Summary
Aquí se describen los métodos utilizados para estudiar el efecto funcional de las mutaciones RYR1 expresadas endógenamente en los linfocitos B humanos inmortalizados por el virus de Epstein Barr y las células satélite derivadas de biopsia muscular diferenciadas en miotubos.
Abstract
Se han identificado más de 700 variantes en el gen RYR1 en pacientes con diferentes trastornos neuromusculares incluyendo susceptibilidad a hipertermias malignas, miopatías centrales y miopatía centronuclear. Debido a los diversos fenotipos vinculados a las mutaciones RYR1 es fundamental caracterizar sus efectos funcionales para clasificar las variantes que portan los pacientes para futuras intervenciones terapéuticas e identificar variantes no patógenas. Muchos laboratorios se han interesado en desarrollar métodos para caracterizar funcionalmente las mutaciones RYR1 expresadas en las células de los pacientes. Este enfoque tiene numerosas ventajas, que incluyen: las mutaciones se expresan endógenamente, RyR1 no se sobreexpresa, se evita el uso de células heterólogas que expresan RyR1. Sin embargo, dado que los pacientes pueden presentar mutaciones en diferentes genes aparte de RYR1, es importante comparar los resultados del material biológico de individuos que albergan la misma mutación, con diferentes antecedentes genéticos. El presente manuscrito describe métodos desarrollados para estudiar los efectos funcionales de las variantes RYR1 expresadas endógenamente en: (a) linfocitos B humanos inmortalizados por el virus de Epstein Barr y (b) células satélite derivadas de biopsias musculares y diferenciadas en miotubos. Luego se monitorean los cambios en la concentración intracelular de calcio desencadenados por la adición de un activador farmacológico de RyR1. El tipo de célula seleccionado está cargado con un indicador de calcio fluorescente ratiométrico y los cambios intracelulares [Ca2+] se monitorean a nivel de una sola célula mediante microscopía de fluorescencia o en poblaciones celulares utilizando un espectrofluorómetro. Las curvas de respuesta a dosis agonistas en reposo [Ca2+],se comparan entre las células de los controles sanos y los pacientes que albergan variantes de RYR1, lo que lleva a una idea del efecto funcional de una variante dada.
Introduction
Hasta la fecha, se han identificado más de 700 variantes de RYR1 en la población humana y se han relacionado con diversos trastornos neuromusculares, incluida la susceptibilidad a la hipertermia maligna (MHS), la rabdomiólisis inducida por el ejercicio, la enfermedad del núcleo central (CCD), la enfermedad multi-minicore (MmD), la miopatía centronuclear (CNM)1,2,3 ; sin embargo, los estudios para caracterizar sus efectos funcionales están rezagados y solo aproximadamente el 10% de las mutaciones se han probado funcionalmente. Se pueden utilizar diferentes enfoques experimentales para evaluar el impacto de una variante RyR1 dada, incluida la transfección de células heterólogas como las células HEK293 y COS-7 con plásmido que codifica para el WT y el mutante RYR1 cDNA4,5, transducción de fibroblastos de ratón dispédicos con plásmidos y vectores que codifican para el WT y mutante RYR1 cDNA, seguido de transducción con myo-D y diferenciación en miotubos6 , generación de modelos animales transgénicos portadores de mutantes RyR1s7,8,9, caracterización de células de pacientes que expresan la variante RYR1 endógenamente10,11,12. Tales métodos han ayudado a establecer cómo las diferentes mutaciones afectan funcionalmente el canal RyR1 Ca2+.
Aquí, se describen los métodos desarrollados para evaluar los efectos funcionales de las mutaciones de RYR1. Se investigan varios parámetros de la homeostasis del calcio intracelular en células humanas que expresan endógenamente el canal de calcio RyR1, incluidos los miotubos y los linfocitos B inmortalizados por el virus de Epstein Barr (VEB). Las células se obtienen de los pacientes, se expanden en cultivo y se cargan con indicadores de calcio fluorescentes ratiométricos como Fura-2 o indo-1. Los parámetros que se ha informado que están alterados debido a mutaciones patógenas de RYR1, incluido el reposo [Ca2+],la sensibilidad a diferentes agonistas farmacológicos y el tamaño de las reservas intracelulares de Ca2+ se miden a nivel de una sola célula, utilizando microscopía de fluorescencia, o en poblaciones celulares utilizando un fluorímetro. Los resultados obtenidos en células de portadores de mutaciones se comparan con los obtenidos de miembros sanos de la familia de control. Este enfoque ha demostrado que: (i) muchas mutaciones relacionadas con MHS conducen a un aumento en el reposo [Ca2+] y un desplazamiento hacia la izquierda en la curva de dosis-respuesta a la despolarización inducida por KCl o a la activación farmacológica de RyR1 con 4-cloro-m-cresol10,11,12,13; (ii) las mutaciones relacionadas con CCD conducen a una disminución en el pico [Ca2+] liberado por activación farmacológica del RyR1 y a una disminución del tamaño si el Ca2+ intracelular almacena12,13,14,15; (iii) algunas variantes no afectan a la homeostasis de Ca2+13. Las ventajas de este enfoque experimental son: la proteína RyR1 no está sobreexpresada y los niveles fisiológicos están presentes, las células pueden ser inmortalizadas (tanto las células musculares como los linfocitos B) proporcionando líneas celulares que contienen mutaciones. Algunas desventajas se relacionan con el hecho de que los pacientes pueden portar mutaciones en más de un gen que codifica proteínas involucradas en la homeostasis del calcio y / o el acoplamiento de contracción de excitación (ECC) y esto puede complicar las conclusiones experimentales. Por ejemplo, se identificaron dos variantes de JP-45 en la población MHS y control y se demostró que su presencia impacta la sensibilidad del receptor de dihidropiridina (DHPR) a la activación16. Los pacientes deben estar disponibles, el material biológico debe ser recién recolectado y los permisos éticos deben obtenerse de las juntas éticas locales.
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Protocol
Los protocolos que se describen a continuación cumplen con las directrices éticas de la Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.
1. Preparación de las líneas celulares de linfocitos B inmortalizadas de Epstein Barr11
- Después del consentimiento informado, recolecte 30 ml de sangre total en tubos estériles tratados con EDTA de la probanda portadora de una mutación RYR1 y de miembros sanos de la familia sin mutación.
NOTA: Mantenga todas las soluciones estériles y trabaje en una campana de cultivo de tejidos. - Aislar células mononucleares de sangre total por medio de centrifugación de gradiente de densidad (por ejemplo, Ficoll-Hypaque, .077 g/L).
- Coloque 30 ml de sangre estéril en un tubo estéril cónico de 50 ml.
- Coloque la punta de una pipeta Pasteur que contenga el medio de centrifugación de gradiente de densidad en la parte inferior del tubo y la capa 20 ml estéril de solución de medios de centrifugación de gradiente de densidad lentamente debajo de la sangre.
- Centrifugar durante 30 min a 900 x g a 18°-20°C, sin rotura.
NOTA: La capa de células mononucleares aparece como un anillo turbio en la interfase entre la capa de medios de centrifugación de gradiente de densidad y la capa superior que contiene plasma enriquecido con plaquetas.
- Con una pipeta estéril, retire suavemente la capa interfase que contiene células mononucleares (aproximadamente 3-5 ml) y transfiera la solución a un tubo cónico estéril limpio de 50 ml.
- Agregue 20 ml de solución salina tampón de fosfato (PBS) para enjuagar las células, centrífuga durante 10 min a 600 x g a temperatura ambiente y resuspender el pellet en PBS. Repetir por un total de tres veces; esto garantiza que se eliminen todos los medios.
- Después del último lavado, resuspenda las células en 1-2 ml de medio de cultivo de tejidos (medio RPMI suplementado con suero fetal de ternero al 10%, 2 mM de L-glutamina y 100 unidades de penicilina y estreptomicina). Coloque las células mononucleares (aproximadamente 1 x 106 células) en un matraz de cultivo de tejidos T125 que contenga 20 ml de medio de cultivo de tejidos.
- Infectar células mononucleares con el virus de Epstein-Barr.
- Utilizar sobrenadantes de cultivos de líneas celulares B95.8 (que contengan10 2-10 3 unidades transformadoras/ml almacenados a -80 °C) como fuente de VEB.
- Resuspendir 1 x 106 células mononucleares del paso 1.5 en 20 mL de medio de cultivo tisular y exponerlas a 2 mL de sobrenadante de la línea celular B95.8 en presencia de ciclosporina A (concentración final de 0.2 μg/mL) para la infección.
- Coloque el matraz en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y permita que las células crezcan. Después de una semana cambiar el medio de cultivo.
NOTA: Una vez que las células B comienzan a proliferar, forman grupos reconocibles y crecen rápidamente para que los cultivos puedan expandirse y congelarse. - Extraer el ADN genómico de las líneas celulares de linfocitos B inmortalizadas por el VEB11 para confirmar la presencia o ausencia de la mutación dada.
2. Mediciones intracelulares de Ca2+
NOTA: Los cambios en la concentración intracelular de calcio de las líneas celulares de linfocitos B transformadas por el VEB se pueden monitorear en poblaciones celulares, con un espectrofluorómetro equipado con un agitador magnético y un soporte de cubeta ajustado a 37 ° C. Alternativamente, los cambios de Ca2+ se pueden monitorear en células individuales mediante microscopía de fluorescencia. En ambos casos se extraen células del matraz de cultivo tisular, se lavan dos veces con solución de Krebs Ringer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,20 mM HEPES, 1 mM NaHPO4,5,5 mM glucosa, pH 7,4 que contiene 1 mM CaCl2)y se cuentan.
- Para experimentos en poblaciones celulares utilizando un espectrofluorómetro11,13,14
- Resuspend las células a una concentración final de 1 x 107 células/mL en la solución de Krebs Ringer e incubar a 37°C durante 30 min con una concentración final de 5 μM Fura-2/AM.
- Centrifugar las células a 900 x g durante 10 min y resuspenderlas en la solución de Krebs Ringer a una concentración de 2 x 106 células/ml.
- Mida los cambios de fluorescencia (relación 340/380 nm) utilizando un espectrofluorómetro equipado con un agitador magnético ajustado a velocidad máxima y ajustado a 37 °C.
- Justo antes del experimento girar las células a 900 x g durante 5 min en una microcentrífuga y resuspendir rápidamente el pellet en 1,5 mL de la solución de Krebs Ringer con 0,5 mM de EGTA pero sin Ca2+añadido.
- Coloque las células en una cubeta de espectrofluorómetro de vidrio de 3 ml y registre la relación de fluorescencia (excitación de 340 nm / 380 nm, emisión de 510 nm).
- Lograr una línea base estable (aproximadamente 30 segundos), agregar la concentración seleccionada de agonista RyR1 (4-cloro-m-cresol, o 4-cmc) y registrar el transitorio de calcio.
NOTA: Se utiliza una solución madre de 300 mM de 4 cmc fabricada en DMSO como reactivo de partida. Esta solución se puede hacer por adelantado, alicitar y almacenar a -20 °C durante varios meses. - Realizar experimentos para diferentes concentraciones de 4 cmc.
NOTA: Incluya 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM a 1 mM para generar una curva dosis-respuesta de agonista versus cambio en [Ca2+]. Las diferentes concentraciones de 4 cmc se obtienen añadiendo el volumen apropiado de 4 cmc de la solución madre, directamente en la cubeta que contiene las celdas cargadas con Fura-2. Por ejemplo, para una concentración final de 300 μM 4-cmc, se agregan 1,5 μL de la solución madre a la cubeta que contiene 1,5 ml de células en la solución de Krebs Ringer. Para concentraciones agonistas más bajas, la solución madre de 300 mM debe diluirse a 75 mM con DMSO y agregarse el volumen apropiado a la cubeta que contiene 1,5 ml de células en la solución de Krebs Ringer. - Agregue 400 nM de talasgargina a las células para calcular la cantidad total de Ca2+ presente en las reservas intracelulares. Registre el pico Ca2+.
- Trazar el pico de calcio inducido por una concentración dada de 4 cmc versus el pico de calcio inducido por la talasgargina, que se considera 100% y construir una curva de respuesta a la dosis de 4 cmc comparando las células de un pariente proband y sano
- Para experimentos con células individuales13
- Diluya la poli-L-lisina 1:10 en H2O estéril y trate previamente las cubiertas de vidrio durante 30 min. Deje secar al aire bajo una campana de cultivo de tejidos estériles.
- Vuelva a suspender los linfocitos B transformados en VEB a una concentración final de 1 x 106 células/ml en la solución de Krebs Ringer que contiene 1 mM de CaCl2 y agregue una concentración final de 5 μM de Fura-2/AM.
- Coloque 1 ml de células en los cobertores tratados con poli-L-lisina e incube a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificado durante 30 minutos para permitir que las células del VEB se adhieran a la cubierta de vidrio durante la carga.
- Coloque el recambio en la cámara de perfusión e inicie la perfusión (a razón de 2 ml/min) con la solución de Krebs Ringer que contiene 1 mM Ca2+.
- Utilice un microscopio fluorescente invertido (equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 40x (apertura numérica de 0,17), filtros (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) para registrar mediciones en línea, con un accesorio de cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) controlado por software.
- Adquiera imágenes a intervalos de 1 s a un tiempo de exposición fijo (100 ms para longitudes de onda de excitación de 340 y 380 nm). Utilice software de imágenes para analizar los cambios en la fluorescencia. Mida el valor medio de píxeles para cada celda en longitudes de onda de excitación de 340 y 380 nm13.
- Para lograr la estimulación celular, use un estimulador de perfusión celular con 12 válvulas y agregue diferentes concentraciones de 4 cmc. La válvula de descarga contiene la solución de Krebs Ringer sin Ca2+ añadido más 100 μM La3+ para controlar la liberación de calcio de las reservas intracelulares solamente.
- Construir una curva dosis-respuesta de 4-cmc versus cambio en [Ca2+], como se describió anteriormente.
3. Preparación de miotubos humanos a partir de biopsias musculares10,12,15
NOTA: Diferentes laboratorios han utilizado diferentes métodos para obtener mioblastos y miotubos derivados de células satélite. A continuación se muestra la descripción del método utilizado en Basilea.
- Enjuague la biopsia muscular con PBS estéril para eliminar el exceso de sangre y cortar en pequeños fragmentos de aproximadamente 0.5-1 mm.
- Prepare 6 platos de cultivo de tejidos bien con inserto. Agregue 1.5 ml de medio de crecimiento muscular humano a cada pozo y 0.5 ml de medio de crecimiento muscular humano a cada inserto.
NOTA: El medio de crecimiento se compone de la siguiente manera: 500 ml del medio eagle modificado de Dulbecco con glucosa alta, o DMEM (4,5 mg / ml), que contiene 10% de suero de caballo, 5 ng / ml de insulina, 3 mM de glutamina, 600 ng / ml de penicilina G y estreptomicina, y 7 mM HEPES, pH 7.4. También se puede utilizar el medio de crecimiento del músculo esquelético disponible comercialmente. - Coloque 2-3 pequeños fragmentos musculares en cada inserto(Figura 1A)y coloque los platos de cultivo en la incubadora de cultivo celular (5% CO2, 37 ° C). Después de aproximadamente 8-10 días, se pueden ver células satélite creciendo fuera y alrededor de la biopsia muscular, unidas al inserto(Figura 1,B y C, flechas).
- Libere un número suficiente de células de la biopsia (después de aproximadamente 10-14 días), tripsinique de la siguiente manera:
- Retire todo el medio de cultivo, enjuague las células una vez con 1 ml de PBS, agregue 0,5 ml de solución de tripsina/EDTA (0,025% de tripsina y 0,01% de EDTA) e incube a 37 °C durante 5 min.
- Agregue 1 ml de medio de crecimiento a las células para neutralizar el efecto de la tripsina y transferir las células satélite a un nuevo matraz de cultivo de células T25; añadir 3 ml de medio de crecimiento y colocar las células en una incubadora de cultivo celular (5% CO2, 37 °C).
- Cambie el medio de crecimiento al día siguiente para eliminar el EDTA y posteriormente cambie el medio una vez por semana.
- Cuando los mioblastos son aproximadamente 75% confluentes, tripsinícelos y transfiéralos a una cubierta de vidrio tratada con laminina.
NOTA: Como proporción, las células que crecen en un matraz T25 deben transferirse a una cubierta de vidrio tratada con laminina de 43 mm de diámetro. La cubierta de vidrio debe colocarse dentro de una placa de cultivo de tejidos de 60 mm de diámetro que contenga 3 ml de medio de crecimiento. - Cultive células en la cubierta de vidrio en medio de crecimiento en una incubadora de cultivo celular (5% CO2, 37 ° C) cambiando el medio una vez por semana. Al 90% de confluencia, cambie al medio de diferenciación compuesto de la siguiente manera: DMEM de glucosa alta (4,5 mg / ml), albúmina sérica bovina al 0,5%, factor de crecimiento epidérmico de 10 ng / ml, creatina de 0,15 mg / ml, insulina de 5 ng / ml, glutamina de 200 mM, penicilina G y estreptomicina 600 ng / ml, y 7 mM HEPES, pH 7.4). También se puede utilizar un medio de diferenciación disponible comercialmente. Cambie el medio de diferenciación una vez por semana.
- Después de 7-10 días en medio de diferenciación, los miotubos multinucleados son visibles. Evalúe los cambios en [Ca2+] dentro de una semana, como se describe a continuación.
4. [Ca2+]i medidas de relación determinadas con Fura-2
- Cargue miotubos cultivados con virutas de vidrio con Fura-2/AM (concentración final de 5 μM) diluidos en DMEM durante 30 min a 37 °C. Brevemente, retire el medio de diferenciación de las células cultivadas con cubierta de vidrio y agregue 2 ml de medio de diferenciación fresco. Añadir 10 μL de Fura-2 AM a partir de una solución madre de 1 mM e incubar 30 min en una incubadora de cultivo celular (5% CO2, 37 °C).
- Transfiera la tapa de vidrio a la cámara de perfusión y enjuague las células con la solución de Krebs Ringer que contiene 2 mM CaCl2.
- Realice mediciones en línea [Ca2+] como se describió anteriormente en la sección de celda única del VEB con el uso de un objetivo FLUAR de inmersión en agua de 20x (apertura numérica de 0.17).
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Representative Results
[Ca2+]i mediciones en poblaciones de linfocitos B inmortalizados por el VEB
Los linfocitos B primarios expresan la isoforma RyR1 que funciona como un canal de liberación de Ca2+ durante los procesos de señalización estimulados por el receptor de antígeno de células B17. La inmortalización de células B con VEB, un procedimiento utilizado rutinariamente por los genetistas para obtener líneas celulares que contienen información genómica de los pacientes, proporciona la ventaja de generar líneas celulares que expresan canales mutantes RyR1 Ca2+ en pacientes que albergan mutaciones RYR111,13. [Ca2+] Los cambios provocados por la adición de agonistas específicos de RyR1 como el 4-cloro-m-cresol18 y la cafeína pueden ser fácilmente monitoreados para establecer si una mutación RYR1 dada altera la sensibilidad a un agonista, la cantidad de calcio liberado, el reposo [Ca2+ ],u otros parámetros que han demostrado verse afectados por las mutaciones. [Ca2+] Los cambios pueden ser monitoreados en poblaciones de células cargadas de Fura-2 en suspensión con un espectrofluorómetro o en grupos de células unidas a cubiertas de vidrio y examinadas por epifluorescencia. La Figura 2 muestra un experimento representativo llevado a cabo en suspensiones celulares. Inmediatamente antes de ser colocado en la cubeta, las células se hicieron girar para eliminar Fura-2 que puede haberse filtrado; las células se resuspendieron a una concentración final de 1 x10 6 células/ml en solución de Krebs Ringer caliente (37 °C) que no contenía Ca2+ adicional más 0,5 mM de EGTA y se colocaron en el espectrofluorómetro. El agitador magnético se encendió a la posición 4 (la posición más alta) para mantener las células en suspensión y se registró la fluorescencia. Después de obtener un rastro estable, se agregó el agonista seleccionado (en la Figura 2A esto fue de 300 μM 4-cloro-m-cresol) lo que llevó a un rápido aumento de Ca2 + que luego disminuyó lentamente a niveles de reposo. La naturaleza transitoria del cambio en la fluorescencia es importante ya que indica (i) que no es un artefacto causado por la adición de un compuesto fluorescente o calmante, (ii) que no se debe a la unión del calcio a Fura-2 extracelular y (iii) que las células están sanas y pueden eliminar activamente el calcio de su citoplasma.
El mismo experimento necesita ser repetido varias veces para ser analizado estadísticamente. Para cada línea celular y cada día, los experimentos se llevan a cabo y la cantidad total de calcio rápidamente liberable en las tiendas debe determinarse agregando el inhibidor de SERCA thapsigargin11,13,14. Como se muestra en la Figura 2B,la adición de 400 nM de thapsigargin causa un gran transitorio de calcio que alcanza un valor máximo de fluorescencia de 2,4 unidades arbitrarias (u.a.); por lo tanto, la cantidad total de calcio que se puede liberar de las reservas intracelulares de las células B inmortalizadas por el VEB que se muestra en la Figura 2B es igual a 2.4 a.u. (pico de thapsigargin) - 1.45 a.u. (relación de reposo) o 0.95 Este valor de fluorescencia se consideró 100% al construir la curva de dosis-respuesta mostrada en la Figura 2C.
Mediciones de células individuales [Ca2+]i en linfocitos B inmortalizados por VEB
Este segundo enfoque se basa en la disponibilidad de un microscopio de fluorescencia y una configuración de microperfusión que permite la estimulación de una sola célula o pequeños grupos de células con una concentración dada de agonista y el registro simultáneo de los cambios de fluorescencia. Las jeringas del sistema de microperfusión están cargadas con diferentes concentraciones del agonista RyR1 seleccionado (ya sea cafeína o 4-cloro-m-cresol) que se utilizarán para generar curvas de dosis-respuesta. En el ejemplo mostrado en la Figura 3,las células fueron estimuladas con 0.5-10 mM de cafeína disuelta en la solución de Krebs Ringer que no contenía calcio agregado más 100 μM La3+ para monitorear la liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares. Las fundas de vidrio en las que se permitió que se unieran linfocitos B inmortalizados por el VEB cargados con Fura-2 se colocan en la cámara de perfusión y se perfunden con la solución de Krebs Ringer que contiene 1 mM Ca2+. La mayoría de las células se habrán adherido al cobertor tratado con poli-L-lisina y se deben identificar y verificar pequeños grupos de células para detectar la carga de Fura-2. La punta del sistema de perfusión se coloca cerca de las células para bañarlas (y no todas las células en el cobertor) con cafeína. Normalmente las células se estimulan a partir de la concentración más baja a la más alta de cafeína; para cada concentración, se selecciona una nueva célula o grupo de células. Las mediciones de fluorescencia ratiométricas (excitación a 340 nm y 380 nm, emisión a 510 nm) se registran cada segundo durante un máximo de 2 min. Se obtienen algunas imágenes antes de la perfusión para obtener una línea de base constante, posteriormente se inicia la perfusión celular, primero enjuagando las células con una solución de solución de Krebs Ringer que contiene 100 μM La3+ durante 5 segundos. Esto no debe resultar en un cambio en la florescencia y es un control para asegurar que la(s) célula(s) se adhieran a la cubierta durante todo el experimento; posteriormente, una solución que contiene la concentración de agonistas seleccionada se enjuaga sobre la(s) célula(s). En el ejemplo que se muestra en la Figura 3A,las células fueron estimuladas con 5 mM de cafeína durante 20 segundos. La flecha que se muestra indica cuándo se abrió la válvula de cafeína y esto resulta en un aumento inmediato en la relación fluorescente de 340/380 nm. Después de 20 segundos, la válvula de cafeína se cierra y las células se enjuagan con la solución de Krebs Ringer que contiene 100 μM La3+; la fluorescencia se registra hasta que se alcanza la línea de base. Para cada concentración de cafeína, el ΔF, es decir, el pico de fluorescencia inducida por la cafeína de 340/380 nm: la fluorescencia inicial en reposo de 340/380 nm se calcula y se utiliza para construir una curva de dosis-respuesta como se muestra en la Figura 3B. El ΔF medio de 5-10 células se promedia para cada concentración de cafeína. La cantidad de calcio en las reservas intracelulares también puede ser monitoreada. En este caso, las células se enjuagan con la solución de Krebs Ringer que contiene 0,5 mM de EGTA y se agrega una solución de 1 μM de thapsigargina, 1 μM de ionomicina y 0,5 mM de EGTA a las células (no a través del sistema de microperfusión ya que la ionomicina se adhiere al tubo y no se puede lavar) y la fluorescencia se registra durante aproximadamente 4-5 min. Para calcular el ΔF, se obtiene una región de interés (ROI) que describe una célula y los cambios en la fluorescencia dentro del ROI se calculan utilizando un software de imágenes.
En resumen, cuando se utilizan células B inmortalizadas por el VEB para medir la sensibilidad del RyR1 a un agonista específico, se deben realizar experimentos repetidos en células de un individuo, en días diferentes. Para las mediciones en poblaciones celulares, se debe evaluar el estado de las reservas intracelulares de calcio y se traza la liberación de calcio inducida por EC50 a agonista en relación con la cantidad total de calcio que se puede liberar de las reservas. Una ventaja de usar este enfoque es que la respuesta [Ca2+] de millones de células se promedia; además, no se necesita ningún sistema de microperfusión y microscopios fluorescentes. El método de celda única permite el uso de un número menor de celdas y la visualización en línea de los cambios en [Ca2+] de las celdas seleccionadas.
Mediciones de células individuales [Ca2+]i en miotubos derivados de células satélite humanas
Los miotubos cultivados y diferenciados se cargan con Fura-2, se transfieren a la cámara de perfusión y se bañan en la solución de Krebs Ringer que contiene 2 mM Ca2+ como se describió anteriormente para las células del VEB. Las jeringas del sistema de perfusión se llenan con el agonista seleccionado y los miotubos se estimulan como se describió anteriormente. Dado que no todas las células en el coverlip son miotubos multinucleados, es importante seleccionar la(s) celda(s) apropiada(s) que se medirán. Pequeños grupos de miotubos pueden ser estimulados simultáneamente. En el ejemplo mostrado en la Figura 4,se enjuagó un solo miotubo con una solución que contenía KCl, diferentes concentraciones de 4-cloro-m-cresol y finalmente cafeína, sin embargo, normalmente se construyen curvas de respuesta a dosis a agonistas, como se indica en la sección anterior, con el fin de comparar la sensibilidad agonista de células de diferentes individuos12,15,16 . KCl se utiliza como una forma de despolarizar la membrana plasmática. En el esqueleto, la despolarización de la membrana plasmática muscular se detecta por el DHPR sensible al voltaje que, por lo tanto, sufre un cambio conformacional que conduce a la activación y apertura del RyR1. Por otro lado, el 4-cloro-m-cresol y la cafeína son activadores farmacológicos directos del RyR1.
Figura 1: Generación de cultivos de mioblastos derivados de biopsias primarias de músculo humano. (A) Pequeños fragmentos de músculo (flechas) se colocan en insertos que contienen 0,5 ml de medio de crecimiento. Después de 7-14 días se pueden ver células satélite (pequeñas flechas) adyacentes al tejido muscular y creciendo en la parte inferior del inserto. Imagen tomada a través de un objetivo 10x(B)y un objetivo 20x(C). Las cajas grises del panel A se utilizaron para cubrir la identidad del paciente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Experimentos de liberación de calcio en linfocitos B inmortalizados por EBV. Mediciones ratiométricas [Ca2+]i en una población de células cargadas de Fura-2 en suspensión. A) La adición de 300 μM 4-cloro-m-cresol (flecha) provoca un aumento inmediato en el citoplasmático [Ca2+],que posteriormente vuelve a descomponerse a niveles en reposo en 500 segundos. En este ejemplo, el ΔF inducido por la adición de 300 μM 4-cloro-m-cresol es de 1,7 unidades de fluorescencia- 1,4 unidades de fluorescencia = 0,3 unidades de fluorescencia. B) La adición del inhibidor de SERCA thapsigargin (400 nM, flecha) causa un mayor aumento en la relación de fluorescencia Fura-2 que alcanza un máximo de 2,4 unidades de fluorescencia, y posteriormente se desintegra a niveles de reposo a 1,45 unidades de fluorescencia. El transitorio inducido por thapsigargin [Ca2+] representa la cantidad total de calcio rápidamente liberable en las reservas intracelulares presentes en la población celular. El pico transitorio obtenido (2.4-1.45= 0.95 unidades) se utiliza para calcular el porcentaje de calcio liberado por una concentración dada de 4-cloro-m-cresol. C) Curvas de dosis-respuesta representativas que correlacionen el ΔF como porcentaje de la cantidad total de calcio rápidamente liberable en las reservas intracelulares. Para 300 μM 4-cloro-m-cresol este valor es 0.3/0.95x100=31.6%. Cada símbolo representa la media± SEM% de 5-10 valores de células inmortalizadas por EBV de un control (círculos cerrados, línea punteada) y un individuo MHS (cuadrados cerrados, línea continua) portador de una mutación RYR1. Las curvas se generaron utilizando una función de curva dosis-respuesta sigmoidal. Los paneles A y B son adaptados de Girard et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:Liberación de Ca2+ inducida por cafeína en linfocitos B individuales inmortalizados por EBV de un individuo control. A) Paneles superiores, imágenes de lapso de tiempo (A) Contraste de fase; (B-E), monocelular [Ca2+]I mediciones de linfocitos inmortalizados por EBV cargados con fura-2: (B) t=0, (C) t=36 s, (D) t=50 s y (E) t=77 s después de la aplicación de 5 mM de cafeína. Las células fueron estimuladas individualmente por la adición de cafeína diluida en solución de Krebs-Ringer. Barra de escala=10 μm. Panel inferior, traza representativa obtenida tras la estimulación de una sola célula con 5 mM de cafeína (flecha). B) Curvas dosis-respuesta que muestran el cambio dependiente de cafeína en [Ca2+]i, expresado como cambio en la relación de fluorescencia (relación pico 340/380 nm−relación de reposo 340/380 nm). Cada punto representa la media ± SEM del cambio en la fluorescencia de 4-15 células. Las curvas se generaron utilizando una función de curva dosis-respuesta sigmoidal. Cuadrados cerrados, línea punteada, celdas de control; triángulos cerrados, línea continua, individuo MHS portador de una mutación RYR1. Esta figura es una adaptación de Ducreux et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Liberación de calcio estimulada por KCl, 4-cloro-m-cresol y cafeína en miotubos humanos de un individuo control. Paneles izquierdos: A) contraste de fase (B-H), mediciones intracelulares de Ca2+ unicelular de miotubos humanos cargados con Fura-2. B) reposo [Ca2+]i ; C) t=2 s después de la aplicación de 150 mM KCl. D) t= 2 s después de la aplicación de 150 μM 4-cloro-m-cresol; E) t=2 s después de la aplicación de 300 μM 4-cloro-m-cresol; F) t=2 s después de la aplicación de 600 μM 4-cloro-m-cresol; G) t=2 s después de la aplicación de 10 mM de cafeína; H) t=20 s después de la aplicación de cafeína. Panel derecho:Gráfico de tiempo (s) versus relación de fluorescencia (340/380 nm) en la célula estimulada. Los miotubos fueron estimulados individualmente mediante la adición del agonista en el tampón de Krebs-Ringer que contiene 100 μM La3+,por lo que el aumento de [Ca2+]i representa solo la liberación de calcio de las reservas intracelulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los protocolos descritos en este artículo han sido utilizados con éxito por varios laboratorios para estudiar el impacto de las mutaciones RYR1 en la homeostasis del calcio. Los pasos críticos de los enfoques descritos en este documento se refieren a la esterilidad, las habilidades y técnicas de cultivo celular y la disponibilidad de material biológico. En principio, el uso de linfocitos B inmortalizados por EBV es más simple y permite generar líneas celulares que contienen canales RyR1 mutantes. Las células se pueden congelar y almacenar en nitrógeno líquido durante muchos años y los cultivos se pueden reiniciar en cualquier momento. Además, se puede elegir si monitorear la homeostasis del calcio en poblaciones celulares o a nivel de una sola célula. El primer método es más simple, no requiere un microscopio de fluorescencia y permite al investigador probar líneas celulares generadas a partir de diferentes individuos en un corto período de tiempo. La limitación es la velocidad de crecimiento celular y la disponibilidad de un espectrofluorómetro totalmente equipado (calentado y con agitador magnético). Como enfoque alternativo, la citometría de flujo en combinación con indicadores de calcio fluorescente se puede utilizar para medir los flujos de calcio en linfocitos B inmortalizados por el VEB; de tal manera se pueden determinar cambios en la concentración intracelular de calcio19. Si un microscopio fluorescente, una cámara de perfusión y un sistema de microperfusión están disponibles, entonces las imágenes de una sola célula tienen la ventaja de ser más sensibles y brindar información más detallada, incluida la variabilidad de célula a célula, el análisis cinético y la identificación de dominios subcelulares involucrados en la liberación de calcio. Este último enfoque es técnicamente más desafiante y requiere más equipo.
Hay múltiples ventajas en el uso de linfocitos B inmortalizados por EBV, incluyendo que se pueden medir otros parámetros aparte de [Ca2+]i homeostasis. Por ejemplo, la acidificación inducida por 4-cloro-m-cresol de las células B se ha utilizado para diferenciar las células de los individuos de control de los pacientes con MHS20,21. Sin embargo, se debe tener en cuenta (i) que las células B no expresan muchas de las proteínas involucradas en el acoplamiento de contracción de la excitación del músculo esquelético que puede influir indirectamente en la liberación de calcio, (ii) son células no excitables, por lo que no pueden activarse fisiológicamente por despolarización de la membrana plasmática, y finalmente un informe de Monnier et al. encontró que una mutación identificada en un paciente no se expresó en células B inmortalizadas por EBV debido a un sitio de empalme críptico22.
Los cultivos de células musculares primarias derivadas de pacientes han sido utilizados por varios grupos interesados en estudiar el efecto de mutaciones en diferentes genes que codifican proteínas implicadas en la homeostasis del calcio10,23,24. Estas células se pueden diferenciar en miotubos multinucleados, responden a la despolarización de la membrana plasmática y pueden evaluarse por medios electrofisiológicos. Además, pueden ser inmortalizados para obtener líneas celulares portadoras de mutaciones RYR125,aunque el procedimiento es mucho más complejo que para los linfocitos B. Si bien también es cierto que las células musculares son de crecimiento lento y el tiempo necesario desde la toma de una biopsia hasta tener un número suficiente de células puede ser de más de un mes, también es posible almacenar los pequeños trozos de biopsias musculares en medio de congelación en nitrógeno líquido para obtener mioblastos años después. Los largos tiempos de cultivo tienen el riesgo añadido de contaminación por bacterias, levaduras o mohos y tan pronto como se haya obtenido un número suficientemente grande de mioblastos, es importante congelarlos y almacenarlos en nitrógeno líquido. Nuestro laboratorio ha aplicado con éxito la misma técnica descrita anteriormente para los miotubos, para estudiar los cambios de calcio en fibroblastos derivados de la piel humana transducidos con myoD y diferenciados en miotubos26. Esto se hizo para estudiar el efecto funcional de las mutaciones de RYR1 cuando los mioblastos derivados de biopsias musculares no estaban disponibles. En cuanto a los linfocitos B, la acidificación inducida por 4-cloro-m-cresol de miotubos de pacientes con mutaciones RYR1 vinculadas a MHS se ha probado con éxito27.
En conclusión, el uso de material biológico de los pacientes para estudiar la correlación genotipo-fenotipo tiene muchas ventajas el inconveniente y puede ser utilizado con éxito para estudiar el efecto de las mutaciones en RYR1. Sin embargo, al utilizar este enfoque, es importante tener en cuenta que las mutaciones presentes en otros genes pueden influir en la homeostasis del calcio; por lo tanto, se debe realizar el uso de células de diferentes familias que albergan la misma mutación, así como de miembros de la familia que no albergan la mutación RYR1 como controles.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo descrito en este manuscrito fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias (SNF) y la Fundación Suiza del Músculo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
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