İki florofor molekülü arasındaki Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET), canlı hücredeki protein etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. Burada, alıcı ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak donör molekülünün söndürülmesi ile alıcının duyarlılaştırılmış emisyonunu tespit ederek canlı hücrelerde FRET'nin nasıl ölçüleceğine dair bir protokol sağlanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
FRET'e duyarlı emisyona sahip canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET), uyarılmış bir donörden bir alıcı moleküle radyasyonsuz enerji transferidir ve moleküllerin mesafesine ve oryantasyonuna ve ayrıca donör emisyonu ile alıcı absorpsiyon spektrumları arasındaki örtüşme derecesine bağlıdır. FRET, canlı hücredeki proteinlerin zaman içinde ve farklı hücre altı bölmelerdeki etkileşimini incelemeye izin verir. Literatürde mikroskopi kullanarak FRET ölçümü için farklı yoğunluk tabanlı algoritmalar tanımlanmıştır. Burada, hem alıcının duyarlılaştırılmış emisyonunu hem de donör molekülün söndürülmesini ölçmeye dayanarak FRET verimliliğini ölçmek için bir protokol ve bir algoritma sağlanmaktadır. Canlı hücredeki oranmetrik FRET'nin nicelleştirilmesi, sadece floresan proteinlerinin çapraz konuşmasının (spektral dökülme veya kanama) belirlenmesini değil, aynı zamanda mikroskobik kurulumun tespit verimliliğini de gerektirir. Burada sağlanan protokol, bu kritik parametrelerin nasıl değerlendirileceğini ayrıntılarıyla açıklamaktadır.
Giriş
Förster Rezonans Enerji Transferi'nin (FRET) mikroskopi tabanlı analizi, canlı hücrelerdeki proteinler arasındaki etkileşimlerin değerlendirilmesine izin verir. Etkileşimin hücrenin neresinde ve hangi hücre altı bölmede gerçekleştiği ve bu etkileşimin zaman içinde değişip değişmediği hakkında bilgi de dahil olmak üzere mekansal ve zamansal bilgi sağlar.
Theodor Förster, 1948'de FRET'in teorik temelini attı1. FRET, uyarılmış bir donörden bir alıcı moleküle radyasyonsuz bir enerji transferidir ve moleküllerin mesafesine ve geçiş dipollerinin göreceli oryantasyonuna ve ayrıca donör emisyonu ile alıcı absorpsiyon spektru....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Plazmid yapımı
- eGFP-mCherry1 füzyon probunu oluşturmak için, AgeI ve BsrGI kısıtlama bölgeleri kullanılarak eklenen mCherry1 10 ile bir N1 memeli hücre ekspresyon vektörü (bkz. Malzeme Tablosu) kullanın.
- SalI-BamHI parçası olarak bir durdurma kodonu olmadan eGFP11'i yükseltmek için aşağıdaki oligonükleotidleri kullanın: N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' ve C-terminal primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.
- Yeşil ve kırmızı floresan proteini arasına RNPPV bağlayıcı (beş aminoasit) bağlayıcı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1, sırasıyla donör kanal, kanal 1 (488, 505-530 nm), transfer kanalı, kanal 2 (488, >585 nm) ve alıcı kanal, kanal 3'te (561, >585 nm) elde edilen görüntüleri göstermektedir. Sadece GFP'yi, sadece Cherry'yi, GFP ve Cherry'yi birlikte eksprese eden ve GFP-Cherry füzyon proteinini eksprese eden hücrelerin temsili görüntüleri. GFP-Cherry füzyon proteinini eksprese eden NRK hücrelerinde (pozitif kontrol, Şekil 2A) ve GFP-Cherry'yi (negatif kontrol,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Sunulan protokol, alıcının duyarlılaştırılmış emisyonunun tespitini ve donör molekülün konfokal mikroskopi ile söndürülmesini kullanarak FRET'yi ölçmek için genetik olarak eşleşmiş bire bir floresan protein kalibrasyon probunun kullanımını detaylandırmaktadır. Bu yöntem, farklı hücre altı bölmelerde canlı hücrenin fizyolojik bağlamındaki protein etkileşimlerini değerlendirmek için uygulanabilir. Uzamsal çözünürlük, bir görüntünün her pikselindeki FRET verimliliklerini hesaplamak için sunulan algoritma uygulanarak daha da.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi Sinirbilim Görüntüleme Servisi'ne bu proje için ekipman ve alan sağladığı için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Stanford Kanser Enstitüsü ve Jinekolojik Onkoloji Bölümü Stanford'un intramural finansmanının yanı sıra Macaristan Ulusal Araştırma, Geliştirme ve İnovasyon Ofisi'nden GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Fenol kırmızısı içermeyen% 0,5 Tripsin-EDTA (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vektör | Addgene | 3553 | |
| fenol kırmızısı içermeyen DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Bilimsel | 15630080 | |
| LabTek 8 kuyulu odalar #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamin (200 mM) | Thermo Fisher Scientific 25030081 |
Kaynaklar
- Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 3/14/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:
György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
