Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הערכת אינטראקציות חלבונים בתאים חיים עם פליטה רגישה ל-FRET

Published: April 22, 2021 doi: 10.3791/62241
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) בין שתי מולקולות פלואורופור יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבונים בתא החי. כאן, פרוטוקול מסופק כיצד למדוד FRET בתאים חיים על ידי זיהוי פליטה רגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

Abstract

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) היא העברת אנרגיה ללא קרינה מתורם נרגש למולקולה מקבלת ותלויה במרחק ובכיוון של המולקולות, כמו גם במידת החפיפה בין ספקטרום פליטת התורם לספקטרום קליטת המקבל. FRET מאפשר לחקור את האינטראקציה של חלבונים בתא החי לאורך זמן ובתאים תת-תאיים שונים. אלגוריתמים שונים מבוססי עוצמה למדידת FRET באמצעות מיקרוסקופיה תוארו בספרות. כאן, פרוטוקול ואלגוריתם מסופקים לכימות יעילות FRET בהתבסס על מדידת הפליטה הרגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם. הכימות של FRET יחסימטרי בתא החי דורש לא רק את קביעת הקרוס-טוק (זליגה ספקטרלית, או דימום) של החלבונים הפלואורסצנטיים, אלא גם את יעילות הזיהוי של המערך המיקרוסקופי. הפרוטוקול המובא כאן מפרט כיצד להעריך פרמטרים קריטיים אלה.

Introduction

ניתוח מבוסס מיקרוסקופיה של Förster Resonance Energy Transfer (FRET) מאפשר הערכה של אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים. הוא מספק מידע מרחבי וזמני, כולל מידע על היכן בתא ובאיזה תא תת-תאי מתרחשת האינטראקציה ואם אינטראקציה זו משתנה עם הזמן.

תיאודור פורסטר הניח את הבסיס התאורטי של FRET בשנת 19481. FRET היא העברה ללא קרינה של אנרגיה מתורם נרגש למולקולת קבלה, והיא תלויה במרחק המולקולות ובאוריינטציה היחסית של דיפולי המעבר שלהן, כמו גם בחפיפה בין ספקטרום פליטת התורם לספקטרום קליטת המקבל. קצב העברת האנרגיה עומד ביחס הפוך לחזקה השישית של מרחק התורם-מקבל. לפיכך, FRET יכול לשמש למדידת קרבה מולקולרית בטווח של 1-10 ננומטר.

FRET מתחרה בתהליכי עירור אחרים של מולקולת התורם ומביא למה שמכונה פליטה מרוותה ורגישה של התורם של המקבל. מרווה מתורם היא הפחתה של מספר פוטוני התורם הנפלטים, בעוד פליטה רגישה היא עלייה בפוטונים הקולטים הנפלטים. ניתוחי FRET מיקרוסקופיים רבים משתמשים במדידות עוצמת פלואורסצנטיות, כולל הלבנה פוטואורסצנטית של המקבל 2, הלבנה פוטו-לוגית של תורם2, או הלבנה פוטו-רגישה ל-FRET של המקבל3.

כאן, פרוטוקול ניסויי שלב אחר שלב ואלגוריתם מתמטי מוצגים כדי לכמת FRET באמצעות מרווה תורם ומקבל פליטה רגישה4,5, שיטה המכונה לעתים קרובות FRET יחסי. פרוטוקולים רבים כיצד להעריך פליטה רגישה פורסמו, מעטים כימתו את יעילות FRET המוחלטת 6,7,8,9. כימות יעילות FRET בתא החי דורש לקבוע (i) את crosstalk (זליגה ספקטרלית, או דימום דרך) של החלבונים הפלואורסצנטיים, וגם (ii) את יעילות הזיהוי של המערך המיקרוסקופי. בעוד שניתן להעריך דיבור צולב על ידי תאי הדמיה המבטאים רק אחד מהפלואורופורים, הערכת יעילות הזיהוי היחסית של התורם והפלואורסצנטיות המקבלת מורכבת יותר. זה דורש ידע של לפחות את היחס בין מספר מולקולות תורם ומקבל היוצר את האותות הנמדדים. עם זאת, מספר הפלואורופורים המבוטאים בתאים חיים משתנה מתא לתא ואינו ידוע. מה שמכונה גורם α מאפיין את עוצמות האות היחסיות ממולקולת תורם ומקבל נרגשת אחת. ידיעת הגורם היא תנאי מוקדם למדידות FRET יחסיות כמותיות בדגימות עם יחסי מולקולות משתנים בין קבלה לתורם, כפי שנתקלים בהן במהלך הדמיה של תאים חיים עם חלבונים פלואורסצנטיים. שימוש בחלבון היתוך 1 ל-1 תורם-מקבל כבדיקת כיול מאפשר קביעת גורם α ומשמש גם כבקרה חיובית. בדיקה מצומדת גנטית זו מבוטאת על ידי תאים בכמויות כוללות לא ידועות אך בכמות יחסית קבועה וידועה של אחד לאחד. הפרוטוקול הבא מפרט כיצד לבנות את הגשושית 1 ל-1 וכיצד להשתמש בה לכימות יעילות FET. גיליון אלקטרוני הכולל את כל הנוסחאות נמצא במוסף ויכול לשמש את הקוראים כדי להזין את המידות שלהם בעמודות המתאימות כמפורט להלן.

בעוד שהפרוטוקול משתמש בזוג התורם/מקבל GFP-Cherry, ניתן לבצע את הגישה המוצגת עם כל זוג FRET אחר. הקובץ המשלים 1 מספק פרטים על זוגות ציאן-צהוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בניית פלסמיד

  1. ליצירת בדיקת ההיתוך eGFP-mCherry1, השתמש בווקטור ביטוי תאי יונקים N1 (ראה טבלת חומרים) עם mCherry110 שהוכנס באמצעות אתרי ההגבלה AgeI ו - BsrGI.
  2. השתמש באוליגונוקלאוטידים הבאים כדי להגביר את eGFP11 ללא קודון עצירה כקטע SalI-BamHI : פריימר N-terminal 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' ופריימר C-terminal 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC CTC GTC GTC CAT GC 3'.
  3. הכנס מקטע SalI-BamHI זה לאתר השיבוט המרובה של וקטור N1 כדי להציג מקשר RNPPV (חמש חומצות אמינו) בין החלבון הפלואורסצנטי הירוק והאדום.
    הערה: מקשר זה מניב יעילות FRET ממוצעת עבור זוג התורמים-מקבלים GFP-Cherry של כ-0.25-0.3 (איור 1A). הבחירה במקשרים קשיחים12 וסליליים13 באורכים משתנים כדי להגדיל את יעילות FRET הנמדדת נדונה במקומות אחרים, אך אינה נדרשת למטרתנו של חלבון ההיתוך. בהמשך לשם הפשטות נקרא לחלבונים הפלואורסצנטיים 'GFP' ו'דובדבן'.

2. תרבית תאים וטרנספקציה

  1. השתמש בכל קו תאים, למשל, תאי NRK, עבור ניסויי FRET במדיה, למשל, מדיה שונה של Eagle's Media (DMEM) של Dulbecco, ללא אדום פנול, כדי להפחית פלואורסצנטיות רקע. מאותה סיבה, מומלץ להשתמש בטריפסין ללא פנול אדום.
  2. ברגע שהתאים נפגשים ב-80%, מנתקים תאים עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA, סופרים את מספר התאים בתרחיף באמצעות תא נויבאואר וזורעים כ-10,000 תאים לבאר של זכוכית כיסוי בעלת 8 תאים; לחלופין, מתרבית תאים קונפלואנטית שגדלה בבקבוק T25, השתמשו בטיפה אחת של תרחיף תאים מפיפטה של 2 מ"ל או ב-3 טיפות מתרחיף תאים של 5 מ"ל מתרבית מפגש שגדלה בצלוחית של תרבית תאי T 12.5.
  3. לגדל תאים בתאי 8 בארות (0.8 ס"מ 2 / טוב) עם זכוכית כיסוי #1.0 למיקרוסקופ תאים חיים פלואורסצנטיים בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס ו -5% CO2).
  4. 24 שעות לאחר ציפוי ההדבקה של התאים באמצעות מדיית טרנספקציה מסחרית מתאימה (ראה טבלת חומרים), עם תערובת GFP, דובדבן, GFP/דובדבן (תערובת 1:1, כלומר 0.8 מיקרוגרם ו-0.8 מיקרוגרם GFP ו-DNA פלסמיד דובדבן), וכימרה GFP-Cherry.
    1. עבור transfection, להשתמש 5 μL של מגיב transfection ב 45 μL של DMEM ו 1.6 מיקרוגרם של DNA פלסמיד. ערבבו על ידי תנועה עדינה של צינור המיקרוצנטריפוגה.
    2. לאחר 15 דקות דגירה של התערובת בטמפרטורת החדר, להוסיף 1-2 μL של תערובת מגיב transfection לכל באר של שקופית תא 8 בארות. מחזירים את זכוכית הכיסוי התאית לאינקובטור.
  5. יש לחלוף 20 שעות לאחר הטרנספקציה לפני הדמיה של תאים חיים, כדי לאפשר ביטוי תקין של חלבון פלואורסצנטי, קיפול והבשלה, במיוחד של הפלואורופור האדום.

3. הדמיית FRET

  1. תמונה תאים נגועים בתא סביבתי לח ומחומם ב 37 ° C. כדי לאגור את המדיה התאית ב- pH פיזיולוגי, השתמש בגז CO 2 המוגדר לזרימה של 5%, או הוסף HEPES של 20 mM כדי להפוך את המדיה התאית לבלתי תלויה ב- CO2.
  2. השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. הגדר את העירור והפליטה באופן הבא כדי למטב את האות ולמזער דיבור צולב.
    1. השתמש בקו 488 ננומטר של לייזר יון ארגון כדי לעורר GFP ובלייזר מצב מוצק שאוב דיודה 561 ננומטר (או לייזר הליום ניאון 543 ננומטר, בהתאם לקווי לייזר זמינים) כדי לעורר את Cherry.
    2. הגדר את הדברים הבאים בתוכנה של מיקרוסקופ קונפוקלי מסחרי. הגדר את המראה הדיכרואית ל- 488/ 561 בלחיצת כפתור באמצעות התפריט הנפתח. לאסוף פלואורסצנטיות באמצעות אור לייזר 488 ננומטר לעירור בערוץ 1 דרך פס פליטה של 505 - 530 ננומטר (או 505 - 550 ננומטר) ובערוץ 2 עם מסנן מעבר ארוך >585 ננומטר ולהשתמש באור לייזר 561 ננומטר לעירור בתעלה 3 עם מסנן מעבר ארוך > 585 ננומטר (הקלד באורכי גל). ניתן להשתמש גם במסנני פסים כגון 590 - 650 ננומטר או דומים שיש להם את היתרון של אי הכללת פיזור ראמאן.
  3. התרגש עם שני הלייזרים ברצף והגדר את מצב ההדמיה ל - Switch לאחר כל שורה , כך שהעירור של התמונה בגודל 512 x 512 פיקסלים לסירוגין לאחר כל שורה (ולא לאחר כל פריים, מה שיבטל את היכולת לזהות FRET עקב דיפוזיה של החלבונים המסומנים בעת הקלטת התמונות עם עירורים שונים; לחץ על כפתור).
  4. הגדר סדרה מיני-טיבית של שלוש תמונות בלחיצות לחצן כדי לזהות אם מתרחשת הלבנה משמעותית של הצבעה, ואולי להפחית את עוצמת הלייזר. הלבנה של פחות מ-1% היא אופטימלית. עוצמת לייזר גבוהה יכולה גם להוביל לרוויית ספיגה המפחיתה את יעילות FRET לכאורה14. עוצמת לייזר, עד 10-20 μW הנמדדת בעדשת האובייקט בטוחה לשימוש.
  5. ראשית, תאי תמונה המבטאים את מבנה ההיתוך GFP-Cherry. הגדר את הפרמטרים המגדירים את עוצמת הלייזר המשולבת בזמן לפיקסל בתמונה קונפוקלית, כלומר, זמן השהייה של הפיקסלים במיקרו-שניות, שידור המסנן האקוסטי-אופטי (AOTF) באחוזים והזום.
    1. תאים בתמונה המשתמשים במטרה שמן של 63x וזום מוגדר ל- 3x. הדבר מספק הגדלה ורזולוציה מספיקות לתאי תמונה בשלמותם. כוונו לגודל פיקסלים של 70-80 ננומטר.
    2. הגדר את זמן השהייה של פיקסלים ל- 2-4 μs ושידור AOTF עבור לייזר 488 ננומטר ו- 561 ננומטר, כך שלתמונות יהיה יחס אות לרעש טוב ללא הלבנה וללא פיקסלים המציגים רוויה בעוצמת פלואורסצנטיות. יתרון הוא להתאים את עוצמת הלייזר של 488 ו 561 כך שרמות האות בערוץ 1 ובערוץ 3 יהיו דומות.
    3. הגדר את הרווח Photomultiplier (מצב ממוצע) ל- 600-800.
  6. תמונה עם הגדרות אלה 15-20 תאים המבטאים את חלבון ההיתוך GFP-Cherry. 15-20 תאים מספקים נתונים סטטיסטיים טובים תוך שמירה על הזמן הכולל של סשן מדידת FRET מוגבל למספר שעות כדי לסייע להבטיח יציבות של ההגדרה המיקרוסקופית.
  7. תמונה עם תאי הגדרות זהים המבטאים GFP, Cherry, GFP ו- Cherry ותאים שאינם נגועים. חפשו תאים המבטאים תאים בערוץ הירוק או בערוץ האדום, בהתאמה.
  8. לאחר מכן, תמונה 15-20 תאים המבטאים במשותף חלבונים בעלי עניין המצומדים ל-GFP ולדובדבן, בהתאמה. בחיפוש אחר תאים מבטאים, הימנעו מחשיפה ארוכה של התאים על מנת לא להלבין את החלבונים הפלואורסצנטיים. לדובדבן יש יציבות אור נמוכה יותר מאשר GFP, והלבנה של צ'רי, המקבל פוגעת בניתוח FET.
    הערה: ספקטרום הספיגה והפליטה של GFP ודובדבן מוצג באיור משלים 1. לאחר מדידה של 5-6 שעות, מומלץ לחזור על הדמיה של מספר תאים המבטאים את כימרה GFP-Cherry בסוף ההדמיה כדי לתעד שהמערך נשאר יציב ויעילות FRET של חלבון ההיתוך GFP-Cherry לא השתנתה באופן משמעותי במהלך סשן ההדמיה.

4. ניתוח תמונה לאיתור יעילות FRET מוחלטת באמצעות מרווה של תורמים ופליטה רגישה

הערה: כאן מסופק מדריך מעשי שלב אחר שלב כיצד לקבוע יעילות FRET באמצעות הגיליון האלקטרוני המצורף (קובץ משלים 2). תיאוריה וגזירה של המשוואות המוצגות ניתן למצוא בפירוט בפרסומים קודמים 4,15,16,17. עם ההגדרות המתוארות, נאספות עוצמות הפלואורסצנטיות הבאות.

  1. מדוד את אות התורם I 1 בערוץ 1, ערוץ התורם, עם עירור 488 ננומטר ורצועת פליטה של 505-530 ננומטר.
    Equation 2
    כאשר ID הוא אות התורם הבלתי מרוווה בערוץ 1 שיימדד בהיעדר מקבל, הוא יעילות FRET הממוצעת, ו- B 1 אות הרקע הממוצע בערוץ 1.
  2. מדוד את אות המקבל I 3 בערוץ 3, ערוץ המקבל, עם עירור ופליטה של 561 ננומטר ב- >585 ננומטר.
    Equation 3
    כאשר IA הוא אות הקבלה ו-B 3 הוא הרקע בערוץ 3.
  3. מדוד את אות FRET בערוץ 2, ערוץ ההעברה, עם עירור ופליטה של 488 ננומטר ב- >585 ננומטר.
    Equation 4
    כאשר, האות בערוץ 2 הוא סכום של ארבעה מרכיבים שונים: (i) I D(1 - E)S 1 הוא הזליגה הספקטרלית מהאות התורם המרווה לערוץ הגילוי >585 (עם גורם הדיבור הצולב S 1), (ii) IA S 2 הוא האות המקבל מהעירור הישיר על ידי אור 488 ננומטר (עם גורם הדיבור הצולב S2), (iii) IDEα הוא הפליטה הרגישה של המקבל על ידי FRET ממולקולת התורם הנרגש (α יפורט בהמשך 4.8 - 4.10.), ו- (iv) B2 הוא אות הרקע.
  4. למדוד עוצמות רקע ממוצעות בתעלות 1, 2, 3 בתאים שאינם נגועים או מדומים; כל אחד מהם בסדר עם הבדל זניח. עבור כל מדידות התא, השתמש בכלי יד חופשית כדי לתחום אזורי עניין ולהימנע משלפוחיות פרי-גרעיניות עם אוטופלואורסצנטיות מוגברת. חשוב להימנע autofluorescence משמעותי מן שלפוחיות perinuclear אלה.
    1. הזן את המידות בעמודות X, Y ו- Z של הגיליון האלקטרוני שסופק. עוצמות הרקע הממוצעות בשלושת הערוצים מוזנות ל- A2, B2 ו- C2 של הגיליון האלקטרוני של Excel (קובץ משלים 2).
  5. מדדו עוצמות ממוצעות בתעלות 1, 2, 3 של תאים המבטאים GFP או דובדבן בלבד, והזינו את המדידות לעמודות C, D, E ו-N, O, P. עוצמות הרקע המתאימות מופחתות (ב-F, G, H ו-Q, R, S).
  6. על מנת לחשב E, יעילות FRET, לקבוע את גורמי הדיבור הצולבות S 1 ו- S2. גורם הדיבור הצולבות הספקטרלי S1 מחושב מתאים המבטאים GFP בלבד
    Equation 6
    בעמודה I. הזן את הערך הממוצע עבור S1 בתא D2 בגיליון האלקטרוני של Excel.
  7. חישוב פקטור הדיבור הצולב-ספקטרלי S2 מתאים המבטאים רק דובדבן
    Equation 7
    בעמודה T. הזן את הממוצע עבור S2 בתא E2 בגיליון האלקטרוני של Excel.
  8. ודא שגורם α מקשר את האות מכל מספר נתון של מולקולות GFP מעוררות בערוץ 1 לאות של מספר שווה של מולקולות דובדבן מעוררות בערוץ 2, ומוגדר על ידי
    Equation 8   Equation 13
    כאשר Q A ו-Q D הם התשואות הקוונטיות הפלואורסצנטיות של Cherry ו-GFP; ηA ו-ηD יעילות הזיהוי של פלואורסצנטיות של מקבל ותורם בתעלות 2 ו-1, בהתאמה.
    הערה: ניתן לקבוע את גורם α משתי דגימות המבטאות כמויות מוחלטות ידועות של GFP ודובדבן. עם זאת, אי אפשר לדעת את הכמות המדויקת של GFP ודובדבן המבוטאים בתא. לכן, חישבנו את הגורם באמצעות תאים המבטאים את חלבון ההיתוך GFP-Cherry. כאן, בעוד שהכמות האבסולוטית עדיין אינה ידועה, היחס בין מולקולות התורם והמקבל ידוע כאחד.
  9. מדדו עוצמות ממוצעות בתעלות 1, 2, 3 של תאים המבטאים את חלבון ההיתוך GFP-Cherry, והזינו את המדידות לעמודות AE, AF, AG. עוצמות הרקע מופחתות (ב- AH, AI, AJ).
  10. חשב את גורם α (עמודת AJ) מעוצמות הפלואורסצנטיות בערוץ 1, 2 ו- 3 של חלבון היתוך GFP-Cherry באופן הבא:
    Equation 10
  11. עוצמות מתוקנות רקע שנמדדו בערוץ 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B 2) ו- 3 (I 3 - B3), בהתאמה, נמדדות באמצעות כימרה GFP-Cherry. גורם הדיבור הצולבות הספקטרלי S1 נקבע באמצעות תאים המבטאים GFP בלבד (ראה 4.7). εD ו-ε A הם מקדמי ההכחדה של GFP, התורם, וצ'רי, המקבל, ב-488 ננומטר, וניתן לקבוע אותם מהספרות (ε GFP = 53,000 M-1 cm-1)18 ועקומת הספיגה של דובדבן (εCherry ≈ 5560 M-1cm 1). היחס Equation 11 הוזן בתא G2 של הגיליון האלקטרוני של Excel. הזן את הערך הממוצע של גורם α ב- J2.
  12. השתמש בגורם α שנקבע לחישוב יעילות FET, E, באופן הבא (עמודה AK):
    Equation 12
  13. לחלופין, קבע יעילות FET, E, עבור הבקרות השליליות, כלומר, הביטוי המשותף של GFP ו- Cherry והביטוי של GFP בלבד על ידי הוספת המדידות של ערוצים 1, 2 ו- 3 בגיליון האקסל בעמודה AD, AE ו- AF תחת מדידות חלבון היתוך GFP-Cherry. לקבוע יעילות FRET בין GFP וחלבונים מסומנים דובדבן של עניין באותו אופן.
  14. לקבוע את עוצמת התורם הבלתי מרווה, I D כמו (I 1 - B 1)/(1 - E), ואת עוצמת המקבל כמו I A = I 3 - B3; ערכים אלה פרופורציונליים לרמות הביטוי של החלבונים המתויגים.
  15. קבע את יחס עוצמת המקבל לתורם המתוקן (Q) של חלבון היתוך GFP-Cherry באופן הבא (עמודה AL):
    Equation 13
  16. עבור תאים אחרים שעברו טרנסבקציה משותפת, חשב את היחס המולקולרי בין מקבל לתורם N A/ND באופן הבא:
    Equation 14
    הערה: הרציונל לקבוע את יחס N A/N D ולשרטט את יעילות ה-FRET התאית הממוצעת E לעומת N A/N D, הוא שמולקולה תורמת אחת יכולה להעביר אנרגיה למספר מקבלים בעוד שמולקולה מקבלת יכולה לקבל אנרגיה רק מתורם אחד בזמן נתון. גם אם רק מקבל אחד יכול לקיים אינטראקציה עם תורם בגלל הסטויכיומטריה של האינטראקציה, עלייה בריכוז המקבל צפויה להגדיל את שיעור התורמים המורכבים עם המקבל בגלל חוק הפעולה ההמונית. לכן, עבור טווח קבוע (או צר של) ביטוי תורם, יעילות FRET צריכה לעלות עם הגדלת N A/ND. כאשר משרטטים את יעילות FRET E לעומת N A/N D עבור הביטוי המשותף של GFP ו- Cherry, כלומר הבדיקה השלילית, עם זאת, עלייה ב- N A/N D לא אמורה לגרום לעלייה ביעילות FRET (לפחות בריכוזי קבלה נמוכים מספיק שבהם FRET אקראי עקב קרבת צבעים מקובלים לצבעי תורם אינו מתרחש).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג את התמונות שהתקבלו בערוץ התורם, ערוץ 1 (488, 505-530 ננומטר), ערוץ ההעברה, ערוץ 2 (488, >585 ננומטר) וערוץ המקבל, ערוץ 3 (561, >585 ננומטר), בהתאמה. תמונות מייצגות של תאים המבטאים GFP בלבד, דובדבן בלבד, המבטאים במשותף GFP ודובדבן, ומבטאים את חלבון ההיתוך GFP-Cherry. יעילות ה-FRET התאית הממוצעת המחושבת בתאי NRK המבטאים חלבון היתוך GFP-Cherry (בקרה חיובית, איור 2A) ובתאים המבטאים במשותף GFP-Cherry (בקרה שלילית, איור 2B) משורטטות לעומת יחס עוצמת יחס קבלה לתורם (Q) או יחס מולקולרי N A/ND בכל תא. איור 2C מדגים דוגמה כיצד לשרטט אזור מעניין ולהימנע משלפוחיות פרי-גרעיניות עם אוטופלואורסצנטיות גבוהה.

האלגוריתם המוצג יכול לשמש לכימות יעילות FRET בכל אזור עניין, כולל הכימות בכל פיקסל של התמונה בערוץ ההעברה. איור 2D מראה תמונות FRET מנורמלות פיקסל אחר פיקסל של תאים המבטאים את חלבון ההיתוך GFP-Cherry, מבטאים במשותף GFP וצ'רי כבקרה שלילית, ומבטאים תת-יחידות קולטן של קולטן אשוול-מורל. גרסת החולדה של קולטן זה, לקטין הכבד של החולדה (RHL1 ו-RHL2), היא מערכת קולטנים דו-תת-יחידה הידועה כהטרו-אוליגומריזציה. כל יעילות FRET נורמלה לזו של חלבון היתוך GFP-Cherry. סימנו RHL1 ו-2 עם GFP ודובדבן בצד הציטופלזמי של קרום הפלזמה. התמונה מציגה ערכי FRET ברורים בקרום הפלזמה בהשוואה לשלפוחיות תוך תאיות. מחיקת תחום הגבעול של RHL1 (GFP-RHL1Δstalk), שנחשב כמתווך את האינטראקציה ההדוקה בין שתי יחידות המשנה, מפחיתה את יעילות ה-FRET שזוהה. באיור 2E, יעילות FRET תאית ממוצעת של תאים המבטאים GFP-RHL1 ו-Cherry-RHL2, ו-GFP-RHL1Δstalk ו-Cherry-RHL2 משורטטים לעומת היחס המולקולרי בין מקבל לתורם (N A/ND). לניתוחי FRET נוספים של מערכת קולטנים זו הקורא יכול להפנות לפרסום קודם5.

Figure 1
איור 1: תמונות מייצגות של תאים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים. תאים המבטאים GFP בלבד (A), דובדבן בלבד (B), GFP וביטוי משותף של דובדבן (C), וחלבון היתוך GFP-Cherry (D). תמונות בערוץ 1 (488, 505-530 ננומטר), ערוץ 2 (488, >585 ננומטר) וערוץ 3 (561, >585 ננומטר), בהתאמה. התמונות התקבלו עם מטרת שמן 63x וזום מוגדר ל 3x. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: כימות תמונות FET. יעילות FRET תאית ממוצעת עבור תאים המבטאים את חלבון ההיתוך GFP-Cherry לעומת יחס עוצמת המקבל לתורם (Q) (A) ולעומת היחס המולקולרי בין המקבל לתורם (N A/ND) עבור תאים המבטאים במשותף GFP ודובדבן (B). קו עבה עיגול פתוח מייצג תא בודד המבטא חלבון היתוך GFP-Cherry. עיגול פתוח קו דק מייצג תא המבטא במשותף GFP ודובדבן. שים לב שביחסי N A/N D גבוהים יותר, החלק של האות השימושי, הפליטה הרגישה (I DEα) בערוץ ההעברה נעשית קטנה יותר ויותר ביחס לעירור הישיר של המקבל (IAS2). התוצאה היא שגיאה גדולה יותר בקביעה של E. תמונות FRET פיקסל אחר פיקסל מחושבות באמצעות האלגוריתם המוצג (C). פאנל זה מדגים תא המבטא במשותף GFP ודובדבן, הבקרה השלילית, בערוץ התורם, בערוץ ההעברה ובערוץ המקבל. זה גם מראה מתאר אפשרי של אזור עניין הימנעות שלפוחיות perinuclear עם autofluorescence גבוה אשר עלול להשפיע לרעה על הדיוק של חישוב FET. (D) כל יעילות FRET נורמלה לזו של חלבון היתוך GFP-Cherry. משמאל לימין, חלבון היתוך GFP-Cherry (בקרה חיובית), ביטוי משותף של GFP Cherry (בקרה שלילית), GFP-RHL1 ו-Cherry-RHL2, ו-GFP-RHL1Δstalk ו-Cherry-RHL2. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. סרגל קנה מידה מקודד בצבע: יעילות FRET ממוצעת מנורמלת (מנורמלת לערך הממוצע של הבקרה החיובית, חלבון ההיתוך GFP-Cherry). (E) פאנל זה מראה יעילות FRET תאית ממוצעת עבור תאים המבטאים את GFP-RHL1 ו-Cherry-RHL2, כמו גם GFP-RHL1Δstalk ו-Cherry-RHL2 שהתוו לעומת היחס המולקולרי בין מקבל לתורם (N A/ND). עיגול אפור סגור מייצג תא בודד המבטא GFP-RHL1 ו-Cherry-RHL2. עיגול שחור סגור מייצג תא המבטא GFP-RHL1Δstalk ו-Cherry-RHL2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: אלגוריתם לזוגות תורמים-מקבלים אחרים. אלגוריתם לזוגות תורמים-מקבלים אחרים כגון גרסאות שונות של חלבונים פלואורסצנטיים ציאן (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) וצהוב (EYFP, סיטרין, ונוס, SYFP2, YPet). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: גיליון אלקטרוני עם אלגוריתם FRET המוצג ושימוש בחלבון היתוך GFP-Cherry לכימות FRET על ידי פליטה רגישה של המקבל ומרווה התורם. תאים A2, B2, C2: אותות רקע ממוצעים (B 1, B 2, B 3) בערוצים 1, 2 ו- 3, בהתאמה. תאים D2 ו- E2: ערכים ממוצעים עבור גורמי דיבור צולב S 1 ו- S2. תא G2: ערך עבור יחס Equation 11מקדם הכחדה . תא I1 ו-I2: מקדמי הכחדה של GFP ודובדבן באור לייזר של 488 ננומטר. תא J2: ערך ממוצע עבור גורם. עמודה C (C5 ומעלה): נמדדה עוצמת הפלואורסצנטיות של תא המבטא GFP בתעלה 1. עמודה D (D5 ומעלה): נמדדה עוצמת הפלואורסצנטיות של תא המבטא GFP בערוץ 2. עמודה E (E5 ומעלה): נמדדה עוצמת פלואורסצנטיות של תא המבטא GFP בתעלה 3. עמודות F, G ו- H (F5, G5, H5 ומעלה, בהתאמה): עוצמות פלואורסצנטיות נמדדו מופחתות בעוצמות רקע ממוצעות בכל שלושת הערוצים. עמודה I (I5 ומעלה): גורם שיחה צולבת מחושב S1. עמודה M (M5 ומעלה): נמדדה עוצמת הפלואורסצנטיות של תא המבטא דובדבן בתעלה 1. עמודה N (N5 ומעלה): נמדדה עוצמת הפלואורסצנטיות של תא המבטא דובדבן בתעלה 2. עמודה O (O5 ומעלה): נמדדה עוצמת הפלואורסצנטיות של תא המבטא דובדבן בערוץ 3. עמודות P, Q ו- R (P5, Q5, R5 ומעלה, בהתאמה): נמדדו עוצמות פלואורסצנטיות שהופחתו בעוצמות רקע ממוצעות בכל שלושת הערוצים. עמודה S (S5 ומעלה): גורם דיבור צולב מחושב S2. עמודה W (W5 ומעלה): נמדדה עוצמת הפלואורסצנטיות של תא שאינו נגוע או מדומה בתעלה 1. עמודה X (X5 ומעלה): נמדדה עוצמת פלואורסצנטיות של תא לא נגוע או מדומה בתעלה 2. עמודה Y (Y5 ומעלה): עוצמת פלואורסצנטיות נמדדת של תא שאינו נגוע או מדומה בתעלה 3.עמודה AD (AD5 ומעלה): עוצמת פלואורסצנטיות נמדדת של תא המבטא את חלבון ההיתוך GFP-Cherry (או ביטוי משותף של GFP ודובדבן, או כל זוג חלבונים מעניין) בערוץ 1. עמודה AE (AE5 ומעלה): נמדדה עוצמת הפלואורסצנטיות של תא המבטא את חלבון ההיתוך GFP-Cherry (או ביטוי משותף של GFP ודובדבן, או כל זוג חלבונים מעניין) בערוץ 2. עמודה AF (AF5 ומעלה): עוצמת פלואורסצנטיות נמדדת של תא המבטא את חלבון ההיתוך GFP-Cherry (או ביטוי משותף של GFP ודובדבן, או כל זוג חלבונים מעניין) בערוץ 3. עמודות AG, AH ו- AI (AG5, AH5, AI5 ומעלה, בהתאמה): נמדדו עוצמות פלואורסצנטיות שהופחתו בעוצמות רקע ממוצעות בכל שלושת הערוצים. עמודה AJ (AJ5 ומעלה): גורם α מחושב. עמודה AK (AK 5 ומעלה): יעילות FRET מחושבת ממוצעת E. עמודה AL (AL5 ומעלה): יחס עוצמת מקבל לתורם מתוקן מחושב (Q). דוגמאות לפרמטרים מחושבים מניסוי FRET כפי שהם מבוטא כממוצע וסטיית תקן: S1 = 0.2232 ± 0.0060. S2 = 0.2039 ± 0.0074. α = 1.9463 ± 0.1409. E = 0.2713 ± 0.0220. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 1: GFP וספקטרום ספיגה ופליטת דובדבן. ספקטרום ספיגה ופליטת פלואורסצנטיות מנורמל של eGFP ו-mCherry. קווי לייזר העירור (488 ו-543 ננומטר) ושידורי המסנן המשמשים לערוץ התורם (ch1: 505-530 ננומטר) ולתעלות ההעברה/קבלה (ch2 ו-3: >585 ננומטר) במיקרוסקופ הקונפוקלי מסומנים בהצללה. עבור עירור של המקבל, קווי לייזר 561 או 590 ננומטר ניתן להשתמש גם. בסיס נתונים של חלבון פלואורסצנטי מקור (fpbase.org). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המוצג מפרט את השימוש בבדיקת כיול חלבון פלואורסצנטי מצומד גנטית אחד לאחד לכימות FRET באמצעות זיהוי פליטה רגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי להעריך אינטראקציות חלבונים בהקשר הפיזיולוגי של התא החי בתאים תת-תאיים שונים. ניתן לשפר עוד יותר את הרזולוציה המרחבית על ידי החלת האלגוריתם המוצג לחישוב יעילות FRET בכל פיקסל בתמונה (FRET פיקסל אחר פיקסל). קביעה מבוססת עוצמה של יעילות FRET מוחלטת דורשת את קביעת השיחה הצולבת, המכומתת כאן עם גורמי S , ואת יעילות הזיהוי של מולקולות תורם ומקבל על ידי מערך מיקרוסקופי נתון, מכומת על ידי גורם α. כאן, מסופק פרוטוקול המאפשר כימות הן של cross-talk והן של יעילות זיהוי. צימוד ישיר של המידע הגנטי של חלבון פלואורסצנטי מבטיח ביטוי שווה משקל בתאים חיים ובכך מאפשר את קביעת הגורם α. הידע של הגורם α בתורו הוא תנאי מוקדם לכימות יעילות FRET בתאים חיים. שלבים קריטיים בפרוטוקול המסופק הם שיבוט נכון של כימרה חלבונית פלואורסצנטית מצומדת ישירות, מספיק זמן לאחר הטרנספקציה כדי לאפשר הבשלת חלבון פלואורסצנטי, שימוש בחלבונים פלואורסצנטיים במיקרו-סביבה תאית דומה, למשל, חלבונים פלואורסצנטיים בציטופלסמה ובצד הציטופלזמי של קרום הפלזמה, ומערך מיקרוסקופ יציב.

מערך ניסיוני ואלגוריתם המוצגים כאן מיועדים לזוג GFP-Cherry FET. אנו מספקים בקובץ המשלים 1 את האלגוריתם עבור גרסאות שונות של ציאן (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) וחלבונים פלואורסצנטיים צהובים (EYFP, סיטרין, ונוס, SYFP2, YPet). היתרון של זוגות חלבונים פלואורסצנטיים אלה הוא חפיפה ספקטרלית גדולה יותר בין ספקטרום הפליטה של הציאן לבין ספקטרום הבליעה של החלבון הצהוב (בהשוואה ל-GFP-Cherry), וכתוצאה מכך ערכי R0 גבוהים יותר ויעילות FRET גדולה יותר. עם זאת, מאותה סיבה, גם מספר גורמי הדיבור ההדדיים הלא זניחים ועוצמתם גדולים יותר (ראו טקסט משלים).

יש לקחת בחשבון מגבלות של FRET יחסי מיקרוסקופי כמותי בתאים חיים ולדון בהן. תנאי מוקדם לשימוש ב- FRET לאיתור אינטראקציות מולקולריות הוא יישום תגים פלואורסצנטיים. הפרוטוקול שלנו משתמש בחלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית. מכיוון שחלבונים פלואורסצנטיים אלה עשויים להיות דומים בגודלם (27 kDa) לחלבון המתויג המעניין, הם עשויים לשנות לוקליזציה ותפקוד של החלבון המעניין. לכן, יש לבדוק הן לוקליזציה והן פונקציונליות של כל חלבון מתויג של עניין ולהשוות לאלה של חלבון אנדוגני ללא תווית. נקודה קריטית נוספת שיש לזכור היא המאגר האנדוגני והלא מסומן של החלבון המעניין. האינטראקציות של המסומנים עם חלבונים אנדוגניים לא מסומנים יפחיתו את אות ה- FET. באופן אידיאלי, כל החלבונים של עניין מסומנים. ניתן להשיג זאת על-ידי שימוש בתאים שאין להם את החלבון המעניין באופן אנדוגני (כמו בדוגמה שניתנה באיור 2C ו-2E ), שימוש בתאים שמקורם בעכברי נוק-אין, שימוש בתאים שעברו שינוי CRISPR וכו'. אפילו עם השימוש ב- FRET פיקסל אחר פיקסל, האות של מולקולות תורם ומקבל יהיה ממוצע על נקודה מוגבלת עקיפה, גבול הרזולוציה של מיקרוסקופ קונפוקלי. לכן, אי אפשר לפתור אוכלוסיות תורמים שונות בתוך נקודה מוגבלת עקיפה. ייתכנו תורמים ללא מקבל, או תורמים עם מספר מקבלים התורמים לאות FRET הממוצע. ניתוח תת-אוכלוסיות מולקולריות שונות על ידי FRET דורש הדמיית חיים פלואורסצנטית22. בעיה נוספת, במיוחד ברמות ביטוי גבוהות, היא מה שנקרא FRET אקראי בין פלואורופורים בסמיכות ללא אינטראקציה בסיסית של החלבונים המעניינים23. FRET אקראי זה יכול להיות משמעותי בקרום הפלזמה בהינתן הכליאה הדו-ממדית של חלבוני הממברנה בהשוואה לחלבונים ציטופלזמיים דיפוזיים חופשיים. לכן, תמיד יש לבצע ניסויי בקרה כגון מחיקת תחומים המתווכים את האינטראקציה המשוערת בין מולקולות ובדיקת הפחתה באות FRET שזוהה.

חוסר הוודאות של סטויכיומטריה מדויקת של חלבונים המקיימים אינטראקציה בתאים חיים מגביל את השימוש ב- FRET כסרגל ספקטרוסקופי להערכת מרחקים מולקולריים בין חלבונים בתאים חיים. אפילו במקרה של אינטראקציה קפדנית של אחד לאחד, (i) הגמישות של המקשר המצמיד את החלבון הפלואורסצנטי לחלבון המעניין, כמו גם (ii) חוסר הידע של הכיוון היחסי של מומנטי הדיפול של הצבעים (קביעת גורם κ2 ) עשויים לבלבל מדידות מרחק מדויקות. מחקרים על מבני היתוך מקובלים עם מקשרים קשיחים באורכים שונים המפרידים בין שני הפלואורופורים ומציגים יעילות FRET שונה דווחו במקומות אחרים12. לעומת זאת, הערכת סטויכיומטריה עם מדידות FRET בתאים חיים היא מורכבת, אולם אפשרית באמצעות כימות FRET יחסימטרי מוצג. ניתן להפנות את הקורא הנוטה לעבודה קודמת המפרטת גישה ישימה5.

לסיכום, גישת FRET הכמותית המוצגת כאן מאפשרת זיהוי של (i) אינטראקציות חלבונים בהקשר הפיזיולוגי של התא החי, (ii) שינויים באינטראקציות חלבונים לאורך זמן ו-(iii) הבדלים באינטראקציות בתאים תת-תאיים שונים עד לרמת פיקסל אחר פיקסל של תמונה קונפוקלית, ו-(iv) התלות של אות FRET שזוהה ביחס המולקולרי המקובל לתורם המתבטא בתא חי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לשירות הדימות של מדעי המוח בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד על אספקת ציוד ומקום לפרויקט זה. מחקר זה נתמך על ידי מימון פנימי של מכון הסרטן של סטנפורד והחטיבה האונקולוגית הגינקולוגית בסטנפורד, כמו גם GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 מהמשרד הלאומי למחקר, פיתוח וחדשנות, הונגריה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) Thermo Fisher Scientific 15400054
Clontech mCherry N1 vector Addgene 3553
DMEM without phenol red Thermo Fisher Scientific 11054020
Fugene 6 Promega E2691
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080
LabTek 8-well chambers #1.0 Thermo Fisher Scientific 12565470
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific 25030081

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
  2. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  3. Mekler, V. M. A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer. Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).
  4. Vamosi, G., et al. Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study. Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).
  5. Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).
  6. van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).
  7. Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).
  8. Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors. Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).
  9. Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry Part A. , 24194 (2020).
  10. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  11. Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173, 1 Spec No 33-38 (1996).
  12. Nagy, P., et al. Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins. Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).
  13. Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).
  14. Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy. Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).
  15. Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).
  16. Sebestyen, Z., et al. Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).
  17. Szaloki, N., et al. High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).
  18. McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).
  19. Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Scott, B. L., Hoppe, A. D. Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells. Science Reports. 5, 10270 (2015).
  22. Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it. Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).
  23. King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments. Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).

Tags

ביולוגיה גיליון 170 דימות תאים חיים FRET מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי פלואורופור אינטראקציה עם חלבונים פליטה רגישה

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

to:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

הערכת אינטראקציות חלבונים בתאים חיים עם פליטה רגישה ל-FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vámosi, G., Miller, S., Sinha,… More

Vámosi, G., Miller, S., Sinha, M., Fernandez, M. K., Mocsár, G., Renz, M. Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. J. Vis. Exp. (170), e62241, doi:10.3791/62241 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter