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Immunology and Infection

मानव थूक के नमूनों में न्यूट्रोफिल इलास्टेस और कैथेप्सिन जी गतिविधि की निगरानी

Published: May 21, 2021 doi: 10.3791/62193
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3,4, 1,2,5,6,7, 1,3,8
1Translational Lung Research Center Heidelberg (TLRC), German Center for Lung Research (DZL), 2Dept. of Translational Pulmonology, University of Heidelberg, 3Molecular Medicine Partnership Unit (MMPU), European Molecular Biology Laboratory (EMBL), University of Heidelberg, 4Faculty of Biosciences, Collaboration for Joint Ph.D. Degree between EMBL and Heidelberg University, University of Heidelberg, 5Dept. of Pediatric Pulmonology, Immunology and Critical Care Medicine, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 6Berlin Institute of Health (BIH), 7German Center for Lung Research (DZL), Associated Partner Site, Berlin, 8Dept. of Chemical Physiology and Biochemistry, Oregon Health and Science University
* These authors contributed equally

Summary

यहां वर्णित प्रोटोकॉल मानव थूक में न्यूट्रोफिल प्रोटेसेस की गतिविधि की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक गाइड प्रदान करते हैं। इस तरह के विश्लेषण के अनुप्रयोगों विरोधी भड़काऊ उपचार के मूल्यांकन से अवधि, बायोमार्कर सत्यापन, दवा स्क्रीनिंग और बड़े पलटन नैदानिक अध्ययन के लिए ।

Abstract

प्रोटेस अनगिनत शारीरिक प्रक्रियाओं के नियामक हैं और उनकी गतिविधियों की सटीक जांच एक पेचीदा जैव चिकित्सा चुनौती बनी हुई है। मानव जीनोम द्वारा एन्कोड किए गए ~ 600 प्रोटेस में, न्यूट्रोफिल सेरीन प्रोटीज (एनएसएस) को श्वसन रोगों सहित भड़काऊ स्थितियों की शुरुआत और प्रगति में उनकी भागीदारी के लिए अच्छी तरह से जांच की जाती है। विशिष्ट रूप से, स्रावित एनएसएप्स न केवल बाह्राश तरल पदार्थों के भीतर फैलाना बल्कि प्लाज्मा झिल्ली के लिए भी स्थानीयकरण करते हैं। न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (एनईटी) गठन के दौरान, एनएसएप्स स्रावित क्रोमेटिन का एक अभिन्न हिस्सा बन जाते हैं। इस तरह के जटिल व्यवहार NSPs रोगविज्ञान की समझ एक चुनौतीपूर्ण काम प्रदान करता है । यहां, विस्तृत प्रोटोकॉल थूक के नमूनों में स्वतंत्र और झिल्ली से बंधे न्यूट्रोफिल इलास्टेज (एनई) और कैथेप्सिन जी (सीजी) गतिविधियों की कल्पना, मात्रा और भेदभाव करने के लिए दिखाए गए हैं। एनई और सीजी एनएसएपी हैं जिनकी गतिविधियों में सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) के रोगजनन में प्लियोट्रोपिक भूमिकाएं होती हैं: वे ऊतक रीमॉडलिंग को बढ़ावा देते हैं, डाउनस्ट्रीम प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करते हैं और फेफड़ों की बीमारी की गंभीरता से सहसंबंधित होते हैं। प्रोटोकॉल दिखाते हैं कि तरल पदार्थ और सेलुलर अंश को कैसे अलग किया जाए, साथ ही छोटे अणु फॉस्टर प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण आधारित (FRET) संवाददाताओं के माध्यम से एंजाइमेटिक गतिविधि मात्राकरण के लिए मानव थूक से न्यूट्रोफिल का अलगाव कैसे किया जाए। एनई और सीजी गतिविधियों की सापेक्ष भूमिका में विशिष्ट अंतर्दृष्टि इकट्ठा करने के लिए, एक FRET readout विभिन्न प्रौद्योगिकियों द्वारा मापा जा सकता है: i) इन विट्रो प्लेट रीडर माप उच्च-थ्रूपुट और प्रोटीज गतिविधि के थोक का पता लगाने की अनुमति देते हैं; ii) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी स्पेटियोटम्पोरली कोशिका की सतह पर झिल्ली-बाध्य गतिविधि को हल करता है; iii) छोटे-अणु FRET प्रवाह साइटोमेट्री एकल-कोशिका प्रोटीज गतिविधि क्वांटिफिकेशन और फेनोटाइपिंग के माध्यम से विरोधी भड़काऊ उपचारों के तेजी से मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है। इस तरह के तरीकों का कार्यान्वयन एनएसएपी रोगविज्ञान और सीएफ और सीओपीडी के लिए रोग गंभीरता के बायोमार्कर के रूप में उनकी क्षमता का पता लगाने के लिए दरवाजे खोलता है। उनकी मानकीकरण क्षमता, उनके मजबूत readout और हस्तांतरण की सादगी को देखते हुए, वर्णित तकनीकों को अनुसंधान और नैदानिक प्रयोगशालाओं में कार्यान्वयन के लिए तुरंत साझा किया जा सकता है।

Introduction

न्यूट्रोफिल इलास्टेज (एनई), कैथेप्सिन जी (सीजी), प्रोटीनेज 3 (पीआर 3) और न्यूट्रोफिल सेरीन प्रोटीज 4 (एनएसपी4) चार न्यूट्रोफिल सेरीन प्रोटेसेस (एनएसएप्स)1हैं । उन्हें न्यूट्रोफिल प्राइमरी या अजूरोफिलिक कणिकाओं के भीतर माइलोप्रोक्सिडेस के साथ संग्रहित किया जाता है। उनकी श्रेष्ठ प्रोटेओलिटिक सामग्री के कारण, प्राथमिक कणिकाओं का स्राव कसकर विनियमित होता है और न्यूट्रोफिल को उत्तेजक औरउत्तेजनाओंको सक्रिय करने के साथ क्रमिक रूप से चुनौती दी जानी चाहिए।

फागोलिसोमेसोम के अंदर, एनएसएप्स इंट्रासेलर बैक्टीरियिसाइडल एजेंटों के रूप में कार्य करते हैं3। जब स्रावित किया जाता है, तो एनएसएपी सूजन के मजबूत मध्यस्थ बन जाते हैं: वे साइटोकिन्स और सतह रिसेप्टर्स को क्लीव करते हैं, समानांतर समर्थक भड़काऊरास्ते 3को सक्रिय करते हैं। महत्वपूर्ण बात, भड़काऊ स्थितियों में एक अनियंत्रित एनएसएप्स स्राव की सुविधा है। उदाहरण के लिए, सूजन वाले वायुमार्ग के भीतर, अत्यधिक एनई गतिविधि बलगम हाइपरसेक्रेशन, गोबलेट कोशिकाओं मेटाप्लासिया, सीएफटीआर निष्क्रियता और बाह्य मैट्रिक्स रिमॉडलिंग4, 5का कारणबनतीहै। कैथेप्सिन जी सूजन में भी भाग लेता है: यह विशेष रूप से आईएल-1 परिवार, आईएल-36α और आईएल-36ο6के दो घटकों को विशेष रूप से क्लीव्स और सक्रिय करता है। एनई के साथ संगीत कार्यक्रम में, सीजी क्लीव्स प्रोटीज-एयरवे एपिथेलियम पर सक्रिय रिसेप्टर्स और टीएनएफ-α और आईएल-11 को भी सक्रिय करता है।

अंतर्जात एंटी-प्रोटीज जैसे अल्फा-1-एंटीट्रीप्सिन, अल्फा-1-एंटीकिमोट्रीप्सिन और सीक्रेटरी ल्यूकोसिटे प्रोटीज अवरोधक न्यूट्रोफिल इलास्टेस और कैथेप्सिन जी गतिविधि5को विनियमित करते हैं। हालांकि, फेफड़ों की बीमारी की प्रगति के दौरान, प्रोटीज का निरंतर स्राव एंटी-प्रोटीज़ शील्ड को stoichiometrically से अधिक हो जाता है, जिससे वायुमार्ग में न्यूट्रोफिलिया को हल न किया जाता है, सूजन बिगड़ती है और ऊतक क्षति5,7। यद्यपि रोगी वायुमार्ग के घुलनशील अंशों में एनई एकाग्रता और गतिविधि को रोग गंभीरता8का एक आशाजनक बायोमार्कर दिखाया गया है, एनई और सीजी भी न्यूट्रोफिल प्लाज्मा झिल्ली से संबद्ध हैं और इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन9,10 के माध्यम से बाह्य डीएनए के लिए हैं जहां वे एंटी-प्रोटीज के लिए कम सुलभ हो जाते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रीक्लिनिकल अध्ययनों ने एक परिदृश्य को परिभाषित किया जहां कोशिका सतह से जुड़ी प्रोटीज गतिविधि पहले दिखाई देती है और/या अपने घुलनशील समकक्ष4,11से स्वतंत्र रूप से । वास्तव में, पता लगाने योग्य बनने के लिए, मुफ्त प्रोटीज़ गतिविधि को पहले एंटी-प्रोटीज़ शील्ड को अभिभूत करने की आवश्यकता होती है। इसके बजाय, कोशिका की सतह पर, झिल्ली से बंधे प्रोटीज गतिविधि सेल प्लाज्मा झिल्ली12के लिए बड़े अवरोधकों की पहुंच के कारण कम से आंशिक रूप से बरकरार रहती है। इस तरह के जटिल प्रोटीज व्यवहार के न्यूट्रोफिल-मध्यस्थता सूजन शुरुआत और प्रचार पर महत्वपूर्ण परिणाम होते हैं, और इसलिए सटीक और जानकारीपूर्ण उपकरणों के साथ जांच किए जाने की आवश्यकता होती है।

इन वर्षों में, Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) आधारित जांच उपकरण है कि कुशलता से और तेजी से मानव नमूनों में एक विशिष्ट प्रोटीज गतिविधि का आकलन के रूप में कई जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों पाया13। कार्य करने के लिए, प्रोटीज़ रिपोर्टर्स एक मान्यता आकृति (यानी, एक पेप्टाइड) से बना होते हैं, जो लक्ष्य एंजाइम द्वारा मान्यता प्राप्त है और एक भौतिक प्रक्रिया पर भरोसा करता है, जहां उत्तेजन पर, एक दाता फ्लोरोफोर एक स्वीकार्य अणु को ऊर्जा स्थानांतरित करता है। रिपोर्टर पर एंजाइम द्वारा संचालित प्रसंस्करण, अर्थात् मान्यता भाग का दरार, स्वीकारकर्ता में परिणाम दाता से दूर फैलाना: एंजाइम गतिविधि इसलिए स्वीकारकर्ता फ्लोरेसेंस पर दाता में एक समय पर निर्भर परिवर्तन के रूप में मापा जाता है । इस तरह के पढ़े-जाने से आत्म-सामान्य और अनुपातमेट्रिक होता है, इसलिए पीएच और स्थानीय जांच एकाग्रता जैसी पर्यावरणीय स्थितियों से केवल मामूली रूप से प्रभावित होता है । NEmo-114 और SSAM15 FRET जांच है कि क्रमशः पूर्वोत्तर और तटरक्षक गतिविधि पर विशेष रूप से रिपोर्ट कर रहे हैं । हालांकि, ऐसे रिपोर्टर विशेष रूप से किसी भी सेलुलर डिब्बे में स्थानीयकरण नहीं करते हैं, इसलिए उन्हें मानव तरल पदार्थ में मौजूद प्रोटीज गतिविधि की निगरानी के लिए नियोजित किया जाता है। स्थानिक रूप से स्थानीय फैशन में प्रोटीज गतिविधि की निगरानी करने के लिए, हमने और अन्य लोगों ने एसवाईआरटी जांच विकसित की जो आणविक टैग 14 ,15, 16 ,17,18,19के माध्यम से उपकोशिकीय घटकों से संबद्ध है। इस तरह की सिंथेटिक रणनीति ने एनएमओ-2 और एमएसएएम के विकास की अनुमति दी, दो FRET जांच लिपिड एंकर से लैस हैं जो प्लाज्मा झिल्ली का स्थानीयकरण करते हैं। इन रिपोर्टर्स ने सिस्टिक फाइब्रोसिस और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज14,15में एनई और सीजी प्रोटेसे की गहरी समझ को शह दी .

यहां, एनईएमओ और एसएआरटी जांच की सैम श्रृंखला के माध्यम से मानव थूक में घुलनशील और झिल्ली से बंधे एनई और सीजी गतिविधियों के दृश्य और मात्राकरण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं। एनएसएपी रोगविज्ञान के विविध पहलुओं को संबोधित करने और उपयोगकर्ता-विशिष्ट आवश्यकता के अनुसार नियोजित किए जा सकने वाले तरीकों की एक सरणी प्रदान करने के लिए, फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण दिखाया गया है।

Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल मानव थूक पर किए गए विश्लेषण का वर्णन करते हैं। मानव नमूना हैंडलिंग हीडलबर्ग विश्वविद्यालय की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और लिखित सहमति सभी रोगियों या उनके माता पिता/कानूनी संरक्षक (एस-370/2011) और स्वस्थ नियंत्रण (एस-046/2009) से प्राप्त किया गया था ।

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल नमूना तैयारी और न्यूट्रोफिल सेरीन प्रोटेसेस (एनएसएप्स) गतिविधि के मात्राकरण का वर्णन करते हैं। यहां प्रस्तुत प्रायोगिक प्रक्रियाएं मानव थूक और न्यूट्रोफिल इलास्टेस14,20,21 (एनई) या कैथेप्सिन जी15 (सीजी) गतिविधि माप पर ध्यान केंद्रित करती हैं। हालांकि, नमूना तैयारी प्रोटोकॉल में मामूली अनुकूलन रक्त-व्युत्पन्न कोशिकाओं और ट्यूमर समरूपता के विश्लेषण को संभव प्रदान करते हैं। इसके अलावा, मैट्रिक्स मेटललोप्रोटीज 12 और कैथेप्सिन एस गतिविधियों की जांच इसी तरह समर्पित FRET जांच22,23, 24,25,26केमाध्यम से की जा सकती है।

1. नमूना तैयारी: सेल अलगाव और सुपरनैंट जुदाई

नोट: यदि संभव हो, तो थूक का उपचार उम्मीद के बाद 120 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए और थूक को आगे की प्रक्रिया तक बर्फ पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।

  1. यदि थूक की सहज उम्मीद संभव नहीं है, तो थूक को पहले19वर्णित प्रेरित करें। थूक प्रेरण प्रक्रिया शुरू करने से पहले β-2-रिसेप्टर-विरोधी साल्बुटामोल के 200 माइक्रोन को श्वास लें। बाद में, नेबुलाइजर का उपयोग करके 15 मिनट के लिए हाइपरटॉनिक (6%) खारा समाधान श्वास लें। पेट्री डिश में उम्मीद के साथ थूक ले लीजिए।
  2. बलगम के झुरमुटों को लार से एक पेट्री डिश में पिपेट टिप की मदद से अलग करें।
  3. बलगम का वजन करें।
    नोट: बलगम नमूनों का औसत वजन 0.8 ग्राम (0.1 ग्राम और 5 ग्राम के बीच भिन्न) है; 0.1 ग्राम आमतौर पर उल्लिखित प्रक्रियाओं को करने के लिए पर्याप्त होते हैं।
  4. थूक के प्रत्येक ग्राम के लिए 10% स्पुटालिसिन (पीबीएस में) के 4 भागों (v/w) को जोड़ें (उदाहरण के लिए: 10% स्पुटालिसिन के 4 एमएल)।
    सावधानी: स्पुटाइसिन फॉस्फेट बफर में केंद्रित डिइयोथरेइटॉल से बना है, इसलिए इसे देखभाल के साथ संभालें।
  5. बलगम को भंग करने के लिए 15 मिनट के लिए एक कमाल के शेखर पर कमरे के तापमान (आरटी) पर मिश्रण को इनक्यूबेट करें। सुरक्षा कारणों से, शेखर को धूम हुड में रखें।
  6. ठंडे पीबीएस की एक ही मात्रा जोड़कर प्रतिक्रिया को बुझाएं (उदाहरण के लिए: 10% स्पुतिसिन के प्रत्येक एमएल के लिए ठंडे पीबीएस का 1 एमएल)।
  7. एक समरूप समाधान प्राप्त करने के लिए पिपिंग द्वारा मिलाएं।
  8. मिश्रण को 100 माइक्रोन नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से 50 एमएल ट्यूब में फ़िल्टर करें।
  9. एक 40 μm नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से छानने का काम कदम दोहराएं।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए समाधान अपकेंद्रित्र करें।
  11. सुपरनेट अंश को ध्यान से एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे बर्फ पर स्टोर करें।
    नोट: सुपरनिटेंट अंशों को आगे के विश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  12. धीरे-धीरे ठंडे पीबीएस के 500 माइक्रोल में सेल पेलेट को फिर से रीसस्ट करें और इसे बर्फ पर रखें।
    नोट: सेल अंश को तुरंत संसाधित किया जाना चाहिए।

2. न्यूट्रोफिल सेरीन प्रोटीज गतिविधि माप

नोट: यहां, FRET संवाददाताओं के माध्यम से NSPs गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए विभिन्न तरीकों को पेश किया जाता है। प्रौद्योगिकी का चुनाव विशिष्ट जैव चिकित्सा प्रश्न और प्रयोग के उद्देश्य से तय होता है। प्रस्तुत की गई जांच में फेफड़ों के प्रासंगिक एंजाइमों14,15के एक सेट के खिलाफ उनकी विशिष्टता के लिए व्यापक रूप से परीक्षण किया गया था । हालांकि जांच उनके लक्ष्य एंजाइम की ओर विशिष्ट हैं, हमेशा ब्याज के नैदानिक नमूने पर जांच विशिष्टता की जांच करें । यह जांच के अलावा से पहले एक विशिष्ट प्रोटीज अवरोधक के साथ नमूने को इनक्यूबेटिंग करके प्राप्त किया जा सकता है, जो डी/ए अनुपात में किसी भी वृद्धि को समाप्त करना चाहिए ।

  1. फ्लोरीमीटर या प्लेट रीडर परख के माध्यम से घुलनशील एनएसएप्स गतिविधि मात्राकरण
    नोट: नमूने के घुलनशील अंशों में प्रोटीज गतिविधि फ्लोरेसेंस का पता लगाने में सक्षम किसी भी उपकरण के साथ पता लगाया जा सकता है।
    1. बर्फ पर एंजाइमों गल।
    2. उपयोग होने तक, आत्म-दरार को रोकने के लिए अम्लीय भंडारण बफर (50 एमएम सोडियम एसीटेट, 200 mM NaCl, पीएच 5.5) में एनई और सीजी रखें।
    3. एंजाइम मानक वक्र स्थापित करने के लिए, एक्टिवेशन बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5 में 500 एमएन एनएसीएल) में एंजाइम (एनई के लिए 33.9 - 0.271 एनएम; सीजी के लिए 42.6 - 0.333 एनएम) तैयार करें। सक्रियण बफर में एक तटस्थ पीएच होता है और इसलिए एंजाइमेटिक उत्प्रेरक को कुशलतापूर्वक होने में सक्षम बनाता है।
      1. उच्चतम मानक एकाग्रता (एनई एकाग्रता: 33.9 एनएम), सक्रियण बफर के 999 माइक्रोन में एनई (33.9 माइक्रोन) के 1 माइक्रोन को पतला करने के लिए।
      2. दूसरा मानक (एनई एकाग्रता: 16.95 एनएम) तैयार करने के लिए, एक्टिवेशन बफर के 200 माइक्रोन के साथ पहले कमजोर पड़ने के 200 माइक्रोन मिलाएं।
      3. शेष 1:2 कमजोर पड़ने को तैयार करने के लिए तदनुसार आगे बढ़ें।
      4. अंतिम मानक, जो खाली है, शुद्ध सक्रियण बफर से बना है। तकनीकी डुप्लिकेट या ट्रिपलिट्स के माप की सिफारिश की जाती है। मानक और नमूना तैयार करने के दौरान, बर्फ पर शीशियों को रखने की कोशिश करें।
    4. मानक तैयारी के समानांतर, सक्रियण बफर में थूक के नमूनों को पतला करें। रिपोर्टर सिग्नल (दाता/स्वीकारकर्ता अनुपात) की वृद्धि की रैखिक सीमा में बने रहने के लिए उनकी प्रोटीज गतिविधि का आकलन करने से पहले मानव नमूनों को पतला करें। यदि रोगी के नमूनों को बिना पतला छोड़ दिया गया था, दरार एक विश्वसनीय फिटिंग के लिए भी तेजी से होगा । चूंकि स्वस्थ दाता थूक में सीएफ और सीओपीडी रोगियों के नमूनों की तुलना में कम सक्रिय प्रोटेसे होते हैं, इसलिए आम तौर पर विभिन्न कमजोर पड़ने (स्वस्थ थूक सुपरनेट के लिए 1:10, सीओपीडी या सीएफ रोगियों के थूक सुपरनेट के लिए 1:20-500) किए जाते हैं।
      नोट: नमूनों में प्रोटीज गतिविधि को मापने के लिए जहां उनकी एकाग्रता अज्ञात है, ज्ञात एंजाइम सांद्रता के साथ एक मानक वक्र को समानांतर रूप से मापा जाना चाहिए, आदर्श रूप से एक ही प्लेट पर। मानव थूक में सक्रिय एंजाइम की एकाग्रता की गणना मानक घटता के साथ मापा लोगों के साथ मानव थूक के नमूनों में मापा ढलानों को इंटरपोलेट करने के माध्यम से किया जाता है।
    5. माप के लिए नमूने तैयार करने से पहले, उपकरण स्थापित करें। पूर्वोत्तर FRET जांच (NEmo-114)के लिए 354 एनएम के लिए उत्साह तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें, और दाता के लिए 400 एनएम और स्वीकारकर्ता के लिए 490 एनएम के लिए पहचान तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें। सीजी FRET जांच (एसएसएएम15) से 405एनएम के लिए उत्साह तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें, और उत्सर्जन को 485 (दाता) और 580 एनएम (स्वीकारकर्ता) तक सेट करें।
    6. एक काले ९६-अच्छी तरह से आधा क्षेत्र प्लेट के कुओं में नमूने, मानक या खाली के ४० μL जोड़ें ।
    7. रिपोर्टर्स (मास्टर मिक्स में रिपोर्टर की एकाग्रता: 10 माइक्रोन) युक्त मास्टर मिक्स तैयार करने के लिए, एक्टिवेशन बफर में 1:100 जांच स्टॉक (डीएमएसओ में 1 mm) को पतला करें। आवश्यक प्लेट कुओं की संख्या 10 माइक्रोन एक्स गुणा करके आवश्यक मास्टर मिक्स वॉल्यूम तैयार करें। NEmo-1 और sSAM संवाददाताओं के फ्लोरेसेंस माप के लिए इष्टतम अंतिम एकाग्रता (2 माइक्रोन) तक पहुंचने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से मास्टर मिश्रण के 10 माइक्रोन जोड़ें (या तो नमूना, मानक या खाली के 40 माइक्रोन युक्त) और readout शुरू करते हैं। इसलिए NEmo-1 और SSAM रिपोर्टर्स क्रमशः घुलनशील न्यूट्रोफिल इलास्टेज और कैथेप्सिन जी गतिविधि की निगरानी करेंगे ।
      नोट: यदि कोई अभिवात इंजेक्टर उपलब्ध नहीं है, तो नमूनों के लिए रिपोर्टर अतिरिक्त के बाद जितनी जल्दी हो सके readout शुरू करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    8. प्लेट रीडर माप शुरू करें और दाता/स्वीकारकर्ता अनुपात को कम से कम 20 मिनट के लिए हर 60-90 सेकंड में वृद्धि दर्ज करें या जब तक सिग्नल में वृद्धि एक पठार तक नहीं पहुंच जाती है।
    9. एक बार डेटा निर्यात कर रहे हैं, दाता/स्वीकारकर्ता अनुपात (डी/एक अनुपात) की गणना दाता सापेक्ष फ्लोरेसेंस इकाइयों (RFU) प्रत्येक बार बिंदु और नमूना के लिए स्वीकारकर्ता RFU के साथ विभाजित करके ।
    10. प्रत्येक नमूने के डी/ए अनुपात का मतलब और मानक विचलन की गणना करें ।
    11. डी/ए अनुपात परिवर्तन के रैखिक विकास के भीतर ढलान का निर्धारण करें । ढलान एक FRET जांच के लिए एंजाइम दरार दर का एक संकेतक है। एंजाइम मानक से गणना किए गए लोगों के साथ मानव नमूनों से प्राप्त रैखिक प्रतिगमन ढलानों को फिट करके थूक में सक्रिय एंजाइम की एकाग्रता की गणना करें।
  2. फ्लोरीमीटर या प्लेट रीडर परख के माध्यम से झिल्ली-बाध्य एनएसएप्स गतिविधि मात्राकरण
    1. ऊपर वर्णित थूक कोशिकाओं को अलग करें। पीबीएस के40 माइक्रोन की मात्रा में 3 x 10 4 कोशिकाओं को फिर से पेंड करें। प्लेट रीडर में कोशिकाओं को अच्छी तरह से जोड़ें।
    2. यंत्र स्थापित करें। झिल्ली से बंधे एनई FRET जांच (NEmo-214)के लिए ४०५ एनएम के लिए उत्साह तरंगदैर्ध्य सेट करें, और दाता के लिए ४८५ एनएम और स्वीकारकर्ता के लिए ५८० एनएम के लिए पहचान तरंगदैर्ध्य सेट करें । झिल्ली से बंधे सीजी FRET जांच (एमएसएएम15) से 405एनएम के लिए उत्साह तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें, और उत्सर्जन को 485 (दाता) और 580 एनएम (स्वीकारकर्ता) तक सेट करें।
    3. संवाददाताओं युक्त मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए, एक्टिवेशन बफर में जांच स्टॉक को 10 माइक्रोन की एकाग्रता तक पतला करें। आवश्यक प्लेट कुओं की संख्या 10 माइक्रोन एक्स गुणा करके आवश्यक मास्टर मिक्स वॉल्यूम तैयार करें। NEmo-2 और mSAM संवाददाताओं के फ्लोरेसेंस माप के लिए इष्टतम अंतिम एकाग्रता (2 माइक्रोन) तक पहुंचने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से मास्टर मिश्रण के 10 माइक्रोन जोड़ें (या तो नमूना, मानक या खाली के 40 माइक्रोन युक्त) और readout शुरू करते हैं। इसलिए एनईएमओ-2 और एमएनएएम रिपोर्टर्स क्रमशः झिल्ली से बंधे न्यूट्रोफिल इलास्टेस और कैथेप्सिन जी गतिविधि की निगरानी करेंगे।
      नोट: एक सेलुलर नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, कोशिकाएं जो सक्रिय रूप से एनएसएपी को स्रावित नहीं करती हैं। उदाहरण के लिए, 3 x 104 ल्यूकोसाइट जनक एचएल-60 प्रोमाइलोसाइटिक कोशिकाओं के साथ संवाददाताओं की इनक्यूबेशन एक वैध दरार नकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है।
    4. दाता/स्वीकारकर्ता अनुपात में कम से कम 20 मिनट के लिए या जब तक संकेत की वृद्धि एक पठार तक पहुंचता है रिकॉर्ड परिवर्तन । ऊपर वर्णित डेटा का विश्लेषण करें।
  3. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से झिल्ली से बंधे एनएसएप्स गतिविधि माप
    1. उन स्थितियों की संख्या निर्धारित करें जिनका विश्लेषण किए जाने की आवश्यकता है।
      नोट: प्रत्येक थूक नमूना माप के लिए, अतिरिक्त सकारात्मक (पीसी) और नकारात्मक (नेकां) नियंत्रण की तैयारी और विश्लेषण की सिफारिश की जाती है।
    2. प्रत्येक माप के लिए, 1.5 एमएल ट्यूब में 50 माइक्रोन पीबीएस की मात्रा में 3 x 104 थूक कोशिकाओं को फिर से ढर्रादार करें।
    3. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, 100 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता पर एक विशिष्ट अवरोधक (सिवेलेस्टैट, विशिष्ट एनई अवरोधक, या कैथेप्सिन जी अवरोधक I, विशिष्ट सीजी अवरोधक) के साथ थूक कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। आरटी में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    4. सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, आरटी में 10 मिनट के लिए उपयुक्त एंजाइम (एनई या सीजी क्रमशः 340 एनएम या 200 एनएम पर) के साथ थूक कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    5. पीबीएस के 50 μL जोड़ें जिसमें FRET रिपोर्टर और एक परमाणु दाग (1:1000 अंतिम कमजोर पड़ने में) प्रत्येक ट्यूब (सकारात्मक नियंत्रण-उपचारित कोशिकाओं, नकारात्मक नियंत्रण-उपचारित कोशिकाओं और अनुपचारित कोशिकाओं) में जोड़ें ताकि 2 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता तक पहुंच सके। आरटी में 10-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      महत्वपूर्ण: एक परमाणु दाग के अलावा फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी इमेजिंग की सुविधा के रूप में यह FRET जांच चैनलों का उपयोग कर के बिना ब्याज की थूक कोशिकाओं के लिए खोज करने के लिए और इसलिए रिपोर्टर विरंजन से बचने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, डीएनए दाग उनके नाभिक के आकार के अनुसार थूक कोशिकाओं को खंडित करने की अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, न्यूट्रोफिल को उनके बहुभाषी नाभिक द्वारा आसानी से पहचाना जा सकता है। इसके अलावा, कोशिकाओं की व्यवहार्यता के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्राप्त की जा सकती है (अधिक खंडित नाभिक वाले न्यूट्रोफिल जीवित होने की अधिक संभावना रखते हैं)।
      नोट: झिल्ली से बंधे एक के अलावा, मानव थूक में डीएनए-बाध्य NE या CG की गतिविधि एच-एनई और एच-सीजी के माध्यम से उसी तरह मापा जा सकता है, बाह्यश डीएनए-संबद्ध FRET जांच27। मास्टर मिक्स तैयार करते समय, एच-एनई और एच-सीजी को 10 माइक्रोन की एकाग्रता में जोड़ा जा सकता है और साइटोस्पिन और स्लाइड तैयारी से पहले थूक के साथ इनक्यूबेटेड किया जा सकता है। अतिरिक्त कोशिकीय डीएनए पर डी/ए अनुपात मात्राकरण NEmo-2 और mSAM के लिए समान रूप से आय, केवल अंतर है कि बाह्राश डीएनए समुच्चय एकल कोशिकाओं के बजाय खंडित कर रहे है27।
    6. बर्फ के 100 माइक्रोल जोड़कर प्रतिक्रिया को बुझाएं- ठंडा पीबीएस, और बर्फ पर नमूने स्थानांतरित करें।
    7. साइटोस्पिन मिश्रण को माइक्रोस्कोपी स्लाइड, एयर ड्राई, आइस कोल्ड मेथनॉल के साथ 10% के लिए 10 मिनट, एयर ड्राई और माउंट पर एक उपयुक्त बढ़ते माध्यम के साथ फिक्स करें।
      नोट: माइक्रोस्कोपी स्लाइड को आगे के विश्लेषण तक एक महीने तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    8. पीएल एपीओ 40x या 63x तेल उद्देश्य के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके माइक्रोस्कोपी छवियों को प्राप्त करें। छवि की गुणवत्ता बढ़ाने और अधिग्रहण के समय को कम करने के लिए एक अनुक्रमिक छवि अधिग्रहण मोड की सिफारिश की जाती है।
      1. छवि परमाणु दाग पहले हीलियम-नीयन-लेजर लाइन के साथ ६३३ एनएम उत्तेजन के माध्यम से और ६५० और ७१५ एनएम के बीच अपने उत्सर्जन रिकॉर्ड ।
      2. एक आर्गन लेजर के साथ 458 एनएम पर उत्तेजन पर 470 और 510 एनएम के बीच FRET रिपोर्टर के दाता (coumarin 343) रिकॉर्ड। एकमात्र दाता उत्तेजन के बाद 570 और 610 एनएम के बीच संवेदनशील स्वीकारकर्ता (5,6-TAMRA) उत्सर्जन प्राप्त करें।
      3. डायोड पंप सॉलिड स्टेट (डीपीएस) लेजर का उपयोग करके 561 एनएम पर 561 एनएम पर 470 और 510 एनएम के बीच एक अलग चैनल में प्रत्यक्ष स्वीकार्य उत्सर्जन रिकॉर्ड करें।
      4. प्रयोग की शुरुआत में पिनहोल सेट करें और इमेजिंग सत्र के दौरान बनाए रखें।
        नोट: उनके छोटे आकार के कारण, न्यूट्रोफिल को ठीक से कल्पना करने के लिए 40x या 63x माइक्रोस्कोप उद्देश्य के उपयोग की सिफारिश की जाती है। आमतौर पर, छवियों को अधिग्रहण के दौरान रिपोर्टर की फोटोब्लैचिंग को रोकने के लिए लंबे समय तक उत्तेजन तरंग दैर्ध्य के साथ शुरू करते हुए लगातार कई चैनलों में प्राप्त किया जाता है।
    9. छवि निर्णायक आंकड़ों के लिए प्रति शर्त कम से १०० कोशिकाओं । माइक्रोस्कोपी छवियों के विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें: कोशिकाओं को खंडित करें और पिक्सेल-बाय-पिक्सेल आधार पर डी/ए अनुपात की गणना करें, बाद में ब्याज के किसी दिए गए क्षेत्र के मतलब या औसत की गणना करें जिसे उपयोगकर्ता द्वारा मैन्युअल रूप से चुना जाता है। प्रतिनिधि परिणामों के लिए चित्र 1देखें ।

Figure 1
चित्रा 1:प्रतिनिधि छवियां और सीएफ रोगी थूक से अलग न्यूट्रोफिल पर झिल्ली से बंधे NE गतिविधि की मात्रा । क)रिपोर्टर NEmo-2 (2 μM) के अलावा १०० माइक्रोएम के साथ 10 मिनट के लिए न्यूट्रोफिल्स की प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां (शीर्ष पैनल) 10 मिनट के लिए या रिपोर्टर NEmo-2 (2 μM) के अलावा से पहले अनुपचारित (w/o) (नीचे पैनल) छोड़ दिया । बाईं ओर से पहला कॉलम परमाणु दाग, दूसरा दाता चैनल, तीसरा स्वीकारकर्ता चैनल और पिछले गणना डी/एक अनुपात एक पिक्सेल-बाय-पिक्सेल आधार पर दाता और स्वीकार्य चैनलों को विभाजित करके प्राप्त दिखाता है । ब्याज के क्षेत्र (एकल न्यूट्रोफिल) की सीमाओं को धराशायी रेखा के रूप में चित्रित किया गया है। स्केल (10 माइक्रोन) और अंशांकन बार (डी/ए अनुपात) इंगित किए जाते हैं । ख)बॉक्स-और डॉट-प्लॉट एक प्रतिनिधि सीएफ रोगी से थूक न्यूट्रोफिल के डी/ए अनुपात को दिखाते हैं । अवरोधक और अनुपचारित कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेटेड कोशिकाओं को क्रमशः ग्रे और नीले रंग में दिखाया जाता है। प्रत्येक डॉट एक कोशिका का प्रतिनिधित्व करता है (एन: w/अवरोधक = ११३ और w/o अवरोधक = ९६) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से झिल्ली-बाध्य एनएसएप्स गतिविधि माप
    1. 5 एमएल FACS पॉलीस्टीरिन राउंड-बॉटम ट्यूब में पीबीएस के 100 माइक्रोन में 1 x 106 कोशिकाओं को रेशपेंड करें और ट्यूब को बर्फ पर रखें।
    2. थूक न्यूट्रोफिल को गेट करने के लिए, निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग करें: सीडी 14 (1:50), सीडी 16 (1:50), सीडी 45 (1:33) और सीडी 66b (1:50)। सभी नमूनों के लिए पर्याप्त मास्टर मिश्रण तैयार करें। अंधेरे में बर्फ पर मास्टर मिक्स रखें।
    3. चित्रा 2में वर्णित गेटिंग रणनीति स्थापित करें । न्यूट्रोफिल को 7AAD-सीडी 45+सीडी 14-सीडी 16 + सीडी66बी+घटनाओं के रूप में जोड़ा जाता है। गेटेड घटनाओं को उनके दाता के लिए उनकी झिल्ली-बाध्य प्रोटीज गतिविधि के लिए विश्लेषण किया जाएगा (λएक्सी = 405 एनएम, λउन्हें = 450/50 एनएम) और स्वीकारकर्ता (λएक्सी = 405 एनएम, λउन्हें = 585/42 एनएम) मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता (एम एफआईएस)।
    4. प्रत्येक नमूने में एफसीब्लॉक के 2 माइक्रोन जोड़ें, और आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. प्रत्येक ट्यूब में चुने हुए एंटीबॉडी जोड़ें, और अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. ठंडे पीबीएस के 2 मिलील जोड़कर कोशिकाओं को धोएं, और 300 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें। कोल्ड पीबीएस के 200 माइक्रोन में सुपरनैंट और रिसिपेंड कोशिकाओं को त्यागें।
    7. 100 माइक्रोन प्रत्येक के साथ दो ट्यूबों में 200 माइक्रोन विभाजित करें और प्रत्येक ट्यूब में सेल व्यवहार्यता धुंधला समाधान के 5 माइक्रोन जोड़ें। बर्फ पर ट्यूब रखें।
    8. नकारात्मक नियंत्रण (एनसी) टेस्ट ट्यूब में 100 माइक्रोन पर सीजी उपयोग कैथेप्सिन जी अवरोधक I के लिए, 225 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता पर एनई उपयोग सिवेलस्टेट के लिए एक उपयुक्त विशिष्ट एनएसपी अवरोधक जोड़ें। अंधेरे में 10 मिनट के लिए आरटी में नमूनों को इनक्यूबेट करें ।
    9. नमूने में ठंडे पीबीएस के 100 माइक्रोन जोड़ें, इसे एक साफ FACS ट्यूब में 40 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें ताकि उपकरण की क्लोजिंग को रोका जा सके।
    10. नेकां के नमूने के लिए 4 माइक्रोनएम की अंतिम एकाग्रता पर रिपोर्टर (एनई, एनएमओ-2 के लिए, सीजी के लिए, 2 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता पर एमएसएएम) जोड़ें, धीरे-धीरे ट्यूब को भंवर दें।
    11. यदि आवश्यक हो, तो यदि आवश्यक हो, तो विशिष्ट अवरोधक के साथ इनक्यूबेटेड कोशिकाओं को प्राप्त करना शुरू करें, गेट्स के साथ-साथ रिपोर्टर पीएमटी वोल्टेज।
    12. रिकॉर्ड कम से कम 1000 न्यूट्रोफिल। नमूना कमरे के तापमान पर रखें।
      नोट: हालांकि अधिक घटनाओं को दर्ज किया जा सकता है, १००० कोशिकाओं को उचित आंकड़ों और रिकॉर्डिंग समय के बीच एक अच्छा समझौता सुनिश्चित करते हैं ।
    13. तदनुसार निम्नलिखित ट्यूबों (अनुपचारित थूक के नमूनों) के साथ आगे बढ़ें।
    14. झिल्ली से बंधे प्रोटीज गतिविधि के कारण डी/ए अनुपात में परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए, प्रत्येक ट्यूब से हर 5 से 10 मिनट तक 1000 न्यूट्रोफिल रिकॉर्ड करें।
      नोट: सफल FRET रिपोर्टर दरार के बाद, दाता चैनल MFIs तीव्रता समय के साथ वृद्धि होगी । स्वीकार्य चैनल एमएफआई तीव्रता को समय के साथ कम या स्थिर रहना चाहिए।
    15. गेटेड व्यवहार्य एकल न्यूट्रोफिल पर मापा नमूनों के लिए स्वीकार्य चैनल मूल्यों द्वारा दाता को विभाजित करके FRET अनुपात की गणना करें।
    16. उन्हें संबंधित 0 मिनट के समय बिंदु के साथ विभाजित करके नमूना-माप को सामान्य करें (प्रतिनिधि परिणामों और विश्लेषण के लिए चित्रा 2देखें)।
      नोट: डी/ए अनुपात परिवर्तन के गतिशील माप के लिए कम से कम दो समय अंक (यानी, 0 और 10 मिनट) की रिकॉर्डिंग आवश्यक है। प्रत्येक नमूने के लिए गतिविधि माप को सामान्य बनाने के लिए, बाद के समय बिंदुओं (जैसे, 10 मिनट) में मापा गया डी/ए अनुपात जांच अतिरिक्त (0 मिनट) के तुरंत बाद गणना किए गए अनुपात से विभाजित होता है ।

Figure 2
चित्रा 2:गेटिंग रणनीति और झिल्ली से बंधे NE गतिविधि के प्रतिनिधि भूखंडों सीएफ रोगी थूक से अलग न्यूट्रोफिल पर मापा । क)थूक न्यूट्रोफिल को गेट करने के लिए निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है: सीडी 14 (1:50), सीडी 16 (1:50), सीडी 45 (1:33) और सीडी 66b (1:50)। न्यूट्रोफिल को 7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ घटनाओं के रूप में गेट किया जाता है। gated घटनाओं उनके दाता के लिए विश्लेषण कर रहे है(λ exc= ४०५ एनएम, λउंहें= 450/50 एनएम) और स्वीकारकर्ता (λexc= ४०५ एनएम, λउंहें= 585/42 एनएम) मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता (MFIs) । ख)सीएफ थूक न्यूट्रोफिल के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम ने अपनी झिल्ली-बाध्य NE गतिविधि के लिए विश्लेषण किया। बाएं कॉलम दाता संकेत से पता चलता है, सही कॉलम स्वीकारकर्ता संकेत से पता चलता है । शीर्ष पंक्ति रिपोर्टर के अलावा से पहले 10 मिनट के लिए Sivelestat (w/) के साथ इलाज कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस तीव्रता का मतलब दिखाता है । नीचे पंक्ति अनुपचारित (w/o) कोशिकाओं जिसका रिपोर्टर फ्लोरेसेंस तुरंत मापा जाता है (0 मिनट, ग्रे) और 10 मिनट (नीला) रिपोर्टर इसके अलावा के बाद दिखाता है । न्यूट्रोफिल पैनल ए सी में दिखाई गई रणनीति के अनुसार गेट किए जातेहैं ) डेटा टेबल में कई समय बिंदुओं (0-3-5-10-15-20 मिनट) के साथ-साथ गणना किए गए डी/ए अनुपात पर मापा गया दाता और न्यूट्रोफिल पर स्वीकार्य संकेत के लिए कच्चे एमएफआई से मिलकर एक प्रतिनिधि डेटासेट दिखाया गया है । डी/ए अनुपात को सामान्यीकृत किया जा सकता है, यानी 0 मिनट टाइम पॉइंट (वाइट फॉन्ट) तक । 0 मिनट दाग थूक कोशिकाओं के साथ प्रवाह ट्यूब के लिए रिपोर्टर इसके अलावा के बाद जितनी जल्दी हो सके किया रिकॉर्डिंग इंगित करता है । एमएफआई डेटा को 1000 न्यूट्रोफिल के लिए मानक विचलन ± मतलब के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Representative Results

चित्रा 1ए में दिखाए गए परिणाम एक प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी डेटासेट को दर्शाते हैं। परमाणु संकेत का उपयोग उनकी विशेषता खंडित नाभिक द्वारा न्यूट्रोफिल की पहचान करने के लिए किया जाता है। ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) को मैन्युअल रूप से चुना जाता है (चित्र 1एमें धराशायी रेखा)। डी/ए अनुपात छवि की गणना पिक्सेल-बाय-पिक्सल आधार पर स्वीकार्य चैनल की तीव्रताओं द्वारा दाता चैनल की तीव्रता को विभाजित करके की जाती है । अंतिम चरण में औसत डी/ए अनुपात प्रति सेल (आरओआई) की गणना की जाती है। चित्रा 1b में प्रत्येक डॉट एक आरओआई (न्यूट्रोफिल) के मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। प्रति स्थिति लगभग 100 कोशिकाओं को छवि और मूल्यांकन करने की सिफारिश की जाती है।

चित्रा 2एमें एक प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति दिखाई गई है । इस तरह की गेटिंग से थूक न्यूट्रोफिल में भेदभाव और अध्ययन करने की अनुमति होती है। फ्लोरेसेंस स्पिलओवर या क्षतिपूर्ति कलाकृतियों से बचने के लिए, एक लेजर लाइन (जैसे, ब्लू लेजर) को FRET जांच फ्लोरेसेंस डिटेक्शन को समर्पित करने की सिफारिश की जाती है। प्रवाह साइटोमेट्री फ्लोरेसेंस मुआवजा एंटीबॉडी के लिए किया जाना चाहिए न कि FRET जांच के लिए। चित्रा 2b रिपोर्टर इसके अलावा के बाद 0 और 10 मिनट पर MFI वितरण दर्शाया गया है । चित्रा 2c में प्रत्येक पंक्ति 1000 थूक न्यूट्रोफिल के लिए मतलब दाता और स्वीकारकर्ता एमएफआई मूल्यों को इंगित करती है। डी/ए अनुपात की गणना दाता और स्वीकारकर्ता एमएफआई को विभाजित करके की जाती है । दाईं ओर चित्रा 2c में समय पाठ्यक्रम माप की प्रगति से पता चलता है: एक तेजी से प्रारंभिक वृद्धि के बाद, डी/एक अनुपात एक पठार तक पहुंचता है, झिल्ली की गतिविधि के अनुसार बाध्य एंजाइम ।

Discussion

रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल मानव थूक के नमूनों में न्यूट्रोफिल इलास्टेज और कैथेप्सिन जी की गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों की व्याख्या करते हैं। एक सफल एंजाइम गतिविधि माप के लिए महत्वपूर्ण अंक मैं) सटीक समय और ऑपरेटिव प्रक्रिया के मानकीकरण और ii) विश्वसनीय नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर रहे हैं । यदि इन स्थितियों को पूरा किया जाता है, तो वर्णित तरीके थूक तक ही सीमित नहीं हैं, लेकिन रक्त में प्रोटीज गतिविधि के विश्लेषण के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, ब्रोंकोएल्वोलार लावेज तरल पदार्थ और ऊतक अनुभाग या समरूपता।

तीन तकनीकों में से प्रत्येक की अपनी ताकत और सीमाएं हैं, जो अक्सर एक दूसरे के पूरक हैं। उदाहरण के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री दुर्लभ सेल आबादी के तेजी से विश्लेषण के साथ-साथ सेल फेनोटाइपिंग के लिए अनुमति देता है लेकिन स्थानिक संकल्प जानकारी का अभाव है, जिसे माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इसके बजाय, प्लेट रीडर माप एक उच्च थ्रूपुट फैशन में कई नमूनों या शर्तों के समानांतर मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं। चूंकि ताजा थूक कोशिकाओं को जमे हुए और संग्रहीत नहीं किया जा सकता है, इसलिए तीन तरीकों की आवश्यकता होती है कि अनुमान के बाद नमूनों को तेजी से संसाधित किया जाना चाहिए। यह झिल्ली-बाध्य गतिविधि मापों के लचीलेपन या थ्रूपुट को सीमित करता है। एक प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल का विकास जो जांच के बाद कोशिकाओं को ठीक करने की अनुमति देता है और एंजाइमेटिक दरार अधिक संख्या में ट्यूबों के समानांतर माप के लिए खुलेगा। इसके अलावा, FRET जांच की हैंडलिंग और भंडारण पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। दरअसल, पेप्टाइड सब्सट्रेट में मौजूद कुछ अमीनोएसिड्स जैसे मेथियोनिन ऑक्सीकरण से गुजरते हैं जिससे रिपोर्टर सेंसिटिविटी में कमी आती है । रिपोर्टर के शेल्फ लाइफ (20 डिग्री सेल्सियस पर लगभग तीन महीने का अनुमान) बढ़ाने के लिए, उन्हें नाइट्रोजन या आर्गन जैसी निष्क्रिय गैस के तहत छोटे वॉल्यूम एलिकोट्स (1-2μL) में संग्रहीत किया जा सकता है।

CF और अन्य पुरानी भड़काऊ फेफड़ों की बीमारियों में जितनी जल्दी हो सके सूजन का पता लगाना महत्वपूर्ण है, और विश्वसनीय बायोमार्कर में इस तरह के लक्ष्य को प्राप्त करने की क्षमता है। सतह से बंधे एनएसएप्स गतिविधि का पता लगाने की संभावना, जिसे आसपास के ऊतकों के लिए हानिकारक दिखाया गया है, उन परिस्थितियों में भी जब कोई या कम मुक्त एनई गतिविधि नहीं होती है, मूल्यवान जानकारी का एक और स्तर जोड़ता है, जिसे अन्य मौजूदा तरीकों के माध्यम से शायद ही हासिल किया जा सकता है4,11।

संवाददाताओं को विशेष रूप से अपनी शुरुआत में फेफड़ों की बीमारी की गंभीरता और प्रगति के साथ झिल्ली से बंधे एनएसपी गतिविधि के लिंक का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । तरीकों का उपयोग उपचार प्रभावकारिता (उदाहरण के लिए, विरोधी भड़काऊ उपचार या अत्यधिक प्रभावी सीएफटीआर मोडुलेटर और शक्तिशाली28)की निगरानी के लिए किया जा सकता है और न्यूट्रोफिल-चालित सूजन के परिणामस्वरूप गीला होने की जांच कर सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल गैर-आक्रामक नमूना प्रक्रियाओं पर आधारित हैं जो रोगी के लिए बहुत कम जोखिम लेते हैं और इसलिए, बहुत व्यापक पैमाने पर उपयोग किया जा सकता है और कई रोमांचक अनुप्रयोगों के लिए दरवाजे खोल सकते हैं।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते ।

Acknowledgments

इस परियोजना को जर्मन शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (FKZ 82DZL004A1 से एमए.M) और जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (एसएफबी-TR84TP B08 से एमए.M) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। इस पांडुलिपि में वर्णित काम को जर्मन सेंटर ऑफ लंग रिसर्च (डीजेएल) और एम.जी. के लिए पीएचडी फैलोशिप के माध्यम से ईएमबीएल हीडलबर्ग द्वारा समर्थित किया गया था। हम विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए जे Schatterny, एस Butz और एच Scheuermann शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µm Nylon cell strainer Corning Inc. 431752
2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader) PerkinElmer
35x10mm Dish, Nunclon Delta Thermo Fisher Scientific 150318
40 µm Nylon cell strainer Corning Inc. 431750
50 mL tubes Sarstedt 10535253
7-AAD, viability dye Bio Legend 420404 5 µL/100 µL
Balance OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd. PR124
BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL BD Bioscience 352054
BD LSRFortessa cell analyzer BD Bioscience
black flat bottom 96 well half area plate Corning Life Science 3694
Cathepsin G Elastin Products Company SG623
Cathepsin G Inhibitor I Merck KGaA 219372
Centrifuge 5418R Eppendorf AG EP5401000137
Combitips advanced 1.0 mL Eppendorf AG 0030 089 430
cOmplete proteinase inhibitor Roche 11697498001
Countig chambers improved Neubauer Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG 40442
coverslips Ø 25mm Thermo Fisher Scientific MENZCB00250RA003
Cytospin 4 Thermo Fisher Scientific
DRAQ5 (nuclear stain) BioStatus Limited DR50050 1:10000
FACSDiva software, v8.0.1 BD Bioscience
FcBlock BD Bioscience 564219
Fiji (Fiji Is Just ImageJ) fiji.sc
Flow Jo software, v10 TreeStar
FluoQ Plugin, v3-97
Heraeus Megafuge 16R Thermo Fisher Scientific
Human Sputum Leucocyte Elastase Elastin Products Company SE563
Leica SP8 confocal microscope Leica Microsystems
Mini Rock-Shaker PEQLAB Biotechnologie GmbH MR-1
mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2 BD Bioscience 557742 Lot:8221983 1:50
mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8 BD Bioscience 557820 Lot:8208791 1:50
mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1 BD Bioscience 557833 Lot:8059688 1:33
mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5 BioLegend 305122 Lot:B241921 1:50
mSAM in house 2 mM
Multipette plus Eppendorf AG
NEmo-1 SiChem SC-0200 1 mM
NEmo-2E SiChem SC-0201 2 mM
Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer Pari 085G3001
phosphate buffered saline Gibco 10010-015
ROTI Histokitt (mounting medium) Carl Roth GmbH + Co.KG 6638.1
Salbutamol Teva GmbH
Sivelestat Cayman Chemicals 17779
Sputolysin Calbiochem 560000-1SET
sSAM in house 2 mM
SuperFrost Plus Adhesion slides Thermo Fisher Scientific 10149870
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154

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References

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Frey, D. L., Guerra, M., Mall, M.… More

Frey, D. L., Guerra, M., Mall, M. A., Schultz, C. Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples. J. Vis. Exp. (171), e62193, doi:10.3791/62193 (2021).

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