Avaliando interações proteicas em células vivas com emissão sensibilizada por FRET
Summary
A Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) entre duas moléculas de fluoróforo pode ser usada para estudar as interações proteicas na célula viva. Aqui, um protocolo é fornecido sobre como medir o FRET em células vivas, detectando a emissão sensibilizada do aceptor e a têmpera da molécula doadora usando microscopia confocal de varredura a laser.
Abstract
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) é a transferência de energia sem radiação de um doador excitado para uma molécula aceitadora e depende da distância e orientação das moléculas, bem como da extensão da sobreposição entre os espectros de emissão do doador e absorção do aceitador. FRET permite estudar a interação de proteínas na célula viva ao longo do tempo e em diferentes compartimentos subcelulares. Diferentes algoritmos baseados em intensidade para medir FRET usando microscopia têm sido descritos na literatura. Aqui, um protocolo e um algoritmo são fornecidos para quantificar a eficiência do FRET com base na medição da emissão sensibilizada do aceptor e da têmpera da molécula doadora. A quantificação do FRET ratiométrico na célula viva não requer apenas a determinação do crosstalk (transbordamento espectral ou sangria) das proteínas fluorescentes, mas também a eficiência de detecção da configuração microscópica. O protocolo fornecido aqui detalha como avaliar esses parâmetros críticos.
Introduction
A análise baseada em microscopia da Transferência de Energia por Ressonância de Förster (FRET) permite a avaliação das interações entre proteínas em células vivas. Ele fornece informações espaciais e temporais, incluindo informações sobre onde na célula e em qual compartimento subcelular a interação ocorre e se essa interação muda ao longo do tempo.
Theodor Förster lançou as bases teóricas do FRET em 19481. FRET é uma transferência de energia sem radiação de um doador excitado para uma molécula aceitadora e depende da distância das moléculas e da orientação relativa de seus dipolos de transição, bem como da sobreposição entre os espectros de emissão e absorção do doador e do aceitador. A taxa de transferência de energia é inversamente proporcional à sexta potência da distância doador-aceitador. Assim, o FRET pode ser usado para medir a proximidade molecular na faixa de 1-10 nm.
O FRET compete com outros processos de desexcitação da molécula doadora e resulta na chamada extinção do doador e na emissão sensibilizada do aceitador. A têmpera de doadores é uma redução do número de fótons de doadores emitidos, enquanto a emissão sensibilizada é um aumento nos fótons aceptores emitidos. Muitas análises microscópicas de FRET usam medidas de intensidade de fluorescência, incluindo fotobranqueamento do aceitador 2, fotobranqueamento do doador2 ou fotobranqueamento sensibilizado pelo FRET do aceitador3.
Aqui, um protocolo experimental passo-a-passo e um algoritmo matemático são apresentados para quantificar o FRET usando a têmpera do doador e a emissão sensibilizada pelo aceitador4,5, um método muitas vezes referido como FRET ratiométrico. Muitos protocolos sobre como aproximar a emissão sensibilizada têm sido publicados, poucos quantificaram a eficiência absoluta do FRET 6,7,8,9. A quantificação das eficiências de FRET na célula viva requer a determinação (i) do crosstalk (transbordamento espectral ou sangria) das proteínas fluorescentes e, também (ii) da eficiência de detecção da configuração microscópica. Embora o crosstalk possa ser avaliado por células de imagem que expressam apenas um dos fluoróforos, a avaliação da eficiência relativa de detecção da fluorescência do doador e do aceitador é mais complicada. Requer o conhecimento de, pelo menos, a razão entre o número de moléculas doadoras e aceitadoras que dão origem aos sinais medidos. O número de fluoróforos expressos em células vivas varia, no entanto, de célula para célula e é desconhecido. O chamado fator de α caracteriza as forças relativas do sinal de uma única molécula excitado doador e aceitador. O conhecimento do fator é um pré-requisito para medições quantitativas de FRET ratiométrico em amostras com proporções variáveis de moléculas aceitador-doador, conforme encontrado durante imagens de células vivas com proteínas fluorescentes. O uso de uma proteína de fusão doador-aceptor 1 para 1 como sonda de calibração permite a determinação do fator α e também serve como um controle positivo. Esta sonda geneticamente acoplada é expressa por células em quantidades totais desconhecidas, mas em uma quantidade relativa fixa e conhecida de um-para-um. O protocolo a seguir estabelece como construir a sonda 1 para 1 e como usá-la para quantificação da eficiência do FET. Uma planilha que inclui todas as fórmulas pode ser encontrada no suplemento e pode ser usada pelos leitores para inserir suas próprias medidas nas respectivas colunas, conforme descrito abaixo.
Embora o protocolo utilize o par doador/aceitador GFP-Cherry, a abordagem apresentada pode ser realizada com qualquer outro par FET. O Arquivo Suplementar 1 fornece detalhes sobre pares ciano-amarelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado detalha o uso da sonda de calibração de proteínas fluorescentes um-para-um acoplada geneticamente para quantificação do FRET utilizando a detecção de emissão sensibilizada do aceptor e têmpera da molécula doadora por microscopia confocal. Este método pode ser aplicado para avaliar as interações proteicas no contexto fisiológico da célula viva em diferentes compartimentos subcelulares. A resolução espacial pode ser melhorada ainda mais aplicando o algoritmo apresentado para calcula…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Serviço de Imagem de Neurociência da Escola de Medicina da Universidade de Stanford por fornecer equipamentos e espaço para este projeto. Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento intramural do Stanford Cancer Institute e da Gynecologic Oncology Division Stanford, bem como pelo GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 do Escritório Nacional de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação, Hungria.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
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