificere og diskriminere fri og membran-bundet neutrofil elastase (NE) og cathepsin G (CG) aktiviteter i spytprøver. NE og CG er NSP'er, hvis aktiviteter har pleiotropiske roller i patogenese af cystisk fibrose (CF) og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL): de fremmer vævsfornyelse, regulerer downstream immunrespons og korrelerer med lungesygdom sværhedsgrad. Protokollerne viser, hvordan man kan adskille væske og cellulære fraktion, samt isolering af neutrofiler fra menneskelige spyt for enzymatisk aktivitet kvantificering via små-molekyle Förster resonans energioverførsel-baserede (FRET) reportere. For at indsamle specifik indsigt i den relative rolle, som NE- og CG-aktiviteter spiller, kan en FRET-udlæsning måles ved hjælp af forskellige teknologier: i) målinger af in vitro-pladelæsere giver mulighed for høj gennemløb og massedetektion af proteaseaktivitet; ii) konfokal mikroskopiforeholdelsesspuratorisk forløser membranbundet aktivitet på celleoverfladen iii) små-molekyle FRET flow cytometry gør det muligt for hurtig evaluering af anti-inflammatoriske behandlinger via encellet protease aktivitet kvantificering og fænotyping. Implementeringen af sådanne metoder åbner dørene for at udforske NSP'er patobiologi og deres potentiale som biomarkører for sygdoms sværhedsgrad for CF og KOL. I betragtning af deres standardiseringspotentiale, deres robuste udlæsning og enkelhed i overførslen kan de beskrevne teknikker straks deles til implementering på tværs af forsknings- og diagnoselaboratorier.
Introduction
Neutrofil elastase (NE), cathepsin G (CG), proteinase 3 (PR3) og neutrofil serin protease 4 (NSP4) er de fire neutrofile serinproteaser (NSP)1. De opbevares sammen med myeloperoxidase inden for neutrofile primære eller azurofile granulater. På grund af deres forhøjede proteolytiske indhold er udskillelsen af primære granulater stramt reguleret, og neutrofiler skal sekventielt udfordres med grunding og aktivering af stimuli2.
Inde i fagagolysse fungerer NSP'er som intracellulære baktericide midler3. Når udskilles, bliver NSP'er stærke formidlere af betændelse: de kløver cytokiner og overfladereceptorer og aktiverer parallelle proinflammatoriske veje3. Det er vigtigt, inflammatoriske tilstande har en ukontrolleret NSP'er sekretion. For eksempel forårsager overdreven NE-aktivitet inden for betændte luftveje slimhypersecretion, bægerceller metaplasi, CFTR-inaktivering og ekstracellulær matrixombygning4,5. Cathepsin G deltager også i inflammation: det kløver specifikt og aktiverer to komponenter i IL-1-familien, IL-36α og IL-36β6. I samråd med NE, CG kløver protease-aktiverede receptorer på luftvejene epitel og aktiverer også TNF-α og IL-1β.
Endogene antiproteaser som alfa-1-antitrypsin, alpha-1-antichymotrypsin og sekretorisk leukocyt protease-hæmmer regulerer neutrofil elastase og cathepsin G-aktivitet5. Men i løbet af lungesygdomsprogression overstiger den kontinuerlige sekretion af proteaser stoichiometrisk anti-proteaseskjoldet, hvilket fører til ikke-opløsende neutrofili i luftvejene, betændelse forværres og vævsskader5,7. Selv om NE koncentration og aktivitet i opløselige fraktioner af patientens luftveje har vist sig at være en lovende biomarkør af sygdommen sværhedsgrad8, NE og CG også knytte sig til neutrofil plasmamembran og ekstracellulære DNA via elektrostatiske interaktioner 9 ,10, hvor deblivermindre tilgængelige for anti-proteaser. Det er vigtigt , at prækliniske undersøgelser definerede et scenario , hvor celleoverfladerelateret proteaseaktivitet forekommer tidligere og/eller uafhængigt af dens opløselige modstykke4,11. Faktisk, at blive påviselig, gratis protease aktivitet først nødt til at overvælde anti-protease skjold. I stedet forbliver membranbundet proteaseaktivitet ved celleoverfladen i det mindste delvist intakt på grund af utilgængeligheden af store hæmmere til celleplasmamembranen12. En sådan kompleks protease adfærd har vigtige konsekvenser for neutrofil-medieret inflammation debut og formering, og derfor skal undersøges med præcise og informative værktøjer.
I årenes løb fandt Förster resonansenergioverførsel (FRET)-baserede sonder adskillige biomedicinske anvendelser som værktøjer, der effektivt og hurtigt vurderer en specifik proteaseaktivitet i menneskelige prøver13. For at fungere består protease-journalister af et anerkendelsesmotiv (dvs. en peptid), som genkendes af målenzymet og er afhængige af FRET, en fysisk proces, hvor en donorfluorophore ved excitation overfører energi til et acceptormolekyle. Den behandling, som enzym drives af journalisten, nemlig genkendelsesdelens kavalergang, resulterer i, at acceptoren diffunderer væk fra donoren: Enzymaktiviteten måles derfor som en tidsafhængig ændring i donoren over acceptor fluorescens. En sådan udlæsning er selvnormaliserende og ratiometrisk, og derfor kun marginalt påvirket af miljøforhold som pH og lokal sondekoncentration. NEmo-114 og sSAM15 er FRET sonder, der rapporterer specifikt om NE og CG aktivitet, henholdsvis. Imidlertid lokaliserer sådanne journalister ikke specifikt til noget cellulært rum, derfor er de ansat til at overvåge proteaseaktiviteten, der er til stede i menneskelige væsker. For at overvåge proteaseaktivitet på en rumlig lokaliseret måde udviklede vi og andre FRET-sonder, der forbinder subcellulære komponenter via molekylære tags14,15,16,17,18,19. En sådan syntetisk strategi gjorde det muligt at udvikle NEmo-2 og mSAM, to FRET-sonder udstyret med lipidankre, der lokaliserer plasmamembranen. Disse journalister næret en dybere forståelse af NE og CG proteaser i cystisk fibrose og kronisk obstruktiv lungesygdomme14,15.
Her er der fastsat detaljerede protokoller for visualisering og kvantificering af opløselige og membranbundne NE- og CG-aktiviteter i humant spyt ved hjælp af NEmo- og SAM-serier af FRET-sonder. For at behandle forskellige aspekter af NSP'ers patofysiologi og tilvejebringe en række metoder, der kan anvendes i henhold til det brugerspecifikke behov, vises analysen via fluorescensspektroskopi, fluorescensmikroskopi og flowcytometik.
Protocol
Følgende protokoller beskriver analyse udført på menneskeligt spyt. Håndtering af menneskelige stikprøver blev godkendt af det etiske udvalg ved Universitetet i Heidelberg, og der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle patienter eller deres forældre/værger (S-370/2011) og sunde kontroller (S-046/2009).
BEMÆRK: Følgende protokoller beskriver prøveforberedelsen og kvantificeringen af neutrofil serinproteases (NSP'er). De eksperimentelle procedurer, der præsenteres heri, fokuserer på måling af humant sputum og neutrofil elastase14,20,21 (NE) eller cathepsin G15 (CG). Små tilpasninger i prøveforberedelsesprotokollen gør imidlertid analysen af blodbaserede celler og tumor homogenater mulig. Derudover kan matrix metalloproteinase 12 og cathepsin S aktiviteter undersøges på samme måde ved hjælp af dedikerede FRET sonder22,23,24,25,26.
1. Prøveforberedelse: celleisolation og supernatantadskillelse
BEMÆRK: Hvis det er muligt, skal behandlingen af spyt udføres inden for 120 minutter efter ekspektoration, og spyt skal opbevares på is indtil videre behandling.
- Hvis spontan ekspektoration af sputum ikke er mulig, fremkalder sputum som beskrevet tidligere19. Inhaler kort 200 μg af β-2-receptor-antagonist salbutamol, før du starter induktionsproceduren for spyt. Derefter indåndes en hypertonisk (6%) saltvandsopløsning i 15 minutter ved hjælp af en forstøver. Saml det forventede spyt i en petriskål.
- Adskil slimklumperne fra spyt i en petriskål ved hjælp af en pipettespids.
- Vej slimet.
BEMÆRK: Gennemsnitsvægten af en slimprøver er 0,8 g (varierende mellem 0,1 g og 5 g); 0,1 g er normalt tilstrækkelige til at udføre de nævnte procedurer. - Der tilsættes 4 dele (v/w) af 10% Sputolysin (i PBS) til sputum (f.eks. 4 mL på 10% Sputolysin for hvert gram spyt).
ADVARSEL: Sputolysin består af koncentreret dithiothreitol i fosfatbuffer, og håndterer det derfor forsigtigt. - Inkuber blandingen ved stuetemperatur (RT) på en gyngende shaker i 15 minutter for at opløse slimet. Af sikkerhedsmæssige årsager skal du placere shakeren i en røghætte.
- Sluk for reaktionen ved at tilsætte det samme volumen kold PBS (f.eks.: 1 mL kold PBS for hver mL på 10% Sputolysin).
- Bland ved pipetter for at opnå en homogen opløsning.
- Blandingen filtreres gennem en 100 μm nyloncelleflæser i et 50 mL rør.
- Filtreringstrinnet gentages gennem en 40 μm nyloncellefumer.
- Opløsningen centrifugeres i 10 minutter ved 300 x g ved 4 °C.
- Overfør den supernatantfraktion forsigtigt til et frisk rør og opbevar det på is.
BEMÆRK: De supernatantfraktioner kan opbevares ved -20 °C eller -80 °C indtil videre. - Resuspend forsigtigt cellepillen i 500 μL kold PBS og læg den på is.
BEMÆRK: Cellefraktionen skal behandles med det samme.
2. Måling af neutrofil serinproteaseaktivitet
BEMÆRK: Her introduceres forskellige metoder til at kvantificere NSP-aktivitet ved hjælp af FRET-journalister. Valget af teknologi er dikteret af det specifikke biomedicinske spørgsmål og formålet med eksperimentet. De præsenterede sonder blev grundigt testet for deres specificitet mod et sæt lungerelevante enzymer14,15. Selvom sonderne er specifikke over for deres målenzym, skal du altid kontrollere sondens specificitet på den kliniske prøve af interesse. Dette kan opnås ved at inkubere prøven med en specifik proteasehæmmer inden sondetilsætning, som bør afskaffe enhver forøgelse af D/A-forholdet.
- Opløselige NSP'er aktivitet kvantificering via fluormeter eller pladelæser assay
BEMÆRK: Proteaseaktivitet i opløselige fraktioner af prøven kan påvises med ethvert instrument, der kan fluorescensdetektering.- Tø enzymer på is.
- Indtil brug skal NE og CG opbevares i sur opbevaringsbuffer (50 mM natriumacetat, 200 mM NaCl, pH 5.5) for at forhindre selvspaltning.
- For at oprette en enzymstandardkurve skal der forberedes en 1:2 seriel fortynding af enzym (33,9 - 0,271 nM for NE; 42,6 - 0,333 nM for CG) i aktiveringsbuffer (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl ved pH 7,5). Aktiveringsbufferen har en neutral pH-kort og gør det derfor muligt at foregå effektivt med enzymatisk katalyse.
- For at forberede den højeste standardkoncentration (NE-koncentration: 33,9 nM) fortyndes 1 μL NE (33,9 μM) i 999 μL aktiveringsbuffer.
- For at forberede den anden standard (NE-koncentration: 16,95 nM) blandes 200 μL af den første fortynding med 200 μL aktiveringsbuffer.
- Fortsæt i overensstemmelse hermed for at forberede de resterende 1:2 fortyndinger.
- Den sidste standard, som er tom, består af ren aktiveringsbuffer. Måling af tekniske dubletter eller tre eksemplarer anbefales. Under standard- og prøveforberedelsen skal du forsøge at holde hætteglas på is.
- Parallelt med standardpræparatet fortyndes sputumprøver i aktiveringsbuffer. De menneskelige prøver fortyndes, inden de vurderes, så de forbliver i det lineære interval for stigning i reportersignalet (donor/acceptorforhold). Hvis patientprøver blev efterladt ufortyndet, ville kavalergangen ske for hurtigt til en pålidelig montering. Da sund donor sputum indeholder færre aktive proteaser i forhold til prøver fra CF og KOL patienter, forskellige fortyndinger er generelt udføres (1:10 for sund sputum supernatant, 1:20-500 for sputum supernatant af KOL eller CF patienter).
BEMÆRK: For kvantitativt at måle proteaseaktiviteten i prøver, hvor koncentrationen er ukendt, skal en standardkurve med kendte enzymkoncentrationer måles parallelt, helst på samme plade. Koncentrationen af aktivt enzym i humant spyt beregnes ved at interpolere de skråninger, der måles i humane spytprøver, med dem, der måles med standardkurverne. - Før prøverne forberedes til måling, skal instrumentet sættes op. Indstil excitationsbølgelængden for NE FRET-sonden (NEmo-114) til 354 nm, og indstil detektionsbølgelængden til 400 nm for donoren og 490 nm for acceptoren. Indstil excitation bølgelængde for CG FRET sonde (sSAM15) til 405 nm, og sæt emissionen til 485 (donor) og 580 nm (acceptor).
- Der tilsættes 40 μL prøver, standard eller blank, i brøndene på en sort 96-brønds halvområdeplade.
- For at forberede masterblandingen, der indeholder reporterene (koncentrationen af journalisten i masterblandingen: 10 μM), fortyndes sondelageret (1 mM i DMSO) 1:100 i aktiveringsbuffer. Forbered det nødvendige master mix volumen ved at multiplicere 10 μL x antallet af nødvendige pladebrønde. For at opnå den optimale endelige koncentration (2 μM) for fluorescensmåling af NEmo-1- og sSAM-reportere tilsættes 10 μL masterblandingen til hver brønd (indeholdende 40 μL enten prøve, standard eller blindprøve) og udlæsningen påbegyndes. NEmo-1 og sSAM reportere vil derfor overvåge opløselige neutrofile elastase og cathepsin G aktivitet, henholdsvis.
BEMÆRK: Hvis der ikke er en reagensinjektor til rådighed, skal du sørge for at starte udlæsningen så hurtigt som muligt efter reporter ud over prøverne. - Start pladelæsermålingen, og registrer donor/acceptor-forholdet forøg hvert 60-90. sekund i mindst 20 minutter, eller indtil stigningen i signalet når et plateau.
- Når dataene er eksporteret, beregnes donor/acceptor-forholdet (D/A-forholdet) ved at dividere donorens relative fluorescensenheder (RFU) med acceptoren RFU for hvert tidspunkt og hver prøve.
- D/A-forholdet beregnes middelværdi og standardafvigelse for hver prøve.
- Bestem hældningen inden for den lineære vækst i D/A-forholdsændringen. Hældningen er en indikator for enzymets kavalergangshastighed for en FRET-sonde. Koncentrationen af aktivt enzym i sputum beregnes ved at montere de lineære regressionshældninger, der stammer fra de menneskelige prøver, med dem, der er beregnet ud fra enzymstandarden.
- Membran-bundet NSP aktivitet kvantificering via fluormeter eller pladelæser assay
- Isoler sputumceller som beskrevet ovenfor. 3 x 104 celler i et volumen på 40 μL PBS. Tilføj cellerne til pladelæser godt.
- Sæt instrumentet op. Indstil excitationsbølgelængden for membranbundet NE FRET-sonde (NEmo-214)til 405 nm, og indstil detektionsbølgelængden til 485 nm for donoren og 580 nm for acceptoren. Indstil excitationsbølgelængden for membranbundet CG FRET-sonde (mSAM15) til 405 nm, og indstil emissionen til 485 (donor) og 580 nm (acceptor).
- For at forberede masterblandingen, der indeholder journalisterne, fortyndes sondelageret i aktiveringsbufferen til en koncentration på 10 μM. Forbered det nødvendige masterblandingsvolumen ved at multiplicere 10 μL X antallet af påkrævede pladebrønde. For at opnå den optimale endelige koncentration (2 μM) for fluorescensmåling af NEmo-2- og mSAM-reportere tilsættes 10 μL masterblandingen til hver brønd (indeholdende 40 μL enten prøve, standard eller blindprøve) og udlæsningen påbegyndes. NEmo-2 og mSAM reportere vil derfor overvåge membran-bundet neutrofil elastase og cathepsin G aktivitet, henholdsvis.
BEMÆRK: En cellulær negativ kontrol kan bruges, for eksempel celler, der ikke aktivt udskiller NSP'er. For eksempel repræsenterer inkubationen af journalister med 3 x 104 leukocyt forfædre HL-60 promyelocytic celler en gyldig kavalergang negativ kontrol. - Registrer ændring i donor/acceptor-forholdet i mindst 20 min., eller indtil signalets stigning når et plateau. Analyser dataene som beskrevet ovenfor.
- Membranbundet NSP-aktivitetsmåling via fluorescensmikroskopi
- Bestem antallet af betingelser, der skal analyseres.
BEMÆRK: For hver sputumprøvemåling anbefales det at forberede og analysere yderligere positiv (PC) og negativ (NC) kontrol. - For hver måling blev 3 x 104 sputumceller opsuspendt i et volumen på 50 μL PBS i et 1,5 mL rør.
- Som negativ kontrol inkuberes sputumceller med en specifik inhibitor (Sivelestat, specifik NE-hæmmer eller cathepsin G-hæmmer I, specifik CG-hæmmer, ved en endelig koncentration på 100 μM). Inkuber i 10 min på RT.
- Som positiv kontrol inkuberes sputumceller med det relevante enzym (henholdsvis NE eller CG ved henholdsvis 340 nM eller 200 nM) i 10 min. ved RT.
- Der tilsættes 50 μL PBS, der indeholder FRET-reporteren og en nuklear plet (i en endelig fortynding på 1:1000) til hvert rør (positive kontrolbehandlede celler, negative kontrolbehandlede celler og ubehandlede celler) for at nå en sonde endelig koncentration på 2 μM. Inkubat i 10-20 min ved RT.
VIGTIGT: Tilføjelsen af en nuklear plet letter fluorescensmikroskopi billeddannelse, da det gør det muligt at søge efter spytceller af interesse uden at bruge FRET sonde kanaler og derfor for at undgå reporter blegning. Derudover tillader DNA-pletten at segmentere sputumceller i henhold til formen på deres kerne. For eksempel kan neutrofiler let identificeres ved deres multilobular kerner. Yderligere oplysninger om cellernes levedygtighed kan også hentes (neutrofiler med en mere segmenteret kerne er mere tilbøjelige til at være i live).
BEMÆRK: Ud over den membranbundne kan dna-bundet NE's eller CG's aktivitet i humant spyt måles på samme måde ved hjælp af H-NE og H-CG, ekstracellulære DNA-associerende FRET-sonder27. Ved tilberedning af masterblandingen kan H-NE og H-CG tilsættes i koncentrationen på 10 μM og inkuberes med spyt før cytospin og diasforberedelse. D/A-forholdets kvantificering på ekstracellulært DNA fortsætter identisk med NEmo-2 og mSAM, med den eneste forskel, at ekstracellulære DNA-aggregater segmenteres i stedet for enkeltceller27. - Afspørge reaktionen ved at tilsætte 100 μL iskold PBS og overføre prøver på is.
- Cytospin blandingen på mikroskopi dias, lufttørre, fix med iskold methanol 10% i 10 min, lufttørre og montere med en passende montering medium.
BEMÆRK: Mikroskopidiasene kan opbevares ved 4 °C i mørke i op til en måned indtil videre analyse. - Anskaf mikroskopibilleder ved hjælp af et konfokalt mikroskop med et PL APO 40x eller 63x oliemål. For at øge billedkvaliteten og reducere anskaffelsestiden anbefales en sekventiel billedopsamlingstilstand.
- Billede den nukleare plet først via 633 nm excitation med helium-neon-laser linje og registrere sin emission mellem 650 og 715 nm.
- Registrer donor (cumarin 343) af FRET reporter mellem 470 og 510 nm ved excitation på 458 nm med en argon laser. Den sensibiliserede acceptor (5,6-TAMRA) emission erhverves mellem 570 og 610 nm efter enedonor excitation.
- Registrer den direkte acceptor emission i en separat kanal mellem 470 og 510 nm ved acceptor optimal excitation ved 561 nm ved hjælp af diode pumpes fast tilstand (DPSS) laser.
- Indstil pinhole i begyndelsen af eksperimentet og vedligeholde i løbet af billedbehandling session.
BEMÆRK: På grund af deres lille størrelse anbefales det at bruge et 40x eller 63x mikroskopmål for at visualisere neutrofiler korrekt. Normalt erhverves billeder i flere på hinanden følgende kanaler, begyndende med den længere excitation bølgelængde for at forhindre fotobleaching af journalisten under erhvervelsen.
- Billede mindst 100 celler pr betingelse for afgørende statistik. Til mikroskopibilleder analyse bruge en passende software: segment cellerne og beregne D / A-forholdet på en pixel-for-pixel basis, bagefter beregne gennemsnittet eller medianen af en given region af interesse, som er valgt manuelt af brugeren. For repræsentative resultater se figur 1.
- Bestem antallet af betingelser, der skal analyseres.
Figur 1: Repræsentative billeder og kvantificering af membranbundet NE-aktivitet på neutrofiler isoleret fra CF-patientsputum. a)Repræsentative konfokale mikroskopibilleder af neutrofiler, der er forinkuberede (øverste panel) i 10 minutter med 100 μM Sivelestat (w/) eller venstre ubehandlet (w/o) (bundpanel) før reporter NEmo-2 (2 μM) tilføjelse. Den første kolonne fra venstre viser den nukleare plet, den anden donorkanal, den tredje acceptorkanalen og den sidste det beregnede D/A-forhold, der opnås ved at dividere donor- og acceptorkanalerne pixel for pixel. Grænserne for interesseregionen (enkelt neutrofil) er afbildet som stiplet linje. Skala (10 μm) og kalibreringsstænger (D/A-forhold) er angivet. b)Kasse- og prik-plots, der viser D/A-forholdet mellem sputum neutrofiler fra en repræsentativ CF-patient. Celler, der inkuberes med hæmmer og ubehandlede celler, vises i henholdsvis grå og blå. Hver prik repræsenterer en celle (N: w/ inhibitor = 113 og w/o inhibitor = 96). Klik her for at se en større version af dette tal.
- Membranbundne NSP'er aktivitetsmåling via flowcytometri
- Resuspend 1 x 106 celler i 100 μL PBS i en 5 mL FACS polystyren rundbundet rør og læg røret på is.
- Hvis du vil gate sputum neutrofiler, skal du bruge følgende antistoffer: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) og CD66b (1:50). Forbered tilstrækkelig master mix til alle prøver. Placer master mix på is i mørke.
- Opsæt gating-strategien som beskrevet i figur 2. Neutrofilerne er gated som 7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ events. De indhegnede hændelser vil derefter blive analyseret for deres membranbundne proteaseaktivitet for deres donor (λexc = 405 nm, λem = 450/50 nm) og acceptor (λexc = 405 nm, λem = 585/42 nm) betyder fluorescerende intensiteter (MFI'er).
- Der tilsættes 2 μL FcBlock til hver prøve, og der inkuberes i 5 min ved RT.
- Tilsæt de valgte antistoffer til hvert rør, og inkuber i 30 minutter på is i mørke.
- Cellerne vaskes ved at tilsætte 2 mL kold PBS og centrifuge i 5 min ved 300 x g og 4 °C. Supernatant og genanvendelige celler kasseres i 200 μL kold PBS.
- 200 μL opdeles i to rør med hver 100 μL og tilsættes 5 μL cellesygtighedspletopløsning i hvert rør. Placer rør på is.
- Der tilsættes en passende specifik NSP-hæmmer (til NE-brug Sivelestat ved 225 μM endelig koncentration til CG-brug cathepsin G Inhibitor I ved 100 μM) i det negative kontroltestglas (NC). Inkuber prøverne på RT i 10 minutter i mørke.
- Der tilsættes 100 μL kold PBS til prøven, og den filtreres gennem et 40 μm filter i et rent FACS-rør for at forhindre tilstopning af instrumentet.
- Tilsættes reporteren (for NE, NEmo-2 ved en endelig koncentration på 4 μM, for CG, mSAM ved en endelig koncentration på 2 μM) til NC-prøven, forsigtigt hvirvle røret.
- Begynd at erhverve celler inkuberet med den specifikke hæmmer for om nødvendigt at justere portene såvel som reporterENS PMT'ers spændinger lidt.
- Optag mindst 1000 neutrofiler. Hold prøven ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Selvom der kan registreres flere hændelser, sikrer 1000 celler et godt kompromis mellem korrekt statistik og registreringstid. - Fortsæt med følgende rør (ubehandlede sputumprøver) i overensstemmelse hermed.
- For at registrere ændringer i D/A-forholdet på grund af membranbundet proteaseaktivitet skal du registrere 1000 neutrofiler fra hvert rør hvert 5. til 10. minut.
BEMÆRK: Efter vellykket FRET reporter kavalergang, donorkanalen MFI'er intensitet vil stige over tid. Acceptorkanalens MFI-intensitet skal falde eller forblive konstant over tid. - FRET-forholdet beregnes ved at dividere donoren med acceptorkanalværdierne for de prøver, der måles på de indhegnede levedygtige enkeltetrofiler.
- Prøvemålinger normaliseres ved at dividere dem med det tilsvarende 0 min. tidstidspunkt (se figur 2for repræsentative resultater og analyser).
BEMÆRK: Registrering af mindst to tidspunkter (dvs. 0 og 10 min. ) er nødvendig for en dynamisk måling af D/A-forholdsændringen. For at normalisere aktivitetsmålingen for hver prøve divideres D/A-forholdet målt i senere tidspunkter (f.eks. 10 min. ) med det forhold, der beregnes umiddelbart efter tilsætning af sonden (0 min).
Figur 2: Gating-strategi og repræsentative observationsområder for membranbundet NE-aktivitet målt på neutrofiler isoleret fra CF-patientsputum. a)For at gate sputum neutrofiler anvendes følgende antistoffer: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) og CD66b (1:50). Neutrofilerne er gated som 7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ events. De indhegnede hændelser analyseres for deres donor (λexc= 405 nm, λem= 450/50 nm) og acceptor (λexc= 405 nm, λem= 585/42 nm) gennemsnitlige fluorescensintensiteter (MFI'er). b)Repræsentative histogrammer af CF-sputum neutrofiler analyseret for deres membranbundne NE-aktivitet. Den venstre kolonne viser donorsignalet, den højre kolonne viser acceptorsignalet. Den øverste række viser gennemsnitlige fluorescensintensiteter af celler behandlet med Sivelestat (w/) i 10 minutter før tilføjelse af reporteren. Den nederste række viser ubehandlede (w/o) celler, hvis reporter fluorescens måles straks (0 min, grå) og 10 min (blå) efter reporter tilføjelse. Neutrofiler gates i henhold til den strategi, der er vist i panel a. c) Datatabellen viser et repræsentativt datasæt bestående af rå MFI'er for donoren og acceptorsignalet på neutrofiler målt over flere tidspunkter (0-3-5-10-15-20 min.) samt det beregnede D/A-forhold. D/A-forholdet kan normaliseres, dvs. 0 min angiver en optagelse udført så hurtigt som muligt efter reporter tilføjelse til flow røret med farvede spyt celler. MFI-data vises som middel ± standardafvigelse for 1000 neutrofiler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Representative Results
Resultaterne i figur 1a illustrerer et repræsentativt mikroskopdatasæt. Det nukleare signal bruges til at identificere neutrofiler ved deres karakteristiske segmenterede kerner. Interesseområdet (ROI) vælges manuelt (stiplet linje i figur 1a). D/A-forholdets billede beregnes ved at dividere donorkanalens intensitet med intensiteten af acceptorkanalen pixel for pixel. I det sidste trin beregnes det gennemsnitlige D/A-forhold pr. celle (ROI). I figur 1b repræsenterer hver prik gennemsnittet af et investeringsafkast (neutrofil). Det anbefales at afbilde og evaluere omkring 100 celler pr. tilstand.
Figur 2aviser en repræsentativ strategi for strømningscytometri . En sådan gating gør det muligt at diskriminere og studere sputum neutrofiler. For at undgå fluorescensudslip eller kompensationsartefakter anbefales det at dedikere en laserlinje (f.eks. blå laser) til FRET-sondens fluorescensdetektion. Der bør ydes flusscenskompensation for antistoffer og ikke for FRET-sonden. Figur 2b viser MFI-fordelingen ved 0 og 10 minutter efter reportertilsætning. Hver række i figur 2c angiver middeldonor- og acceptor-MFI-værdierne for 1000 sputum-neutrofiler. D/A-forholdet beregnes ved at dividere donor- og acceptor-MFI'erne. Tidsforløbet i figur 2c på højre side viser målingens progression: Efter en hurtig indledende stigning når D/A-forholdet et plateau i henhold til det membranbundne enzym.
Discussion
De rapporterede protokoller forklarer forskellige tilgange til at kvantificere aktiviteten af neutrofil elastase og cathepsin G i humane spytprøver. Kritiske punkter for en vellykket måling af enzymaktivitet er den i) præcise timing og standardisering af den operative procedure og ii) brugen af pålidelige negative og positive kontroller. Hvis disse betingelser er opfyldt, er de beskrevne metoder ikke begrænset til spyt, men kan også let tilpasses analysen af proteaseaktivitet i blod, bronchoalveolar lavagevæsker og vævssektioner eller homogenater.
Hver af de tre teknikker har sine styrker og begrænsninger, som ofte supplerer hinanden. For eksempel giver flowcytometry mulighed for hurtig analyse af sjældne cellepopulationer samt cellefenotyping, men mangler rumlig opløsningsinformation, som kan opnås ved mikroskopi. I stedet giver pladelæsermålinger mulighed for parallel vurdering af flere prøver eller forhold på en højgennemstrømningshastighed. Da friske spytceller ikke kan fryses og opbevares, kræver de tre metoder, at prøverne skal behandles hurtigt efter ekspektoration. Dette begrænser fleksibiliteten eller gennemløbet af de membranbundne aktivitetsmålinger. Udviklingen af en flow cytometry protokol, der gør det muligt at fastsætte celler efter sonde tilsætning og enzymatisk kavalergang ville åbne for parallel måling af et højere antal rør. Desuden bør der lægges særlig vægt på håndtering og opbevaring af FRET-sonderne. Faktisk gennemgår nogle aminosyrer, der er til stede i peptidsubstratet, såsom methionin, oxidation, hvilket fører til nedsat reporterfølsomhed. For at øge reporterens holdbarhed (anslået til ca. tre måneder ved 20 °C) kan de opbevares i små volumenfoder (1-2 μL) under inert gas som nitrogen eller argon.
I CF og andre kroniske inflammatoriske lungesygdomme er det vigtigt at opdage betændelsen så tidligt som muligt, og pålidelige biomarkører har potentialet til at nå et sådant mål. Muligheden for at opdage overfladebundne NSP'ers aktivitet, som har vist sig at være skadelig for det omgivende væv, også under forhold, hvor der ikke er nogen eller lidt fri NE-aktivitet, tilføjer et andet niveau af værdifuld information, som næppe kan opnås ved hjælp af andre eksisterende metoder4,11.
Journalisterne kan bruges til at studere forbindelsen mellem membran-bundet forbundet NSP aktivitet med sværhedsgrad og progression af lungesygdom, især ved sin tidlige debut. Metoderne kan anvendes til at overvåge behandlingseffektiviteten (f.eks. antiinflammatoriske behandlinger eller meget effektive CFTR-modulatorer og potentiatorer28) og undersøge den deraf følgende dæmpning af neutrofil-drevet inflammation. Derudover er protokollerne baseret på ikke-invasive prøveprocedurer, som indebærer meget lav risiko for patienten og derfor kan bruges i meget bred skala og åbne dørene til mange spændende applikationer.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af tilskud fra det tyske ministerium for undervisning og forskning (FKZ 82DZL004A1 til M.A.M) og den tyske forskningsfond (SFB-TR84TP B08 til M.A.M). Det arbejde, der er beskrevet i dette manuskript, blev støttet af det tyske Center for Lungeforskning (DZL) og EMBL Heidelberg gennem et ph.d.-stipendium til M.G. Vi takker J. Schatterny, S. Butz og H. Scheuermann for ekspert teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431752 | |
| 2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader) | PerkinElmer | ||
| 35x10mm Dish, Nunclon Delta | Thermo Fisher Scientific | 150318 | |
| 40 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431750 | |
| 50 mL tubes | Sarstedt | 10535253 | |
| 7-AAD, viability dye | Bio Legend | 420404 | 5 µL/100 µL |
| Balance | OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd. | PR124 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL | BD Bioscience | 352054 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | ||
| black flat bottom 96 well half area plate | Corning Life Science | 3694 | |
| Cathepsin G | Elastin Products Company | SG623 | |
| Cathepsin G Inhibitor I | Merck KGaA | 219372 | |
| Centrifuge 5418R | Eppendorf AG | EP5401000137 | |
| Combitips advanced 1.0 mL | Eppendorf AG | 0030 089 430 | |
| cOmplete proteinase inhibitor | Roche | 11697498001 | |
| Countig chambers improved Neubauer | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442 | |
| coverslips Ø 25mm | Thermo Fisher Scientific | MENZCB00250RA003 | |
| Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific | ||
| DRAQ5 (nuclear stain) | BioStatus Limited | DR50050 | 1:10000 |
| FACSDiva software, v8.0.1 | BD Bioscience | ||
| FcBlock | BD Bioscience | 564219 | |
| Fiji (Fiji Is Just ImageJ) | fiji.sc | ||
| Flow Jo software, v10 | TreeStar | ||
| FluoQ Plugin, v3-97 | |||
| Heraeus Megafuge 16R | Thermo Fisher Scientific | ||
| Human Sputum Leucocyte Elastase | Elastin Products Company | SE563 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Mini Rock-Shaker | PEQLAB Biotechnologie GmbH | MR-1 | |
| mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2 | BD Bioscience | 557742 Lot:8221983 | 1:50 |
| mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8 | BD Bioscience | 557820 Lot:8208791 | 1:50 |
| mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1 | BD Bioscience | 557833 Lot:8059688 | 1:33 |
| mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5 | BioLegend | 305122 Lot:B241921 | 1:50 |
| mSAM | in house | 2 mM | |
| Multipette plus | Eppendorf AG | ||
| NEmo-1 | SiChem | SC-0200 | 1 mM |
| NEmo-2E | SiChem | SC-0201 | 2 mM |
| Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer | Pari | 085G3001 | |
| phosphate buffered saline | Gibco | 10010-015 | |
| ROTI Histokitt (mounting medium) | Carl Roth GmbH + Co.KG | 6638.1 | |
| Salbutamol | Teva GmbH | ||
| Sivelestat | Cayman Chemicals | 17779 | |
| Sputolysin | Calbiochem | 560000-1SET | |
| sSAM | in house | 2 mM | |
| SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Korkmaz, B., Moreau, T., Gauthier, F. Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: Physicochemical properties, activity and physiopathological functions. Biochimie. 90 (2), 227-242 (2008).
- Sheshachalam, A., Srivastava, N., Mitchell, T., Lacy, P., Eitzen, G. Granule Protein Processing and Regulated Secretion in Neutrophils. Frontiers in Immunology. 5, 448 (2014).
- Pham, C. T. N. Neutrophil serine proteases: Specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Gehrig, S., et al. Lack of neutrophil elastase reduces inflammation, mucus hypersecretion, and emphysema, but not mucus obstruction, in mice with cystic fibrosislike lung disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (9), 1082-1092 (2014).
- McKelvey, M. C., Weldon, S., McAuley, D. F., Mall, M. A., Taggart, C. C. Targeting proteases in cystic fibrosis lung disease paradigms, progress, and potential. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (2), 141-147 (2020).
- Clancy, D. M., et al. Extracellular Neutrophil Proteases Are Efficient Regulators of IL-1, IL-33, and IL-36 Cytokine Activity but Poor Effectors of Microbial Killing. Cell Reports. 22 (11), 2937-2950 (2018).
- Giacalone, V. D., Margaroli, C., Mall, M. A., Tirouvanziam, R. Neutrophil adaptations upon recruitment to the lung: New concepts and implications for homeostasis and disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-21 (2020).
- Sly, P. D., et al. Risk Factors for Bronchiectasis in Children with Cystic Fibrosis. New England Journal of Medicine. 368 (21), 1963-1970 (2013).
- Owen, C. A., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Campbell, E. J. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: A novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. Journal of Cell Biology. 131 (3), 775-789 (1995).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Margaroli, C., et al. Elastase Exocytosis by Airway Neutrophils Associates with Early Lung Damage in Cystic Fibrosis Children. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. , (2018).
- Owen, C., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Carolina, N. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: a novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. The Journal of cell biology. 131 (3), 775-789 (1995).
- Garland, M., Yim, J. J., Bogyo, M. A Bright Future for Precision Medicine: Advances in Fluorescent Chemical Probe Design and Their Clinical Application. Cell chemical biology. 23 (1), 122-136 (2016).
- Gehrig, S., Mall, M. A., Schultz, C. Spatially resolved monitoring of neutrophil elastase activity with ratiometric fluorescent reporters. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (25), 6258-6261 (2012).
- Guerra, M., et al. Cathepsin G Activity as a New Marker for Detecting Airway Inflammation by Microscopy and Flow Cytometry. ACS Central Science. 5 (3), 539-548 (2019).
- Hu, H. Y., et al. In vivo imaging of mouse tumors by a lipidated cathepsin S substrate. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (29), 7669-7673 (2014).
- Korkmaz, B., et al. Measuring elastase, proteinase 3 and cathepsin G activities at the surface of human neutrophils with fluorescence resonance energy transfer substrates. Nature Protocols. 3 (6), 991-1000 (2008).
- Craven, T. H., et al. Super-silent FRET Sensor Enables Live Cell Imaging and Flow Cytometric Stratification of Intracellular Serine Protease Activity in Neutrophils. Scientific Reports. 8 (1), 13490 (2018).
- Mu, J., et al. A small-molecule fret reporter for the real-time visualization of cell-surface proteolytic enzyme functions. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (52), 14357-14362 (2014).
- Hagner, M., et al. New method for rapid and dynamic quantification of elastase activity on sputum neutrophils from patients with cystic fibrosis using flow cytometry. European Respiratory Journal. 55 (4), 1902355 (2020).
- Dittrich, A. S., et al. Elastase activity on sputum neutrophils correlates with severity of lung disease in cystic fibrosis. European Respiratory Journal. , 1701910 (2018).
- Cobos-Correa, A., Trojanek, J. B., Diemer, S., Mall, M. A., Schultz, C. Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation. Nature Chemical Biology. 5 (9), 628-630 (2009).
- Hu, H. -Y., et al. FRET-based and other fluorescent proteinase probes. Biotechnology Journal. 9 (2), 266-281 (2014).
- Trojanek, J. B., et al. Airway mucus obstruction triggers macrophage activation and matrix metalloproteinase 12-dependent emphysema. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (5), 709-720 (2014).
- Wagner, C. J., Schultz, C., Mall, M. A. Neutrophil elastase and matrix metalloproteinase 12 in cystic fibrosis lung disease. Molecular and Cellular Pediatrics. 3 (1), 25 (2016).
- Gaggar, A., et al. The role of matrix metalloproteinases in cystic fibrosis lung disease. The European respiratory journal. 38 (3), 721-727 (2011).
- Guerra, M., et al. Protease FRET Reporters Targeting Neutrophil Extracellular Traps. Journal of the American Chemical Society. 142 (48), 20299-20305 (2020).
- Middleton, P. G., et al. Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor for Cystic Fibrosis with a Single Phe508del Allele. New England Journal of Medicine. 381 (19), 1809-1819 (2019).
