Summary
Burada açıklanan protokoller, nötrofil proteazların insan balgamındaki aktivitesini görselleştirmek ve ölçmek için bir kılavuz sağlar. Bu tür analizlerin uygulamaları anti-enflamatuar tedavilerin değerlendirilmesinden biyobelirteç doğrulamasına, ilaç taramasına ve büyük kohort klinik çalışmalarına kadar yayılmaktadır.
Abstract
Proteazlar sayısız fizyolojik işlemin düzenleyicileridir ve faaliyetlerinin hassas bir şekilde araştırılması ilgi çekici bir biyomedikal zorluk olmaya devam etmektedir. İnsan genomu tarafından kodlanan ~600 proteaz arasında, nötrofil serine proteazlar (NSP' ler) solunum yolu hastalıkları da dahil olmak üzere enflamatuar durumların başlangıcında ve ilerlemesinde rol oynadıkları için kapsamlı bir şekilde araştırılmaktadır. Benzersiz olarak, salgılanan NSP'ler sadece hücre dışı sıvılar içinde yayılmakla kalmaz, aynı zamanda plazma membranlarına lokalize olur. Nötrofil hücre dışı tuzak (NET) oluşumu sırasında, NSP'ler salgılanan kromatin ayrılmaz bir parçası haline gelir. Bu tür karmaşık davranışlar, NSP patofizyolojisinin anlaşılmasını zorlu bir görev haline getirir. Burada, balgam örneklerinde serbest ve zara bağlı nötrofil elastaz (NE) ve katepsin G (CG) aktivitelerini görselleştirmek, ölçmek ve ayırt etmek için ayrıntılı protokoller gösterilmiştir. NE ve CG, kistik fibrozis (CF) ve kronik obstrüktif akciğer hastalığının (KOAH) patogenezinde pleiotropik rollere sahip olan NSP'lerdir: doku remodelingini teşvik ederler, aşağı akış immün yanıtlarını düzenlerler ve akciğer hastalığı şiddeti ile ilişkilidirler. Protokoller, sıvı ve hücresel fraksiyonun nasıl ayrıştırılacağının yanı sıra küçük moleküllü Förster rezonans enerji transfer tabanlı (FRET) muhabirler aracılığıyla enzimmatik aktivite nicelemesi için nötrofillerin insan balgamından izole edilmesini göstermektedir. NE ve CG faaliyetlerinin göreceli rolü hakkında özel içgörüler toplamak için, bir FRET okuması farklı teknolojilerle ölçülebilir: i) in vitro plaka okuyucu ölçümleri, proteaz aktivitesinin yüksek verim ve toplu olarak algılanmasına izin verir; ii) konfokal mikroskopi mekanotemporal olarak hücre yüzeyindeki membranla ilişkili aktiviteyi çözen; iii) küçük moleküllü FRET akış sitometrisi, tek hücreli proteaz aktivitesi nicelemesi ve fenotipleme yoluyla antienflamatuar tedavilerin hızlı değerlendirilmesini sağlar. Bu tür yöntemlerin uygulanması, NSP patolojisini ve CF ve KOAH için hastalık şiddetinin biyobelirteçleri olarak potansiyellerini keşfetmenin kapılarını açar. Standardizasyon potansiyelleri, sağlam okumaları ve aktarım basitlikleri göz önüne alındığında, açıklanan teknikler araştırma ve tanı laboratuvarlarında uygulanmak üzere hemen paylaşılabilir.
Introduction
Nötrofil elastaz (NE), katepsin G (CG), proteinaz 3 (PR3) ve nötrofil serine proteaz 4 (NSP4) dört nötrofil serin proteaz (NSP)1'dir. Miyeoperoksidaz ile birlikte nötrofil birincil veya azurofilik granüller içinde saklanırlar. Yüksek proteolitik içerikleri nedeniyle, birincil granüllerin salgılanması sıkı bir şekilde düzenlenir ve nötrofiller astarlama ve aktifleştirme uyaranları ile ardışık olarak zorlanması gerekir2.
Fagolysozomun içinde, NSP'ler hücre içi bakterisidal ajanlar olarak işlev görür3. Salgılandığında, NSP'ler iltihabın güçlü arabulucuları haline gelir: sitokinleri ve yüzey reseptörlerini ayırırlar, paralel pro-enflamatuar yolları aktive ederler3. Daha da önemlisi, enflamatuar durumlar kontrolsüz bir NSPs salgılanmasına sahiptir. Örneğin, iltihaplı hava yollarında, aşırı NE aktivitesi mukus hipersecretion, kadeh hücreleri metaplazi, CFTR inaktivasyonu ve hücre dışı matris remodeling4,5neden olur. Cathepsin G de inflamasyona katılır: özellikle IL-1 ailesinin iki bileşenini, IL-36α ve IL-36β6'yıayırır ve aktive eder. NE ile birlikte, CG hava yolu epitelinde proteaz ile aktive reseptörleri ayırır ve ayrıca TNF-α ve IL-1β'yi aktive eder.
Alfa-1-antitripsin, alfa-1-antikimyatripsin ve salgı lökosit proteaz inhibitörü gibi endojen anti-proteazlar nötrofil elastaz ve katepsin G aktivitesini düzenler5. Bununla birlikte, akciğer hastalığının ilerlemesi sırasında, proteazların sürekli salgılanması stoichiometrik olarak anti-proteaz kalkanını aşar, hava yollarında çözülmeyen nötrofilere, iltihaplanmanın kötüyelmesine ve doku hasarına yol açar5,7. Hasta hava yollarının çözünür fraksiyonlarında NE konsantrasyonu ve aktivitesinin hastalıkşiddetininumut verici bir biyobelirteci olduğu gösterilmiş olsa da 8 , NE ve CG ayrıca nötrofil plazma zarı ve anti-proteazlar için daha az erişilebilir hale geldikleri elektrostatik etkileşimler9,10 yoluyla hücre dışı DNA ile ilişkilidir. Daha da önemlisi, preklinik çalışmalar hücre yüzeyi ile ilişkili proteaz aktivitesinin çözünür muadili4,11'dendaha erken ve/veya bağımsız olarak göründüğü bir senaryo tanımlamıştır. Aslında, tespit edilebilir hale gelmek için, serbest proteaz aktivitesinin önce anti-proteaz kalkanını bastırması gerekir. Bunun yerine, hücre yüzeyinde, membran bağlı proteaz aktivitesi, büyük inhibitörlerin hücre plazma membranına erişilmemesi nedeniyle en azından kısmen bozulmadan kalır12. Bu tür karmaşık proteaz davranışı nötrofil aracılı inflamasyon başlangıcı ve yayılması üzerinde önemli sonuçlar doğurur ve bu nedenle hassas ve bilgilendirici araçlarla araştırılması gerekir.
Yıllar içinde, Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı problar, insan örneklerinde belirli bir proteaz aktivitesini verimli ve hızlı bir şekilde değerlendiren araçlar olarak çok sayıda biyomedikal uygulama buldu13. Proteaz muhabirleri, hedef enzim tarafından tanınan ve bir donör floroforunun enerjiyi bir alıcı moleküle aktardığı fiziksel bir süreç olan FRET'e dayanan bir tanıma motifi (yani bir peptit) oluşur. Enzim tarafından muhabir üzerinde, yani tanıma kısmının bölünmesiyle 2015 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 20 Bu tür bir okuma kendi kendini normalleştirir ve oranmetriktir, bu nedenle pH ve yerel prob konsantrasyonu gibi çevresel koşullardan sadece marjinal olarak etkilenir. NEmo-114 ve sSAM15, sırasıyla özellikle NE ve CG aktivitesi hakkında rapor veren FRET problarıdır. Bununla birlikte, bu tür muhabirler özellikle herhangi bir hücresel bölmeye yerleşmiyor, bu nedenle insan sıvılarında bulunan proteaz aktivitesini izlemek için kullanılırlar. Proteaz aktivitesini mekansal olarak lokalize bir şekilde izlemek için, biz ve diğerleri moleküler etiketler 14 , 15 , 16 ,17,18,19aracılığıyla hücre altı bileşenlerle ilişkilendiren FRET probları geliştirdik. Böyle sentetik bir strateji, plazma zarını lokalize eden lipid ankrajları ile donatılmış iki FRET probu olan NEmo-2 ve mSAM'ın geliştirilmesine izin verdi. Bu muhabirler kistik fibrozis ve kronik obstrüktif akciğer hastalıklarında NE ve CG proteazlarının daha derin bir şekilde anlaşılmasına neden oldu14,15.
Burada, NEmo ve SAM serisi FRET probları ile insan balgamında çözünür ve membran bağlı NE ve CG faaliyetlerinin görselleştirilmesi ve ölçülmesi için ayrıntılı protokoller sağlanmaktadır. NSP patofizyolojisinin çeşitli yönlerini ele almak ve kullanıcıya özgü ihtiyaca göre sunulabilecek bir dizi yöntem sağlamak için floresan spektroskopi, floresan mikroskopi ve akış sitometrisi ile yapılan analizler gösterilmiştir.
Protocol
Aşağıdaki protokoller insan balgamında gerçekleştirilen analizi açıklar. İnsan örneği kullanımı Heidelberg Üniversitesi etik komitesi tarafından onaylandı ve tüm hastalardan veya ebeveynlerinden/yasal vasilerinden (S-370/2011) ve sağlıklı kontrollerden (S-046/2009) yazılı bilgilendirilmiş onay alındı.
NOT: Aşağıdaki protokoller örnek hazırlamayı ve nötrofil serine proteaz (NSP) aktivitesinin nicelliğini açıklar. Burada sunulan deneysel prosedürler insan balgam ve nötrofil elastaz14,20,21 (NE) veya katepsin G15 (CG) aktivite ölçümüne odaklanmaktadır. Bununla birlikte, örnek hazırlama protokolündeki hafif adaptasyonlar, kan türevi hücrelerin ve tümör homojenatlarının analizini mümkün kılır hale getirir. Ek olarak, matris metalloproteinaz 12 ve katepsin S aktiviteleri, özel FRET probları22 , 23 , 24,25,26ile benzer şekilde araştırılabilir.
1. Örnek hazırlama: hücre izolasyonu ve süpernatant ayırma
NOT: Mümkünse balgam sezme işlemi balgam sekonorttan sonra 120 dakika içinde yapılmalı ve balgam bir sonraki işleme kadar buz üzerinde saklanmalıdır.
- Balganın kendiliğinden balgam sezmesi mümkün değilse, daha önce açıklandığı gibi balgamını indükle19. Kısaca, balgam indüksiyon prosedürüne başlamadan önce β-2-reseptör-antagonist salbutamolün 200 μg'sını içine alın. Daha sonra, bir nebülizör kullanarak 15 dakika boyunca hipertonik (%6) bir tuzlu su çözeltisi solu. Balgam salımını petri kabında toplayın.
- Mukus kümelerini tükürükten pipet ucu yardımıyla bir Petri kabına ayırın.
- Mukusu tartın.
NOT: Bir mukus numunesinin ortalama ağırlığı 0,8 g'dır (0,1 g ile 5 g arasında değişir); 0.1 g genellikle belirtilen prosedürleri gerçekleştirmek için yeterlidir. - Balgama %10 Sputolysin (PBS olarak) 4 parça (v/w) ekleyin (örneğin: her balgam gramı için %10 Balgamlının 4 mL'si).
DİkKAT: Sputolysin fosfat tamponunda konsantre dithiothreitolden oluşur, bu nedenle dikkatli bir şekilde kullanın. - Mukusu çözmek için karışımı oda sıcaklığında (RT) sallanan bir çalkalayıcı üzerinde 15 dakika kuluçkaya yatırın. Güvenlik nedeniyle çalkalayıcıyı duman kaputuna yerleştirin.
- Aynı miktarda soğuk PBS ekleyerek reaksiyonun sesini kesin (örneğin: %10 Sputolysin'in her mL'si için 1 mL soğuk PBS).
- Homojen bir çözelti elde etmek için pipetleme ile karıştırın.
- Karışımı 100 μm naylon hücre süzgecinden 50 mL'lik bir tüpe filtreleyin.
- Filtrasyon adımını 40 μm naylon hücre süzgecinden tekrarlayın.
- Çözeltiyi 4 °C'de 300 x g'da 10 dakika santrifüj edin.
- Süpernatant fraksiyonu dikkatlice taze bir tüpe aktarın ve buzda saklayın.
NOT: Süpernatant fraksiyonlar, daha fazla analize kadar -20 °C veya -80 °C'de saklanabilir. - Hücre peletini 500 μL soğuk PBS'de hafifçe yeniden depolayın ve buza yerleştirin.
NOT: Hücre kesir hemen işlenmelidir.
2. Nötrofil serine proteaz aktivite ölçümü
NOT: Burada, FRET muhabirleri vasıteyle NSP etkinliğini ölçmek için farklı yöntemler getirilmiştir. Teknolojinin seçimi, deneyin spesifik biyomedikal sorusu ve amacı tarafından dikte edilir. Sunulan problar, bir dizi akciğerle ilgili enzim14,15'ekarşı özgüllükleri için kapsamlı bir şekilde test edilmiştir. Problar hedef enzimlerine özgü olmasına rağmen, her zaman klinik ilgi örneği üzerindeki prob özgüllüğünü kontrol edin. Bu, prob eklemeden önce numunenin belirli bir proteaz inhibitörü ile inkübe edilmesiyle elde edilebilir, bu da D / A oranındaki herhangi bir artışı ortadan kaldırmalıdır.
- Florometre veya plaka okuyucu test yoluyla çözünür NSP aktivitesi nicelemesi
NOT: Numunenin çözünür fraksiyonlarındaki proteaz aktivitesi floresan algılama yeteneğine sahip herhangi bir aletle tespit edilebilir.- Buzdaki enzimleri eritin.
- Kullanıma kadar, kendi kendine bölünmeyi önlemek için NE ve CG'yi asidik depolama tamponunda (50 mM sodyum asetat, 200 mM NaCl, pH 5.5) tutun.
- Bir enzim standart eğrisi ayarlamak için, aktivasyon tamponunda (10 mM Tris-HCl, pH 7.5'te 500 mM NaCl) enzimin 1:2 seri seyreltilmesini (NE için 33.9 - 0.271 nM; CG için 42.6 - 0.333 nM) hazırlayın. Aktivasyon tamponu nötr bir pH'a sahiptir ve bu nedenle enzimatik katalizin verimli bir şekilde gerçekleşmesini sağlar.
- En yüksek standart konsantrasyonu (NE konsantrasyonu: 33,9 nM) hazırlamak için, 999 μL aktivasyon tamponunda 1 μL NE (33,9 μM) seyreltin.
- İkinci standardı hazırlamak için (NE konsantrasyonu: 16,95 nM), ilk seyreltmenin 200 μL'lik kısmını 200 μL aktivasyon tamponu ile karıştırın.
- Kalan 1:2 seyreltmeleri hazırlamak için buna göre devam edin.
- Boşluk olan son standart saf etkinleştirme arabelleği oluşur. Teknik kopyaların veya üç taraflıların ölçümü önerilir. Standart ve numune hazırlama sırasında şişeleri buzda tutmaya çalışın.
- Standart preparasyona paralel olarak, balgam örneklerini aktivasyon tamponunda seyreltin. Proteaz aktivitelerini değerlendirmeden önce insan örneklerini, muhabir sinyalinin doğrusal artış aralığında (donör/alıcı oranı) kalacak şekilde seyreltin. Hasta örnekleri sulandırılmamış bırakılırsa, dekolte güvenilir bir montaj için çok hızlı gerçekleşirdi. Sağlıklı donör balgam, CF ve KOAH hastalarından alınan örneklere kıyasla daha az aktif proteaz içerdiğinden, genellikle farklı seyreltmeler yapılır (sağlıklı balgam süpernatantı için 1:10, KOAH veya CF hastalarının balgam süpernatantı için 1:20-500).
NOT: Konsantrasyonlarının bilinmediği örneklerde proteaz aktivitesini nicel olarak ölçmek için, bilinen enzim konsantrasyonlarına sahip standart bir eğrinin paralel olarak, ideal olarak aynı plaka üzerinde ölçülmesi gerekir. İnsan balgamında aktif enzim konsantrasyonu, insan balgam örneklerinde ölçülen eğimlerin standart eğrilerle ölçülen eğimlerle enterpolasyon edilmesiyle hesaplanır. - Numuneleri ölçüm için hazırlamadan önce cihazı kurun. NE FRET probu (NEmo-114)için heyecan dalga boyunu 354 nm olarak ayarlayın ve algılama dalga boyunu donör için 400 nm ve alıcı için 490 nm olarak ayarlayın. CG FRET probu (sSAM15)için ekscitasyon dalga boyunu 405 nm olarak ayarlayın ve emisyonu 485 (donör) ve 580 nm (alıcı) olarak ayarlayın.
- Siyah 96 kuyulu yarım alan plakasının kuyularına standart veya boş 40 μL numune ekleyin.
- Muhabirleri içeren ana karışımı hazırlamak için (ana karışımdaki muhabirin konsantrasyonu: 10 μM), prob stoğunu (DMSO'da 1 mM) 1:100 aktivasyon tamponunda seyreltin. Gerekli plaka kuyularının sayısını 10 μL x çarparak gerekli ana karışım hacmini hazırlayın. NEmo-1 ve sSAM muhabirlerinin floresan ölçümü için en uygun son konsantrasyona (2 μM) ulaşmak için, her kuyuya 10 μL ana karışım ekleyin (numune, standart veya boş 40 μL içerir) ve okumaya başlayın. Bu nedenle NEmo-1 ve sSAM muhabirleri sırasıyla çözünür nötrofil elastaz ve katepsin G aktivitesini izleyecektir.
NOT: Reaktif enjektör yoksa, numunelere muhabir eklemeden sonra okumayı mümkün olan en kısa sürede başlatmayı unutmayın. - Plaka okuyucu ölçümünü başlatın ve donör/alıcı oranı artışını her 60-90 saniyede bir en az 20 dakika boyunca veya sinyaldeki artış bir platoya ulaşana kadar kaydedin.
- Veriler dışa aktarıldıktan sonra, donör bağıl floresan birimlerini (RFU) her zaman noktası ve örnek için kabul eden RFU ile bölerek donör/alıcı oranını (D/A oranı) hesaplayın.
- Her numunenin D/A oranı ortalamasını ve standart sapması hesaplayın.
- D/A oranı değişikliğinin doğrusal büyümesi içindeki eğimi belirleyin. Eğim, bir FRET probu için enzim bölünme oranının bir göstergesidir. İnsan örneklerinden elde edilen doğrusal regresyon eğimlerini enzim standardından hesaplananlarla donatarak balgamdaki aktif enzim konsantrasyonunu hesaplayın.
- Florometre veya plaka okuyucu test yoluyla membran bağlı NSP aktivitesi nicelemesi
- Yukarıda açıklandığı gibi balgam hücrelerini izole edin. 3 x 10 4 hücreyi40 μL PBS hacminde yeniden biriktirin. Hücreleri plaka okuyucuya iyi ekleyin.
- Aleti kurun. Membran bağlı NE FRET probu (NEmo-214)için ekscitasyon dalga boyunu 405 nm olarak ayarlayın ve algılama dalga boyunu donör için 485 nm ve alıcı için 580 nm olarak ayarlayın. Membran bağlı CG FRET probu (mSAM15)için ekscitasyon dalga boyunu 405 nm olarak ayarlayın ve emisyonu 485 (donör) ve 580 nm (alıcı) olarak ayarlayın.
- Muhabirleri içeren ana karışımı hazırlamak için, prob stoğunu aktivasyon tamponunda 10 μM konsantrasyona seyreltin. NEmo-2 ve mSAM muhabirlerinin floresan ölçümü için en uygun son konsantrasyona (2 μM) ulaşmak için, her kuyuya 10 μL ana karışım ekleyin (numune, standart veya boş 40 μL içerir) ve okumaya başlayın. Bu nedenle NEmo-2 ve mSAM muhabirleri sırasıyla membran bağlı nötrofil elastaz ve katepsin G aktivitesini izleyecektir.
NOT: Hücresel negatif kontrol, örneğin NSP'leri aktif olarak salgılamayan hücreler kullanılabilir. Örneğin, muhabirlerin 3 x 104 lökosit progenitors HL-60 promyelositik hücrelerle inkübasyonu geçerli bir bölünme negatif kontrolünü temsil eder. - Donör/kabul eden oranında en az 20 dakika veya sinyalin artışı platoya ulaşana kadar rekor değişim. Yukarıda açıklandığı gibi verileri analiz edin.
- Floresan mikroskopi ile membran bağlı NSP aktivite ölçümü
- Analiz edilmesi gereken koşulların sayısını belirleyin.
NOT: Her balgam numunesi ölçümü için ek pozitif (PC) ve negatif (NC) kontrolün hazırlanması ve analizi önerilir. - Her ölçüm için, 3 x 104 balgam hücrelerini 1,5 mL'lik bir tüpte 50 μL PBS hacimde yeniden biriktirin.
- Negatif bir kontrol olarak, balgam hücrelerini belirli bir inhibitörle (Sivelestat, spesifik NE inhibitörü veya katepsin G inhibitörü I, spesifik CG inhibitörü, 100 μM'lik son konsantrasyonda) kuluçkaya yatırın. RT'de 10 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Pozitif kontrol olarak, balgam hücrelerini RT'de 10 dakika boyunca uygun enzimle (sırasıyla 340 nM veya 200 nM'de NE veya CG) kuluçkaya yatırın.
- RT'de 10-20 dakika boyunca 2 μM'lik bir prob son konsantrasyonuna ulaşmak için her tüpe (pozitif kontrol işlem görmüş hücreler, negatif kontrolle işlenmiş hücreler ve işlenmemiş hücreler) FRET muhabirini içeren 50 μL PBS ve bir nükleer leke (1:1000 son seyreltmede) ekleyin.
Önemlİ: Nükleer leke ilavesi, FRET prob kanallarını kullanmadan ilgi çekici balgam hücrelerinin aranmasını ve dolayısıyla muhabir ağartmasını önlemeyi sağladığı için floresan mikroskopi görüntülemesini kolaylaştırır. Ek olarak, DNA lekesi balgam hücrelerini çekirdeklerinin şekline göre segmentlere ayırır. Örneğin, nötrofiller çokbüler çekirdekleri tarafından kolayca tanımlanabilir. Ayrıca, hücrelerin yaşayabilirliği hakkında ek bilgi alınabilir (daha parçalı çekirdeğe sahip nötrofillerin canlı olma olasılığı daha yüksektir).
NOT: Membranla ilişkili olana ek olarak, DNA'ya bağlı NE veya CG'nin insan balgamındaki aktivitesi, H-NE ve H-CG, hücre dışı DNA ilişkilendiren FRET probları27ile aynı şekilde ölçülebilir. Ana karışımı hazırlarken, H-NE ve H-CG 10 μM konsantrasyonda eklenebilir ve sitospin ve slayt hazırlamadan önce balgam ile inkübe edilebilir. Hücre dışı DNA'daki D/A oranı nicelemesi NEmo-2 ve mSAM ile aynı şekilde ilerler ve hücre dışı DNA agregalarının tek hücre yerine bölümlere ayırdığı tek fark27. - 100 μL buz gibi PBS ekleyerek reaksiyonun söndürülür ve numuneleri buza aktarın.
- Karışımı mikroskopi slaytlarına cytospin, hava kuru, buz gibi metanol ile 10 dakika boyunca% 10 sabitleyin, uygun bir montaj ortamı ile hava kurutun ve monte edin.
NOT: Mikroskopi slaytları, bir sonraki analize kadar bir aya kadar karanlıkta 4 °C'de saklanabilir. - PL APO 40x veya 63x yağ hedefine sahip bir konfokal mikroskop kullanarak mikroskopi görüntüleri elde edin. Görüntü kalitesini artırmak ve edinme süresini azaltmak için sıralı görüntü alma modu önerilir.
- Nükleer lekeyi ilk olarak helyum-neon-lazer hattı ile 633 nm eksitasyon ile görüntüleyin ve emisyonunu 650 ila 715 nm arasında kaydedin.
- FRET muhabirinin donörlerini (coumarin 343) 470 ila 510 nm arasında bir argon lazerle 458 nm'de heyecanlandıktan sonra kaydedin. Tek donör ekscitasyonundan sonra 570 ila 610 nm arasında duyarlı kabul eden (5,6-TAMRA) emisyonunu elde edin.
- Doğrudan kabul eden emisyonu, diyot pompalı katı hal (DPSS) lazerini kullanarak 561 nm'de kabul eden optimum çıkarma üzerine 470 ila 510 nm arasında ayrı bir kanala kaydedin.
- Deneyin başında iğne deliğini ayarlayın ve görüntüleme oturumu sırasında koruyun.
NOT: Küçük boyutları nedeniyle nötrofilleri düzgün bir şekilde görselleştirmek için 40x veya 63x mikroskop hedefinin kullanılması önerilir. Genellikle, görüntüler, satın alma sırasında muhabirin fotobleachingini önlemek için daha uzun heyecan dalga boyundan başlayarak birkaç ardışık kanalda elde edilir.
- Kesin istatistikler için durum başına en az 100 hücreyi görüntüleyin. Mikroskopi görüntüleri analizi için uygun bir yazılım kullanın: hücreleri segmentlere ayırın ve piksel bazında D/A oranını hesaplayın, daha sonra kullanıcı tarafından manuel olarak seçilen belirli bir ilgi bölgesinin ortalamasını veya ortancasını hesaplayın. Temsili sonuçlar için bkz.
- Analiz edilmesi gereken koşulların sayısını belirleyin.
Şekil 1: CF hasta balgamından izole edilmiş nötrofiller üzerinde membran bağlı NE aktivitesinin temsili görüntüleri ve nicelemesi. a)Nötrofillerin temsili konfokal mikroskopi görüntüleri, muhabir NEmo-2 (2 μM) ilavesinden önce 100 μM Sivelestat (w/) veya sol işlenmemiş (w/o) (alt panel) ile 10 dakika boyunca önceden inkübe edilmiştir (üst panel). Soldan ilk sütunda nükleer leke, ikinci donör kanalı, üçüncü kabul eden kanal ve son olarak donör ve alıcı kanalların piksel bazında bölünmesiyle elde edilen hesaplanan D/A oranı gösterilir. İlgi çekici bölgenin sınırları (tek nötrofil) kesik çizgi olarak tasvir edilir. Ölçek (10 μm) ve kalibrasyon çubukları (D/A oranı) belirtilir. b)Temsili bir CF hastasından balgam nötrofillerinin D/A oranını gösteren kutu ve nokta çizimleri. İnhibitör ve tedavi edilmemiş hücreler ile inkübe edilen hücreler sırasıyla gri ve mavi renkte gösterilmiştir. Her nokta bir hücreyi temsil eder (N: w/ inhibitörü = 113 ve w/o inhibitörü = 96). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Akış sitometrisi ile membran bağlı NSP aktivite ölçümü
- 100 μL PBS'de 1 x 106 hücreyi 5 mL FACS polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe yeniden yerleştirin ve tüpü buza yerleştirin.
- Balgam nötrofillerini geçit etmek için aşağıdaki antikorları kullanın: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) ve CD66b (1:50). Tüm numuneler için yeterli ana karışım hazırlayın. Karanlıkta buz üzerine ana karışımı yerleştirin.
- Şekil 2 'de açıklandığı gibi gating stratejisini ayarlayın. Nötrofiller 7AAD-CD45+CD14-CD16 + CD66b+olaylar olarak kapılıdır. Kapılı olaylar daha sonra donörleri için membran bağlı proteaz aktiviteleri için analiz edilecektir (φexc = 405 nm, φem = 450/50 nm) ve alıcı (φexc = 405 nm, φem = 585/42 nm) floresan yoğunlukları (MFI' ler) anlamına gelir.
- Her örneğe 2 μL FcBlock ekleyin ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Seçilen antikorları her tüpe ekleyin ve karanlıkta buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri 2 mL soğuk PBS ekleyerek yıkayın ve 300 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüj yapın. 200 μL soğuk PBS'de süpernatant ve resuspend hücrelerini atın.
- 200 μL'yi her biri 100 μL olan iki tüpe bölün ve her tüpe 5 μL hücre canlılık boyama çözeltisi ekleyin. Tüpleri buza yerleştirin.
- Negatif kontrol (NC) test tüpüne uygun bir spesifik NSP inhibitörü (225 μM son konsantrasyonda NE kullanımı için Sivelestat, 100 μM'de CG kullanımı için katepsin G Inhibitörü I) ekleyin. Rt'deki örnekleri karanlıkta 10 dakika kuluçkaya yatır.
- Numuneye 100 μL soğuk PBS ekleyin, cihazın tıkanmasını önlemek için temiz bir FACS tüpünde 40 μm filtreden filtreleyin.
- Muhabiri (NE için, NEmo-2 için 4 μM'lik son konsantrasyonda, CG için mSAM, 2 μM'lik son konsantrasyonda mSAM) NC örneğine ekleyin, tüpü hafifçe girdaplayın.
- Gerekirse kapıları ve muhabir PMT'lerin voltajlarını hafifçe ayarlamak için belirli inhibitörle inkübe edilmiş hücreleri edinmeye başlayın.
- En az 1000 nötrofil kaydedin. Numuneyi oda sıcaklığında tutun.
NOT: Daha fazla olay kaydedilebilse de, 1000 hücre uygun istatistikler ve kayıt süresi arasında iyi bir uzlaşma sağlar. - Aşağıdaki tüplerle (işlenmemiş balgam örnekleri) buna göre devam edin.
- Membran bağlı proteaz aktivitesi nedeniyle D/A oranındaki değişiklikleri kaydetmek için her tüpten her 5 ila 10 dakikada bir 1000 nötrofil kaydedin.
NOT: Başarılı FRET muhabir bölünmesinden sonra donör kanal MMI'ların yoğunluğu zamanla artacaktır. Kabul eden kanal MFI yoğunluğu zaman içinde azalmalı veya sabit kalmalıdır. - FRET oranını, donörün kapılı uygulanabilir tek nötrofiller üzerinde ölçülen numuneler için alıcı kanal değerlerine bölerek hesaplayın.
- Örnek ölçümleri ilgili 0 dakikalık zaman noktasıyla bölerek normalleştirin (temsili sonuçlar ve analiz için bkz. Şekil 2).
NOT: D/A oranı değişikliğinin dinamik ölçümü için en az iki zaman noktasının (yani 0 ve 10 dk) kaydedilması gereklidir. Her numune için aktivite ölçümünü normalleştirmek için, daha sonraki zaman noktalarında (örneğin, 10 dk) ölçülen D/A oranı, prob eklenmesinden hemen sonra hesaplanan orana bölünür (0 dk).
Şekil 2: GATING stratejisi ve CF hasta balgamından izole edilmiş nötrofiller üzerinde ölçülen membran bağlı NE aktivitesinin temsili çizimleri. a)Kapı balgam nötrofillerine aşağıdaki antikorlar kullanılır: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) ve CD66b (1:50). Nötrofiller 7-AAD-CD45+CD14-CD16 + CD66b+olaylar olarak kapılıdır. Kapılı olaylar donörleri için analiz edilir (φexc= 405 nm, φem= 450/50 nm) ve alıcı (φexc= 405 nm, φem= 585/42 nm) floresan yoğunlukları (MFI'ler) anlamına gelir. b)CF balgam nötrofillerinin membran bağlı NE aktivitesi için analiz edilen temsili histogramları. Sol sütun donör sinyalini, sağ sütun kabul eden sinyalini gösterir. Üst satır, muhabirin eklenmesinden önce 10 dakika boyunca Sivelestat (w/) ile tedavi edilen hücrelerin ortalama floresan yoğunluklarını gösterir. Alt satır, muhabir eklendikten hemen sonra (0 dk, gri) ve 10 dk (mavi) muhabir floresanları ölçülen tedavi edilmemiş (w/o) hücreleri gösterir. Nötrofiller panelde gösterilen stratejiye göre kapılıdır a. c) Veri tablosu, hesaplanan D/A oranının yanı sıra birkaç zaman noktasında (0-3-5-10-15-20 dk) ölçülen nötrofiller üzerinde donör ve alıcı sinyali için ham MFI'lerden oluşan temsili bir veri kümesi gösterir. D/A oranı normale, yani 0 dakikalık zaman noktasına (beyaz yazı tipi) normalleştirilebilir. 0 dk, lekeli balgam hücrelerine sahip akış tüpüne muhabir ilavesi yapıldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede yapılan bir kaydı gösterir. MFI verileri, 1000 nötrofil için ortalama ± standart sapma olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Representative Results
Şekil 1a'da gösterilen sonuçlar temsili bir mikroskopi veri kümesini göstermektedir. Nükleer sinyal nötrofilleri karakteristik parçalı çekirdekleriyle tanımlamak için kullanılır. İlgi alanı (ROI) el ile seçilir (Şekil 1a'dakesikli çizgi). D/A oranı görüntüsü, donör kanalın yoğunluklarının, alıcı kanalın yoğunluklarına piksel bazında bölünmesiyle hesaplanır. Son adımda, hücre başına ortalama D/A oranı (YATıRıM GETIRIsi) hesaplanır. Şekil 1b'de her nokta bir yatırım getirisinin (nötrofil) ortalamasını temsil eder. Durum başına yaklaşık 100 hücrenin görüntülenerek değerlendirilmesi önerilir.
Şekil 2a'datemsili bir akış sitometrisi gating stratejisi gösterilmiştir. Bu tür gating, balgam nötrofillerini ayırt etmeye ve incelemeye izin verir. Floresan dökülmesini veya kompanzasyon yapıtlarını önlemek için, FRET probu floresan tespitine bir lazer hattı (örneğin, mavi lazer) ithaf edilmesi önerilir. Akış sitometrisi floresan kompanzasyonu FRET probu için değil antikorlar için yapılmalıdır. Şekil 2b, muhabir eklemeden sonra 0 ve 10 dakika olan MFI dağılımını tasvir eder. Şekil 2c'deki her satır, 1000 balgam nötrofil için ortalama donör ve kabul eden MFI değerlerini gösterir. D/A oranı, donör ve kabul eden MMI'ler bölünerek hesaplanır. Sağ taraftaki Şekil 2c'deki zaman seyri ölçümün ilerlemesini gösterir: hızlı bir başlangıç artışından sonra, membranla ilişkili enzimin aktivitesine göre D/ A oranı bir platoya ulaşır.
Discussion
Bildirilen protokoller, insan balgam örneklerinde nötrofil elastaz ve katepsin G'nin aktivitesini ölçmek için farklı yaklaşımları açıklamamaktadır. Başarılı bir enzim aktivitesi ölçümü için kritik noktalar i) operatif prosedürün hassas zamanlaması ve standardizasyonu ve ii) güvenilir negatif ve pozitif kontrollerin kullanılmasıdır. Bu durumlar karşılanırsa, açıklanan yöntemler balgamla sınırlı değildir, aynı zamanda kan, bronkoalveoler lavaj sıvıları ve doku bölümleri veya homojenatlardaki proteaz aktivitesinin analizine kolayca uyarlanabilir.
Üç tekniğin her birinin, genellikle birbirini tamamlayan güçlü ve sınırlamaları vardır. Örneğin, akış sitometrisi nadir hücre popülasyonlarının yanı sıra hücre fenotiplemenin hızlı analizini sağlar, ancak mikroskopi ile elde edilebilen mekansal çözünürlük bilgilerinden yoksundur. Bunun yerine, plaka okuyucu ölçümleri, çeşitli örneklerin veya koşulların yüksek verimli bir şekilde paralel olarak değerlendirilmesine izin sağlar. Taze balgam hücreleri dondurulamadığından ve depolanamadığından, üç yöntem numunelerin balgam sürücüden sonra hızlı bir şekilde işlenmesini gerektirir. Bu, membranla ilişkili aktivite ölçümlerinin esnekliğini veya verimini sınırlar. Prob ilavesi ve enzimatik bölünmeden sonra hücrelerin sabitlenebilen bir akış sitometri protokolünün geliştirilmesi, daha yüksek sayıda tüpün paralel ölçümüne açılacaktır. Ayrıca, FRET problarının taşınmasına ve depolanmasına özellikle dikkat edilmelidir. Aslında, peptit substratında bulunan metiyonin gibi bazı aminoasitler oksidasyona uğrar ve bu da muhabir duyarlılığının azalmasına neden olan bir oksidasyona uğrar. Muhabirin raf ömrünü artırmak için (20 °C'de yaklaşık üç ay olduğu tahmin edilir), Azot veya Argon gibi inert gaz altında küçük hacimli aliquotlarda (1-2 μL) saklanabilirler.
CF ve diğer kronik inflamatuar akciğer hastalıklarında iltihabı mümkün olduğunca erken tespit etmek önemlidir ve güvenilir biyobelirteçler böyle bir hedefe ulaşma potansiyeline sahiptir. Çevredeki doku için zararlı olduğu gösterilen yüzeye bağlı NSP aktivitesini, ayrıca serbest NE aktivitesi olmadığı veya az olduğu durumlarda tespit etme imkanı, mevcut diğeryöntemlerleneredeyse hiç elde edilebilen başka bir değerli bilgi seviyesi ekler 4,11.
Muhabirler, membranla ilişkili NSP aktivitesinin akciğer hastalığının şiddeti ve ilerlemesi ile olan bağlantısını incelemek için kullanılabilir, özellikle erken başlangıcında. Yöntemler, tedavi etkinliğini izlemek (örneğin, antienflamatuar tedaviler veya son derece etkili CFTR modülatörleri ve potentiatörleri28)izlemek ve nötrofil güdümlü iltihabın ortaya çıkan sönümlenliğini araştırmak için kullanılabilir. Ek olarak, protokoller hasta için çok düşük risk taşıyan ve bu nedenle çok geniş ölçekte kullanılabilen ve çok sayıda heyecan verici uygulamaya kapı açabilen non-invaziv örnek prosedürlere dayanmaktadır.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu proje, Alman Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (FKZ 82DZL004A1'den M.A.A.M'a) ve Alman Araştırma Vakfı'ndan (SFB-TR84TP B08'den M.A.M'ye) verilen hibelerle desteklenmiştir. Bu yazıda açıklanan çalışmalar Alman Akciğer Araştırmaları Merkezi (DZL) ve EMBL Heidelberg tarafından M.G. için doktora bursu ile desteklenmiştir. J. Schatterny, S. Butz ve H. Scheuermann'a uzman teknik yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431752 | |
| 2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader) | PerkinElmer | ||
| 35x10mm Dish, Nunclon Delta | Thermo Fisher Scientific | 150318 | |
| 40 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431750 | |
| 50 mL tubes | Sarstedt | 10535253 | |
| 7-AAD, viability dye | Bio Legend | 420404 | 5 µL/100 µL |
| Balance | OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd. | PR124 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL | BD Bioscience | 352054 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | ||
| black flat bottom 96 well half area plate | Corning Life Science | 3694 | |
| Cathepsin G | Elastin Products Company | SG623 | |
| Cathepsin G Inhibitor I | Merck KGaA | 219372 | |
| Centrifuge 5418R | Eppendorf AG | EP5401000137 | |
| Combitips advanced 1.0 mL | Eppendorf AG | 0030 089 430 | |
| cOmplete proteinase inhibitor | Roche | 11697498001 | |
| Countig chambers improved Neubauer | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442 | |
| coverslips Ø 25mm | Thermo Fisher Scientific | MENZCB00250RA003 | |
| Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific | ||
| DRAQ5 (nuclear stain) | BioStatus Limited | DR50050 | 1:10000 |
| FACSDiva software, v8.0.1 | BD Bioscience | ||
| FcBlock | BD Bioscience | 564219 | |
| Fiji (Fiji Is Just ImageJ) | fiji.sc | ||
| Flow Jo software, v10 | TreeStar | ||
| FluoQ Plugin, v3-97 | |||
| Heraeus Megafuge 16R | Thermo Fisher Scientific | ||
| Human Sputum Leucocyte Elastase | Elastin Products Company | SE563 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Mini Rock-Shaker | PEQLAB Biotechnologie GmbH | MR-1 | |
| mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2 | BD Bioscience | 557742 Lot:8221983 | 1:50 |
| mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8 | BD Bioscience | 557820 Lot:8208791 | 1:50 |
| mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1 | BD Bioscience | 557833 Lot:8059688 | 1:33 |
| mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5 | BioLegend | 305122 Lot:B241921 | 1:50 |
| mSAM | in house | 2 mM | |
| Multipette plus | Eppendorf AG | ||
| NEmo-1 | SiChem | SC-0200 | 1 mM |
| NEmo-2E | SiChem | SC-0201 | 2 mM |
| Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer | Pari | 085G3001 | |
| phosphate buffered saline | Gibco | 10010-015 | |
| ROTI Histokitt (mounting medium) | Carl Roth GmbH + Co.KG | 6638.1 | |
| Salbutamol | Teva GmbH | ||
| Sivelestat | Cayman Chemicals | 17779 | |
| Sputolysin | Calbiochem | 560000-1SET | |
| sSAM | in house | 2 mM | |
| SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Korkmaz, B., Moreau, T., Gauthier, F. Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: Physicochemical properties, activity and physiopathological functions. Biochimie. 90 (2), 227-242 (2008).
- Sheshachalam, A., Srivastava, N., Mitchell, T., Lacy, P., Eitzen, G. Granule Protein Processing and Regulated Secretion in Neutrophils. Frontiers in Immunology. 5, 448 (2014).
- Pham, C. T. N. Neutrophil serine proteases: Specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Gehrig, S., et al. Lack of neutrophil elastase reduces inflammation, mucus hypersecretion, and emphysema, but not mucus obstruction, in mice with cystic fibrosislike lung disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (9), 1082-1092 (2014).
- McKelvey, M. C., Weldon, S., McAuley, D. F., Mall, M. A., Taggart, C. C. Targeting proteases in cystic fibrosis lung disease paradigms, progress, and potential. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (2), 141-147 (2020).
- Clancy, D. M., et al. Extracellular Neutrophil Proteases Are Efficient Regulators of IL-1, IL-33, and IL-36 Cytokine Activity but Poor Effectors of Microbial Killing. Cell Reports. 22 (11), 2937-2950 (2018).
- Giacalone, V. D., Margaroli, C., Mall, M. A., Tirouvanziam, R. Neutrophil adaptations upon recruitment to the lung: New concepts and implications for homeostasis and disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-21 (2020).
- Sly, P. D., et al. Risk Factors for Bronchiectasis in Children with Cystic Fibrosis. New England Journal of Medicine. 368 (21), 1963-1970 (2013).
- Owen, C. A., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Campbell, E. J. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: A novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. Journal of Cell Biology. 131 (3), 775-789 (1995).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Margaroli, C., et al. Elastase Exocytosis by Airway Neutrophils Associates with Early Lung Damage in Cystic Fibrosis Children. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. , (2018).
- Owen, C., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Carolina, N. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: a novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. The Journal of cell biology. 131 (3), 775-789 (1995).
- Garland, M., Yim, J. J., Bogyo, M. A Bright Future for Precision Medicine: Advances in Fluorescent Chemical Probe Design and Their Clinical Application. Cell chemical biology. 23 (1), 122-136 (2016).
- Gehrig, S., Mall, M. A., Schultz, C. Spatially resolved monitoring of neutrophil elastase activity with ratiometric fluorescent reporters. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (25), 6258-6261 (2012).
- Guerra, M., et al. Cathepsin G Activity as a New Marker for Detecting Airway Inflammation by Microscopy and Flow Cytometry. ACS Central Science. 5 (3), 539-548 (2019).
- Hu, H. Y., et al. In vivo imaging of mouse tumors by a lipidated cathepsin S substrate. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (29), 7669-7673 (2014).
- Korkmaz, B., et al. Measuring elastase, proteinase 3 and cathepsin G activities at the surface of human neutrophils with fluorescence resonance energy transfer substrates. Nature Protocols. 3 (6), 991-1000 (2008).
- Craven, T. H., et al. Super-silent FRET Sensor Enables Live Cell Imaging and Flow Cytometric Stratification of Intracellular Serine Protease Activity in Neutrophils. Scientific Reports. 8 (1), 13490 (2018).
- Mu, J., et al. A small-molecule fret reporter for the real-time visualization of cell-surface proteolytic enzyme functions. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (52), 14357-14362 (2014).
- Hagner, M., et al. New method for rapid and dynamic quantification of elastase activity on sputum neutrophils from patients with cystic fibrosis using flow cytometry. European Respiratory Journal. 55 (4), 1902355 (2020).
- Dittrich, A. S., et al. Elastase activity on sputum neutrophils correlates with severity of lung disease in cystic fibrosis. European Respiratory Journal. , 1701910 (2018).
- Cobos-Correa, A., Trojanek, J. B., Diemer, S., Mall, M. A., Schultz, C. Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation. Nature Chemical Biology. 5 (9), 628-630 (2009).
- Hu, H. -Y., et al. FRET-based and other fluorescent proteinase probes. Biotechnology Journal. 9 (2), 266-281 (2014).
- Trojanek, J. B., et al. Airway mucus obstruction triggers macrophage activation and matrix metalloproteinase 12-dependent emphysema. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (5), 709-720 (2014).
- Wagner, C. J., Schultz, C., Mall, M. A. Neutrophil elastase and matrix metalloproteinase 12 in cystic fibrosis lung disease. Molecular and Cellular Pediatrics. 3 (1), 25 (2016).
- Gaggar, A., et al. The role of matrix metalloproteinases in cystic fibrosis lung disease. The European respiratory journal. 38 (3), 721-727 (2011).
- Guerra, M., et al. Protease FRET Reporters Targeting Neutrophil Extracellular Traps. Journal of the American Chemical Society. 142 (48), 20299-20305 (2020).
- Middleton, P. G., et al. Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor for Cystic Fibrosis with a Single Phe508del Allele. New England Journal of Medicine. 381 (19), 1809-1819 (2019).
