FRET-Sensitized Emission with FRET-Sensitized Release를 사용한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 평가
Summary
두 형광단 분자 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수용체의 감작 방출을 감지하고 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 기증자 분자의 소멸을 통해 살아있는 세포에서 FRET를 측정하는 방법에 대한 프로토콜이 제공됩니다.
Abstract
Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 여기된 기증자에서 수용체 분자로 에너지를 방사선 없이 전달하는 것이며 분자의 거리와 방향, 기증자 방출과 수용체 흡수 스펙트럼 사이의 겹침 정도에 따라 달라집니다. FRET를 사용하면 시간이 지남에 따라 살아있는 세포와 다른 세포 내 구획에서 단백질의 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 현미경을 사용하여 FRET를 측정하는 다양한 강도 기반 알고리즘이 문헌에 설명되어 있습니다. 여기서, 수용체의 감작된 방출과 공여체 분자의 담금질 모두를 측정하여 FRET 효율을 정량화하기 위한 프로토콜과 알고리즘이 제공됩니다. 살아있는 세포에서 비율계량 FRET의 정량화는 형광 단백질의 누화(스펙트럼 유출 또는 블리드 스루)의 측정뿐만 아니라 현미경 설정의 검출 효율도 필요로 합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 이러한 중요한 매개 변수를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.
Introduction
Förster 공명 에너지 전달(FRET)의 현미경 기반 분석을 통해 살아있는 세포에서 단백질 간의 상호 작용을 평가할 수 있습니다. 그것은 세포 내 어디에 있고 어떤 세포 내 구획에서 상호 작용이 일어나는지, 그리고 이 상호 작용이 시간이 지남에 따라 변하는지에 대한 정보를 포함하여 공간 및 시간 정보를 제공합니다.
Theodor Förster는 1948년 FRET의 이론적 토대를 마련했습니다1. FRET는 여기 된 기증자에서 수용체 분자로의 무방사선 에너지 전달이며 분자의 거리와 전이 쌍극자의 상대적 방향, 기증자 방출과 수용체 흡수 스펙트럼 사이의 겹침에 따라 달라집니다. 에너지 전달 속도는 도너-수용체 거리의 6승에 반비례합니다. 따라서 FRET는 1-10nm 범위의 분자 근접성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
FRET는 기증자 분자의 다른 여기 제거 과정과 경쟁하여 수용체의 소위 기증자 담금질 및 감작 방출을 초래합니다. 도너 담금질은 방출된 도너 광자의 수를 감소시키는 반면, 감응 방출은 방출된 수용체 광자의 증가입니다. 많은 현미경 FRET 분석은 수용체 광표백2, 기증자 광표백2 또는 수용체3의 FRET 민감 광표백을 포함한 형광 강도 측정을 사용합니다.
여기에서는 종종 비율계량 FRET라고 하는 방법인 기증자 담금질 및 수용체 감응 방출 4,5를 사용하여 FRET를 정량화하기 위한 단계별 실험 프로토콜과 수학적 알고리즘이 제시됩니다. 감작 방출을 근사화하는 방법에 대한 많은 프로토콜이 발표되었지만 절대 FRET 효율 6,7,8,9를 정량화한 프로토콜은 거의 없습니다. 살아있는 세포에서 FRET 효율을 정량화하려면 (i) 형광 단백질의 누화(스펙트럼 유출 또는 블리드 스루)와 (ii) 현미경 설정의 검출 효율을 결정해야 합니다. 누화는 형광단 중 하나만 발현하는 이미징 세포로 평가할 수 있지만 공여체 및 수용체 형광의 상대적 검출 효율 평가는 더 복잡합니다. 측정된 신호를 발생시키는 공여체와 수용체 분자의 수의 비율에 대한 지식이 필요합니다. 그러나 살아있는 세포에서 발현되는 형광단의 수는 세포마다 다르며 알려져 있지 않습니다. 소위 α 인자는 단일 여기 기증자 및 수용체 분자의 상대적 신호 강도를 특성화합니다. 인자에 대한 지식은 형광 단백질을 사용한 생세포 이미징 중에 발생하는 가변 수용체-기증자 분자 비율을 가진 샘플에서 정량적 비율계량 FRET 측정을 위한 전제 조건입니다. 1:1 공여체-수용체 융합 단백질을 보정 프로브로 사용하면 α 인자를 측정할 수 있으며 양성 대조군으로도 사용할 수 있습니다. 이 유전적으로 결합된 프로브는 세포에 의해 알려지지 않은 총량으로 발현되지만 고정되고 알려진 상대적인 일대일의 양으로 발현됩니다. 다음 프로토콜은 1:1 프로브를 구성하는 방법과 FRET 효율의 정량화에 사용하는 방법을 설명합니다. 모든 공식이 포함된 스프레드시트는 부록에서 찾을 수 있으며 독자가 아래에 설명된 대로 각 열에 자신의 측정값을 입력하는 데 사용할 수 있습니다.
프로토콜은 GFP-Cherry 기증자/수용체 쌍을 사용하지만 제시된 접근 방식은 다른 FRET 쌍으로 수행할 수 있습니다. 보충 파일 1 은 청록색-노란색 쌍에 대한 세부 정보를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 프로토콜은 수용체의 민감 방출 검출 및 공초점 현미경에 의한 기증자 분자의 소멸을 사용하여 FRET를 정량화하기 위한 유전적으로 결합된 일대일 형광 단백질 보정 프로브의 사용에 대해 자세히 설명합니다. 이 방법은 서로 다른 세포 내 구획에 있는 살아있는 세포의 생리학적 맥락에서 단백질 상호작용을 평가하는 데 적용할 수 있습니다. 공간 해상도는 제시된 알고리즘을 적용하여 이미…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트를 위한 장비와 공간을 제공한 Stanford University School of Medicine의 Neuroscience Imaging Service에 감사드립니다. 이 연구는 스탠포드 암 연구소 (Stanford Cancer Institute)와 스탠포드 부인과 종양학 부서 (Gynecologic Oncology Division Stanford)의 교내 자금 지원과 헝가리 국립 연구 개발 혁신 사무소의 GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
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