Summary
Protokollene heri beskrevet gir en guide for å visualisere og kvantifisere aktiviteten til nøytrofile proteaser i menneskelig sputum. Anvendelsen av slik analyse spenner fra evaluering av antiinflammatoriske behandlinger, til biomarkørvalidering, legemiddelscreening og store kliniske kohortstudier.
Abstract
Proteaser er regulatorer av utallige fysiologiske prosesser, og den nøyaktige undersøkelsen av deres aktiviteter er fortsatt en spennende biomedisinsk utfordring. Blant de ~600 proteasene som er kodet av det menneskelige genom, undersøkes nøytrofile serinproteaser (NSP-er) grundig for deres involvering i utbruddet og progresjonen av inflammatoriske tilstander, inkludert luftveissykdommer. Unikt, utskilte NSP-er sprer seg ikke bare i ekstracellulære væsker, men også lokaliserer til plasmamembraner. Under nøytrofil ekstracellulær felle (NETs) dannelse, NSP blir en integrert del av utskilt kromatin. Slik kompleks atferd gjør forståelsen av NSP-patofysiologi til en utfordrende oppgave. Her er detaljerte protokoller vist å visualisere, kvantifisere og diskriminere frie og membranbundne nøytrofil elastase (NE) og cathepsin G (CG) aktiviteter i sputumprøver. NE og CG er NSP-er hvis aktiviteter har pleiotrope roller i patogenesen av cystisk fibrose (CF) og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS): de fremmer vevsoppussing, regulerer nedstrøms immunresponser og korrelerer med lungesykdoms alvorlighetsgrad. Protokollene viser hvordan man skiller væske og cellulær brøkdel, samt isolering av nøytrofiler fra menneskelig sputum for enzymatisk aktivitets kvantifisering via småmolekyl Förster resonans energioverføringsbaserte (FRET) reportere. For å samle spesifikk innsikt i den relative rollen til NE- og CG-aktiviteter, kan en FRET-avlesning måles av forskjellige teknologier: i) in vitro platelesermålinger gir mulighet for høy gjennomstrømning og bulkdeteksjon av proteaseaktivitet; ii) konfektmikroskopi spatiotemporally løser membranbundet aktivitet på celleoverflaten; iii) småmolekyl fret strømning cytometri muliggjør rask evaluering av antiinflammatoriske behandlinger via encellet proteaseaktivitet kvantifisering og fenotyping. Implementeringen av slike metoder åpner dørene for å utforske NSP-patobiologi og deres potensial som biomarkører for sykdoms alvorlighetsgrad for CF og KOLS. Gitt deres standardiseringspotensial, deres robuste avlesning og enkel overføring, kan de beskrevne teknikkene umiddelbart deles for implementering på tvers av forsknings- og diagnostiske laboratorier.
Introduction
Nøytrofil elastase (NE), cathepsin G (CG), proteinase 3 (PR3) og nøytrofil serinprotease 4 (NSP4) er de fire nøytrofile serinproteasene (NSP)1. De lagres, sammen med myeloperoxidase, innenfor nøytrofile primære eller azurofile granulater. På grunn av deres forhøyede proteolytiske innhold er sekresjonen av primære granulater tett regulert og nøytrofiler må utfordres sekvensielt med grunning og aktivering av stimuli2.
Inne i fagosomet fungerer NSP-er som intracellulære bakteriedrepende midler3. Når de utskilles, blir NSP-er sterke formidlere av betennelse: de cleave cytokiner og overflatereseptorer, aktiverer parallelle proinflammatoriske veier3. Det er viktig at inflammatoriske tilstander har en ukontrollert NSP-sekresjon. For eksempel, innenfor betente luftveier, forårsaker overdreven NE-aktivitet slim hypersekresjon, begerceller metaplasi, CFTR-inaktivering og ekstracellulær matriseoppussing4,5. Cathepsin G deltar også i betennelse: det klemmer spesielt og aktiverer to komponenter i IL-1-familien, IL-36α og IL-36β6. I samarbeid med NE cleaves CG proteaseaktiverte reseptorer på luftveisepitelet og aktiverer også TNF-α og IL-1β.
Endogene anti-proteaser som alfa-1-antitrypsin, alfa-1-antichymotrypsin og sekretorisk leukocytt proteasehemmer regulerer nøytrofil elastase og cathepsin G aktivitet5. Men i løpet av lungesykdomsprogresjonen overskrider den kontinuerlige sekresjonen av proteaser stoichiometrisk anti-proteaseskjoldet, noe som fører til ikke-løsende nøytrofililia i luftveiene, betennelse forverres og vevsskade5,7. Selv om NE-konsentrasjon og aktivitet i løselige fraksjoner av pasient luftveier har vist seg å være en lovende biomarkør for sykdomalvorlighetsgrad 8, NE og CG også knyttet til nøytrofil plasmamembran og til ekstracellulært DNA via elektrostatiske interaksjoner9,10 hvor de blir mindre tilgjengelige for anti-proteaser. Det er viktig at prekliniske studier definerte et scenario der celleoverflaterelatert proteaseaktivitet vises tidligere og/eller uavhengig av den løselige motparten4,11. Faktisk, for å bli påviselig, må fri proteaseaktivitet først overvelde anti-protease skjoldet. I stedet, på celleoverflaten, forblir membranbundet proteaseaktivitet i det minste delvis intakt på grunn av utilgjengeligheten av store hemmere til celleplasmamembranen12. Slik kompleks protease atferd har viktige konsekvenser på nøytrofilmediert betennelse utbrudd og forplantning, og må derfor undersøkes med presise og informative verktøy.
Gjennom årene fant Förster resonansenergioverføring (FRET)-baserte sonder mange biomedisinske applikasjoner som verktøy som effektivt og raskt vurderer en bestemt proteaseaktivitet i menneskelige prøver13. For å fungere består proteasereportere av et anerkjennelsesmotiv (dvs. et peptid), som er anerkjent av målenzymet og er avhengig av FRET, en fysisk prosess der en donorfluofor ved eksitasjon overfører energi til et akseptormolekyl. Behandlingen som drives av enzymet på reporteren, nemlig spaltingen av anerkjennelsesdelen, resulterer i at akseptoren sprer seg bort fra donoren: enzymaktiviteten måles derfor som en tidsavhengig endring i donoren over akseptorfluorescensen. Slik avlesning er selv-normaliserende og forholdsmessig, og påvirkes derfor bare marginalt av miljøforhold som pH og lokal sondekonsentrasjon. NEmo-114 og sSAM15 er FRET-sonder som rapporterer spesifikt om henholdsvis NE- og CG-aktivitet. Imidlertid lokaliserer slike reportere ikke spesielt til noe cellulært rom, derfor brukes de til å overvåke proteaseaktiviteten som er tilstede i menneskelige væsker. For å overvåke proteaseaktivitet på en romlig lokalisert måte utviklet vi og andre FRET-sonder som knytter seg til subcellulære komponenter via molekylære koder14,15,16,17,18,19. En slik syntetisk strategi tillot utvikling av NEmo-2 og mSAM, to FRET-sonder utstyrt med lipidankere som lokaliserer til plasmamembranen. Disse reporterne førte til en dypere forståelse av NE- og CG-proteaser i cystisk fibrose og kroniske obstruktive lungesykdommer14,15.
Her er det gitt detaljerte protokoller for visualisering og kvantifisering av løselige og membranbundne NE- og CG-aktiviteter i menneskelig sputum ved hjelp av NEmo- og SAM-serien av FRET-sonder. For å adressere ulike aspekter ved NSP-patofysiologi og gi en rekke metoder som kan brukes i henhold til det brukerspesifikke behovet, vises analysen via fluorescensspektroskopi, fluorescensmikroskopi og strømningscytometri.
Protocol
Følgende protokoller beskriver analyse utført på menneskelig sputum. Menneskelig utvalgshåndtering ble godkjent av etikkkomiteen ved Universitetet i Heidelberg og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter eller deres foreldre/foresatte (S-370/2011) og sunn kontroll (S-046/2009).
MERK: Følgende protokoller beskriver prøvepreparatet og kvantifiseringen av nøytrofil serinproteaser (NSP)-aktivitet. De eksperimentelle prosedyrene som presenteres her, fokuserer på human sputum og nøytrofil elastase14,20,21 (NE) eller cathepsin G15 (CG) aktivitetsmåling. Imidlertid gjør små tilpasninger i prøveprepareringsprotokollen analysen av blodavledede celler og tumor homogenater mulig. I tillegg kan matrisemetalloproteinase 12 og cathepsin S-aktiviteter undersøkes på samme måte ved hjelp av dedikerte FRET-sonder22,23,24,25,26.
1. Prøvepreparering: celleisolasjon og supernatant separasjon
MERK: Hvis det er mulig, bør behandlingen av sputum utføres innen 120 minutter etter ekspektorering, og sputumet skal lagres på is inntil videre behandling.
- Hvis spontan ekspektorering av sputum ikke er mulig, induser sputum som beskrevet tidligere19. Kort sagt, inhaler 200 μg av β-2-reseptor-antagonist salbutamol før du starter sputum induksjonsprosedyren. Deretter inhalerer du en hypertonisk (6%) saltoppløsning i 15 minutter ved hjelp av en forstøver. Samle det ekspektorerte sputumet i en Petri-tallerken.
- Skill slimklumper fra spytt i en Petri-tallerken ved hjelp av en pipettespiss.
- Vei slimet.
MERK: Gjennomsnittlig vekt av slimprøver er 0,8 g (varierende mellom 0,1 g og 5 g); 0,1 g er vanligvis tilstrekkelig til å utføre de nevnte prosedyrene. - Tilsett 4 deler (v/w) 10 % Sputolysin (i PBS) i sputum (for eksempel: 4 ml 10 % Sputolysin for hvert gram sputum).
FORSIKTIG: Sputolysin består av konsentrert dithiothreitol i fosfatbuffer, og håndterer det derfor med forsiktighet. - Inkuber blandingen ved romtemperatur (RT) på en gynge shaker i 15 min for å oppløse slimet. Av sikkerhetsgrunner plasserer du shakeren i en avtrekkshette.
- Slukk reaksjonen ved å legge til samme volum kald PBS (for eksempel: 1 ml kald PBS for hver ml 10% Sputolysin).
- Bland ved pipettering for å oppnå en homogen løsning.
- Filtrer blandingen gjennom en 100 μm nyloncellesil i et 50 ml rør.
- Gjenta filtreringstrinnet gjennom en 40 μm nyloncellesil.
- Sentrifuger oppløsningen i 10 min ved 300 x g ved 4 °C.
- Overfør den supernatante fraksjonen forsiktig inn i et friskt rør og oppbevar den på is.
MERK: De supernatante fraksjonene kan lagres ved -20 °C eller -80 °C inntil videre analyse. - Resuspend cellepellet forsiktig i 500 μL kald PBS og legg den på is.
MERK: Cellefraksjonen må behandles umiddelbart.
2. Neutrophil serin protease aktivitetsmåling
MERK: Her innføres ulike metoder for å kvantifisere NSP-aktivitet ved hjelp av FRET-reportere. Valget av teknologien er diktert av det spesifikke biomedisinske spørsmålet og formålet med eksperimentet. Sondene som ble presentert ble grundig testet for deres spesifisitet mot et sett med lungerelevante enzymer14,15. Selv om sondene er spesifikke mot deres målenzym, må du alltid sjekke sondespesifikasjonen på den kliniske prøven av interesse. Dette kan oppnås ved å inkubere prøven med en bestemt proteasehemmer før sondetilsetning, noe som bør avskaffe enhver økning i D / A-forholdet.
- Løselige NSP-er aktivitetskvartifisering via fluorimeter eller plateleseranalyse
MERK: Proteaseaktivitet i løselige fraksjoner av prøven kan påvises med ethvert instrument som er i stand til fluorescensdeteksjon.- Tine enzymer på is.
- Inntil bruk, hold NE og CG i sur lagringsbuffer (50 mM natriumacetat, 200 mM NaCl, pH 5,5) for å forhindre selvspalting.
- For å sette opp en enzymstandardkurve, lag en 1: 2 seriell fortynning av enzym (33,9 - 0,271 nM for NE; 42,6 - 0,333 nM for CG) i aktiveringsbuffer (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl ved pH 7,5). Aktiveringsbufferen har en nøytral pH og gjør det derfor mulig å oppnå enzymatisk katalyse effektivt.
- For å forberede den høyeste standardkonsentrasjonen (NE-konsentrasjon: 33,9 nM), fortynn 1 μL NE (33,9 μM) i 999 μL aktiveringsbuffer.
- For å forberede den andre standarden (NE-konsentrasjon: 16,95 nM), bland 200 μL av den første fortynning med 200 μL aktiveringsbuffer.
- Fortsett deretter for å forberede de resterende 1:2 fortynningene.
- Den siste standarden, som er den tomme, består av ren aktiveringsbuffer. Måling av tekniske duplikater eller triplikater anbefales. Under standard- og prøveforberedelsene, prøv å holde hetteglass på is.
- Parallelt med standardpreparatet fortynnes sputumprøver i aktiveringsbufferen. Fortynn de menneskelige prøvene før du vurderer deres proteaseaktivitet for å forbli i det lineære spekteret av økning av reportersignal (donor / akseptorforhold). Hvis pasientprøver ble stående ufortynnet, ville spaltingen skje for raskt for en pålitelig tilpasning. Siden sunn donor sputum inneholder færre aktive proteaser sammenlignet med prøver fra CF- og KOLS-pasienter, utføres forskjellige fortynninger vanligvis (1:10 for friske sputum supernatant, 1:20-500 for sputum supernatant av KOLS- eller CF-pasienter).
MERK: For å kvantitativt måle proteaseaktivitet i prøver der konsentrasjonen er ukjent, må en standardkurve med kjente enzymkonsentrasjoner måles parallelt, ideelt på samme plate. Konsentrasjonen av aktivt enzym i menneskelig sputum beregnes ved å interpolere bakkene målt i menneskelige sputumprøver med de som måles med standardkurvene. - Før du forbereder prøvene for måling, må du sette opp instrumentet. Sett eksitasjonsbølgelengden for NE FRET-proben (NEmo-114) til 354 nm, og sett deteksjonsbølgelengden til 400 nm for donoren og 490 nm for akseptoren. Sett eksitasjonsbølgelengden for CG FRET-proben (sSAM15) til 405 nm, og sett utslippet til 485 (donor) og 580 nm (akseptor).
- Tilsett 40 μL prøver, standard eller blank i brønnene på en svart 96-brønns halvarealplate.
- For å forberede hovedblandingen som inneholder reporterne (konsentrasjonen av reporteren i hovedblandingen: 10 μM), fortynn sondelageret (1 mM i DMSO) 1:100 i aktiveringsbuffer. Forbered det nødvendige master mix-volumet ved å multiplisere 10 μL x antall nødvendige platebrønner. For å nå den optimale sluttkonsentrasjonen (2 μM) for fluorescensmåling av NEmo-1 og sSAM-reportere, tilsett 10 μL av masterblandingen til hver brønn (inneholder 40 μL av enten prøve, standard eller blank) og start avlesningen. NEmo-1- og sSAM-reportere vil derfor overvåke henholdsvis løselig nøytrofil elastase og cathepsin G-aktivitet.
MERK: Hvis en reagensinjektor ikke er tilgjengelig, må du starte avlesningen så snart som mulig etter at reporteren har lagt til prøvene. - Start platelesermålingen og registrer donor/akseptorforholdet øke hvert 60-90 sekund i minst 20 minutter eller til økningen i signalet når et platå.
- Når data er eksportert, beregner du donor/akseptorforholdet (D/A-forholdet) ved å dele donor relative fluorescensenheter (RFU) med akseptoren RFU for hvert tidspunkt og prøve.
- Beregn gjennomsnittet for D/A-forholdet og standardavviket for hvert utvalg.
- Bestem stigningstallet innenfor den lineære veksten i D/A-forholdsendringen. Skråningen er en indikator på enzymets spaltingshastighet for en FRET-sonde. Beregn konsentrasjonen av aktivt enzym i sputum ved å montere de lineære regresjonsbakkene avledet fra de menneskelige prøvene med de som beregnes ut fra enzymstandarden.
- Membranbundne NSP-er aktivitetskvartifisering via fluororimeter- eller plateleseranalyse
- Isoler sputumceller som beskrevet ovenfor. Resuspend 3 x 104 celler i et volum på 40 μL PBS. Legg cellene godt til plateleseren.
- Sett opp instrumentet. Sett eksitasjonsbølgelengden for membranbundet NE FRET-sonde (NEmo-214) til 405 nm, og sett deteksjonsbølgelengden til 485 nm for donoren og 580 nm for akseptoren. Sett eksitasjonsbølgelengden for membranbundet CG FRET-sonde (mSAM15) til 405 nm, og sett utslippet til 485 (donor) og 580 nm (akseptor).
- For å forberede hovedblandingen som inneholder reporterne, fortynn probelageret i aktiveringsbuffer til en konsentrasjon på 10 μM. Forbered det nødvendige masterblandingsvolumet ved å multiplisere 10 μL X antall nødvendige platebrønner. For å nå den optimale sluttkonsentrasjonen (2 μM) for fluorescensmåling av NEmo-2 og mSAM-reportere, tilsett 10 μL av masterblandingen til hver brønn (inneholder 40 μL av enten prøve, standard eller blank) og start avlesningen. NEmo-2- og mSAM-reportere vil derfor overvåke henholdsvis membranbundet nøytrofil elastase og cathepsin G-aktivitet.
MERK: En cellulær negativ kontroll kan for eksempel brukes i celler som ikke aktivt skiller ut NSP-er. For eksempel representerer inkubasjonen av reporterne med 3 x 104 leukocyttforfedre HL-60 promyelocytiske celler en gyldig spalting negativ kontroll. - Registrer endring i donor/akseptorforhold i minst 20 minutter eller til økningen av signalet når et platå. Analyser dataene som beskrevet ovenfor.
- Membranbundet NSP-aktivitetsmåling via fluorescensmikroskopi
- Bestem antall betingelser som må analyseres.
MERK: For hver sputumprøvemåling anbefales forberedelse og analyse av ekstra positiv (PC) og negativ (NC) kontroll. - For hver måling, resuspend 3 x 104 sputum celler i et volum på 50 μL PBS i et 1,5 ml rør.
- Som en negativ kontroll, inkubere sputumceller med en bestemt inhibitor (Sivelestat, spesifikk NE-hemmer eller cathepsin G-hemmer I, spesifikk CG-hemmer, ved en endelig konsentrasjon på 100 μM). Inkuber i 10 min på RT.
- Som positiv kontroll, inkuber sputumceller med riktig enzym (henholdsvis NE eller CG ved 340 nM eller 200 nM) i 10 min ved RT.
- Tilsett 50 μL PBS som inneholder FRET-reporteren og en kjernefysisk flekk (i en 1:1000 endelig fortynning) til hvert rør (positive kontrollbehandlede celler, negative kontrollbehandlede celler og ubehandlede celler) for å nå en sonde endelig konsentrasjon på 2 μM. Inkubere i 10-20 min ved RT.
VIKTIG: Tilsetningen av en kjernefysisk flekk letter fluorescensmikroskopiavbildning, da den gjør det mulig å søke etter sputumceller av interesse uten å bruke FRET-sondekanalene og derfor unngå reporterbleking. I tillegg tillater DNA-flekken å segmentere sputumceller i henhold til formen på kjernen. For eksempel kan nøytrofiler lett identifiseres av deres flerlobulære kjerner. Også tilleggsinformasjon om levedyktigheten til cellene kan hentes (nøytrofiler med en mer segmentert kjerne er mer sannsynlig å være i live).
MERK: I tillegg til den membranbundne kan aktiviteten til DNA-bundet NE eller CG i menneskelig sputum måles på samme måte ved hjelp av H-NE og H-CG, ekstracellulære DNA-assosierende FRET-sonder27. Ved tilberedning av masterblandingen kan H-NE og H-CG tilsettes i konsentrasjonen på 10 μM og inkuberes med sputum før cytospin og glideforberedelse. D/A-forholdet kvantifisering på ekstracellulært DNA fortsetter identisk med NEmo-2 og mSAM, med den eneste forskjellen at ekstracellulære DNA-aggregater segmenteres i stedet for enkeltceller27. - Slukk reaksjonen ved å tilsette 100 μL iskald PBS, og overfør prøver på is.
- Cytospin blandingen på mikroskopi lysbilder, lufttørk, fikse med iskald metanol 10% i 10 min, lufttørk og montere med et passende monteringsmedium.
MERK: Mikroskopilysene kan oppbevares ved 4 °C i mørket i opptil en måned inntil videre analyse. - Anskaffe mikroskopibilder ved hjelp av et konfokalt mikroskop med et PL APO 40x- eller 63x oljemål. Det anbefales å øke bildekvaliteten og redusere anskaffelsestiden for en sekvensiell bildeanskaffelsesmodus.
- Bilde kjernefysisk flekk først via 633 nm eksitasjon med helium-neon-laser linje og registrere sin utslipp mellom 650 og 715 NM.
- Registrer donoren (coumarin 343) til FRET-reporteren mellom 470 og 510 nm ved eksitasjon ved 458 nm med en argonlaser. Erverv det sensibiliserte akseptorutslippet (5,6-TAMRA) mellom 570 og 610 nm etter ene donoreksitasjon.
- Registrer direkte akseptorutslipp i en egen kanal mellom 470 og 510 nm ved akseptor optimal eksitasjon ved 561 nm ved hjelp av dioden pumpet solid state (DPSS) laser.
- Angi hull i begynnelsen av eksperimentet og vedlikehold i løpet av bildebehandlingsøkten.
MERK: På grunn av sin lille størrelse anbefales bruk av et 40x eller 63x mikroskopmål å visualisere nøytrofiler riktig. Vanligvis er bilder anskaffet i flere påfølgende kanaler, og starter med den lengre eksitasjonsbølgelengden for å forhindre fotobleaching av reporteren under oppkjøpet.
- Bilde minst 100 celler per betingelse for avgjørende statistikk. For analyse av mikroskopibilder kan du bruke en passende programvare: segmentere cellene og beregne D/A-forholdet på piksel-for-piksel-basis, og deretter beregne gjennomsnittet eller medianen for et gitt interesseområde som velges manuelt av brukeren. Hvis du vil ha representative resultater, kan du se Figur 1.
- Bestem antall betingelser som må analyseres.
Figur 1: Representative bilder og kvantifisering av membranbundet NE-aktivitet på nøytrofiler isolert fra CF-pasient sputum. a) Representative konfokale mikroskopibilder av nøytrofiler forhåndsinkubert (topppanel) i 10 min med 100 μM Sivelestat (w/) eller venstre ubehandlet (w/o) (bunnpanel) før reporter NEmo-2 (2 μM) tillegg. Den første kolonnen fra venstre viser kjernefysisk flekk, den andre giverkanalen, den tredje akseptorkanalen og den siste beregnede D / A-forholdet oppnådd ved å dele donor- og akseptorkanaler på piksel-for-piksel-basis. Grensene til interesseområdet (enkelt nøytrofil) er avbildet som stiplet linje. Skala (10 μm) og kalibreringsstenger (D/A-forhold) er indikert. b) Boks- og prikkplott som viser D/A-forholdet mellom sputum-nøytrofiler fra en representativ CF-pasient. Celler inkubert med inhibitor og ubehandlede celler er vist i henholdsvis grått og blått. Hver prikk representerer én celle (N: m/hemmer = 113 og uten hemmer = 96). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Membranbundet NSP-aktivitetsmåling via strømningscytometri
- Resuspend 1 x 106 celler i 100 μL PBS i en 5 ml FACS polystyren rundbunnsrør og legg røret på is.
- Til gate sputum nøytrofiler, bruk følgende antistoffer: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) og CD66b (1:50). Forbered tilstrekkelig hovedblanding for alle prøver. Plasser mesterblandingen på isen i mørket.
- Definer gatingstrategien som beskrevet i Figur 2. Nøytrofiler er inngjerdet som 7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ hendelser. De inngjerdede hendelsene vil deretter bli analysert for deres membranbundne proteaseaktivitet for donoren (λexc = 405 nm, λem = 450/50 nm) og akseptor (λexc = 405 nm, λem = 585/42 nm) gjennomsnittlig fluorescerende intensiteter (MFIer).
- Tilsett 2 μL FcBlock i hver prøve, og inkuber i 5 minutter ved RT.
- Tilsett de valgte antistoffene til hvert rør, og inkuber i 30 min på is i mørket.
- Vask celler ved å tilsette 2 ml kald PBS, og sentrifuger i 5 min ved 300 x g og 4 °C. Kast supernatante og resuspendceller i 200 μL kald PBS.
- Del 200 μL i to rør med 100 μL hver og tilsett 5 μL celle levedyktighetsfargingsløsning i hvert rør. Plasser rør på is.
- Tilsett en passende spesifikk NSP-hemmer (for NE bruk Sivelestat ved 225 μM endelig konsentrasjon, for CG bruk cathepsin G Inhibitor I ved 100 μM) til det negative kontrollrøret (NC). Inkuber prøvene på RT i 10 minutter i mørket.
- Tilsett 100 μL kald PBS i prøven, filtrer den gjennom et 40 μm filter i et rent FACS-rør for å forhindre tilstopping av instrumentet.
- Tilsett reporteren (for NE, NEmo-2 ved en endelig konsentrasjon på 4 μM, for CG, mSAM ved en endelig konsentrasjon på 2 μM) i NC-prøven, vir forsiktig røret.
- Begynn å anskaffe celler inkubert med den spesifikke inhibitoren for å justere om nødvendig portene så vel som reporterens PMTs spenninger.
- Registrer minst 1000 nøytrofiler. Oppbevar prøven ved romtemperatur.
MERK: Selv om flere hendelser kan registreres, sikrer 1000 celler et godt kompromiss mellom riktig statistikk og opptakstid. - Fortsett med følgende rør (ubehandlede sputumprøver) tilsvarende.
- For å registrere endringer i D / A-forholdet på grunn av membranbundet proteaseaktivitet, registrer 1000 nøytrofiler fra hvert rør hver 5 til 10 min.
MERK: Etter vellykket FRET-reporterspalting vil donorkanalens MFIs-intensitet øke over tid. MFK-intensiteten for godtarkanalen bør reduseres eller forbli konstant over tid. - Beregn FRET-forholdet ved å dele donoren på akseptorkanalverdiene for prøvene målt på de inngjerdede levedyktige enkeltnøytrofiler.
- Normaliser utvalgsmålinger ved å dele dem med det tilsvarende tidspunktet på 0 minutter (for representative resultater og analyser, se figur 2).
MERK: Opptak av minst to tidspunkter (dvs. 0 og 10 min) er nødvendig for en dynamisk måling av D / A-forholdsendring. For å normalisere aktivitetsmålingen for hver prøve deles D/A-forholdet målt i senere tidspunkter (f.eks. 10 min) på forholdet som beregnes umiddelbart etter sondetillegg (0 min).
Figur 2: Gatingstrategi og representative plott av membranbundet NE-aktivitet målt på nøytrofiler isolert fra CF-pasientsputum. a) For å gate sputum nøytrofiler brukes følgende antistoffer: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) og CD66b (1:50). Nøytrofiler er inngjerdet som 7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ hendelser. De inngjerdede hendelsene analyseres for deres donor (λexc= 405 nm, λem= 450/50 nm) og akseptor (λexc= 405 nm, λem= 585/42 nm) gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFIer). b) Representative histogrammer av CF sputum nøytrofiler analysert for deres membranbundne NE-aktivitet. Den venstre kolonnen viser donorsignalet, den høyre kolonnen viser akseptorsignalet. Den øverste raden viser gjennomsnittlig fluorescensintensitet av celler behandlet med Sivelestat (m/) i 10 minutter før tilsetning av reporteren. Den nederste raden viser ubehandlede celler (w/o) hvis reporterfluorescens måles umiddelbart (0 min, grå) og 10 min (blå) etter reportertillegg. Nøytrofiler er inngjerdet i henhold til strategien vist i panel a. c) Datatabellen viser et representativt datasett som består av rå MFI-er for donor- og akseptorsignalet på nøytrofiler målt over flere tidspunkter (0-3-5-10-15-20 min) samt det beregnede D / A-forholdet. D/A-forholdet kan normaliseres, det vil si til tidspunktet 0 min (hvit skrift). 0 min indikerer et opptak gjort så snart som mulig etter reporter tillegg til strømningsrøret med fargede sputumceller. MFIs-data vises som gjennomsnittlig ± standardavvik for 1000 nøytrofiler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Representative Results
Resultatene vist i figur 1a illustrerer et representativt mikroskopidatasett. Atomsignalet brukes til å identifisere nøytrofiler ved deres karakteristiske segmenterte kjerner. Interesseområdet (ROI) velges manuelt (stiplet linje i figur 1a). Bildet med D/A-forholdet beregnes ved å dele intensitetene i giverkanalen på intensitetene til godtarkanalen piksel for piksel. I det siste trinnet beregnes gjennomsnittlig D/A-forhold per celle (ROI). I figur 1b representerer hver prikk gjennomsnittet av en avkastning (nøytrofil). Det anbefales å bilde og evaluere ca 100 celler per betingelse.
En representativ flow cytometri gating strategi er vist i Figur 2a. Slike gating gjør det mulig å diskriminere og studere sputum nøytrofiler. For å unngå fluorescenssøl eller kompensasjonsartefakter, anbefales det å dedikere en laserlinje (f.eks. blå laser) til FRET-sondens fluorescensdeteksjon. Strømningscytometrifluorescenskompensasjon bør utføres for antistoffer og ikke for FRET-sonden. Figur 2b viser MFI-fordelingen på 0 og 10 min etter reportertillegg. Hver rad i figur 2c angir gjennomsnittlige donor- og akseptor-MFIer-verdier for 1000 sputum-nøytrofiler. D/A-forholdet beregnes ved å dele giveren og akseptor-MFIene. Tidsforløpet i figur 2c på høyre side viser utviklingen av målingen: Etter en rask innledende økning når D / A-forholdet et platå, i henhold til aktiviteten til det membranbundne enzymet.
Discussion
De rapporterte protokollene forklarer ulike tilnærminger for å kvantifisere aktiviteten til nøytrofil elastase og cathepsin G i humane sputumprøver. Kritiske punkter for en vellykket måling av enzymaktivitet er i) presis timing og standardisering av den operative prosedyren og ii) bruk av pålitelige negative og positive kontroller. Hvis disse forholdene er oppfylt, er de beskrevne metodene ikke begrenset til sputum, men kan også lett tilpasses analysen av proteaseaktivitet i blod, bronkoalveolar lavagevæsker og vevsseksjoner eller homogenater.
Hver av de tre teknikkene har sine styrker og begrensninger, som ofte utfyller hverandre. For eksempel tillater strømningscytometri rask analyse av sjeldne cellepopulasjoner samt cellefenotyping, men mangler romlig oppløsningsinformasjon, som kan oppnås ved mikroskopi. I stedet tillater måling av platelesere parallell vurdering av flere prøver eller forhold på en høy gjennomstrømningsmote. Siden friske sputumceller ikke kan fryses og lagres, krever de tre metodene at prøver må behandles raskt etter ekspektorering. Dette begrenser fleksibiliteten eller gjennomstrømningen til de membranbundne aktivitetsmålingene. Utviklingen av en strømningscytometriprotokoll som gjør det mulig å fikse celler etter sondetilsetning og enzymatisk spalting, vil åpne for parallell måling av et høyere antall rør. Videre bør det tas særlig hensyn til håndtering og lagring av FRET-sondene. Faktisk gjennomgår noen aminoacider som er tilstede i peptidssubstratet, som metionin, oksidasjon som fører til redusert reporterfølsomhet. For å øke reporterens holdbarhet (anslått til omtrent tre måneder ved 20 °C), kan de lagres i små volum aliquots (1-2 μL) under inert gass som Nitrogen eller Argon.
I CF og andre kroniske inflammatoriske lungesykdommer er det viktig å oppdage betennelsen så tidlig som mulig, og pålitelige biomarkører har potensial til å oppnå et slikt mål. Muligheten til å oppdage overflatebundet NSP-aktivitet, som har vist seg å være skadelig for det omkringliggende vevet, også under forhold der det ikke er noen eller liten fri NE-aktivitet, legger til et annet nivå av verdifull informasjon, som knapt kan oppnås ved hjelp av andre eksisterende metoder4,11.
Reporterne kan brukes til å studere koblingen av membranbundet assosiert NSP-aktivitet med alvorlighetsgrad og progresjon av lungesykdom, spesielt ved tidlig start. Metodene kan brukes til å overvåke behandlingseffekten (f.eks. antiinflammatoriske behandlinger eller svært effektive CFTR-modulatorer og potensiatorer28) og undersøke den resulterende dempingen av nøytrofildrevet betennelse. I tillegg er protokollene basert på ikke-invasive prøveprosedyrer som har svært lav risiko for pasienten og derfor kan brukes i svært bred skala og åpne dørene for mange spennende applikasjoner.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av tilskudd fra det tyske kunnskapsdepartementet (FKZ 82DZL004A1 til M.A.M) og Den tyske forskningsstiftelsen (SFB-TR84TP B08 til M.A.M). Arbeidet beskrevet i dette manuskriptet ble støttet av Det tyske senter for lungeforskning (DZL) og EMBL Heidelberg gjennom et stipendiatstipend for M.G. Vi takker J. Schatterny, S. Butz og H. Scheuermann for ekspert teknisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431752 | |
| 2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader) | PerkinElmer | ||
| 35x10mm Dish, Nunclon Delta | Thermo Fisher Scientific | 150318 | |
| 40 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431750 | |
| 50 mL tubes | Sarstedt | 10535253 | |
| 7-AAD, viability dye | Bio Legend | 420404 | 5 µL/100 µL |
| Balance | OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd. | PR124 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL | BD Bioscience | 352054 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | ||
| black flat bottom 96 well half area plate | Corning Life Science | 3694 | |
| Cathepsin G | Elastin Products Company | SG623 | |
| Cathepsin G Inhibitor I | Merck KGaA | 219372 | |
| Centrifuge 5418R | Eppendorf AG | EP5401000137 | |
| Combitips advanced 1.0 mL | Eppendorf AG | 0030 089 430 | |
| cOmplete proteinase inhibitor | Roche | 11697498001 | |
| Countig chambers improved Neubauer | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442 | |
| coverslips Ø 25mm | Thermo Fisher Scientific | MENZCB00250RA003 | |
| Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific | ||
| DRAQ5 (nuclear stain) | BioStatus Limited | DR50050 | 1:10000 |
| FACSDiva software, v8.0.1 | BD Bioscience | ||
| FcBlock | BD Bioscience | 564219 | |
| Fiji (Fiji Is Just ImageJ) | fiji.sc | ||
| Flow Jo software, v10 | TreeStar | ||
| FluoQ Plugin, v3-97 | |||
| Heraeus Megafuge 16R | Thermo Fisher Scientific | ||
| Human Sputum Leucocyte Elastase | Elastin Products Company | SE563 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Mini Rock-Shaker | PEQLAB Biotechnologie GmbH | MR-1 | |
| mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2 | BD Bioscience | 557742 Lot:8221983 | 1:50 |
| mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8 | BD Bioscience | 557820 Lot:8208791 | 1:50 |
| mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1 | BD Bioscience | 557833 Lot:8059688 | 1:33 |
| mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5 | BioLegend | 305122 Lot:B241921 | 1:50 |
| mSAM | in house | 2 mM | |
| Multipette plus | Eppendorf AG | ||
| NEmo-1 | SiChem | SC-0200 | 1 mM |
| NEmo-2E | SiChem | SC-0201 | 2 mM |
| Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer | Pari | 085G3001 | |
| phosphate buffered saline | Gibco | 10010-015 | |
| ROTI Histokitt (mounting medium) | Carl Roth GmbH + Co.KG | 6638.1 | |
| Salbutamol | Teva GmbH | ||
| Sivelestat | Cayman Chemicals | 17779 | |
| Sputolysin | Calbiochem | 560000-1SET | |
| sSAM | in house | 2 mM | |
| SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Korkmaz, B., Moreau, T., Gauthier, F. Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: Physicochemical properties, activity and physiopathological functions. Biochimie. 90 (2), 227-242 (2008).
- Sheshachalam, A., Srivastava, N., Mitchell, T., Lacy, P., Eitzen, G. Granule Protein Processing and Regulated Secretion in Neutrophils. Frontiers in Immunology. 5, 448 (2014).
- Pham, C. T. N. Neutrophil serine proteases: Specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Gehrig, S., et al. Lack of neutrophil elastase reduces inflammation, mucus hypersecretion, and emphysema, but not mucus obstruction, in mice with cystic fibrosislike lung disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (9), 1082-1092 (2014).
- McKelvey, M. C., Weldon, S., McAuley, D. F., Mall, M. A., Taggart, C. C. Targeting proteases in cystic fibrosis lung disease paradigms, progress, and potential. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (2), 141-147 (2020).
- Clancy, D. M., et al. Extracellular Neutrophil Proteases Are Efficient Regulators of IL-1, IL-33, and IL-36 Cytokine Activity but Poor Effectors of Microbial Killing. Cell Reports. 22 (11), 2937-2950 (2018).
- Giacalone, V. D., Margaroli, C., Mall, M. A., Tirouvanziam, R. Neutrophil adaptations upon recruitment to the lung: New concepts and implications for homeostasis and disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-21 (2020).
- Sly, P. D., et al. Risk Factors for Bronchiectasis in Children with Cystic Fibrosis. New England Journal of Medicine. 368 (21), 1963-1970 (2013).
- Owen, C. A., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Campbell, E. J. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: A novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. Journal of Cell Biology. 131 (3), 775-789 (1995).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Margaroli, C., et al. Elastase Exocytosis by Airway Neutrophils Associates with Early Lung Damage in Cystic Fibrosis Children. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. , (2018).
- Owen, C., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Carolina, N. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: a novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. The Journal of cell biology. 131 (3), 775-789 (1995).
- Garland, M., Yim, J. J., Bogyo, M. A Bright Future for Precision Medicine: Advances in Fluorescent Chemical Probe Design and Their Clinical Application. Cell chemical biology. 23 (1), 122-136 (2016).
- Gehrig, S., Mall, M. A., Schultz, C. Spatially resolved monitoring of neutrophil elastase activity with ratiometric fluorescent reporters. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (25), 6258-6261 (2012).
- Guerra, M., et al. Cathepsin G Activity as a New Marker for Detecting Airway Inflammation by Microscopy and Flow Cytometry. ACS Central Science. 5 (3), 539-548 (2019).
- Hu, H. Y., et al. In vivo imaging of mouse tumors by a lipidated cathepsin S substrate. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (29), 7669-7673 (2014).
- Korkmaz, B., et al. Measuring elastase, proteinase 3 and cathepsin G activities at the surface of human neutrophils with fluorescence resonance energy transfer substrates. Nature Protocols. 3 (6), 991-1000 (2008).
- Craven, T. H., et al. Super-silent FRET Sensor Enables Live Cell Imaging and Flow Cytometric Stratification of Intracellular Serine Protease Activity in Neutrophils. Scientific Reports. 8 (1), 13490 (2018).
- Mu, J., et al. A small-molecule fret reporter for the real-time visualization of cell-surface proteolytic enzyme functions. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (52), 14357-14362 (2014).
- Hagner, M., et al. New method for rapid and dynamic quantification of elastase activity on sputum neutrophils from patients with cystic fibrosis using flow cytometry. European Respiratory Journal. 55 (4), 1902355 (2020).
- Dittrich, A. S., et al. Elastase activity on sputum neutrophils correlates with severity of lung disease in cystic fibrosis. European Respiratory Journal. , 1701910 (2018).
- Cobos-Correa, A., Trojanek, J. B., Diemer, S., Mall, M. A., Schultz, C. Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation. Nature Chemical Biology. 5 (9), 628-630 (2009).
- Hu, H. -Y., et al. FRET-based and other fluorescent proteinase probes. Biotechnology Journal. 9 (2), 266-281 (2014).
- Trojanek, J. B., et al. Airway mucus obstruction triggers macrophage activation and matrix metalloproteinase 12-dependent emphysema. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (5), 709-720 (2014).
- Wagner, C. J., Schultz, C., Mall, M. A. Neutrophil elastase and matrix metalloproteinase 12 in cystic fibrosis lung disease. Molecular and Cellular Pediatrics. 3 (1), 25 (2016).
- Gaggar, A., et al. The role of matrix metalloproteinases in cystic fibrosis lung disease. The European respiratory journal. 38 (3), 721-727 (2011).
- Guerra, M., et al. Protease FRET Reporters Targeting Neutrophil Extracellular Traps. Journal of the American Chemical Society. 142 (48), 20299-20305 (2020).
- Middleton, P. G., et al. Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor for Cystic Fibrosis with a Single Phe508del Allele. New England Journal of Medicine. 381 (19), 1809-1819 (2019).
