Vurdering af proteininteraktioner i levende celler med FRET-sensibiliseret emission
Summary
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mellem to fluoroformolekyler kan bruges til at studere proteininteraktioner i den levende celle. Her tilvejebringes en protokol for, hvordan man måler FRET i levende celler ved at detektere sensibiliseret emission af acceptoren og slukning af donormolekylet ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi.
Abstract
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) er den strålingsfri overførsel af energi fra en exciteret donor til et acceptormolekyle og afhænger af molekylernes afstand og orientering samt omfanget af overlapning mellem donoremissions- og acceptorabsorptionsspektrene. FRET tillader at studere interaktionen mellem proteiner i den levende celle over tid og i forskellige subcellulære rum. Forskellige intensitetsbaserede algoritmer til måling af FRET ved hjælp af mikroskopi er beskrevet i litteraturen. Her tilvejebringes en protokol og en algoritme til kvantificering af FRET-effektivitet baseret på måling af både den sensibiliserede emission af acceptoren og slukning af donormolekylet. Kvantificeringen af ratiometrisk FRET i den levende celle kræver ikke kun bestemmelse af krydstale (spektral spill-over eller gennemblødning) af de fluorescerende proteiner, men også detektionseffektiviteten af den mikroskopiske opsætning. Protokollen her beskriver, hvordan man vurderer disse kritiske parametre.
Introduction
Mikroskopibaseret analyse af Förster Resonance Energy Transfer (FRET) muliggør vurdering af interaktioner mellem proteiner i levende celler. Det giver rumlig og tidsmæssig information, herunder information om hvor i cellen og i hvilket subcellulært rum interaktionen finder sted, og hvis denne interaktion ændrer sig over tid.
Theodor Förster lagde det teoretiske grundlag for FRET i 19481. FRET er en strålingsfri overførsel af energi fra en exciteret donor til et acceptormolekyle og afhænger af molekylernes afstand og den relative orientering af deres overgangsdipoler samt overlapningen mellem donoremissions- og acceptorabsorptionsspektrene. Energioverførselshastigheden er omvendt proportional med den sjette effekt af donoracceptorafstanden. FRET kan således anvendes til at måle molekylær nærhed i området 1-10 nm.
FRET konkurrerer med andre de-excitationsprocesser af donormolekylet og resulterer i den såkaldte donor-quenching og sensibiliserede emission af acceptoren. Donor-slukning er en reduktion af antallet af udsendte donorfotoner, mens sensibiliseret emission er en stigning i udsendte acceptorfotoner. Mange mikroskopiske FRET-analyser bruger fluorescensintensitetsmålinger, herunder acceptorfotoblegning 2, donorfotoblegning2 eller FRET-sensibiliseret fotoblegning af acceptoren3.
Her præsenteres en trin-for-trin eksperimentel protokol og matematisk algoritme til kvantificering af FRET ved hjælp af donorslukning og acceptorsensibiliseret emission4,5, en metode, der ofte omtales som ratiometrisk FRET. Mange protokoller om, hvordan man tilnærmer sensibiliseret emission er blevet offentliggjort, få har kvantificeret den absolutte FRET-effektivitet 6,7,8,9. Kvantificeringen af FRET-effektiviteten i den levende celle kræver bestemmelse af (i) krydstale (spektral spill-over eller gennemblødning) af de fluorescerende proteiner og også (ii) detektionseffektiviteten af den mikroskopiske opsætning. Mens krydstale kan vurderes ved at billeddannende celler, der kun udtrykker en af fluoroforerne, er vurderingen af donorens og acceptorfluorescensens relative detektionseffektivitet mere kompliceret. Det kræver kendskab til mindst forholdet mellem antallet af donor- og acceptormolekyler, der giver anledning til de målte signaler. Antallet af fluoroforer udtrykt i levende celler varierer imidlertid fra celle til celle og er ukendt. Den såkaldte α faktor karakteriserer de relative signalstyrker fra et enkelt exciteret donor- og acceptormolekyle. Kendskab til faktoren er en forudsætning for kvantitative ratiometriske FRET-målinger i prøver med variable acceptor-til-donor-molekyleforhold, som det ses under levende cellebilleddannelse med fluorescerende proteiner. Brug af et 1-til-1 donoracceptorfusionsprotein som kalibreringssonde muliggør bestemmelse af α faktor og fungerer også som en positiv kontrol. Denne genetisk koblede sonde udtrykkes af celler i ukendte samlede mængder, men i en fast og kendt relativ mængde en-til-en. Følgende protokol beskriver, hvordan 1-til-1-sonden konstrueres, og hvordan den bruges til kvantificering af FRET-effektivitet. Et regneark, der indeholder alle formler, findes i tillægget og kan bruges af læserne til at indtaste deres egne mål i de respektive kolonner som beskrevet nedenfor.
Mens protokollen bruger GFP-Cherry donor / acceptorparret, kan den præsenterede tilgang udføres med ethvert andet FRET-par. Den supplerende fil 1 indeholder nærmere oplysninger om cyangule par.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver brugen af den genetisk koblede en-til-en fluorescerende proteinkalibreringssonde til kvantificering af FRET ved påvisning af sensibiliseret emission af acceptoren og slukning af donormolekylet ved konfokal mikroskopi. Denne metode kan anvendes til at vurdere proteininteraktioner i den fysiologiske kontekst af den levende celle i forskellige subcellulære rum. Den rumlige opløsning kan forbedres yderligere ved at anvende den præsenterede algoritme til at beregne FRET-effektivitet i …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Neuroscience Imaging Service ved Stanford University School of Medicine for at levere udstyr og plads til dette projekt. Denne forskning blev støttet af intramural finansiering af Stanford Cancer Institute og Gynecologic Oncology Division Stanford samt GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 fra National Research, Development and Innovation Office, Ungarn.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
References
- Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
- Mekler, V. M. A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer. Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).
- Vamosi, G., et al. Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study. Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).
- van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).
- Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).
- Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors. Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).
- Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry Part A. , 24194 (2020).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173, 33-38 (1996).
- Nagy, P., et al. Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins. Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).
- Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).
- Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy. Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).
- Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).
- Sebestyen, Z., et al. Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).
- Szaloki, N., et al. High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).
- McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).
- Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Scott, B. L., Hoppe, A. D. Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells. Science Reports. 5, 10270 (2015).
- Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it. Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).
- King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments. Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).
