Summary
Protokollen häri beskrivs ge en guide för att visualisera och kvantifiera aktiviteten av neutrophil proteaser i mänskliga sputum. Tillämpningarna av sådan analys sträcker sig från utvärdering av antiinflammatoriska behandlingar, till biomarkörvalidering, läkemedelsscreening och stora kohort kliniska studier.
Abstract
Proteaser är regulatorer av otaliga fysiologiska processer och den exakta undersökningen av deras verksamhet är fortfarande en spännande biomedicinsk utmaning. Bland de ~ 600 proteaser kodade av det mänskliga genomet undersöks neutrofila serinproteaser (NSPs) noggrant för deras inblandning i uppkomsten och progressionen av inflammatoriska tillstånd inklusive andningssjukdomar. Unikt, utsöndrade NSPs inte bara diffusa inom extracellulära vätskor utan också lokalisera till plasmamembran. Under neutrophil extracellulär fälla (NETs) bildandet, NSPs blir en integrerad del av den utsöndrade kromatin. Ett sådant komplext beteende gör förståelsen av NSPs patofysiologi till en utmanande uppgift. Här visas detaljerade protokoll visualisera, kvantifiera och diskriminera fria och membranbundna neutrofilalastas (NE) och cathepsin G (CG) aktiviteter i sputumprover. NE och CG är NSPs vars verksamhet har pleiotropa roller i patogenesen vid cystisk fibros (CF) och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL): de främjar vävnadsrenovering, reglerar immunsvar nedströms och korrelerar med lungsjukdomens svårighetsgrad. Protokollen visar hur man separerar vätska och cellulär fraktion, liksom isolering av neutrofiler från mänskligt sputum för enzymatisk aktivitetsk kvantifiering via småmolekylen Förster resonans energiöverföringsbaserade (FRET) reportrar. För att samla in specifika insikter om ne- och CG-aktiviteters relativa roll kan en FRET-avläsning mätas med olika tekniker: i) mätningar av in vitro-plåtläsare möjliggör hög genomströmning och massdetektering av proteasaktivitet; ii) konfokal mikroskopi spatiotemporally löser membranbunden aktivitet vid cellytan; iii) småmolekyler FRET flöde cytometri möjliggör snabb utvärdering av antiinflammatoriska behandlingar via encellig proteas aktivitet kvantifiering och fenotypning. Genomförandet av sådana metoder öppnar dörrarna för att utforska NSPs patobiologi och deras potential som biomarkörer för sjukdomens svårighetsgrad för CF och KOL. Med tanke på deras standardiseringspotential, deras robusta avläsning och enkelhet i överföringen är de beskrivna teknikerna omedelbart delbara för implementering över forsknings- och diagnostiska laboratorier.
Introduction
Neutrofilalastas (NE), cathepsin G (CG), proteinas 3 (PR3) och neutrofilserinproteas 4 (NSP4) är de fyra neutrofila serinproteaserna (NSPs)1. De lagras, tillsammans med myeloperoxidas, inom neutrofil primära eller azurofila granuler. På grund av deras förhöjda proteolytiska innehåll är utsöndring av primära granulat tätt reglerad och neutrofiler måste i tur och nedförvisas med priming och aktiverande stimuli2.
Inuti faagolysosomen fungerar NSPs som intracellulära bakteriedödande medel3. När de utsöndras blir NSPs starka medlare av inflammation: de klyver cytokiner och ytreceptorer och aktiverar parallella proinflammatoriska vägar3. Viktigt är att inflammatoriska tillstånd har en okontrollerad NSPs utsöndring. Till exempel, inom inflammerade luftvägar, orsakar överdriven NE-aktivitet slem hypersecretion, bägare celler metaplasi, CFTR inaktivering och extracellulär matris ombyggnad4,5. Cathepsin G deltar också i inflammation: det klyver specifikt och aktiverar två komponenter i IL-1-familjen, IL-36α och IL-36β6. I samarbete med NE klyver CG proteasaktiverade receptorer på luftvägsepiteleriet och aktiverar även TNF-α och IL-1β.
Endogena antiproteaser såsom alfa-1-antitrypsin, alfa-1-antichymotrypsin och den sekretoriska leukocyt proteashämmaren reglerar neutrofila elastas och cathepsin G aktivitet5. Men under lungsjukdomens progression överstiger den kontinuerliga utsöndring av proteaser stoichiometriskt antiproteasskölden, vilket leder till icke-lösning av neutrofili i luftvägarna, inflammationsförsämring ochvävnadsskada 5,7. Även om NE koncentration och aktivitet i lösliga fraktioner av patientens luftvägar har visat sig vara en lovande biomarkör av sjukdomens svårighetsgrad8,ne och CG associeras också till neutrofil plasmamembranet och extracellulärt DNA via elektrostatiska interaktioner9,10 där de blir mindre tillgängliga för antiproteaser. Viktigt är att prekliniska studier definierade ett scenario där cellytans associerade proteasaktivitet uppträder tidigare och/eller oberoende av dess lösliga motsvarighet4,11. Faktum är att för att bli detekterbar måste gratis proteasaktivitet först överväldiga antiproteasskölden. Vid cellytan förblir istället membranbunden proteasaktivitet åtminstone delvis intakt på grund av att stora hämmare är otillgängliga för cellplasmamembranet12. Sådant komplext proteasbeteende har viktiga konsekvenser för neutrofilmedierad inflammationsuppkomst och förökning, och behöver därför undersökas med exakta och informativa verktyg.
Under årens lopp har Förster resonansenergiöverföring (FRET)-baserade sonder hittat många biomedicinska tillämpningar som verktyg som effektivt och snabbt bedömer en specifik proteasaktivitet i mänskliga prover13. För att fungera består proteasereportrar av ett igenkänningsmotiv (dvs. en peptid), som känns igen av målenzymet och förlitar sig på FRET, en fysisk process där en donatorfluorofor vid excitation överför energi till en acceptormolekyl. Den bearbetning som drivs av enzymet på reportern, nämligen klyvningen av erkännandedelen, resulterar i att acceptorn sprids bort från givaren: enzymaktiviteten mäts därför som en tidsberoende förändring i givaren över acceptorfluorescensen. Sådan avläsning är självnormaliserande och ratiometrisk, vilket endast marginellt påverkas av miljöförhållanden som pH och lokal sondkoncentration. NEmo-114 och sSAM15 är FRET-sonder som rapporterar specifikt om NE- respektive CG-aktivitet. Sådana reportrar lokaliserar dock inte specifikt till något cellområde, därför används de för att övervaka proteasaktiviteten som finns i mänskliga vätskor. För att övervaka proteasaktivitet på ett rumsligt lokaliserat sätt utvecklade vi och andra FRET-sonder som associerar till subcellulära komponenter viamolekylära taggar 14,15,16,17,18,19. En sådan syntetisk strategi tillät utvecklingen av NEmo-2 och mSAM, två FRET-sonder utrustade med lipidankare som lokaliserar till plasmamembranet. Dessa reportrar underblåste en djupare förståelse av NE och CG proteaser i cystisk fibros och kronisk obstruktiv lungsjukdom14,15.
Här tillhandahålls detaljerade protokoll för visualisering och kvantifiering av lösliga och membranbundna NE- och CG-aktiviteter i mänskligt sputum med hjälp av NEmo- och SAM-serien av FRET-sonder. För att ta itu med olika aspekter av NSPs patofysiologi och tillhandahålla en rad metoder som kan användas enligt det användarspecifika behovet visas analysen via fluorescensspektroskopi, fluorescensmikroskopi och flödescytometri.
Protocol
Följande protokoll beskriver analys som utförts på mänskliga sputum. Hanteringen av mänskliga prover godkändes av Heidelbergs universitets etiska kommitté och skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter eller deras föräldrar/vårdnadshavare (S-370/2011) och friska kontroller (S-046/2009).
OBS: Följande protokoll beskriver provpreparatet och kvantifieringen av neutrofila serinproteaser (NSP) aktivitet. De experimentella förfaranden som presenteras häri fokuserar på mänsklig sputum och neutrophil elastase14,20,21 (NE) eller cathepsin G15 (CG) aktivitetsmätning. Små anpassningar i provberedningsprotokollet gör dock analysen av blodbaserade celler och tumörhom homogenat möjliga. Dessutom kan matrismetalloproteinas 12 och cathepsin S-aktiviteter undersökas på samma sätt med hjälp av dedikerade FRET-sonder22,23,24,25,26.
1. Provberedning: cellisolering och övernaturlig separation
OBS: Om möjligt bör behandlingen av sputum utföras inom 120 minuter efter expectoration och sputum ska förvaras på is tills vidare bearbetning.
- Om spontan expectoration av sputum inte är möjligt, inducera sputum som beskrivits tidigare19. Kort, andas in 200 μg av β-2-receptor-antagonist salbutamol innan sputum induktion förfarande. Därefter andas in en hypertonisk (6%) saltlösning i 15 minuter med en nebulisator. Samla det förväntade sputumet i en Petri-maträtt.
- Separera slemklumparna från saliven i en petriskål med hjälp av en pipettspets.
- Väg slemmet.
OBS: Medelvikten för ett slemprover är 0,8 g (varierar mellan 0,1 g och 5 g); 0,1 g är vanligtvis tillräckliga för att utföra de nämnda procedurerna. - Lägg till 4 delar (v/w) på 10% Sputolysin (i PBS) till sputum (till exempel: 4 ml 10% Sputolysin för varje gram sputum).
VARNING: Sputolysin består av koncentrerad dithiothreitol i fosfatbuffert, hantera den därför med försiktighet. - Inkubera blandningen vid rumstemperatur (RT) på en gungskare i 15 minuter för att lösa upp slemmet. Placera av säkerhetsskäl skakapparaten i en rökhuv.
- Släcka reaktionen genom att tillsätta samma volym kall PBS (till exempel: 1 ml kall PBS för varje ml 10% Sputolysin).
- Blanda genom pipetting för att få en homogen lösning.
- Filtrera blandningen genom en 100 μm nyloncellssil i ett 50 ml-rör.
- Upprepa filtreringssteget genom en 40 μm nyloncellssil.
- Centrifugera lösningen i 10 min vid 300 x g vid 4 °C.
- Överför den övernaturliga fraktionen försiktigt till ett nytt rör och förvara den på is.
OBS: De övernaturliga fraktionerna kan förvaras vid -20 °C eller -80 °C tills vidare analys. - Återanvänd försiktigt cellpelleten i 500 μL kall PBS och lägg den på is.
OBS: Cellfraktionen måste bearbetas omedelbart.
2. Neutrofil serin proteas aktivitetsmätning
OBS: Här introduceras olika metoder för att kvantifiera NSPs-aktivitet med hjälp av FRET-reportrar. Valet av teknik dikteras av experimentet specifika biomedicinska frågor och syfte. Sonderna som presenterades testades i stor utsträckning för deras specificitet mot en uppsättning lungrelevantaenzymer 14,15. Även om sonderna är specifika mot deras målenzym, kontrollera alltid sondens specificitet på det kliniska provet av intresse. Detta kan uppnås genom att inkubera provet med en specifik proteashämmare före sondtillskott, vilket bör avskaffa varje ökning av D/A-förhållandet.
- Löslig NSP-aktivitets kvantifiering via fluorimeter eller plattläsare analys
OBS: Proteasaktivitet i lösliga fraktioner av provet kan detekteras med alla instrument som kan fluorescensdetektering.- Tina enzymer på is.
- Fram till användning, förvara NE och CG i sur lagringsbuffert (50 mM natriumacetat, 200 mM NaCl, pH 5.5) för att förhindra självklyvning.
- För att ställa in en enzymstandardkurva, förbered en 1:2 seriell utspädning av enzym (33,9 - 0,271 nM för NE; 42,6 - 0,333 nM för CG) i aktiveringsbuffert (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl vid pH 7,5). Aktiveringsbufferten har ett neutralt pH-läge och gör det därför möjligt att effektivt uppstå enzymatisk katalys.
- För att förbereda den högsta standardkoncentrationen (NE-koncentration: 33,9 nM), späd 1 μL NE (33,9 μM) i 999 μL aktiveringsbuffert.
- För att förbereda den andra standarden (NE-koncentration: 16,95 nM), blanda 200 μL av den första utspädningen med 200 μL aktiveringsbuffert.
- Fortsätt därefter med att förbereda de återstående 1:2 utspädningarna.
- Den sista standarden, som är tom, består av ren aktiveringsbuffert. Mätning av tekniska dubbletter eller triplikat rekommenderas. Under standard- och provberedningen, försök att hålla injektionsflaskan på is.
- Parallellt med standardberedningen späd sputumprover i aktiveringsbufferten. Späd ut de mänskliga proverna innan de bedömer sin proteasaktivitet för att hålla sig inom det linjära intervallet av ökning av reportersignalen (givar-/acceptorförhållande). Om patientprover lämnades outspädda, skulle klyvningen ske för snabbt för en tillförlitlig montering. Eftersom friska donator sputum innehåller färre aktiva proteaser jämfört med prover från CF och KOL patienter, utförs olika utspädningar i allmänhet (1:10 för friska sputum supernatant, 1:20-500 för sputum supernatant av KOL eller CF patienter).
OBS: För att kvantitativt mäta proteasaktiviteten i prover där deras koncentration är okänd måste en standardkurva med kända enzymkoncentrationer mätas parallellt, helst på samma platta. Koncentrationen av aktivt enzym i humant sputum beräknas genom interpolering av de sluttningar som mäts i humana sputumprover med de som mäts med standardkurvorna. - Innan proverna för mätning bereds, sätt upp instrumentet. Ställ in excitationsvåglängden för NE FRET-sonden (NEmo-114) på 354 nm och ställ in detektionsvåglängden på 400 nm för donatorn och 490 nm för acceptorn. Ställ in excitationsvåglängden för CG FRET-sonden (sSAM15)på 405 nm och ställ in utsläppet på 485 (givare) och 580 nm (acceptor).
- Tillsätt 40 μL prover, standard eller blanka i brunnarna på en svart 96-brunns halvarena.
- För att förbereda mastermixen som innehåller reportrarna (koncentrationen av reportern i huvudmixen: 10 μM), späd sondbeståndet (1 mM i DMSO) 1:100 i aktiveringsbuffert. Förbered den nödvändiga huvudblandningsvolymen genom att multiplicera 10 μL x antalet önskade plåtbrunnar. För att uppnå den optimala slutliga koncentrationen (2 μM) för fluorescensmätning av NEmo-1- och sSAM-reportrar, tillsätt 10 μL av huvudblandningen till varje brunn (som innehåller 40 μL antingen prov, standard eller tom) och starta avläsningen. NEmo-1 och sSAM reportrar kommer därför att övervaka löslig neutrophil elastase respektive cathepsin G aktivitet.
OBS: Om en reagensinjektor inte är tillgänglig, se till att starta avläsningen så snart som möjligt efter att reportern har tillst till proverna. - Starta mätningen av plattläsaren och registrera givaren/acceptorförhållandet var 60-90: e sekund i minst 20 minuter eller tills ökningen av signalen når en platå.
- När data har exporterats beräknar du förhållandet mellan givare och acceptor (D/A-förhållande) genom att dividera donatorns relativa fluorescensenheter (RFU) med acceptorn RFU för varje tidpunkt och prov.
- Beräkna medelvärdet för D/A-förhållandet och standardavvikelsen för varje prov.
- Bestäm lutningen inom den linjära tillväxten av D/A-förhållandesändringen. Lutningen är en indikator på enzymklyvningshastigheten för en FRET-sond. Beräkna koncentrationen av aktivt enzym i sputum genom att passa de linjära regressionssluttningarna som härrör från de mänskliga proverna med de som beräknas från enzymstandarden.
- Membranbunden NSPs aktivitets kvantifiering via fluorimeter eller plåtläsare analys
- Isolera sputumceller enligt beskrivningen ovan. Återanvänd 3 x 104 celler i en volym av 40 μL PBS. Tillsätt cellerna till plattläsaren väl.
- Sätt upp instrumentet. Ställ in excitationsvåglängden för membranbunden NE FRET-sond (NEmo-214) på 405 nm och ställ in detektionsvåglängden på 485 nm för givaren och 580 nm för acceptorn. Ställ in excitationsvåglängden för membranbunden CG FRET-sond (mSAM15)på 405 nm och ställ in utsläppet på 485 (givare) och 580 nm (acceptor).
- För att förbereda huvudblandningen som innehåller reportrarna, späd sondbeståndet i aktiveringsbuffert till en koncentration av 10 μM. Förbered den nödvändiga mastermixvolymen genom att multiplicera 10 μL X antalet önskade plåtbrunnar. För att nå den optimala slutliga koncentrationen (2 μM) för fluorescensmätning av NEmo-2- och mSAM-reportrar, tillsätt 10 μL av huvudblandningen till varje brunn (som innehåller 40 μL antingen prov, standard eller tom) och starta avläsningen. NEmo-2- och mSAM-reportrar kommer därför att övervaka membranbunden neutrofilas- respektive cathepsin G-aktivitet.
OBS: En cellulär negativ kontroll kan användas, till exempel celler som inte aktivt utsöndrar NSP: er. Till exempel representerar inkubationen av reportrarna med 3 x 104 leukocyt-stamceller HL-60 promyelocytiska celler en giltig klyvningsnegativ kontroll. - Registrera förändringar i förhållandet mellan givare och acceptor i minst 20 minuter eller tills signalökningen når en platå. Analysera data enligt beskrivningen ovan.
- Membranbundna NSPs aktivitetsmätning via fluorescensmikroskopi
- Bestäm antalet villkor som behöver analyseras.
OBS: För varje sputumprovmätning rekommenderas beredning och analys av ytterligare positiv (PC) och negativ (NC) kontroll. - För varje mätning återanvänds 3 x 104 sputumceller i en volym av 50 μL PBS i ett 1,5 ml-rör.
- Som negativ kontroll inkuberar inkubera sputumceller med en specifik hämmare (Sivelestat, specifik NE-hämmare eller cathepsin G-hämmare I, specifik CG-hämmare, vid en slutlig koncentration på 100 μM). Inkubera i 10 minuter på RT.
- Som positiv kontroll, inkubera sputumceller med lämpligt enzym (NE eller CG vid 340 nM respektive 200 nM) i 10 minuter vid RT.
- Tillsätt 50 μL PBS som innehåller FRET-reportern och en kärnfläck (i en slutlig utspädning på 1:1000) till varje rör (positiva kontrollbehandlade celler, negativa kontrollbehandlade celler och obehandlade celler) för att nå en slutlig sondkoncentration på 2 μM. Inkubera i 10-20 min vid RT.
VIKTIGT: Tillsats av en nukleär fläck underlättar fluorescensmikroskopi imaging eftersom det gör det möjligt att söka efter sputum celler av intresse utan att använda FRET sond kanaler och därför för att undvika reporter blekning. Dessutom tillåter DNA-fläcken att segmentera sputumceller enligt formen på deras kärna. Till exempel kan neutrofiler lätt identifieras av deras multilobulära atomkärnor. Ytterligare information om cellernas livskraft kan också hämtas (neutrofiler med en mer segmenterad kärna är mer benägna att leva).
OBS: Förutom den membranbundna kan aktiviteten hos DNA-bunden NE eller CG i mänskligt sputum mätas på samma sätt med hjälp av H-NE och H-CG, extracellulära DNA-associerande FRET-sonder27. Vid beredning av huvudblandningen kan H-NE och H-CG tillsättas vid koncentrationen 10 μM och inkuberas med sputum före cytospin- och glidberedning. D/A-förhållandet kvantifiering på extracellulärt DNA fortsätter identiskt med NEmo-2 och mSAM, med den enda skillnaden att extracellulära DNA-aggregat segmenteras istället för enstaka celler27. - Släcka reaktionen genom att tillsätta 100 μL iskallt PBS och överföra prover på is.
- Cytospin blandningen på mikroskopi glider, lufttorka, fixera med iskallt metanol 10% i 10 min, lufttorka och montera med lämpligt monteringsmedium.
OBS: Mikroskopibilderna kan förvaras vid 4 °C i mörker i upp till en månad tills vidare analys. - Skaffa mikroskopibilder med ett konfokalt mikroskop med ett PL APO 40x eller 63x oljemål. För att öka bildkvaliteten och minska förvärvstiden rekommenderas ett sekventiellt bildförvärvsläge.
- Avbilda kärnfläcken först via 633 nm excitation med helium-neon-laserlinjen och registrera dess utsläpp mellan 650 och 715 nm.
- Registrera donatorn (kumarin 343) av FRET-reportern mellan 470 och 510 nm vid excitation vid 458 nm med en argonlaser. Förvärva det sensibiliserade acceptorutsläppet (5,6-TAMRA) mellan 570 och 610 nm efter ensam donatorexcitation.
- Registrera direkt acceptorutsläppet i en separat kanal mellan 470 och 510 nm vid optimal excitation vid 561 nm med hjälp av dpss-lasern (diodpumpat fast tillstånd).
- Ställ in pinhole i början av experimentet och behåll under avbildningssessionen.
OBS: På grund av deras lilla storlek rekommenderas användning av ett 40x eller 63x mikroskopmål för att visualisera neutrofiler ordentligt. Vanligtvis förvärvas bilder i flera på varandra följande kanaler, med början med den längre excitationsvåglängden för att förhindra fotografering av reportern under förvärvet.
- Bild minst 100 celler per villkor för avgörande statistik. För analys av mikroskopibilder använder du en lämplig programvara: segmentera cellerna och beräkna D/A-förhållandet pixel för pixel, beräkna därefter medelvärdet eller medianvärdet för ett visst intresseområde som väljs manuellt av användaren. För representativa resultat se figur 1.
- Bestäm antalet villkor som behöver analyseras.
Figur 1: Representativa bilder och kvantifiering av membranbunden NE-aktivitet på neutrofiler isolerade från CF patientens sputum. a) Representativa konfokala mikroskopibilder av neutrofiler förinkuberade (övre panelen) i 10 minuter med 100 μM Sivelestat (w/) eller lämnas obehandlade (w/o) (nedre panelen) före reporter NEmo-2 (2 μM) tillägg. Den första kolumnen från vänster visar kärnfläcken, den andra givarkanalen, den tredje acceptorkanalen och den sista det beräknade D/A-förhållandet som erhålls genom att dela donator- och acceptorkanalerna pixel för pixel. Gränserna för intresseområdet (enkel neutrofil) avbildas som streckad linje. Skal (10 μm) och kalibreringsstänger (D/A-förhållande) anges. b) Box- och punkt-tomter som visar D/A förhållandet mellan sputum neutrophils från en representativ CF patient. Celler inkuberade med hämmare respektive obehandlade celler visas i grått respektive blått. Varje punkt representerar en cell (N: w/ inhibitor = 113 och w/o-hämmare = 96). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Membranbunden NSPs aktivitetsmätning via flödescytometri
- Återanvänd 1 x 106 celler i 100 μL PBS i ett 5 ml FACS polystyren rundbottnat rör och placera röret på is.
- Använd följande antikroppar: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) och CD66b (1:50). Förbered tillräckligt med huvudblandning för alla prover. Placera mästerblandningen på isen i mörkret.
- Ställ in gatingstrategin enligt beskrivningen i figur 2. Neutrofilerna är gated som 7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ händelser. De gated händelserna kommer sedan att analyseras för deras membranbundna proteas aktivitet för deras givare (λexc = 405 nm, λem = 450/50 nm) och acceptor (λexc = 405 nm, λem = 585/42 nm) medel fluorescerande intensiteter (MFI).
- Tillsätt 2 μL FcBlock till varje prov och inkubera i 5 minuter på RT.
- Tillsätt de valda antikropparna i varje rör och inkubera i 30 minuter på is i mörkret.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 2 ml kall PBS och centrifugera i 5 minuter vid 300 x g och 4 °C. Kassera supernatant och återanvända celler i 200 μL kall PBS.
- Dela 200 μL i två rör med 100 μL vardera och tillsätt 5 μL cellens livsduglighetsfärgningslösning i varje rör. Placera rören på is.
- Tillsätt en lämplig specifik NSP-hämmare (för NE-användning Sivelestat vid 225 μM slutlig koncentration, för CG-användning cathepsin G Inhibitor I vid 100 μM) till det negativa kontrollröret (NC). Inkubera proverna på RT i 10 minuter i mörker.
- Tillsätt 100 μL kall PBS till provet, filtrera det genom ett 40 μm-filter i ett rent FACS-rör för att förhindra igensättning av instrumentet.
- Tillsätt reportern (för NE, NEmo-2 vid en slutlig koncentration av 4 μM, för CG, mSAM vid en slutlig koncentration av 2 μM) till NC-provet, virvel försiktigt röret.
- Börja förvärva celler inkuberade med den specifika hämmaren för att vid behov justera grindarna samt reportern PMTs spänningar.
- Registrera minst 1000 neutrofiler. Förvara provet i rumstemperatur.
OBS: Även om fler händelser kan registreras, säkerställer 1000 celler en bra kompromiss mellan korrekt statistik och inspelningstid. - Fortsätt med följande rör (obehandlade sputumprover) i enlighet därmed.
- För att registrera förändringar i D/A-förhållandet på grund av membranbunden proteasaktivitet, registrera 1000 neutrofiler från varje rör var 5:e till 10:e minut.
OBS: Efter framgångsrik FRET-reporter klyvning kommer givarkanalen MFI-intensiteten att öka med tiden. MFIs-intensiteten för acceptorkanalen bör minska eller förbli konstant med tiden. - Beräkna FRET-förhållandet genom att dividera givaren med acceptorkanalvärdena för de prover som mäts på de gated livskraftiga enskilda neutrofilerna.
- Normalisera provmätningarna genom att dividera dem med motsvarande 0 min tidspunkt (för representativa resultat och analyser se figur 2).
OBS: Registrering av minst två tidpunkter (dvs. 0 och 10 min) är nödvändig för en dynamisk mätning av D/A-förhållandesförändring. För att normalisera aktivitetsmätningen för varje prov divideras D/A-förhållandet mätt i senare tidpunkter (t.ex. 10 min) med det förhållande som beräknas omedelbart efter sondtillskottet (0 min).
Figur 2:Gating strategi och representativa tomter av membran-bundna NE verksamhet mätt på neutrophils isolerade från CF patienten sputum. a) För att gate sputum neutrophils följande antikroppar används: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) och CD66b (1:50). Neutrofilerna är gated som 7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ händelser. De gated händelserna analyseras för deras givare (λexc= 405 nm, λem= 450/50 nm) och acceptor (λexc= 405 nm, λem= 585/42 nm) genomsnittliga fluorescens intensiteter (MFI). b) Representativa histogram av CF sputum neutrophils analyseras för deras membran-bundna NE verksamhet. Den vänstra kolumnen visar givarsignalen, den högra kolumnen visar acceptorsignalen. Den översta raden visar genomsnittliga fluorescensintensiteter av celler som behandlats med Sivelestat (w/) i 10 minuter före tillsats av reportern. Den nedre raden visar obehandlade (w/o) celler vars reporter fluorescens mäts omedelbart (0 min, grå) och 10 min (blå) efter reporter tillägg. Neutrofiler är gated enligt den strategi som visas i panel a. c) Datatabellen visar en representativ datauppsättning bestående av råa MFI för givaren och acceptorsignalen på neutrofiler mätta över flera tidpunkter (0-3-5-10-15-20 min) samt det beräknade D/A-förhållandet. D/A-förhållandet kan normaliseras, dvs. till 0 min-tidpunkten (vitt teckensnitt). 0 min indikerar en inspelning som görs så snart som möjligt efter reporter tillägg till flödesröret med färgade sputum celler. MFI-data visas som ± standardavvikelse för 1000 neutrofiler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Representative Results
Resultaten i figur 1a illustrerar en representativ mikroskopidatauppsättning. Kärnsignalen används för att identifiera neutrofiler med sina karakteristiska segmenterade atomkärnor. Intresseområdet (ROI) väljs manuellt (streckad linje i figur 1a). D/A-förhållandesbilden beräknas genom att givarkanalens intensitet divideras med stödlinjens intensitet på pixel-för-pixel-basis. I det sista steget beräknas det genomsnittliga D/A-förhållandet per cell (ROI). I figur 1b representerar varje punkt medelvärdet av en ROI (neutrofil). Vi rekommenderar att du avbildar och utvärderar cirka 100 celler per villkor.
En representativ strategi för flödescytometrigating visas i figur 2a. Sådan gating tillåter att diskriminera och studera sputum neutrofiler. För att undvika fluorescensspillning eller kompensationsartefakter rekommenderas att en laserlinje (t.ex. blå laser) dedikerar till FRET-sondens fluorescensdetektering. Flödescytometrifluorescenskompensation bör utföras för antikroppar och inte för FRET-sonden. Figur 2b visar MFI-fördelningen 0 och 10 minuter efter reportertillskottet. Varje rad i figur 2c anger medelvärdena för 1000 sputum neutrofiler. D/A-förhållandet beräknas genom att dela givaren och acceptorn MFI. Tidskursen i figur 2c på höger sida visar mätningens förlopp: efter en snabb initial ökning når D/A-förhållandet en platå, beroende på aktiviteten hos det membranbundna enzymet.
Discussion
De rapporterade protokollen förklarar olika metoder för att kvantifiera aktiviteten hos neutrophil elastase och cathepsin G i mänskliga sputum prover. Kritiska punkter för en framgångsrik enzymaktivitetsmätning är i) exakt timing och standardisering av det operativa förfarandet och ii) användningen av tillförlitliga negativa och positiva kontroller. Om dessa villkor är uppfyllda är de beskrivna metoderna inte begränsade till sputum utan kan också enkelt anpassas till analysen av proteasaktivitet i blod, bronkolveolära lavagevätskor och vävnadssektioner eller homogenat.
Var och en av de tre teknikerna har sina styrkor och begränsningar, som ofta kompletterar varandra. Till exempel möjliggör flödescytometri snabb analys av sällsynta cellpopulationer samt cell fenotypning men saknar rumslig upplösningsinformation, vilket kan uppnås genom mikroskopi. I stället möjliggör plåtläsarmätningar en parallell bedömning av flera prover eller förhållanden på ett höggenomströmnings sätt. Eftersom färska sputumceller inte kan frysas och lagras kräver de tre metoderna att proverna måste bearbetas snabbt efter expectoration. Detta begränsar flexibiliteten eller genomströmningen av de membranbundna aktivitetsmätningarna. Utvecklingen av ett flöde cytometri protokoll som gör det möjligt att fixa celler efter sond tillägg och enzymatisk klyvning skulle öppna för parallell mätning av ett högre antal rör. Dessutom bör särskild uppmärksamhet ägnas åt hantering och lagring av FRET-sonderna. Faktum är att vissa aminosyror som finns i peptidsubstratet, såsom metionin, genomgår oxidation vilket leder till minskad reporterkänslighet. För att öka reporterns hållbarhet (uppskattad till cirka tre månader vid 20 °C) kan de lagras i små volymer alikvoter (1-2 μL) under inert gas som kväve eller argon.
I CF och andra kroniska inflammatoriska lungsjukdomar är det viktigt att upptäcka inflammationen så tidigt som möjligt, och pålitliga biomarkörer har potential att uppnå ett sådant mål. Möjligheten att upptäcka ytbunden NSP-aktivitet, som har visat sig vara skadlig för den omgivande vävnaden, även under förhållanden när det inte finns någon eller liten fri NE-aktivitet, lägger till en annan nivå av värdefull information, som knappast kan uppnås med hjälp av andra befintliga metoder4,11.
Reportrarna kan användas för att studera sambandet mellan membranbunden associerad NSP-aktivitet med svårighetsgrad och progression av lungsjukdom, särskilt vid dess tidiga början. Metoderna kan användas för att övervaka behandlingseffekten (t.ex. antiinflammatoriska behandlingar eller mycket effektiva CFTR-modulatorer och potentiatorer28) och undersöka den resulterande dämpningen av neutrofildriven inflammation. Dessutom är protokollen baserade på icke-invasiva provförfaranden som medför mycket låg risk för patienten och därför kan användas i mycket stor skala och öppna dörrarna för många spännande applikationer.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta projekt stöddes av bidrag från det tyska ministeriet för utbildning och forskning (FKZ 82DZL004A1 till M.A.M) och den tyska forskningsstiftelsen (SFB-TR84TP B08 till M.A.M). Arbete som beskrivs i detta manuskript stöddes av german Center of Lung Research (DZL) och EMBL Heidelberg genom ett doktorandstipendium för M.G. Vi tackar J. Schatterny, S. Butz och H. Scheuermann för teknisk hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431752 | |
| 2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader) | PerkinElmer | ||
| 35x10mm Dish, Nunclon Delta | Thermo Fisher Scientific | 150318 | |
| 40 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431750 | |
| 50 mL tubes | Sarstedt | 10535253 | |
| 7-AAD, viability dye | Bio Legend | 420404 | 5 µL/100 µL |
| Balance | OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd. | PR124 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL | BD Bioscience | 352054 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | ||
| black flat bottom 96 well half area plate | Corning Life Science | 3694 | |
| Cathepsin G | Elastin Products Company | SG623 | |
| Cathepsin G Inhibitor I | Merck KGaA | 219372 | |
| Centrifuge 5418R | Eppendorf AG | EP5401000137 | |
| Combitips advanced 1.0 mL | Eppendorf AG | 0030 089 430 | |
| cOmplete proteinase inhibitor | Roche | 11697498001 | |
| Countig chambers improved Neubauer | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442 | |
| coverslips Ø 25mm | Thermo Fisher Scientific | MENZCB00250RA003 | |
| Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific | ||
| DRAQ5 (nuclear stain) | BioStatus Limited | DR50050 | 1:10000 |
| FACSDiva software, v8.0.1 | BD Bioscience | ||
| FcBlock | BD Bioscience | 564219 | |
| Fiji (Fiji Is Just ImageJ) | fiji.sc | ||
| Flow Jo software, v10 | TreeStar | ||
| FluoQ Plugin, v3-97 | |||
| Heraeus Megafuge 16R | Thermo Fisher Scientific | ||
| Human Sputum Leucocyte Elastase | Elastin Products Company | SE563 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Mini Rock-Shaker | PEQLAB Biotechnologie GmbH | MR-1 | |
| mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2 | BD Bioscience | 557742 Lot:8221983 | 1:50 |
| mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8 | BD Bioscience | 557820 Lot:8208791 | 1:50 |
| mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1 | BD Bioscience | 557833 Lot:8059688 | 1:33 |
| mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5 | BioLegend | 305122 Lot:B241921 | 1:50 |
| mSAM | in house | 2 mM | |
| Multipette plus | Eppendorf AG | ||
| NEmo-1 | SiChem | SC-0200 | 1 mM |
| NEmo-2E | SiChem | SC-0201 | 2 mM |
| Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer | Pari | 085G3001 | |
| phosphate buffered saline | Gibco | 10010-015 | |
| ROTI Histokitt (mounting medium) | Carl Roth GmbH + Co.KG | 6638.1 | |
| Salbutamol | Teva GmbH | ||
| Sivelestat | Cayman Chemicals | 17779 | |
| Sputolysin | Calbiochem | 560000-1SET | |
| sSAM | in house | 2 mM | |
| SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Korkmaz, B., Moreau, T., Gauthier, F. Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: Physicochemical properties, activity and physiopathological functions. Biochimie. 90 (2), 227-242 (2008).
- Sheshachalam, A., Srivastava, N., Mitchell, T., Lacy, P., Eitzen, G. Granule Protein Processing and Regulated Secretion in Neutrophils. Frontiers in Immunology. 5, 448 (2014).
- Pham, C. T. N. Neutrophil serine proteases: Specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Gehrig, S., et al. Lack of neutrophil elastase reduces inflammation, mucus hypersecretion, and emphysema, but not mucus obstruction, in mice with cystic fibrosislike lung disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (9), 1082-1092 (2014).
- McKelvey, M. C., Weldon, S., McAuley, D. F., Mall, M. A., Taggart, C. C. Targeting proteases in cystic fibrosis lung disease paradigms, progress, and potential. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (2), 141-147 (2020).
- Clancy, D. M., et al. Extracellular Neutrophil Proteases Are Efficient Regulators of IL-1, IL-33, and IL-36 Cytokine Activity but Poor Effectors of Microbial Killing. Cell Reports. 22 (11), 2937-2950 (2018).
- Giacalone, V. D., Margaroli, C., Mall, M. A., Tirouvanziam, R. Neutrophil adaptations upon recruitment to the lung: New concepts and implications for homeostasis and disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-21 (2020).
- Sly, P. D., et al. Risk Factors for Bronchiectasis in Children with Cystic Fibrosis. New England Journal of Medicine. 368 (21), 1963-1970 (2013).
- Owen, C. A., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Campbell, E. J. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: A novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. Journal of Cell Biology. 131 (3), 775-789 (1995).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Margaroli, C., et al. Elastase Exocytosis by Airway Neutrophils Associates with Early Lung Damage in Cystic Fibrosis Children. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. , (2018).
- Owen, C., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Carolina, N. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: a novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. The Journal of cell biology. 131 (3), 775-789 (1995).
- Garland, M., Yim, J. J., Bogyo, M. A Bright Future for Precision Medicine: Advances in Fluorescent Chemical Probe Design and Their Clinical Application. Cell chemical biology. 23 (1), 122-136 (2016).
- Gehrig, S., Mall, M. A., Schultz, C. Spatially resolved monitoring of neutrophil elastase activity with ratiometric fluorescent reporters. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (25), 6258-6261 (2012).
- Guerra, M., et al. Cathepsin G Activity as a New Marker for Detecting Airway Inflammation by Microscopy and Flow Cytometry. ACS Central Science. 5 (3), 539-548 (2019).
- Hu, H. Y., et al. In vivo imaging of mouse tumors by a lipidated cathepsin S substrate. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (29), 7669-7673 (2014).
- Korkmaz, B., et al. Measuring elastase, proteinase 3 and cathepsin G activities at the surface of human neutrophils with fluorescence resonance energy transfer substrates. Nature Protocols. 3 (6), 991-1000 (2008).
- Craven, T. H., et al. Super-silent FRET Sensor Enables Live Cell Imaging and Flow Cytometric Stratification of Intracellular Serine Protease Activity in Neutrophils. Scientific Reports. 8 (1), 13490 (2018).
- Mu, J., et al. A small-molecule fret reporter for the real-time visualization of cell-surface proteolytic enzyme functions. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (52), 14357-14362 (2014).
- Hagner, M., et al. New method for rapid and dynamic quantification of elastase activity on sputum neutrophils from patients with cystic fibrosis using flow cytometry. European Respiratory Journal. 55 (4), 1902355 (2020).
- Dittrich, A. S., et al. Elastase activity on sputum neutrophils correlates with severity of lung disease in cystic fibrosis. European Respiratory Journal. , 1701910 (2018).
- Cobos-Correa, A., Trojanek, J. B., Diemer, S., Mall, M. A., Schultz, C. Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation. Nature Chemical Biology. 5 (9), 628-630 (2009).
- Hu, H. -Y., et al. FRET-based and other fluorescent proteinase probes. Biotechnology Journal. 9 (2), 266-281 (2014).
- Trojanek, J. B., et al. Airway mucus obstruction triggers macrophage activation and matrix metalloproteinase 12-dependent emphysema. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (5), 709-720 (2014).
- Wagner, C. J., Schultz, C., Mall, M. A. Neutrophil elastase and matrix metalloproteinase 12 in cystic fibrosis lung disease. Molecular and Cellular Pediatrics. 3 (1), 25 (2016).
- Gaggar, A., et al. The role of matrix metalloproteinases in cystic fibrosis lung disease. The European respiratory journal. 38 (3), 721-727 (2011).
- Guerra, M., et al. Protease FRET Reporters Targeting Neutrophil Extracellular Traps. Journal of the American Chemical Society. 142 (48), 20299-20305 (2020).
- Middleton, P. G., et al. Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor for Cystic Fibrosis with a Single Phe508del Allele. New England Journal of Medicine. 381 (19), 1809-1819 (2019).
