Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Beoordeling van eiwitinteracties in levende cellen met FRET-gesensibiliseerde emissie

Published: April 22, 2021 doi: 10.3791/62241
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee fluorofoormoleculen kan worden gebruikt voor het bestuderen van eiwitinteracties in de levende cel. Hier wordt een protocol gegeven over hoe FRET in levende cellen kan worden gemeten door het detecteren van gesensibiliseerde emissie van de acceptor en het blussen van het donormolecuul met behulp van confocale laserscanmicroscopie.

Abstract

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) is de stralingsloze overdracht van energie van een geëxciteerde donor naar een acceptormolecuul en hangt af van de afstand en oriëntatie van de moleculen en de mate van overlap tussen de donoremissie en acceptorabsorptiespectra. FRET maakt het mogelijk om de interactie van eiwitten in de levende cel in de loop van de tijd en in verschillende subcellulaire compartimenten te bestuderen. Verschillende op intensiteit gebaseerde algoritmen om FRET te meten met behulp van microscopie zijn beschreven in de literatuur. Hier worden een protocol en een algoritme verstrekt om de FRET-efficiëntie te kwantificeren op basis van het meten van zowel de gesensibiliseerde emissie van de acceptor als het blussen van het donormolecuul. De kwantificering van ratiometrische FRET in de levende cel vereist niet alleen de bepaling van de overspraak (spectrale spill-over of doorbloeding) van de fluorescerende eiwitten, maar ook de detectie-efficiëntie van de microscopische opstelling. Het protocol dat hier wordt verstrekt, beschrijft hoe deze kritieke parameters moeten worden beoordeeld.

Introduction

Microscopie-gebaseerde analyse van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) maakt het mogelijk om interacties tussen eiwitten in levende cellen te beoordelen. Het biedt ruimtelijke en temporele informatie, inclusief informatie over waar in de cel en in welk subcellulair compartiment de interactie plaatsvindt en of deze interactie in de loop van de tijd verandert.

Theodor Förster legde de theoretische basis van FRET in 19481. FRET is een stralingsloze overdracht van energie van een aangeslagen donor naar een acceptormolecuul en hangt af van de afstand van de moleculen en de relatieve oriëntatie van hun overgangsdipolen, evenals de overlap tussen de donoremissie en acceptorabsorptiespectra. De snelheid van energieoverdracht is omgekeerd evenredig met de zesde macht van de donor-acceptor afstand. FRET kan dus worden gebruikt om moleculaire nabijheid te meten in het bereik van 1-10 nm.

FRET concurreert met andere de-excitatieprocessen van het donormolecuul en resulteert in de zogenaamde donor-quenching en sensibilized emissie van de acceptor. Donor-quenching is een vermindering van het aantal uitgezonden donorfotonen, terwijl gesensibiliseerde emissie een toename is van uitgezonden acceptorfotonen. Veel microscopische FRET-analyses maken gebruik van fluorescentie-intensiteitsmetingen, waaronder acceptorfotobleaching 2, donorfotobleaching2 of FRET-gesensibiliseerde fotobleaching van de acceptor3.

Hier worden een stap-voor-stap experimenteel protocol en wiskundig algoritme gepresenteerd om FRET te kwantificeren met behulp van donorblussing en acceptorsensibiliseerde emissie4,5, een methode die vaak ratiometrische FRET wordt genoemd. Er zijn veel protocollen gepubliceerd over het benaderen van gesensibiliseerde emissie, weinigen hebben de absolute FRET-efficiëntie 6,7,8,9 gekwantificeerd. De kwantificering van FRET-efficiënties in de levende cel vereist het bepalen van (i) de overspraak (spectrale spill-over of doorbloeding) van de fluorescerende eiwitten en ook (ii) de detectie-efficiëntie van de microscopische opstelling. Terwijl overspraak kan worden beoordeeld door cellen af te beelden die slechts één van de fluoroforen tot expressie brengen, is de beoordeling van de relatieve detectie-efficiëntie van de fluorescentie van donor en acceptor ingewikkelder. Het vereist de kennis van ten minste de verhouding van het aantal donor- en acceptormoleculen die aanleiding geven tot de gemeten signalen. Het aantal fluoroforen dat in levende cellen tot expressie komt, varieert echter van cel tot cel en is onbekend. De zogenaamde α-factor karakteriseert de relatieve signaalsterkten van een enkele aangeslagen donor- en acceptormolecuul. Kennis van de factor is een voorwaarde voor kwantitatieve ratiometrische FRET-metingen in monsters met variabele acceptor-donormolecuulverhoudingen zoals aangetroffen tijdens live-cell imaging met fluorescerende eiwitten. Het gebruik van een 1-op-1 donor-acceptor fusie-eiwit als kalibratiesonde maakt de bepaling van de α factor mogelijk en dient ook als een positieve controle. Deze genetisch gekoppelde sonde wordt door cellen uitgedrukt in onbekende totale hoeveelheden, maar in een vaste en bekende relatieve hoeveelheid van één-op-één. Het volgende protocol legt uit hoe de 1-op-1-sonde moet worden geconstrueerd en hoe deze moet worden gebruikt voor de kwantificering van FRET-efficiëntie. Een spreadsheet die alle formules bevat, is te vinden in het supplement en kan door de lezers worden gebruikt om hun eigen metingen in de respectieve kolommen in te voeren, zoals hieronder beschreven.

Hoewel het protocol het GFP-Cherry-donor/ acceptorpaar gebruikt, kan de gepresenteerde aanpak worden uitgevoerd met elk ander FRET-paar. Het Aanvullend Dossier 1 geeft details over cyaan-gele paren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmide constructie

  1. Gebruik voor het genereren van de eGFP-mCherry1-fusiesonde een N1-zoogdiercelexpressievector (zie materiaaltabel) met mCherry110 ingevoegd met behulp van de restrictiesites AgeI en BsrGI.
  2. Gebruik de volgende oligonucleotiden om eGFP11 te versterken zonder stopcodon als SalI-BamHI-fragment : N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' en C-terminal primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.
  3. Plaats dit SalI-BamHI-fragment in de meervoudige kloonplaats van de N1-vector om RNPPV-linker (vijf aminozuur) tussen het groene en rode fluorescerende eiwit te introduceren.
    OPMERKING: Deze linker levert een gemiddelde FRET-efficiëntie op voor het GFP-Cherry donor-acceptorpaar van ongeveer 0,25 -0,3 (figuur 1A). De keuze van stijve12 en spiraalvormige13 linkers van verschillende lengtes om gemeten FRET-efficiënties op schaal te schalen, is elders besproken, maar is niet vereist voor ons doel van het fusie-eiwit. In de toekomst zullen we voor de eenvoud de fluorescerende eiwitten 'GFP' en 'Cherry' noemen.

2. Celkweek en transfectie

  1. Gebruik elke cellijn, bijvoorbeeld NRK-cellen, voor FRET-experimenten in media, bijvoorbeeld Dulbecco's gemodificeerde Eagle's media (DMEM), zonder fenolrood, om achtergrondfluorescentie te verminderen. Om dezelfde reden wordt het gebruik van fenolrode vrije trypsine geadviseerd.
  2. Zodra cellen voor 80% confluent zijn, maakt u cellen los met 1 ml 0,05% trypsine-EDTA, telt u het aantal cellen in suspensie met behulp van een Neubauer-kamer en zaait u ongeveer 10.000 cellen per put van een 8-well chambered cover glass; als alternatief, uit een confluente celcultuur gekweekt in T25-kolf, gebruik 1 druppel celsuspensie uit een pipet van 2 ml of 3 druppels uit een celsuspensie van 5 ml uit een confluente cultuur gekweekt in een T 12,5-celkweekkolf.
  3. Kweek cellen in 8-well kamers (0,8 cm 2/ put) met #1.0 afdekglas voor fluorescentie live-cell microscopie bij standaard celkweekomstandigheden (37°C en 5% CO2).
  4. 24 h na het bekleden transfecteren de cellen met behulp van een geschikt in de handel verkrijgbaar transfectiemedium (zie materiaaltabel), met GFP, Cherry, GFP/ Cherry mix (1:1 mix, d.w.z. 0,8 μg en 0,8 μg GFP en Cherry plasmide DNA), en de GFP-Cherry chimera.
    1. Gebruik voor transfectie 5 μL van het transfectiereagens in 45 μL DMEM en 1,6 μg plasmide-DNA. Roer door de microcentrifugebuis voorzichtig te vegen.
    2. Voeg na 15 minuten incubatie van het mengsel bij kamertemperatuur 1-2 μL van het transfectiereagensmengsel toe aan elk putje van de 8-well kamerschuif. Breng het kamerdekselglas terug naar de incubator.
  5. Laat 20 uur na transfectie verstrijken voordat live-cell beeldvorming plaatsvindt, om een goede fluorescerende eiwitexpressie, vouwing en rijping mogelijk te maken, vooral van de rode fluorofoor.

3. FRET beeldvorming

  1. Beeld getransfecteerde cellen in een bevochtigde en verwarmde omgevingskamer bij 37 °C. Om de celmedia te bufferen bij fysiologische pH, gebruikt u CO 2-gas ingesteld op 5% stroom of voegt u 20 mM HEPES toe om de celmedia CO2-onafhankelijk te maken.
  2. Gebruik een confocale laserscanmicroscoop. Stel de excitatie en emissie als volgt in om het signaal te optimaliseren en cross-talk te minimaliseren.
    1. Gebruik de 488-nm-lijn van de argon-ionlaser om GFP te prikkelen en de 561-nm diode gepompte solid-state laser (of 543-nm Helium Neon-laser, afhankelijk van beschikbare laserlijnen) om Cherry te prikkelen.
    2. Stel het volgende in de software van een commerciële confocale microscoop in. Stel de Dichroic spiegel in op 488/ 561 door met de knop te klikken via het vervolgkeuzemenu. Verzamel fluorescentie met behulp van 488-nm laserlicht voor excitatie in kanaal 1 door een emissieband van 505 - 530 nm (of 505 - 550 nm) en in kanaal 2 met een langdoorlaatfilter >585 nm en gebruik het 561-nm laserlicht voor excitatie in kanaal 3 met een langdoorlaatfilter > 585 nm (type in golflengten). Banddoorlaatfilters, bijvoorbeeld 590 - 650 nm of iets dergelijks, kunnen ook worden gebruikt die het voordeel hebben dat Raman-verstrooiing wordt uitgesloten.
  3. Exciciteer achtereenvolgens met de twee lasers en stel de beeldmodus in op Schakelen na elke lijn, zodat de excitatie van het beeld van 512 x 512 pixels na elke regel wordt afgewisseld (en niet na elk frame, waardoor de mogelijkheid om FRET te detecteren als gevolg van diffusie van de gelabelde eiwitten tijdens het opnemen van de beelden met verschillende excitaties zou verdwijnen; klik op de knop).
  4. Stel een mini-tijdreeks van drie afbeeldingen in door op de knop te klikken om te detecteren of er significante fotobleaching optreedt en mogelijk het laservermogen te verminderen. Fotobleking van minder dan 1% is optimaal. Een hoge laserintensiteit kan ook leiden tot absorptieverzadiging die de schijnbare FRET-efficiëntie vermindert14. Laservermogen, tot 10-20 μW gemeten op de objectieflens zijn veilig in gebruik.
  5. Ten eerste, beeldcellen die het GFP-Cherry fusieconstruct uitdrukken. Stel de parameters in die de tijdgeïntegreerde laserintensiteit per pixel in een confocaal beeld definiëren, d.w.z. de verblijftijd van de pixel in microseconden, de acousto-optische afstembare filter (AOTF) transmissie in procenten en de zoom.
    1. Afbeeldingscellen met een olieobjectief van 63x en Zoom ingesteld op 3x. Dit zorgt voor voldoende vergroting en resolutie om cellen in zijn geheel af te beelden. Streef naar een pixelgrootte van 70-80 nm.
    2. Stel de pixelverblijftijd in op 2-4 μs en AOTF-transmissie voor de 488-nm- en 561-nm-laser, zodat beelden een goede signaal-ruisverhouding hebben zonder bleken en geen pixels die fluorescentie-intensiteitsverzadiging vertonen. Het is voordelig om het laservermogen van 488 en 561 zodanig aan te passen dat de signaalniveaus in kanaal 1 en kanaal 3 vergelijkbaar zijn.
    3. Stel de versterking van de fotomultiplicator (middelingsmodus) in op 600-800.
  6. Afbeelding met deze instellingen 15-20 cellen die het GFP-Cherry fusie-eiwit tot expressie brengen. 15-20 cellen bieden goede statistieken terwijl de totale tijd van een FRET-meetsessie beperkt blijft tot een paar uur om de stabiliteit van de microscopische opstelling te helpen garanderen.
  7. Afbeelding met dezelfde instellingencellen die GFP, Cherry, GFP en Cherry en niet-getransfecteerde cellen uitdrukken. Zoek naar uitdrukkende cellen in respectievelijk het groene kanaal of het rode kanaal.
  8. Vervolgens beeld 15-20 cellen co-expressie eiwitten van belang gekoppeld aan GFP en Cherry, respectievelijk. Zoek naar tot expressie brengende cellen, vermijd lange blootstelling van de cellen om de fluorescerende eiwitten niet te bleken. Cherry heeft een lagere fotostabiliteit dan GFP, en het bleken van Cherry, de acceptor compromitteert FRET-analyse.
    OPMERKING: Absorptie- en emissiespectra van GFP en Cherry zijn weergegeven in aanvullende figuur 1. Na een meting gedurende 5-6 uur is het raadzaam om de beeldvorming van enkele cellen die de GFP-Cherry-chimaera tot expressie brengen aan het einde van de beeldvormingssessie te herhalen om te documenteren dat de opstelling stabiel bleef en gedetecteerde FRET-efficiëntie van het GFP-Cherry-fusie-eiwit niet significant veranderde in de loop van een beeldvormingssessie.

4. Beeldanalyse voor het detecteren van absolute FRET-efficiëntie met behulp van donorblussing en gesensibiliseerde emissie

OPMERKING: Hier wordt een praktische stapsgewijze handleiding gegeven voor het bepalen van de FRET-efficiëntie met behulp van de bijgevoegde spreadsheet (aanvullend bestand 2). Theorie en afleiding van de gepresenteerde vergelijkingen zijn in detail te vinden in eerdere publicaties 4,15,16,17. Met de beschreven instellingen worden de volgende fluorescentie-intensiteiten verzameld.

  1. Meet het donorsignaal I 1 in kanaal 1, het donorkanaal, met 488 nm excitatie en een emissieband van 505-530 nm.
    Equation 2
    waarbij ID het niet-uitgebluste donorsignaal in kanaal 1 is dat zou worden gemeten zonder een acceptor, de gemiddelde FRET-efficiëntie is en B 1 het gemiddelde achtergrondsignaal in kanaal 1.
  2. Meet het acceptorsignaal I 3 in kanaal 3, het acceptorkanaal, met 561 nm excitatie en emissie bij >585 nm.
    Equation 3
    waarbij IA het acceptorsignaal is en B 3 de achtergrond in kanaal 3.
  3. Meet het FRET-signaal in kanaal 2, het overdrachtskanaal, met 488-nm excitatie en emissie bij >585 nm.
    Equation 4
    Waarbij het signaal in kanaal 2 een som is van vier verschillende componenten: (i) I D(1 - E)S 1 is de spectrale spill-over van het gebluste donorsignaal naar het detectiekanaal >585 (met de cross-talk factor S 1), (ii) IA S 2 is het acceptorsignaal van de directe excitatie door 488-nm licht (met de cross-talk factor S2), (iii) IDEα is de gesensibiliseerde emissie van de acceptor door FRET van het geëxciteerde donormolecuul (α zal verder worden beschreven in 4.8. - 4.10.), en (iv) B2 is het achtergrondsignaal.
  4. Meet de gemiddelde achtergrondintensiteiten in kanalen 1, 2, 3 in niet-getransfecteerde of nep-getransfecteerde cellen; Beide zijn prima met verwaarloosbaar verschil. Gebruik voor alle celmetingen het gereedschap uit de vrije hand om gebieden van belangen af te bakenen en perinucleaire blaasjes met verhoogde autofluorescentie te vermijden. Het is belangrijk om significante autofluorescentie van deze perinucleaire blaasjes te vermijden.
    1. Voer de metingen in de kolommen X, Y en Z van de verstrekte spreadsheet in. Gemiddelde achtergrondintensiteiten in de 3 kanalen worden ingevoerd in A2, B2 en C2 van de Excel-spreadsheet (aanvullend bestand 2).
  5. Meet de gemiddelde intensiteiten in de kanalen 1, 2, 3 van cellen die alleen GFP of Cherry uitdrukken en voer de metingen in de kolommen C, D, E en N, O, P. Respectieve achtergrondintensiteiten worden afgetrokken (in F, G, H en Q, R, S).
  6. Om E, de FRET-efficiëntie, te berekenen, bepaalt u de cross-talk factoren S 1 en S2. De spectrale cross-talk factor S1 wordt berekend uit cellen die alleen GFP tot expressie brengen
    Equation 6
    in kolom I. Voer de gemiddelde waarde voor S1 in cel D2 in de Excel-spreadsheet in.
  7. Bereken de spectrale cross-talk factor S2 uit cellen die alleen Cherry uitdrukken
    Equation 7
    in kolom T. Voer het gemiddelde voor S2 in cel E2 in de Excel-spreadsheet in.
  8. Zorg ervoor dat de factor α het signaal van een bepaald aantal geëxciteerde GFP-moleculen in kanaal 1 relateert aan het signaal van een gelijk aantal geëxciteerde Cherry-moleculen in kanaal 2, en wordt gedefinieerd door
    Equation 8   Equation 13
    waarbij Q A en QD de fluorescentie-kwantumopbrengsten van Cherry en GFP zijn; ηA en ηD de detectie-efficiëntie van acceptor- en donorfluorescentie in respectievelijk kanalen 2 en 1.
    OPMERKING: De factor α kan worden bepaald aan de hand van twee monsters die bekende absolute hoeveelheden GFP en Cherry uitdrukken. Het is echter onmogelijk om de exacte hoeveelheid GFP en Cherry uitgedrukt in een cel te kennen. Daarom hebben we de factor berekend door cellen te gebruiken die het GFP-Cherry-fusie-eiwit tot expressie brengen. Hier, terwijl de absolute hoeveelheid nog onbekend is, is bekend dat de verhouding van donor- en acceptormoleculen één is.
  9. Meet de gemiddelde intensiteiten in de kanalen 1, 2, 3 van cellen die het GFP-Cherry fusie-eiwit tot expressie brengen en voer de metingen in de kolommen AE, AF, AG in. Achtergrondintensiteiten worden afgetrokken (in AH, AI, AJ).
  10. Bereken de α factor (AJ-kolom) uit de fluorescentie-intensiteiten in kanaal 1, 2 en 3 van het GFP-Cherry-fusie-eiwit als volgt:
    Equation 10
  11. Achtergrondgecorrigeerde intensiteiten gemeten in kanaal 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B 2) en 3 (I 3 - B3) worden gemeten met behulp van de GFP-Cherry chimaera. De spectrale overspraakfactor S1 werd bepaald met behulp van cellen die alleen GFP tot expressie brengen (zie 4.7.). εD en ε A zijn de extinctiecoëfficiënten van GFP, de donor, en Cherry, de acceptor, bij 488 nm, en kunnen worden bepaald uit de literatuur (ε GFP = 53.000 M-1 cm-1)18 en de absorptiecurve van Cherry (εCherry ≈ 5560 M-1cm 1). De verhouding Equation 11 is ingevoerd in cel G2 van de excel spreadsheet. Voer de gemiddelde waarde voor de factor α in J2 in.
  12. Gebruik de bepaalde α factor voor de berekening van het FRET-rendement, E, als volgt (kolom AK):
    Equation 12
  13. U kunt ook FRET-efficiëntie, E, bepalen voor de negatieve controles, d.w.z. de co-expressie van GFP en Cherry en de expressie van GFP alleen door de metingen van kanalen 1, 2 en 3 in het Excel-blad in kolom AD, AE en AF op te tellen onder de GFP-Cherry-fusie-eiwitmetingen. Bepaal de FRET-efficiëntie tussen de GFP- en Cherry-gelabelde eiwitten van belang op dezelfde manier.
  14. Bepaal de onuitbluste donorintensiteit, I D als (I 1 - B 1)/(1 - E), en de acceptorintensiteit als I A = I 3 - B3; Deze waarden zijn evenredig met de expressieniveaus van de gelabelde eiwitten.
  15. Bepaal de gecorrigeerde verhouding tussen acceptor en donorintensiteit (Q) van het GFP-Cherry-fusie-eiwit als volgt (kolom AL):
    Equation 13
  16. Bereken voor andere co-getransfecteerde cellen de moleculaire verhouding N A/ND van acceptor tot donor als volgt:
    Equation 14
    OPMERKING: De redenering om de N A/N D-verhouding te bepalen en de gemiddelde cellulaire FRET-efficiëntie E versus N A/N D uit te zetten, is dat één donormolecuul energie kan overdragen aan meerdere acceptoren, terwijl een acceptormolecuul slechts energie van één donor op een bepaald moment kan ontvangen. Zelfs als slechts één acceptor met een donor kan communiceren vanwege de stoichiometrie van de interactie, wordt verwacht dat een toename van de acceptorconcentratie de fractie van donoren in complex met de acceptor zal verhogen vanwege de wet van massa-actie. Voor een vaste (of smalle bandbreedte van) donorexpressie zou de FRET-efficiëntie dus moeten stijgen met toenemende N A/ND. Bij het uitzetten van de FRET-efficiëntie E versus N A/N D voor de co-expressie van GFP en Cherry, d.w.z. de negatieve sonde, mag een toename van N A/N D echter niet leiden tot een toename van de FRET-efficiëntie (ten minste bij voldoende lage acceptorconcentraties waarbij willekeurige FRET vanwege de nabijheid van acceptorkleurstoffen tot donorkleurstoffen niet voorkomt).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont de beelden verkregen in respectievelijk het donorkanaal, kanaal 1 (488, 505-530 nm), het overdrachtskanaal, kanaal 2 (488, >585 nm) en het acceptorkanaal, kanaal 3 (561, >585 nm). Representatieve afbeeldingen van cellen die alleen GFP tot expressie brengen, alleen Cherry, co-expressie van GFP en Cherry, en tot expressie brengen van het GFP-Cherry fusie-eiwit. De gemiddelde cellulaire FRET-efficiënties berekend in NRK-cellen die GFP-Cherry-fusie-eiwit tot expressie brengen (positieve controle, figuur 2A) en die co-expressie GFP-Cherry (negatieve controle, figuur 2B) worden uitgezet versus de intensiteitsratio van de acceptor-donorratio (Q) of moleculaire verhouding N A/ND in elke cel. Figuur 2C illustreert een voorbeeld van hoe een gebied van belang kan worden geschetst en perinucleaire blaasjes met hoge autofluorescentie kunnen worden vermeden.

Het gepresenteerde algoritme kan worden gebruikt om de FRET-efficiëntie in elke interessante regio te kwantificeren, inclusief de kwantificering in elke pixel van het beeld in het overdrachtskanaal. Figuur 2D toont genormaliseerde pixel-voor-pixel FRET-beelden van cellen die het GFP-Cherry-fusie-eiwit tot expressie brengen, GFP en Cherry co-expresseren als negatieve controle en receptorsubeenheden van de Ashwell-Morell-receptor tot expressie brengen. De rattenvariant van deze receptor, de hepatische lectine van de rat (RHL1 en RHL2), is een receptorsysteem met twee subeenheden waarvan bekend is dat het hetero-oligomeriseert. Alle FRET-efficiënties werden genormaliseerd naar die van het GFP-Cherry-fusie-eiwit. We labelden RHL1 en 2 met GFP en Cherry aan de cytoplasmatische kant van het plasmamembraan. De afbeelding toont verschillende FRET-waarden bij het plasmamembraan in vergelijking met intracellulaire blaasjes. Het verwijderen van het stengeldomein van RHL1 (GFP-RHL1Δstalk), waarvan wordt gedacht dat het de nauwe interactie tussen de twee subeenheden bemiddelt, vermindert de gedetecteerde FRET-efficiëntie. In figuur 2E worden de gemiddelde cellulaire FRET-efficiënties van cellen die GFP-RHL1 en Cherry-RHL2 tot expressie brengen, en GFP-RHL1Δstalk en Cherry-RHL2 uitgezet versus de moleculaire verhouding tussen acceptor en donor (N A/ND). Voor verdere FRET-analyses van dit receptorsysteem kan de lezer verwijzen naar een eerdere publicatie5.

Figure 1
Figuur 1: Representatieve beelden van cellen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen. Cellen die alleen GFP (A), alleen Cherry (B), GFP en Cherry co-expressie (C) en GFP-Cherry fusie-eiwit (D) tot expressie brengen. Beelden in respectievelijk kanaal 1 (488, 505-530 nm), kanaal 2 (488, >585 nm) en kanaal 3 (561, >585 nm). Beelden werden verkregen met 63x olieobjectief en zoom ingesteld op 3x. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Kwantificering van FRET-beelden. Gemiddelde cellulaire FRET-efficiëntie voor cellen die het GFP-Cherry-fusie-eiwit uitzetten, uitgezet versus de acceptor-tot-donorintensiteitsverhouding (Q) (A) en versus de moleculaire verhouding tussen acceptor en donor (N A/N,D) voor cellen die GFP en Cherry (B) co-expresseren. Open cirkel dikke lijn vertegenwoordigt enkele cel die GFP-Cherry fusie-eiwit tot expressie brengt. Open cirkel dunne lijn vertegenwoordigt een cel co-expressie GFP en Cherry. Merk op dat bij hogere N A/ND-verhoudingen de fractie van het nuttige signaal, de gesensibiliseerde emissie (I DEα) in het overdrachtskanaal steeds kleiner wordt ten opzichte van de directe excitatie van de acceptor (IAS2). Dit resulteert in een grotere fout in de bepaling van E. Pixel-voor-pixel FRET-afbeeldingen berekend met behulp van het gepresenteerde algoritme (C). Dit paneel illustreert een cel die GFP en Cherry, de negatieve controle, co-expressie geeft in het donorkanaal, het overdrachtskanaal en het acceptorkanaal. Het toont ook een mogelijke schets van een gebied van belang dat perinucleaire blaasjes met hoge autofluorescentie vermijdt, wat een negatieve invloed kan hebben op de precisie van de FRET-berekening. (D) Alle FRET-efficiënties werden genormaliseerd tot die van het GFP-Cherry-fusie-eiwit. Van links naar rechts, GFP-Cherry fusie-eiwit (positieve controle), GFP Cherry co-expressie (negatieve controle), GFP-RHL1 en Cherry-RHL2, en GFP-RHL1Δstalk en Cherry-RHL2. Schaalbalk: 10 μm. Kleurgecodeerde schaalbalk: genormaliseerde gemiddelde FRET-efficiëntie (genormaliseerd tot de gemiddelde waarde van de positieve controle, het GFP-Cherry-fusie-eiwit). (E) Dit paneel toont de gemiddelde cellulaire FRET-efficiëntie voor cellen die de GFP-RHL1 en Cherry-RHL2 tot expressie brengen, evenals GFP-RHL1Δstalk en Cherry-RHL2 uitgezet versus de moleculaire verhouding tussen acceptor en donor (N A / ND). Gesloten grijze cirkel vertegenwoordigt een enkele cel die GFP-RHL1 en Cherry-RHL2 uitdrukt. Gesloten zwarte cirkel vertegenwoordigt een cel die GFP-RHL1Δstalk en Cherry-RHL2 uitdrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier 1: Algoritme voor andere donor-acceptorparen. Algoritme voor andere donor-acceptor paren zoals verschillende versies van cyaan (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) en gele (EYFP, Citrine, Venus, SYFP2, YPet) fluorescerende eiwitten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Spreadsheet met het gepresenteerde FRET-algoritme en gebruik van het GFP-Cherry-fusie-eiwit om FRET te kwantificeren door gesensibiliseerde emissie van de acceptor en donor-quenching. Cellen A2, B2, C2: Gemiddelde achtergrondsignalen (B 1, B 2, B 3) in respectievelijk kanalen 1, 2 en 3. Cellen D2 en E2: Gemiddelde waarden voor cross-talk factoren S 1 en S 2. Cel G2: Waarde voor extinctiecoëfficiëntverhouding Equation 11. Cel I1 en I2: Extinctiecoëfficiënten van GFP en Cherry bij 488 nm laserlicht. Cel J2: Gemiddelde waarde voor factor. Kolom C (C5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteit van een cel die GFP tot expressie brengt in kanaal 1. Kolom D (D5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteit van een cel die GFP uitdrukt in kanaal 2. Kolom E (E5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteit van een cel die GFP uitdrukt in kanaal 3. Kolommen F, G en H (respectievelijk F5, G5, H5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteiten afgetrokken van de gemiddelde achtergrondintensiteiten in alle 3 de kanalen. Kolom I (I5 en hoger): berekende overspraakfactor S1. Kolom M (M5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteit van een cel die Cherry tot expressie brengt in kanaal 1. Kolom N (N5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteit van een cel die Cherry uitdrukt in kanaal 2. Kolom O (O5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteit van een cel die Cherry uitdrukt in kanaal 3. Kolommen P, Q en R (respectievelijk P5, Q5, R5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteiten afgetrokken van de gemiddelde achtergrondintensiteiten in alle 3 de kanalen. Kolom S (S5 en hoger): berekende overspraakfactor S2. Kolom W (W5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteit van een niet- of nep-getransfecteerde cel in kanaal 1. Kolom X (X5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteit van een niet- of nep-getransfecteerde cel in kanaal 2. Kolom Y (Y5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteit van een niet- of nep-getransfecteerde cel in kanaal 3.Kolom AD (AD5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteit van een cel die het GFP-Cherry-fusie-eiwit (of co-expressie GFP en Cherry, of een eiwitpaar van belang) tot expressie brengt in kanaal 1. Kolom AE (AE5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteit van een cel die het GFP-Cherry-fusie-eiwit (of co-expressie GFP en Cherry, of een eiwitpaar van belang) tot expressie brengt in kanaal 2. Kolom AF (AF5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteit van een cel die het GFP-Cherry fusie-eiwit (of co-expressie GFP en Cherry, of een eiwitpaar van belang) tot expressie brengt in kanaal 3. Kolommen AG, AH en AI (respectievelijk AG5, AH5, AI5 en hoger): gemeten fluorescentie-intensiteiten afgetrokken van de gemiddelde achtergrondintensiteiten in alle 3 de kanalen. Kolom AJ (AJ5 en hoger): Berekend α factor. Kolom AK (AK 5 en hoger): Berekend gemiddelde FRET-rendement E. Kolom AL (AL5 en hoger): berekende gecorrigeerde verhouding tussen acceptor en donorintensiteit (Q). Voorbeelden voor berekende parameters uit een FRET-experiment uitgedrukt als gemiddelde en standaardafwijking: S1 = 0,2232 ± 0,0060. S2 = 0,2039 ± 0,0074. α = 1.9463 ± 0.1409. E = 0,2713 ± 0,0220. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 1: GFP- en Cherry-absorptie- en emissiespectra. Genormaliseerde absorptie- en fluorescentie-emissiespectra van eGFP en mCherry. De excitatielaserlijnen (488 en 543 nm) en filtertransmissies die worden gebruikt voor het donorkanaal (ch1: 505-530 nm) en de overdrachts-/acceptorkanalen (ch2 &; 3: >585 nm) in de confocale microscoop worden gemarkeerd door arcering. Voor excitatie van de acceptor kunnen ook 561 of 590 nm laserlijnen worden gebruikt. Bron: databank fluorescerend eiwit (fpbase.org). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van de genetisch gekoppelde één-op-één fluorescerende eiwitkalibratiesonde voor het kwantificeren van FRET met behulp van de detectie van gesensibiliseerde emissie van de acceptor en het blussen van het donormolecuul door confocale microscopie. Deze methode kan worden toegepast om eiwitinteracties te beoordelen in de fysiologische context van de levende cel in verschillende subcellulaire compartimenten. De ruimtelijke resolutie kan verder worden verbeterd door het gepresenteerde algoritme toe te passen om FRET-efficiënties in elke pixel van een afbeelding te berekenen (pixel-voor-pixel FRET). Op intensiteit gebaseerde bepaling van absolute FRET-efficiënties vereist de bepaling van de cross-talk, hier gekwantificeerd met de S-factoren , en de detectie-efficiëntie van donor- en acceptormoleculen door de gegeven microscopische opstelling, gekwantificeerd door de α factor. Hier wordt een protocol verstrekt dat kwantificering van zowel cross-talk als detectie-efficiëntie mogelijk maakt. Directe koppeling van de genetische informatie van fluorescerend eiwit garandeert equimolaire expressie in levende cellen en maakt daardoor de bepaling van de α factor mogelijk. Kennis van de α factor is op zijn beurt een voorwaarde voor de kwantificering van de FRET-efficiëntie in levende cellen. Kritische stappen in het meegeleverde protocol zijn het correct klonen van de direct gekoppelde fluorescerende eiwitchimaera, voldoende tijd na transfectie om fluorescerende eiwitrijping mogelijk te maken, gebruik van fluorescerende eiwitten in een vergelijkbare cellulaire micro-omgeving, bijvoorbeeld fluorescerende eiwitten in cytoplasma en aan de cytoplasmatische kant van het plasmamembraan, en een stabiele microscoopopstelling.

Experimentele set-up en algoritme hier gepresenteerd zijn ontworpen voor de GFP-Cherry FRET paar. We bieden in het Aanvullend Dossier 1 het algoritme voor verschillende versies van cyaan (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) en gele fluorescerende eiwitten (EYFP, Citrien, Venus, SYFP2, YPet). Het voordeel van deze fluorescerende eiwitparen is een grotere spectrale overlap tussen het emissiespectrum van het cyaan en het absorptiespectrum van het gele eiwit (in vergelijking met GFP-Cherry), wat resulteert in iets hogere R0-waarden en grotere FRET-efficiënties. Om dezelfde reden zijn het aantal niet-verwaarloosbare overspraakfactoren en hun omvang echter ook groter (zie aanvullende tekst).

Beperkingen van kwantitatieve microscopische ratiometrische FRET in levende cellen moeten worden overwogen en worden besproken. Voorwaarde voor het gebruik van FRET voor het detecteren van moleculaire interacties is de toepassing van fluorescerende tags. Ons protocol maakt gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten. Aangezien deze fluorescerende eiwitten qua grootte (27 kDa) vergelijkbaar kunnen zijn met het gelabelde eiwit van belang, kunnen ze de lokalisatie en functie van het eiwit van belang veranderen. Daarom moeten zowel de lokalisatie als de functionaliteit van elk gelabeld eiwit van belang worden getest en vergeleken met die van het endogene niet-gelabelde eiwit. Een ander kritisch punt om in gedachten te houden is de endogene ongelabelde pool van het eiwit van belang. De interacties van de gelabelde met niet-gelabelde endogene eiwitten zullen het FRET-signaal verminderen. Idealiter zijn alle eiwitten van belang gelabeld. Dit kan worden bereikt door cellen te gebruiken die het eiwit van belang niet endogeen hebben (zoals in het voorbeeld in figuur 2C en 2E ), cellen te gebruiken die zijn afgeleid van knock-in muizen, CRISPR-gemodificeerde cellen te gebruiken, enz. Zelfs met het gebruik van pixel-voor-pixel FRET zal het signaal van donor- en acceptormoleculen worden gemiddeld over een diffractie-beperkte plek, de resolutielimiet van een confocale microscoop. Daarom is het onmogelijk om verschillende donorpopulaties op te lossen binnen een diffractie-beperkte plek. Er kunnen donoren zijn zonder acceptor, of donoren met meerdere acceptanten die bijdragen aan het gemiddelde FRET-signaal. Het ontleden van verschillende moleculaire subpopulaties door FRET vereist fluorescentie lifetime imaging22. Een ander probleem, vooral bij hoge expressieniveaus, is de zogenaamde willekeurige FRET tussen fluoroforen in de nabijheid zonder onderliggende interactie van de eiwitten van belang23. Deze willekeurige FRET kan significant zijn in het plasmamembraan gezien de 2D-opsluiting van de membraaneiwitten in vergelijking met vrij diffusieve cytoplasmatische eiwitten. Daarom moeten controle-experimenten altijd worden uitgevoerd, zoals het verwijderen van domeinen die de veronderstelde interactie tussen moleculen bemiddelen en testen op vermindering van het gedetecteerde FRET-signaal.

De onzekerheid van exacte stoichiometrieën van interagerende eiwitten in levende cellen beperkt het gebruik van FRET als spectroscopische liniaal om moleculaire afstanden tussen eiwitten in levende cellen te beoordelen. Zelfs in het geval van een strikte één-op-één interactie, kan (i) de flexibiliteit van de linker die het fluorescerende eiwit aan het eiwit van belang hecht, evenals (ii) het gebrek aan kennis van de relatieve oriëntatie van de dipoolmomenten van de kleurstoffen (het bepalen van de zogenaamde κ2-factor ) de exacte afstandsmetingen verstoren. Studies naar acceptorfusieconstructies met stijve linkers van verschillende lengtes die de twee fluoroforen scheiden en verschillende FRET-efficiënties vertonen, zijn elders gerapporteerd12. Omgekeerd is het beoordelen van stoichiometrieën met FRET-metingen in levende cellen complex, maar mogelijk met behulp van de gepresenteerde ratiometrische FRET-kwantificering. De geneigde lezer kan worden verwezen naar eerder werk waarin een haalbare aanpak wordt beschreven5.

Samenvattend maakt de hier gepresenteerde kwantitatieve FRET-benadering de detectie mogelijk van (i) eiwitinteracties in de fysiologische context van de levende cel, (ii) veranderingen in eiwitinteracties in de loop van de tijd en (iii) verschillen in interacties in verschillende subcellulaire compartimenten tot op het pixel-voor-pixelniveau van een confocaal beeld, en (iv) de afhankelijkheid van het gedetecteerde FRET-signaal van de moleculaire acceptor-donorverhouding uitgedrukt in een levende cel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We willen de Neuroscience Imaging Service van Stanford University School of Medicine bedanken voor het leveren van apparatuur en ruimte voor dit project. Dit onderzoek werd ondersteund door intramurale financiering van het Stanford Cancer Institute en de Gynecologic Oncology Division Stanford, evenals GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 van het National Research, Development and Innovation Office, Hongarije.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) Thermo Fisher Scientific 15400054
Clontech mCherry N1 vector Addgene 3553
DMEM without phenol red Thermo Fisher Scientific 11054020
Fugene 6 Promega E2691
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080
LabTek 8-well chambers #1.0 Thermo Fisher Scientific 12565470
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific 25030081

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
  2. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  3. Mekler, V. M. A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer. Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).
  4. Vamosi, G., et al. Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study. Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).
  5. Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).
  6. van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).
  7. Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).
  8. Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors. Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).
  9. Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry Part A. , 24194 (2020).
  10. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  11. Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173, 1 Spec No 33-38 (1996).
  12. Nagy, P., et al. Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins. Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).
  13. Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).
  14. Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy. Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).
  15. Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).
  16. Sebestyen, Z., et al. Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).
  17. Szaloki, N., et al. High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).
  18. McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).
  19. Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Scott, B. L., Hoppe, A. D. Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells. Science Reports. 5, 10270 (2015).
  22. Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it. Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).
  23. King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments. Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).

Tags

Biologie live-cell imaging FRET kwantitatieve fluorescentiemicroscopie fluorofoor eiwitinteractie gesensibiliseerde emissie

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

to:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

Beoordeling van eiwitinteracties in levende cellen met FRET-gesensibiliseerde emissie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vámosi, G., Miller, S., Sinha,… More

Vámosi, G., Miller, S., Sinha, M., Fernandez, M. K., Mocsár, G., Renz, M. Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. J. Vis. Exp. (170), e62241, doi:10.3791/62241 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter