Beoordeling van eiwitinteracties in levende cellen met FRET-gesensibiliseerde emissie
Summary
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee fluorofoormoleculen kan worden gebruikt voor het bestuderen van eiwitinteracties in de levende cel. Hier wordt een protocol gegeven over hoe FRET in levende cellen kan worden gemeten door het detecteren van gesensibiliseerde emissie van de acceptor en het blussen van het donormolecuul met behulp van confocale laserscanmicroscopie.
Abstract
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) is de stralingsloze overdracht van energie van een geëxciteerde donor naar een acceptormolecuul en hangt af van de afstand en oriëntatie van de moleculen en de mate van overlap tussen de donoremissie en acceptorabsorptiespectra. FRET maakt het mogelijk om de interactie van eiwitten in de levende cel in de loop van de tijd en in verschillende subcellulaire compartimenten te bestuderen. Verschillende op intensiteit gebaseerde algoritmen om FRET te meten met behulp van microscopie zijn beschreven in de literatuur. Hier worden een protocol en een algoritme verstrekt om de FRET-efficiëntie te kwantificeren op basis van het meten van zowel de gesensibiliseerde emissie van de acceptor als het blussen van het donormolecuul. De kwantificering van ratiometrische FRET in de levende cel vereist niet alleen de bepaling van de overspraak (spectrale spill-over of doorbloeding) van de fluorescerende eiwitten, maar ook de detectie-efficiëntie van de microscopische opstelling. Het protocol dat hier wordt verstrekt, beschrijft hoe deze kritieke parameters moeten worden beoordeeld.
Introduction
Microscopie-gebaseerde analyse van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) maakt het mogelijk om interacties tussen eiwitten in levende cellen te beoordelen. Het biedt ruimtelijke en temporele informatie, inclusief informatie over waar in de cel en in welk subcellulair compartiment de interactie plaatsvindt en of deze interactie in de loop van de tijd verandert.
Theodor Förster legde de theoretische basis van FRET in 19481. FRET is een stralingsloze overdracht van energie van een aangeslagen donor naar een acceptormolecuul en hangt af van de afstand van de moleculen en de relatieve oriëntatie van hun overgangsdipolen, evenals de overlap tussen de donoremissie en acceptorabsorptiespectra. De snelheid van energieoverdracht is omgekeerd evenredig met de zesde macht van de donor-acceptor afstand. FRET kan dus worden gebruikt om moleculaire nabijheid te meten in het bereik van 1-10 nm.
FRET concurreert met andere de-excitatieprocessen van het donormolecuul en resulteert in de zogenaamde donor-quenching en sensibilized emissie van de acceptor. Donor-quenching is een vermindering van het aantal uitgezonden donorfotonen, terwijl gesensibiliseerde emissie een toename is van uitgezonden acceptorfotonen. Veel microscopische FRET-analyses maken gebruik van fluorescentie-intensiteitsmetingen, waaronder acceptorfotobleaching 2, donorfotobleaching2 of FRET-gesensibiliseerde fotobleaching van de acceptor3.
Hier worden een stap-voor-stap experimenteel protocol en wiskundig algoritme gepresenteerd om FRET te kwantificeren met behulp van donorblussing en acceptorsensibiliseerde emissie4,5, een methode die vaak ratiometrische FRET wordt genoemd. Er zijn veel protocollen gepubliceerd over het benaderen van gesensibiliseerde emissie, weinigen hebben de absolute FRET-efficiëntie 6,7,8,9 gekwantificeerd. De kwantificering van FRET-efficiënties in de levende cel vereist het bepalen van (i) de overspraak (spectrale spill-over of doorbloeding) van de fluorescerende eiwitten en ook (ii) de detectie-efficiëntie van de microscopische opstelling. Terwijl overspraak kan worden beoordeeld door cellen af te beelden die slechts één van de fluoroforen tot expressie brengen, is de beoordeling van de relatieve detectie-efficiëntie van de fluorescentie van donor en acceptor ingewikkelder. Het vereist de kennis van ten minste de verhouding van het aantal donor- en acceptormoleculen die aanleiding geven tot de gemeten signalen. Het aantal fluoroforen dat in levende cellen tot expressie komt, varieert echter van cel tot cel en is onbekend. De zogenaamde α-factor karakteriseert de relatieve signaalsterkten van een enkele aangeslagen donor- en acceptormolecuul. Kennis van de factor is een voorwaarde voor kwantitatieve ratiometrische FRET-metingen in monsters met variabele acceptor-donormolecuulverhoudingen zoals aangetroffen tijdens live-cell imaging met fluorescerende eiwitten. Het gebruik van een 1-op-1 donor-acceptor fusie-eiwit als kalibratiesonde maakt de bepaling van de α factor mogelijk en dient ook als een positieve controle. Deze genetisch gekoppelde sonde wordt door cellen uitgedrukt in onbekende totale hoeveelheden, maar in een vaste en bekende relatieve hoeveelheid van één-op-één. Het volgende protocol legt uit hoe de 1-op-1-sonde moet worden geconstrueerd en hoe deze moet worden gebruikt voor de kwantificering van FRET-efficiëntie. Een spreadsheet die alle formules bevat, is te vinden in het supplement en kan door de lezers worden gebruikt om hun eigen metingen in de respectieve kolommen in te voeren, zoals hieronder beschreven.
Hoewel het protocol het GFP-Cherry-donor/ acceptorpaar gebruikt, kan de gepresenteerde aanpak worden uitgevoerd met elk ander FRET-paar. Het Aanvullend Dossier 1 geeft details over cyaan-gele paren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van de genetisch gekoppelde één-op-één fluorescerende eiwitkalibratiesonde voor het kwantificeren van FRET met behulp van de detectie van gesensibiliseerde emissie van de acceptor en het blussen van het donormolecuul door confocale microscopie. Deze methode kan worden toegepast om eiwitinteracties te beoordelen in de fysiologische context van de levende cel in verschillende subcellulaire compartimenten. De ruimtelijke resolutie kan verder worden verbeterd door het ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de Neuroscience Imaging Service van Stanford University School of Medicine bedanken voor het leveren van apparatuur en ruimte voor dit project. Dit onderzoek werd ondersteund door intramurale financiering van het Stanford Cancer Institute en de Gynecologic Oncology Division Stanford, evenals GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 van het National Research, Development and Innovation Office, Hongarije.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
References
- Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
- Mekler, V. M. A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer. Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).
- Vamosi, G., et al. Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study. Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).
- van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).
- Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).
- Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors. Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).
- Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry Part A. , 24194 (2020).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173, 33-38 (1996).
- Nagy, P., et al. Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins. Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).
- Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).
- Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy. Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).
- Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).
- Sebestyen, Z., et al. Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).
- Szaloki, N., et al. High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).
- McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).
- Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Scott, B. L., Hoppe, A. D. Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells. Science Reports. 5, 10270 (2015).
- Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it. Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).
- King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments. Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).
