Summary
Die hier beschriebenen Protokolle bieten einen Leitfaden zur Visualisierung und Quantifizierung der Aktivität von Neutrophilenproteasen im menschlichen Sputum. Die Anwendungen einer solchen Analyse reichen von der Bewertung entzündungshemmender Behandlungen über die Validierung von Biomarkern, das Screening von Medikamenten bis hin zu klinischen Studien mit großen Kohorten.
Abstract
Proteasen sind Regulatoren unzähliger physiologischer Prozesse und die genaue Untersuchung ihrer Aktivitäten bleibt eine faszinierende biomedizinische Herausforderung. Unter den ~ 600 Proteasen, die vom menschlichen Genom kodiert werden, werden neutrophile Serinproteasen (NSPs) gründlich auf ihre Beteiligung am Auftreten und Fortschreiten von entzündlichen Erkrankungen einschließlich Atemwegserkrankungen untersucht. Einzigartig ist, dass sezernierte NSPs nicht nur in extrazellulären Flüssigkeiten diffundieren, sondern auch in Plasmamembranen lokalisiert sind. Während der Bildung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) werden NSPs zu einem integralen Bestandteil des sezernierten Chromatins. Solch komplexes Verhalten macht das Verständnis der NSPs-Pathophysiologie zu einer herausfordernden Aufgabe. Hier werden detaillierte Protokolle gezeigt, um freie und membrangebundene Neutrophilenelastase (NE) und Cathepsin G (CG) Aktivitäten in Sputumproben zu visualisieren, zu quantifizieren und zu unterscheiden. NE und CG sind NSPs, deren Aktivitäten eine pleiotrope Rolle bei der Pathogenese von Mukoviszidose (CF) und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) spielen: Sie fördern den Gewebeumbau, regulieren nachgelagerte Immunantworten und korrelieren mit der Schwere der Lungenerkrankung. Die Protokolle zeigen, wie flüssige und zelluläre Fraktionen sowie die Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Sputum für die enzymatische Aktivitätsquantifizierung über niedermolekulare Förster-Resonanz-Energietransfer-basierte (FRET) Reporter getrennt werden können. Um spezifische Einblicke in die relative Rolle von NE- und CG-Aktivitäten zu erhalten, kann eine FRET-Auslesung mit verschiedenen Technologien gemessen werden: i) In-vitro-Plattenlesermessungen ermöglichen einen Hochdurchsatz- und Massennachweis der Proteaseaktivität; ii) Konfokale Mikroskopie löst räumlichzeitlich die membrangebundene Aktivität an der Zelloberfläche auf; iii) Die niedermolekulare FRET-Durchflusszytometrie ermöglicht die schnelle Bewertung entzündungshemmender Behandlungen durch Einzelzell-Proteaseaktivitätsquantifizierung und Phänotypisierung. Die Implementierung solcher Methoden öffnet die Türen, um die NSPs-Pathobiologie und ihr Potenzial als Biomarker für den Schweregrad der Erkrankung bei CF und COPD zu erforschen. Aufgrund ihres Standardisierungspotenzials, ihrer robusten Auslesung und der Einfachheit des Transfers sind die beschriebenen Techniken sofort für die Implementierung in Forschungs- und Diagnoselabors nutzbar.
Introduction
Neutrophile Elastase (NE), Cathepsin G (CG), Proteinase 3 (PR3) und neutrophile Serinprotease 4 (NSP4) sind die vier neutrophilen Serinproteasen (NSPs)1. Sie werden zusammen mit der Myeloperoxidase in neutrophilen primären oder azurophilen Granula gelagert. Aufgrund ihres erhöhten proteolytischen Gehalts ist die Sekretion von Primärgranulaten streng reguliert und Neutrophile müssen sequentiell mit Grundierungs- und Aktivierungsreizen herausgefordert werden2.
Im Inneren des Phagolysosoms fungieren NSPs als intrazelluläre bakterizide Wirkstoffe3. Wenn sie sezerniert werden, werden NSPs zu starken Entzündungsmediatoren: Sie spalten Zytokine und Oberflächenrezeptoren und aktivieren parallele entzündungsfördernden Signalwege3. Wichtig ist, dass entzündliche Zustände eine unkontrollierte NSPs-Sekretion aufweisen. Zum Beispiel verursacht übermäßige NE-Aktivität in entzündeten Atemwegen Schleimhyperekretion, Speiseblezellmetaplasie, CFTR-Inaktivierung und extrazelluläre Matrixumbau4,5. Cathepsin G ist auch an Entzündungen beteiligt: Es spaltet und aktiviert spezifisch zwei Komponenten der IL-1-Familie, IL-36α und IL-36β6. In Verbindung mit NE spaltet CG Protease-aktivierte Rezeptoren auf dem Atemwegsepithel und aktiviert auch TNF-α und IL-1β.
Endogene Antiproteasen wie alpha-1-Antitrypsin, alpha-1-Antichymotrypsin und der sekretorische Leukozytenproteasehemmer regulieren die Neutrophilenelastase und die Cathepsin-G-Aktivität5. Im Verlauf des Fortschreitens der Lungenerkrankung übersteigt jedoch die kontinuierliche Sekretion von Proteasen stöchiometrisch den Antiprotease-Schild, was zu einer nicht auflösenden Neutrophilie in den Atemwegen, einer Verschlechterung der Entzündung und Gewebeschäden führt5,7. Obwohl sich die NE-Konzentration und -Aktivität in löslichen Fraktionen der Atemwege des Patienten als vielversprechender Biomarker für den Schweregrad8der Erkrankung erwiesen hat, sind NE und CG auch mit der neutrophilen Plasmamembran und der extrazellulären DNA über elektrostatische Wechselwirkungen9,10 verbunden,wo sie für Antiproteasen weniger zugänglich werden. Wichtig ist, dass präklinische Studien ein Szenario definierten, in dem die Zelloberflächen-assoziierte Proteaseaktivität früher und/oder unabhängig von ihrem löslichen Gegenstück4,11auftritt. Um nachweisbar zu werden, muss die freie Proteaseaktivität zunächst den Antiproteaseschild überwältigen. Stattdessen bleibt an der Zelloberfläche die membrangebundene Proteaseaktivität aufgrund der Unzugänglichkeit großer Inhibitoren für die Zellplasmamembran zumindest teilweise intakt12. Ein solches komplexes Proteaseverhalten hat wichtige Konsequenzen für den Beginn und die Ausbreitung von neutrophilenvermittelten Entzündungen und muss daher mit präzisen und informativen Werkzeugen untersucht werden.
Im Laufe der Jahre fanden Förster-Resonanz-Energieübertragungssonden (FRET)-basierte Sonden zahlreiche biomedizinische Anwendungen als Werkzeuge, die eine spezifische Proteaseaktivität in menschlichen Proben effizient und schnell bewerten13. Um zu funktionieren, bestehen Protease-Reporter aus einem Erkennungsmotiv (d. H. Ein Peptid), das vom Zielenzym erkannt wird, und stützen sich auf FRET, einen physikalischen Prozess, bei dem ein Donorfluorophor nach Anregung Energie auf ein Akzeptormolekül überträgt. Die verarbeitung durch das Enzym auf dem Reporter, nämlich die Spaltung des Erkennungsteils, führt dazu, dass der Akzeptor vom Spender weg diffundiert: Die Enzymaktivität wird also als zeitabhängige Veränderung des Donors über die Akzeptorfluoreszenz gemessen. Eine solche Auslesung ist selbstnormalisierend und ratiometrisch und wird daher nur geringfügig von Umweltbedingungen wie pH-Wert und lokaler Sondenkonzentration beeinflusst. NEmo-114 und sSAM15 sind FRET-Sonden, die speziell über NE- bzw. CG-Aktivität berichten. Solche Reporter lokalisieren jedoch nicht spezifisch auf ein zelluläres Kompartiment, daher werden sie verwendet, um die Proteaseaktivität in menschlichen Flüssigkeiten zu überwachen. Um die Proteaseaktivität räumlich lokalisiert zu überwachen, haben wir und andere FRET-Sonden entwickelt, die über molekulare Tags 14 , 15 ,16,17,18,19mitsubzellulären Komponenten assoziiert werden. Eine solche synthetische Strategie ermöglichte die Entwicklung von NEmo-2 und mSAM, zwei FRET-Sonden, die mit Lipidankern ausgestattet sind, die sich an der Plasmamembran lokalisieren. Diese Reporter befeuerten ein tieferes Verständnis von NE- und CG-Proteasen bei Mukoviszidose und chronisch obstruktiven Lungenerkrankungen14,15.
Hier werden detaillierte Protokolle zur Visualisierung und Quantifizierung löslicher und membrangebundener NE- und CG-Aktivitäten im menschlichen Sputum mittels FRET-Sonden der Serien NEmo und SAM bereitgestellt. Um verschiedene Aspekte der NSPs-Pathophysiologie zu adressieren und eine Reihe von Methoden bereitzustellen, die je nach benutzerspezifischem Bedarf eingesetzt werden können, werden die Analysen mittels Fluoreszenzspektroskopie, Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie gezeigt.
Protocol
Die folgenden Protokolle beschreiben Analysen, die am menschlichen Sputum durchgeführt werden. Der Umgang mit menschlichen Proben wurde von der Ethikkommission der Universität Heidelberg genehmigt und die schriftliche Einwilligung nach Aufklärung aller Patienten bzw. ihrer Eltern/Erziehungsberechtigten (S-370/2011) und der Gesunden Kontrollen (S-046/2009) eingeholt.
HINWEIS: Die folgenden Protokolle beschreiben die Probenvorbereitung und die Quantifizierung der Aktivität von Neutrophilen Serinproteasen (NSPs). Die hier vorgestellten experimentellen Verfahren konzentrieren sich auf die Aktivitätsmessung von humaner Sputum- und neutrophiler Elastase14,20,21 (NE) oder Cathepsin G15 (CG). Leichte Anpassungen im Probenvorbereitungsprotokoll ermöglichen jedoch die Analyse von blutabgeleiteten Zellen und Tumorhomogenaten. Zusätzlich können Matrix-Metalloproteinase-12- und Cathepsin-S-Aktivitäten mittels dedizierter FRET-Sonden22,23,24,25,26ähnlich untersucht werden.
1. Probenvorbereitung: Zellisolierung und Überstandstrennung
HINWEIS: Wenn möglich, sollte die Behandlung von Sputum innerhalb von 120 minuten nach dem Auswurf durchgeführt werden und der Auswurf sollte bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis gelagert werden.
- Wenn ein spontaner Auswurf von Sputum nicht möglich ist, induzieren Sie Sputum wie zuvor beschrieben19. Inhalieren Sie kurz 200 μg des β-2-Rezeptor-Antagonisten Salbutamol, bevor Sie mit der Sputuminduktion beginnen. Anschließend eine hypertone (6%) Kochsalzlösung für 15 Minuten mit einem Vernebler einatmen. Sammeln Sie den schleimerten Auswurf in einer Petrischale.
- Trennen Sie die Schleimklumpen aus dem Speichel mit Hilfe einer Pipettenspitze in eine Petrischale.
- Wiegen Sie den Schleim.
HINWEIS: Das durchschnittliche Gewicht einer Schleimproben beträgt 0,8 g (variiert zwischen 0,1 g und 5 g); 0,1 g reichen in der Regel aus, um die genannten Verfahren durchzuführen. - Fügen Sie 4 Teile (v/w) 10% Sputolysin (in PBS) zum Sputum hinzu (zum Beispiel: 4 ml 10% Sputolysin für jedes Gramm Sputum).
ACHTUNG: Sputolysin besteht aus konzentriertem Dithiothreitol im Phosphatpuffer, daher behandeln Sie es mit Vorsicht. - Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur (RT) auf einem Schaukelschüttler für 15 min, um den Schleim aufzulösen. Aus Sicherheitsgründen den Shaker in einen Abzug setzen.
- Löschen Sie die Reaktion, indem Sie das gleiche Volumen an kaltem PBS hinzufügen (zum Beispiel: 1 ml kaltes PBS für jeden ml 10% Sputolysin).
- Mischen Sie durch Pipettieren, um eine homogene Lösung zu erhalten.
- Filtern Sie die Mischung durch ein 100 μm Nylon-Zellsieb in ein 50-ml-Röhrchen.
- Wiederholen Sie den Filtrationsschritt durch ein 40 μm Nylon-Zellsieb.
- Zentrifuge die Lösung für 10 min bei 300 x g bei 4 °C.
- Die Überstandsfraktion vorsichtig in ein frisches Röhrchen geben und auf Eis lagern.
HINWEIS: Die Überstandsfraktionen können bis zur weiteren Analyse bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden. - Das Zellpellet in 500 μL kaltem PBS vorsichtig wieder aufkehren und auf Eis legen.
HINWEIS: Die Zellfraktion muss sofort verarbeitet werden.
2. Messung der Neutrophilen-Serinprotease-Aktivität
HINWEIS: Hier werden verschiedene Methoden eingeführt, um die Aktivität von NSP mit Hilfe von FRET-Reportern zu quantifizieren. Die Wahl der Technologie wird von der spezifischen biomedizinischen Frage und dem Zweck des Experiments bestimmt. Die vorgestellten Sonden wurden ausgiebig auf ihre Spezifität gegen eine Reihe lungenrelevanter Enzymegetestet 14,15. Obwohl die Sonden spezifisch für ihr Zielenzym sind, überprüfen Sie immer die Sondenspezifität an der klinischen Probe von Interesse. Dies kann erreicht werden, indem die Probe vor der Sondenaddition mit einem spezifischen Proteaseinhibitor inkubiert wird, wodurch eine Erhöhung des D/A-Verhältnisses beseitigt werden sollte.
- Quantifizierung der aktivität löslicher NSPs mittels Fluorimeter- oder Plattenleser-Assay
HINWEIS: Die Proteaseaktivität in löslichen Fraktionen der Probe kann mit jedem Instrument nachgewiesen werden, das zur Fluoreszenzdetektion geeignet ist.- Enzyme auf Eis auftauen.
- Halten Sie NE und CG bis zur Verwendung im sauren Speicherpuffer (50 mM Natriumacetat, 200 mM NaCl, pH 5,5), um eine Selbstspaltung zu verhindern.
- Um eine Enzymstandardkurve einzurichten, bereiten Sie eine 1:2-Serienverdünnung des Enzyms (33,9 - 0,271 nM für NE; 42,6 - 0,333 nM für CG) im Aktivierungspuffer (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl bei pH 7,5) vor. Der Aktivierungspuffer hat einen neutralen pH-Wert und ermöglicht somit eine effiziente enzymatische Katalyse.
- Um die höchste Standardkonzentration (NE-Konzentration: 33,9 nM) zu erhalten, verdünnen Sie 1 μL NE (33,9 μM) in 999 μL Aktivierungspuffer.
- Um den zweiten Standard (NE-Konzentration: 16,95 nM) vorzubereiten, mischen Sie 200 μL der ersten Verdünnung mit 200 μL Aktivierungspuffer.
- Gehen Sie entsprechend vor, um die verbleibenden 1:2-Verdünnungen vorzubereiten.
- Der letzte Standard, der der Leere ist, besteht aus einem reinen Aktivierungspuffer. Die Messung von technischen Duplikaten oder Triplikaten wird empfohlen. Versuchen Sie während der Standard- und Probenvorbereitung, fläschchen auf Eis zu halten.
- Parallel zur Standardvorbereitung verdünnen Sie Sputumproben im Aktivierungspuffer. Verdünnen Sie die menschlichen Proben, bevor Sie ihre Proteaseaktivität bewerten, um im linearen Bereich der Erhöhung des Reportersignals (Donor/Akzeptor-Verhältnis) zu bleiben. Wenn Patientenproben unverdünnt blieben, würde die Spaltung für eine zuverlässige Anpassung zu schnell erfolgen. Da gesunder Spendersputum im Vergleich zu Proben von CF- und COPD-Patienten weniger aktive Proteasen enthält, werden in der Regel unterschiedliche Verdünnungen durchgeführt (1:10 für gesunden Sputumüberstand, 1:20-500 für Sputumüberstand von COPD- oder CF-Patienten).
HINWEIS: Um die Proteaseaktivität in Proben, deren Konzentration unbekannt ist, quantitativ zu messen, muss eine Standardkurve mit bekannten Enzymkonzentrationen parallel gemessen werden, idealerweise auf derselben Platte. Die Konzentration des aktiven Enzyms im menschlichen Sputum wird berechnet, um die in menschlichen Sputumproben gemessenen Steigungen mit denen zu interpolieren, die mit den Standardkurven gemessen wurden. - Bevor Sie die Proben für die Messung vorbereiten, stellen Sie das Gerät ein. Stellen Sie die Anregungswellenlänge für die NE FRET-Sonde (NEmo-114) auf 354 nm und die Detektionswellenlänge auf 400 nm für den Donor und 490 nm für den Akzeptor ein. Stellen Sie die Anregungswellenlänge für die CG FRET-Sonde (sSAM15)auf 405 nm und die Emission auf 485 (Donor) und 580 nm (Akzeptor) ein.
- Fügen Sie 40 μL Proben, Standard oder Leer, in die Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Halbflächenplatte hinzu.
- Um den Master-Mix mit den Reportern (Konzentration des Reporters im Master-Mix: 10 μM) vorzubereiten, verdünnen Sie den Sondenbestand (1 mM in DMSO) 1:100 im Aktivierungspuffer. Bereiten Sie das erforderliche Master-Mix-Volumen vor, indem Sie 10 μL x die Anzahl der erforderlichen Plattenbohrungen multiplizieren. Um die optimale Endkonzentration (2 μM) für die Fluoreszenzmessung von NEmo-1- und sSAM-Reportern zu erreichen, fügen Sie 10 μL der Mastermischung zu jeder Vertiefung hinzu (mit 40 μL Probe, Standard oder Leer) und starten Sie die Auslesung. NEmo-1- und sSAM-Reporter werden daher die Aktivität der löslichen neutrophilen Elastase bzw. der Cathepsin-G überwachen.
HINWEIS: Wenn kein Reagenzinjektor verfügbar ist, stellen Sie sicher, dass Sie die Auslesung so schnell wie möglich nach dem Hinzufügen der Proben durch den Reporter starten. - Starten Sie die Messung des Plattenlesers und zeichnen Sie die Erhöhung des Spender-Akzeptor-Verhältnisses alle 60-90 Sekunden für mindestens 20 Minuten auf oder bis die Erhöhung des Signals ein Plateau erreicht.
- Sobald die Daten exportiert wurden, berechnen Sie das Donor/Akzeptor-Verhältnis (D/A-Verhältnis), indem Sie die donorrelativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) mit der Akzeptor-RFU für jeden Zeitpunkt und jede Probe teilen.
- Berechnen Sie den Mittelwert des D/A-Verhältnisses und die Standardabweichung jeder Probe.
- Bestimmen Sie die Steigung innerhalb des linearen Wachstums der D/A-Verhältnisänderung. Die Steigung ist ein Indikator für die Enzymspaltungsrate für eine FRET-Sonde. Berechnen Sie die Konzentration des aktiven Enzyms im Sputum, indem Sie die linearen Regressionshänge, die aus den menschlichen Proben abgeleitet wurden, mit denen aus dem Enzymstandard anpassen.
- Membrangebundene NSPs-Aktivitätsquantifizierung mittels Fluorimeter- oder Plattenleser-Assay
- Isolieren Sie Sputumzellen wie oben beschrieben. 3 x 10 4 Zellen ineinem Volumen von 40 μL PBS wiedergeben. Fügen Sie die Zellen gut zum Plattenleser hinzu.
- Richten Sie das Instrument ein. Stellen Sie die Anregungswellenlänge für die membrangebundene NE FRET-Sonde (NEmo-214) auf 405 nm und die Detektionswellenlänge auf 485 nm für den Donor und 580 nm für den Akzeptor ein. Stellen Sie die Anregungswellenlänge für die membrangebundene CG-FRET-Sonde (mSAM15)auf 405 nm und die Emission auf 485 (Donor) und 580 nm (Akzeptor) ein.
- Um den Master-Mix mit den Reportern vorzubereiten, verdünnen Sie den Sondenbestand im Aktivierungspuffer auf eine Konzentration von 10 μM. Bereiten Sie das erforderliche Master-Mix-Volumen vor, indem Sie 10 μL X die Anzahl der erforderlichen Plattenbohrungen multiplizieren. Um die optimale Endkonzentration (2 μM) für die Fluoreszenzmessung von NEmo-2- und mSAM-Reportern zu erreichen, fügen Sie 10 μL des Master-Mixes zu jeder Vertiefung hinzu (mit 40 μL Entweder Probe, Standard oder Leer) und starten Sie die Auslesung. NEmo-2- und mSAM-Reporter werden daher die membrangebundene Neutrophilenelastase bzw. die Cathepsin-G-Aktivität überwachen.
HINWEIS: Eine zelluläre Negativkontrolle kann verwendet werden, z. B. Zellen, die NSPs nicht aktiv absondern. Zum Beispiel stellt die Inkubation der Reporter mit 3 x 104 Leukozyten-Vorläufern HL-60 promyelozytäre Zellen eine gültige Spaltungsnegativkontrolle dar. - Zeichnen Sie die Änderung des Spender-Akzeptor-Verhältnisses für mindestens 20 Minuten auf oder bis die Erhöhung des Signals ein Plateau erreicht. Analysieren Sie die Daten wie oben beschrieben.
- Membrangebundene NSPs-Aktivitätsmessung mittels Fluoreszenzmikroskopie
- Bestimmen Sie die Anzahl der Bedingungen, die analysiert werden müssen.
HINWEIS: Für jede Sputumprobenmessung wird die Vorbereitung und Analyse einer zusätzlichen positiven (PC) und negativen (NC) Kontrolle empfohlen. - Für jede Messung werden 3 x 10 4 Sputumzellen ineinem Volumen von 50 μL PBS in einem 1,5 ml Röhrchen resuspendiert.
- Als Negativkontrolle werden Sputumzellen mit einem spezifischen Inhibitor (Sivelestat, spezifischer NE-Inhibitor oder Cathepsin-G-Inhibitor I, spezifischer CG-Inhibitor, in einer Endkonzentration von 100 μM) inkubiert. Inkubieren Sie für 10 minuten bei RT.
- Als Positivkontrolle inkubieren Sie Sputumzellen mit dem entsprechenden Enzym (NE oder CG bei 340 nM bzw. 200 nM) für 10 min bei RT.
- Fügen Sie 50 μL PBS mit dem FRET-Reporter und einem Kernfleck (in einer 1:1000-Endverdünnung) in jedes Röhrchen (positiv kontrollbehandelte Zellen, negativkontrollbehandelte Zellen und unbehandelte Zellen) hinzu, um eine Endkonzentration der Sonde von 2 μM zu erreichen.
WICHTIG: Die Zugabe eines Kernflecks erleichtert die Fluoreszenzmikroskopie, da sie es ermöglicht, nach Sputumzellen von Interesse zu suchen, ohne die FRET-Sondenkanäle zu verwenden und somit das Bleichen von Reportern zu vermeiden. Darüber hinaus ermöglicht der DNA-Fleck, Sputumzellen nach der Form ihres Kerns zu segmentieren. Zum Beispiel können Neutrophile leicht durch ihre multilobulären Kerne identifiziert werden. Außerdem können zusätzliche Informationen über die Lebensfähigkeit der Zellen abgerufen werden (Neutrophile mit einem segmentierteren Kern sind eher am Leben).
HINWEIS: Zusätzlich zum membrangebundenen kann die Aktivität von DNA-gebundenem NE oder CG im menschlichen Sputum auf die gleiche Weise mit Hilfe von H-NE und H-CG, extrazellulären DNA-assoziierenden FRET-Sonden27,gemessen werden. Bei der Herstellung des Master-Mixes können H-NE und H-CG in der Konzentration von 10 μM zugegeben und vor der Cytospin- und Slide-Vorbereitung mit Sputum inkubiert werden. Die Quantifizierung des D/A-Verhältnisses auf extrazellulärer DNA verläuft identisch mit NEmo-2 und mSAM, mit dem einzigen Unterschied, dass extrazelluläre DNA-Aggregate anstelle einzelner Zellen segmentiert werden27. - Löschen Sie die Reaktion, indem Sie 100 μL eiskaltes PBS hinzufügen und Proben auf Eis übertragen.
- Zytospin der Mischung auf Objektträgern, lufttrocken, mit eiskaltem Methanol 10% für 10 min fixieren, an der Luft trocknen und mit einem geeigneten Montagemedium montieren.
HINWEIS: Die Objektträger können bis zu einem Monat bis zur weiteren Analyse bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden. - Erfassen Sie Mikroskopiebilder mit einem konfokalen Mikroskop mit einem PL APO 40x oder 63x Ölobjektiv. Um die Bildqualität zu erhöhen und die Aufnahmezeit zu verkürzen, wird ein sequenzieller Bildaufnahmemodus empfohlen.
- Stellen Sie den Kernfleck zuerst über 633 nm Anregung mit der Helium-Neon-Laserlinie ab und zeichnen Sie seine Emission zwischen 650 und 715 nm auf.
- Erfassen Sie den Spender (Cumarin 343) des FRET-Reporters zwischen 470 und 510 nm bei Anregung bei 458 nm mit einem Argonlaser. Erfassen Sie die sensibilisierte Akzeptoremission (5,6-TAMRA) zwischen 570 und 610 nm nach alleiniger Spendererregung.
- Zeichnen Sie die direkte Akzeptoremission in einem separaten Kanal zwischen 470 und 510 nm bei optimaler Anregung des Akzeptors bei 561 nm mit dem diodengepumpten Festkörperlaser (DPSS) auf.
- Stellen Sie das Loch zu Beginn des Experiments ein und pflegen Sie es während der Bildgebungssitzung.
HINWEIS: Aufgrund ihrer geringen Größe wird die Verwendung eines 40-fachen oder 63-fachen Mikroskopobjektivs empfohlen, um Neutrophile richtig zu visualisieren. Normalerweise werden Bilder in mehreren aufeinanderfolgenden Kanälen aufgenommen, beginnend mit der längeren Anregungswellenlänge, um ein Photobleaching des Reporters während der Aufnahme zu verhindern.
- Bilden Sie mindestens 100 Zellen pro Bedingung ab, um schlüssige Statistiken zu erhalten. Für die Analyse von Mikroskopiebildern verwenden Sie eine geeignete Software: Segmentieren Sie die Zellen und berechnen Sie das D/A-Verhältnis pixelweise, anschließend berechnen Sie den Mittelwert oder Median eines bestimmten Interessenbereichs, der vom Benutzer manuell ausgewählt wird. Für repräsentative Ergebnisse siehe Abbildung 1.
- Bestimmen Sie die Anzahl der Bedingungen, die analysiert werden müssen.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder und Quantifizierung der membrangebundenen NE-Aktivität an Neutrophilen, die aus dem Sputum des CF-Patienten isoliert wurden. a) Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder von Neutrophilen, die 10 min lang mit 100 μM Sivelestat (w/) oder unbehandelt (w/o) (unteres Panel) vor dem Zusatz von NEmo-2 (2 μM) durch den Reporter vorinkubiert wurden (oberes Panel). Die erste Spalte von links zeigt den Kernfleck, die zweite den Donorkanal, die dritte den Akzeptorkanal und die letzte das berechnete D/A-Verhältnis, das durch Pixel-für-Pixel-Teilung von Donor- und Akzeptorkanälen erhalten wird. Die Grenzen der interessierenden Region (einzelne Neutrophile) werden als gestrichelte Linie dargestellt. Skala (10 μm) und Kalibrierbalken (D/A-Verhältnis) sind angegeben. b)Box- und Dot-Plots, die das D/A-Verhältnis von Sputumneutrophilen eines repräsentativen CF-Patienten zeigen. Mit Inhibitor inkubierte Zellen und unbehandelte Zellen sind grau bzw. blau dargestellt. Jeder Punkt steht für eine Zelle (N: w/ Inhibitor = 113 und w/o Inhibitor = 96). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Membrangebundene NSPs-Aktivitätsmessung mittels Durchflusszytometrie
- 1 x 106 Zellen in 100 μL PBS in einem 5 mL FACS Polystyrol Rundbodenrohr resuspendieren und das Röhrchen auf Eis legen.
- Um Sputum-Neutrophile zu gaten, verwenden Sie die folgenden Antikörper: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) und CD66b (1:50). Bereiten Sie für alle Proben eine ausreichende Mastermischung vor. Master-Mix im Dunkeln auf Eis legen.
- Richten Sie die Gating-Strategie wie in Abbildung 2beschrieben ein. Die Neutrophilen sind als 7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ Ereignisse gated. Die gated Events werden dann auf ihre membrangebundene Proteaseaktivität für ihren Donor (λexc = 405 nm, λem = 450/50 nm) und Akzeptor (λexc = 405 nm, λem = 585/42 nm) mittlere fluoreszierende Intensitäten (MFIs) analysiert.
- Fügen Sie 2 μL FcBlock zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie sie für 5 Minuten bei RT.
- Fügen Sie die ausgewählten Antikörper zu jeder Tube hinzu und inkubieren Sie sie für 30 Minuten auf Eis im Dunkeln.
- Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 2 ml kaltem PBS und zentrifugieren Sie für 5 min bei 300 x g und 4 °C. Verwerfen Sie überstandliche und resuspendierte Zellen in 200 μL kaltem PBS.
- Teilen Sie die 200 μL in zwei Röhrchen mit jeweils 100 μL auf und fügen Sie 5 μL Zelllebensfähigkeitsfärbungslösung in jedeM Röhrchen hinzu. Rohre auf Eis legen.
- Dem Reagenzglas mit Negativekontrolle (NC) wird ein geeigneter spezifischer NSP-Inhibitor (für NE-Verwendung Sivelestat bei 225 μM Endkonzentration, für CG-Verwendung Cathepsin-G-Inhibitor I bei 100 μM) hinzugefügt. Inkubieren Sie die Proben bei RT für 10 Minuten im Dunkeln.
- Fügen Sie der Probe 100 μL kaltes PBS hinzu und filtern Sie sie durch einen 40 μm-Filter in einem sauberen FACS-Röhrchen, um ein Verstopfen des Instruments zu verhindern.
- Den Reporter (für NE, NEmo-2 in einer Endkonzentration von 4 μM, für CG, mSAM in einer Endkonzentration von 2 μM) zur NC-Probe geben und das Röhrchen vorsichtig vortexen.
- Beginnen Sie mit der Erfassung von Zellen, die mit dem spezifischen Inhibitor inkubiert wurden, um bei Bedarf die Gatter sowie die Spannungen der Reporter-PMTs leicht anzupassen.
- Akte mindestens 1000 Neutrophile auf. Halten Sie die Probe bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Obwohl mehr Ereignisse aufgezeichnet werden können, sorgen 1000 Zellen für einen guten Kompromiss zwischen korrekten Statistiken und Aufzeichnungszeit. - Fahren Sie mit den folgenden Röhrchen (unbehandelte Sputumproben) entsprechend fort.
- Um Veränderungen des D/A-Verhältnisses aufgrund der membrangebundenen Proteaseaktivität aufzuzeichnen, zeichnen Sie alle 5 bis 10 Minuten 1000 Neutrophile aus jedem Röhrchen auf.
HINWEIS: Nach erfolgreicher FRET-Reporter-Spaltung nimmt die Intensität der Spenderkanal-MFIs im Laufe der Zeit zu. Die Intensität der AKzeptorkanal-MFIs sollte im Laufe der Zeit abnehmen oder konstant bleiben. - Berechnen Sie das FRET-Verhältnis, indem Sie den Donor durch die Akzeptorkanalwerte für die Proben dividieren, die an den gated viable Single Neutrophilen gemessen wurden.
- Normalisieren Sie Die Probenmessungen, indem Sie sie mit dem entsprechenden 0-minuten-Zeitpunkt teilen (für repräsentative Ergebnisse und Analysen siehe Abbildung 2).
HINWEIS: Die Aufzeichnung von mindestens zwei Zeitpunkten (d.h. 0 und 10 min) ist für eine dynamische Messung der D/A-Verhältnisänderung notwendig. Um die Aktivitätsmessung für jede Probe zu normalisieren, wird das in späteren Zeitpunkten (z. B. 10 min) gemessene D/A-Verhältnis durch das unmittelbar nach der Sondenzugabe berechnete Verhältnis (0 min) dividiert.
Abbildung 2: Gating-Strategie und repräsentative Diagramme der membrangebundenen NE-Aktivität, gemessen an Neutrophilen, die aus dem Sputum des CF-Patienten isoliert wurden. a)Zum Gate von Sputum-Neutrophilen werden folgende Antikörper verwendet: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) und CD66b (1:50). Die Neutrophilen sind als 7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ Ereignisse gated. Die Gated Events werden auf ihren Donor (λexc= 405 nm, λem= 450/50 nm) und Akzeptor (λexc= 405 nm, λem= 585/42 nm) mittlere Fluoreszenzdicken (MFIs) analysiert. b)Repräsentative Histogramme von CF-Sputum-Neutrophilen auf ihre membrangebundene NE-Aktivität analysiert. Die linke Spalte zeigt das Spendersignal, die rechte Spalte das Akzeptorsignal. Die obere Zeile zeigt die mittleren Fluoreszenzdichten von Zellen, die mit Sivelestat (w/) für 10 Minuten behandelt wurden, bevor der Reporter hinzugeladen wird. Die untere Zeile zeigt unbehandelte (ohne) Zellen, deren Reporterfluoreszenz sofort (0 min, grau) und 10 min (blau) nach Reporterzugabe gemessen wird. Die Datentabelle zeigt einen repräsentativen Datensatz bestehend aus Roh-MFIs für das Spender- und Akzeptorsignal an Neutrophilen, gemessen über mehrere Zeitpunkte (0-3-5-10-15-20 min) sowie das berechnete D/A-Verhältnis. Das D/A-Verhältnis kann normalisiert werden, d.h. auf den 0-Minuten-Zeitpunkt (weiße Schrift). 0 min zeigt eine Aufzeichnung an, die so schnell wie möglich nach der Zugabe des Reporters zum Durchflussrohr mit gefärbten Sputumzellen durchgeführt wurde. MFIs-Daten werden als mittlere ± Standardabweichung für 1000 Neutrophile angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Representative Results
Die in Abbildung 1a gezeigten Ergebnisse veranschaulichen einen repräsentativen Mikroskopiedatensatz. Das Kernsignal wird verwendet, um Neutrophile anhand ihrer charakteristischen segmentierten Kerne zu identifizieren. Der Interessenbereich (ROI) wird manuell ausgewählt (gestrichelte Linie in Abbildung 1a). Das D/A-Verhältnisbild wird berechnet, indem die Intensitäten des Donorkanals pixelweise durch die Intensitäten des Akzeptorkanals dividiert werden. Im letzten Schritt wird das durchschnittliche D/A-Verhältnis pro Zelle (ROI) berechnet. In Abbildung 1b stellt jeder Punkt den Mittelwert eines ROI (Neutrophil) dar. Es wird empfohlen, etwa 100 Zellen pro Zustand abbilden und bewerten.
Eine repräsentative Durchflusszytometrie-Gating-Strategie ist in Abbildung 2a dargestellt. Ein solches Gating ermöglicht es, Sputum-Neutrophile zu unterscheiden und zu untersuchen. Um Fluoreszenzüberschwappungen oder Kompensationsartefakte zu vermeiden, wird empfohlen, der FRET-Sonde eine Laserlinie (z. B. blauer Laser) der Fluoreszenzdetektion der FRET-Sonde zu widmen. Die Fluoreszenzkompensation der Durchflusszytometrie sollte für Antikörper und nicht für die FRET-Sonde durchgeführt werden. Abbildung 2b zeigt die MFI-Verteilung bei 0 und 10 Minuten nach dem Hinzufügen des Reporters. Jede Zeile in Abbildung 2c gibt die mittleren Werte für Spender- und Akzeptor-MFIs für 1000 Sputumneutrophile an. Das D/A-Verhältnis wird berechnet, indem die MFIs des Spenders und des Akzeptors geteilt werden. Der Zeitverlauf in Abbildung 2c auf der rechten Seite zeigt den Verlauf der Messung: Nach einem schnellen anfänglichen Anstieg erreicht das D/A-Verhältnis ein Plateau, entsprechend der Aktivität des membrangebundenen Enzyms.
Discussion
Die berichteten Protokolle erläutern verschiedene Ansätze zur Quantifizierung der Aktivität von neutrophiler Elastase und Cathepsin G in menschlichen Sputumproben. Kritische Punkte für eine erfolgreiche Enzymaktivitätsmessung sind das i) präzise Timing und die Standardisierung des operativen Vorgehens und ii) der Einsatz zuverlässiger Negativ- und Positivkontrollen. Sind diese Bedingungen erfüllt, beschränken sich die beschriebenen Methoden nicht nur auf Sputum, sondern können auch leicht an die Analyse der Proteaseaktivität in Blut, bronchoalveolären Lavageflüssigkeiten und Gewebeschnitten oder Homogenaten angepasst werden.
Jede der drei Techniken hat ihre Stärken und Grenzen, die sich oft ergänzen. Zum Beispiel ermöglicht die Durchflusszytometrie die schnelle Analyse seltener Zellpopulationen sowie die Zellphänotypisierung, aber es fehlen räumliche Auflösungsinformationen, die durch Mikroskopie erreicht werden können. Stattdessen ermöglichen Plattenlesermessungen die parallele Beurteilung mehrerer Proben oder Bedingungen mit hohem Durchsatz. Da frische Sputumzellen nicht eingefroren und gelagert werden können, erfordern die drei Methoden, dass die Proben nach dem Auswurf schnell verarbeitet werden müssen. Dies schränkt die Flexibilität bzw. den Durchsatz der membrangebundenen Aktivitätsmessungen ein. Die Entwicklung eines Durchflusszytometrie-Protokolls, das es ermöglicht, Zellen nach Sondenzugabe und enzymatischer Spaltung zu fixieren, würde die parallele Messung einer höheren Anzahl von Röhrchen ermöglichen. Darüber hinaus sollte besonderes Augenmerk auf die Handhabung und Lagerung der FRET-Sonden gelegt werden. Tatsächlich durchlaufen einige Aminosäuren, die im Peptidsubstrat vorhanden sind, wie Methionin, eine Oxidation, die zu einer verminderten Reporterempfindlichkeit führt. Um die Haltbarkeit des Meldenden zu erhöhen (geschätzt von etwa drei Monaten bei 20 °C), können sie in kleinen Aliquoten (1-2 μL) unter Inertgas wie Stickstoff oder Argon gelagert werden.
Bei Mukoviszidose und anderen chronisch entzündlichen Lungenerkrankungen ist es wichtig, die Entzündung so früh wie möglich zu erkennen, und zuverlässige Biomarker haben das Potenzial, ein solches Ziel zu erreichen. Die Möglichkeit, oberflächengebundene NSPs-Aktivität, die sich als schädlich für das umgebende Gewebe erwiesen hat, auch unter Bedingungen zu erkennen, unter denen keine oder wenig freie NE-Aktivität vorhanden ist, fügt eine weitere Ebene wertvoller Informationen hinzu, die mit anderen vorhandenen Methoden kaum erreicht werden können4,11.
Die Reporter können verwendet werden, um den Zusammenhang der membrangebundenen assoziierten NSP-Aktivität mit der Schwere und dem Fortschreiten der Lungenerkrankung, insbesondere bei ihrem frühen Beginn, zu untersuchen. Die Methoden können zur Überwachung der Behandlungswirksamkeit (z.B. entzündungshemmende Behandlungen oder hochwirksame CFTR-Modulatoren und Potentiatoren28)eingesetzt und die daraus resultierende Dämpfung neutrophilengetriebener Entzündungen untersucht werden. Darüber hinaus basieren die Protokolle auf nicht-invasiven Probenverfahren, die ein sehr geringes Risiko für den Patienten bergen und daher sehr breit einsetzt werden können und die Türen zu zahlreichen spannenden Anwendungen öffnen.
Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde durch Förderungen des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (FKZ 82DZL004A1 bis M.A.M) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB-TR84TP B08 bis M.A.M) gefördert. Die in diesem Manuskript beschriebene Arbeit wurde vom Deutschen Zentrum für Lungenforschung (DZL) und dem EMBL Heidelberg durch ein Promotionsstipendium für M.G. Wir danken J. Schatterny, S. Butz und H. Scheuermann für die fachkundige technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431752 | |
| 2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader) | PerkinElmer | ||
| 35x10mm Dish, Nunclon Delta | Thermo Fisher Scientific | 150318 | |
| 40 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431750 | |
| 50 mL tubes | Sarstedt | 10535253 | |
| 7-AAD, viability dye | Bio Legend | 420404 | 5 µL/100 µL |
| Balance | OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd. | PR124 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL | BD Bioscience | 352054 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | ||
| black flat bottom 96 well half area plate | Corning Life Science | 3694 | |
| Cathepsin G | Elastin Products Company | SG623 | |
| Cathepsin G Inhibitor I | Merck KGaA | 219372 | |
| Centrifuge 5418R | Eppendorf AG | EP5401000137 | |
| Combitips advanced 1.0 mL | Eppendorf AG | 0030 089 430 | |
| cOmplete proteinase inhibitor | Roche | 11697498001 | |
| Countig chambers improved Neubauer | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442 | |
| coverslips Ø 25mm | Thermo Fisher Scientific | MENZCB00250RA003 | |
| Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific | ||
| DRAQ5 (nuclear stain) | BioStatus Limited | DR50050 | 1:10000 |
| FACSDiva software, v8.0.1 | BD Bioscience | ||
| FcBlock | BD Bioscience | 564219 | |
| Fiji (Fiji Is Just ImageJ) | fiji.sc | ||
| Flow Jo software, v10 | TreeStar | ||
| FluoQ Plugin, v3-97 | |||
| Heraeus Megafuge 16R | Thermo Fisher Scientific | ||
| Human Sputum Leucocyte Elastase | Elastin Products Company | SE563 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Mini Rock-Shaker | PEQLAB Biotechnologie GmbH | MR-1 | |
| mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2 | BD Bioscience | 557742 Lot:8221983 | 1:50 |
| mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8 | BD Bioscience | 557820 Lot:8208791 | 1:50 |
| mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1 | BD Bioscience | 557833 Lot:8059688 | 1:33 |
| mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5 | BioLegend | 305122 Lot:B241921 | 1:50 |
| mSAM | in house | 2 mM | |
| Multipette plus | Eppendorf AG | ||
| NEmo-1 | SiChem | SC-0200 | 1 mM |
| NEmo-2E | SiChem | SC-0201 | 2 mM |
| Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer | Pari | 085G3001 | |
| phosphate buffered saline | Gibco | 10010-015 | |
| ROTI Histokitt (mounting medium) | Carl Roth GmbH + Co.KG | 6638.1 | |
| Salbutamol | Teva GmbH | ||
| Sivelestat | Cayman Chemicals | 17779 | |
| Sputolysin | Calbiochem | 560000-1SET | |
| sSAM | in house | 2 mM | |
| SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
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