Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Оценка белковых взаимодействий в живых клетках с FRET-сенсибилизированным излучением

Published: April 22, 2021 doi: 10.3791/62241
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) между двумя молекулами флуорофора может быть использован для изучения белковых взаимодействий в живой клетке. Здесь представлен протокол о том, как измерять FRET в живых клетках путем обнаружения сенсибилизированного излучения акцептора и гашения донорной молекулы с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Abstract

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) представляет собой безрадиационный перенос энергии от возбужденного донора к акцепторной молекуле и зависит от расстояния и ориентации молекул, а также от степени перекрытия между спектрами донорского излучения и акцепторного поглощения. FRET позволяет изучать взаимодействие белков в живой клетке с течением времени и в различных субклеточных компартментах. В литературе описаны различные алгоритмы измерения FRET с помощью микроскопии, основанные на интенсивности. Здесь представлены протокол и алгоритм для количественной оценки эффективности FRET, основанные на измерении как сенсибилизированного излучения акцептора, так и гашения молекулы-донора. Количественная оценка ратиометрического FRET в живой клетке требует не только определения перекрестных помех (спектрального перелива или утечки) флуоресцентных белков, но и эффективности обнаружения микроскопической установки. В приведенном здесь протоколе подробно описано, как оценить эти критические параметры.

Introduction

Анализ резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) на основе микроскопии позволяет оценить взаимодействия между белками в живых клетках. Он предоставляет пространственную и временную информацию, включая информацию о том, где в клетке и в каком субклеточном компартменте происходит взаимодействие, и изменяется ли это взаимодействие с течением времени.

Теодор Фёрстер заложил теоретическую основу FRET в 1948 году1. FRET представляет собой безрадиационную передачу энергии от возбужденного донора к акцепторной молекуле и зависит от расстояния между молекулами и относительной ориентации их переходных диполей, а также от перекрытия между спектрами донорского излучения и акцепторного поглощения. Скорость передачи энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния донор-акцептор. Таким образом, FRET можно использовать для измерения молекулярной близости в диапазоне 1-10 нм.

FRET конкурирует с другими процессами девозбуждения молекулы-донора и приводит к так называемому донор-гашению и сенсибилизированному излучению акцептора. Донорное гашение — это уменьшение количества испускаемых фотонов-доноров, в то время как сенсибилизированное излучение — увеличение испускаемых акцепторных фотонов. Во многих микроскопических анализах FRET используются измерения интенсивности флуоресценции, включая акцепторное фотообесцвечивание 2, донорское фотообесцвечивание2 или FRET-сенсибилизированное фотообесцвечивание акцептора3.

Здесь представлен пошаговый экспериментальный протокол и математический алгоритм для количественной оценки FRET с использованием донорного гашения и акцепторно-сенсибилизированного излучения4,5, метода, часто называемого ратиометрическим FRET. Было опубликовано много протоколов о том, как аппроксимировать сенсибилизированное излучение, лишь немногие количественно определили абсолютную эффективность FRET 6,7,8,9. Количественная оценка эффективности FRET в живой клетке требует определения (i) перекрестных помех (спектрального перелива или утечки) флуоресцентных белков, а также (ii) эффективности обнаружения микроскопической установки. В то время как перекрестные помехи могут быть оценены путем визуализации клеток, экспрессирующих только один из флуорофоров, оценка относительной эффективности обнаружения донорской и акцепторной флуоресценции является более сложной. Это требует знания, по крайней мере, соотношения числа молекул-доноров и акцепторов, порождающих измеряемые сигналы. Однако количество флуорофоров, экспрессируемых в живых клетках, варьируется от клетки к клетке и неизвестно. Так называемый фактор α характеризует относительную силу сигнала от одной возбужденной молекулы-донора и акцептора. Знание фактора является необходимым условием для количественных измерений коэффициентометрического FRET в образцах с переменным отношением акцепторных и донорных молекул, как это происходит во время визуализации живых клеток флуоресцентными белками. Использование белка слияния донора-акцептора 1 к 1 в качестве калибровочного зонда позволяет определить фактор α, а также служит положительным контролем. Этот генетически связанный зонд экспрессируется клетками в неизвестных общих количествах, но в фиксированном и известном относительном количестве один к одному. В следующем протоколе изложено, как построить зонд 1-к-1 и как использовать его для количественной оценки эффективности FRET. Электронная таблица, включающая все формулы, может быть найдена в приложении и может использоваться читателями для ввода своих собственных измерений в соответствующие столбцы, как указано ниже.

В то время как протокол использует пару донор/акцептор GFP-Cherry, представленный подход может быть выполнен с любой другой парой FRET. Дополнительный файл 1 содержит подробную информацию о голубо-желтых парах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Плазмидная конструкция

  1. Для генерации зонда слияния eGFP-mCherry1 используйте вектор экспрессии клеток млекопитающих N1 (см. Таблицу материалов) со вставленным mCherry110 с использованием сайтов рестрикции AgeI и BsrGI.
  2. Используйте следующие олигонуклеотиды для амплификации eGFP11 без стоп-кодона в виде фрагмента SalI-BamHI : N-концевой праймер 5'-AAT, TAA, CAG, TCG, ACG, ATG, GTG, AGC, AGC, AGC, GAG G, 3' и C-концевой праймер 5'-AAT, ATA, TGG, ATC, CCG, CTT, GTA, CGT, CTC, CAT, GC 3'.
  3. Вставьте этот фрагмент SalI-BamHI в сайт множественного клонирования вектора N1, чтобы ввести линкер RNPPV (пять аминокислот) линкер между зеленым и красным флуоресцентным белком.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот линкер дает среднюю эффективность FRET для пары донор-акцептор GFP-Cherry около 0,25-0,3 (рис. 1A). Выбор жестких12 и спиральных13 линкеров различной длины для масштабирования измеренной эффективности FRET обсуждался в другом месте, но не требуется для нашей цели слияния белка. Для простоты мы будем называть флуоресцентные белки «GFP» и «Cherry».

2. Культивирование клеток и трансфекция

  1. Используйте любую клеточную линию, например, клетки NRK, для экспериментов FRET в средах, например, модифицированных средах Дульбекко Игла (DMEM), без фенольного красного, чтобы уменьшить фоновую флуоресценцию. По этой же причине рекомендуется использовать свободный трипсин фенола.
  2. После того, как клетки слились на 80%, отделите клетки с 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА, подсчитайте количество клеток в суспензии с помощью камеры Нойбауэра и засейте около 10 000 клеток в лунку 8-луночного покровного стекла; в качестве альтернативы, из сливной клеточной культуры, выращенной в колбе Т25, используют 1 каплю клеточной суспензии из пипетки объемом 2 мл или 3 капли из суспензии клеток объемом 5 мл из сливной культуры, выращенной в колбе для культуры Т25.
  3. Выращивайте клетки в 8-луночных камерах (0,8 см 2 / лунка) с покровным стеклом #1,0 для флуоресцентной микроскопии живых клеток в стандартных условиях культивирования клеток (37 ° C и 5% CO2).
  4. Через 24 часа после нанесения покрытия трансфицируют клетки, используя соответствующую коммерчески доступную среду для трансфекции (см. Таблицу материалов) смесью GFP, Cherry, GFP/Cherry (смесь 1:1, т.е. 0,8 мкг и 0,8 мкг GFP и плазмидной ДНК вишни) и химерой GFP-Cherry.
    1. Для трансфекции используют 5 мкл реагента для трансфекции в 45 мкл DMEM и 1,6 мкг плазмидной ДНК. Перемешайте, осторожно щелкнув пробирку микроцентрифуги.
    2. После 15-минутной инкубации смеси при комнатной температуре добавляют по 1-2 мкл смеси трансфекционных реагентов в каждую лунку 8-луночного предметного стекла. Верните камерное покровное стекло в инкубатор.
  5. Пусть пройдет 20 ч после трансфекции перед визуализацией живых клеток, чтобы обеспечить надлежащую экспрессию, сворачивание и созревание флуоресцентного белка, особенно красного флуорофора.

3. Визуализация FRET

  1. Изображение трансфицированных клеток в увлажненной и нагретой камере окружающей среды при 37 ° C. Чтобы буферизовать клеточную среду при физиологическом pH, используйте газ CO2, установленный на поток 5%, или добавьте 20 мМ HEPES, чтобы сделать клеточную среду CO 2-независимой.
  2. Используйте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Установите возбуждение и излучение следующим образом, чтобы оптимизировать сигнал и свести к минимуму перекрестные помехи.
    1. Используйте линейку аргоново-ионного лазера с длиной волны 488 нм для возбуждения GFP и твердотельный лазер с диодной накачкой 561 нм (или гелий-неоновый лазер с длиной волны 543 нм, в зависимости от доступных лазерных линий), чтобы возбудить Cherry.
    2. Установите следующее в программном обеспечении коммерческого конфокального микроскопа. Установите Dichroic зеркало на 488/561 нажатием кнопки с помощью выпадающего меню. Собирают флуоресценцию с помощью лазерного излучения с длиной волны 488 нм для возбуждения в канале 1 через полосу излучения 505 - 530 нм (или 505 - 550 нм) и в канале 2 с фильтром длинных частот >585 нм и используют лазерный свет 561 нм для возбуждения в канале 3 с фильтром длинных частот > 585 нм (тип по длинам волн). Также могут использоваться полосовые фильтры, например, 590 - 650 нм или аналогичные, которые имеют то преимущество, что исключают рамановское рассеяние.
  3. Возбуждайте двумя лазерами последовательно и установите режим визуализации на Switch после каждой строки , чтобы возбуждение изображения размером 512 x 512 пикселей чередовалось после каждой строки (а не после каждого кадра, что свело бы на нет возможность обнаружения FRET из-за диффузии меченых белков при записи изображений с различными возбуждениями; нажатие кнопки).
  4. Настройте мини-временную серию из трех изображений нажатием кнопки, чтобы определить, происходит ли значительное фотообесцвечивание, и потенциально уменьшить мощность лазера. Фотообесцвечивание менее 1% является оптимальным. Высокая интенсивность лазера также может привести к насыщению поглощения, снижая кажущуюся эффективность FRET14. Мощность лазера до 10-20 мкВт, измеренная на линзе объектива, безопасна в использовании.
  5. Во-первых, ячейки изображения, экспрессирующие конструкцию слияния GFP-Cherry. Установите параметры, определяющие интегрированную по времени интенсивность лазера на пиксель в конфокальном изображении, т. е. время выдержки пикселя в микросекундах, пропускание акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF) в процентах и зум.
    1. Ячейки изображения с использованием 63-кратного масляного объектива и 3-кратного увеличения . Это обеспечивает достаточное увеличение и разрешение для изображения ячеек целиком. Стремитесь к размеру пикселя 70-80 нм.
    2. Установите время выдержки пикселя на 2-4 мкс и передачу AOTF для лазера с длиной волны 488 нм и 561 нм, чтобы изображения имели хорошее соотношение сигнал/шум без обесцвечивания и без пикселей, показывающих насыщенность интенсивностью флуоресценции. Выгодно отрегулировать мощность лазера 488 и 561 таким образом, чтобы уровни сигнала в канале 1 и канале 3 были одинаковыми.
    3. Установите коэффициент усиления фотоумножителя (режим усреднения) на 600-800.
  6. Изображение с этими настройками 15-20 клеток, экспрессирующих слитый белок GFP-Cherry. 15-20 ячеек обеспечивают хорошую статистику, сохраняя при этом общее время сеанса измерения FRET ограниченным несколькими часами, чтобы обеспечить стабильность микроскопической установки.
  7. Изображение с одинаковыми настройками ячеек, выражающих GFP, Cherry, GFP и Cherry и нетрансфицированных ячеек. Поиск экспрессирующих ячеек в зеленом или красном канале соответственно.
  8. Затем сфотографируйте 15-20 клеток, совместно экспрессирующих интересующие белки, связанные с GFP и Cherry соответственно. При поиске экспрессирующих клеток избегайте длительного воздействия на клетки, чтобы не обесцвечивать флуоресцентные белки. Вишня имеет более низкую фотостабильность, чем GFP, и отбеливание вишни, акцептор ставит под угрозу анализ FRET.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Спектры поглощения и излучения GFP и Cherry показаны на дополнительном рисунке 1. После измерения в течение 5-6 часов рекомендуется повторить визуализацию нескольких клеток, экспрессирующих химеру GFP-Cherry в конце сеанса визуализации, чтобы документально подтвердить, что установка оставалась стабильной и обнаруженная эффективность FRET слитого белка GFP-Cherry существенно не изменилась в ходе сеанса визуализации.

4. Анализ изображений для определения абсолютной эффективности FRET с использованием донорского гашения и сенсибилизированного излучения

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь приведено практическое пошаговое руководство о том, как определить эффективность FRET с помощью прилагаемой электронной таблицы (Дополнительный файл 2). С теорией и выводом представленных уравнений можно подробно ознакомиться в предыдущих публикациях 4,15,16,17. При описанных настройках собираются следующие интенсивности флуоресценции.

  1. Измерьте донорный сигнал I 1 в канале 1, донорском канале, с возбуждением 488 нм и полосой излучения 505-530 нм.
    Equation 2
    где I D - непогашенный донорский сигнал в канале 1, который был бы измерен в отсутствие акцептора, - средняя эффективность FRET, а B 1 - средний фоновый сигнал в канале 1.
  2. Измерьте акцепторный сигнал I 3 в канале 3, канале акцептора, с возбуждением и излучением 561 нм на длине волны >585 нм.
    Equation 3
    где I A — акцепторный сигнал, а B 3 — фон в канале 3.
  3. Измерьте сигнал FRET в канале 2, канале передачи, с возбуждением и излучением 488 нм на длине волны >585 нм.
    Equation 4
    Где, сигнал в канале 2 представляет собой сумму четырех различных компонентов: (i) ID(1 - E)S 1 - спектральный перетек из погашенного сигнала-донора в канал детектирования >585 (с коэффициентом перекрестных помех S 1), (ii) I A S 2 является акцепторным сигналом от прямого возбуждения светом с длиной волны 488 нм (с коэффициентом перекрестных помех S2), (iii) I D Eα представляет собой сенсибилизированное излучение акцептора FRET от возбужденной молекулы-донора (α будет подробно описано в 4.8 - 4.10.), и (iv) B2 - фоновый сигнал.
  4. Измерение средней интенсивности фона в каналах 1, 2, 3 в нетрансфицированных или имитационных трансфицированных клетках; И то, и другое нормально с незначительной разницей. Для всех измерений клеток используйте инструмент «свободная рука», чтобы очертить интересующие области и избежать перинуклеарных везикул с повышенной автофлуоресценцией. Важно избегать значительной аутофлуоресценции от этих перинуклеарных везикул.
    1. Введите измерения в столбцы X, Y и Z предоставленной электронной таблицы. Средняя интенсивность фона в 3 каналах вводится в A2, B2 и C2 электронной таблицы Excel (дополнительный файл 2).
  5. Измерьте среднюю интенсивность в каналах 1, 2, 3 клеток, экспрессирующих только GFP или Cherry, и введите измерения в столбцы C, D, E и N, O, P. Соответствующие фоновые интенсивности вычитаются (в F, G, H и Q, R, S).
  6. Чтобы рассчитать E, эффективность FRET, определите коэффициенты перекрестных помех S 1 и S2. Спектральный коэффициент перекрестных помех S1 рассчитывается из клеток, экспрессирующих только GFP
    Equation 6
    в столбце I. Введите среднее значение для S1 в ячейку D2 электронной таблицы Excel.
  7. Рассчитайте спектральный коэффициент перекрестных помех S2 из ячеек, экспрессирующих только Cherry
    Equation 7
    в столбце T. Введите среднее значение для S2 в ячейку E2 электронной таблицы Excel.
  8. Убедитесь, что коэффициент α связывает сигнал от любого заданного числа возбужденных молекул GFP в канале 1 с сигналом равного числа возбужденных молекул Cherry в канале 2 и определяется формулой
    Equation 8   Equation 13
    где Q A и QD - квантовые выходы флуоресценции вишни и GFP; ηA и η D эффективность детектирования акцепторной и донорной флуоресценции в каналах 2 и 1 соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фактор α может быть определен по двум образцам, экспрессирующим известные абсолютные количества GFP и вишни. Однако невозможно узнать точное количество GFP и вишни, экспрессируемых в клетке. Поэтому мы рассчитали фактор с помощью клеток, экспрессирующих слитый белок GFP-Cherry. Здесь, хотя абсолютное количество до сих пор неизвестно, известно, что соотношение молекул-доноров и акцепторов равно единице.
  9. Измерьте среднюю интенсивность в каналах 1, 2, 3 клеток, экспрессирующих слитый белок GFP-Cherry, и введите измерения в столбцы AE, AF, AG. Интенсивность фона вычитается (в AH, AI, AJ).
  10. Рассчитайте коэффициент α (столбец AJ) по интенсивности флуоресценции в каналах 1, 2 и 3 белка слияния GFP-Cherry следующим образом:
    Equation 10
  11. Интенсивности с поправкой на фон, измеренные в каналах 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B 2) и 3 (I 3 - B3), соответственно, измеряются с использованием химеры GFP-Cherry. Фактор спектральных перекрестных помех S1 определяли с использованием клеток, экспрессирующих только GFP (см. 4.7.). εD и ε A являются коэффициентами экстинкции GFP, донора, и вишни, акцептора, при 488 нм и могут быть определены из литературы (ε GFP = 53 000 М-1 см-1)18 и кривой поглощения вишни (εCherry ≈ 5560 M-1см 1). Соотношение Equation 11 было введено в ячейку G2 электронной таблицы Excel. Введите среднее значение множителя α в J2.
  12. Для расчета КПД FRET, E, используйте определенный коэффициент α следующим образом (колонка AK):
    Equation 12
  13. В качестве альтернативы определите эффективность FRET, E, для отрицательного контроля, т. е. коэкспрессии GFP и Cherry и экспрессии только GFP, добавив измерения каналов 1, 2 и 3 на листе Excel в столбцах AD, AE и AF под измерениями слитого белка GFP-Cherry. Определите эффективность FRET между интересующими белками GFP и Cherry.
  14. Определить интенсивность неугасимого донора, I D как (I 1 - B 1)/(1 - E), а акцепторную интенсивность как I A = I 3 - B3; Эти значения пропорциональны уровням экспрессии меченых белков.
  15. Определите скорректированное отношение интенсивности акцептора к донору (Q) слитого белка GFP-Cherry следующим образом (столбец AL):
    Equation 13
  16. Для других котрансфицированных клеток рассчитайте молекулярное отношение акцептора к донору NA /N D следующим образом:
    Equation 14
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обоснование для определения соотношения N A/N D и построения графика средней клеточной эффективности FRET E по сравнению с N A / N D заключается в том, что одна молекула-донор может передавать энергию нескольким акцепторам, в то время как молекула-акцептор может получать энергию только от одного донора в данный момент времени. Даже если только один акцептор может взаимодействовать с донором из-за стехиометрии взаимодействия, ожидается, что увеличение концентрации акцептора увеличит долю доноров в комплексе с акцептором из-за закона действия масс. Таким образом, для фиксированной (или узкого диапазона) донорской экспрессии эффективность FRET должна возрастать с увеличением N A/ND. Однако при построении графика эффективности FRET E по сравнению с N A/N D для совместной экспрессии GFP и Cherry, т.е. отрицательного зонда, увеличение NA/N D не должно приводить к увеличению эффективности FRET (по крайней мере, при достаточно низких концентрациях акцепторов, когда случайный FRET из-за близости акцепторных красителей к донорным красителям не возникает).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показаны изображения, полученные в донорном канале, канале 1 (488, 505-530 нм), канале передачи, канале 2 (488, >585 нм) и акцепторном канале, канале 3 (561, >585 нм) соответственно. Репрезентативные изображения клеток, экспрессирующих только GFP, только вишню, совместно экспрессирующих GFP и вишню и экспрессирующих слитый белок GFP-вишни. Средняя клеточная эффективность FRET, рассчитанная в клетках NRK, экспрессирующих слитый белок GFP-Cherry (положительный контроль, рис. 2A), и клетках, совместно экспрессирующих GFP-Cherry (отрицательный контроль, рис. 2B), строится на графике по сравнению с отношением акцептора к донору, отношением интенсивности (Q) или молекулярным отношением NA /N D в каждой клетке. На рисунке 2C показан пример того, как очертить интересующую область и избежать перинуклеарных везикул с высокой автофлуоресценцией.

Представленный алгоритм может быть использован для количественной оценки эффективности FRET в любой интересующей области, включая количественную оценку в каждом пикселе изображения в канале передачи. На рисунке 2D показаны нормализованные попиксельные FRET-изображения клеток, экспрессирующих слитый белок GFP-Cherry, совместно экспрессирующих GFP и Cherry в качестве отрицательного контроля и экспрессирующих рецепторные субъединицы рецептора Эшвелла-Морелла. Крысиный вариант этого рецептора, печеночный лектин крысы (RHL1 и RHL2), представляет собой двухсубъединичную рецепторную систему, которая, как известно, гетероолигомеризируется. Вся эффективность FRET была нормализована до эффективности слитого белка GFP-Cherry. Мы помечали RHL1 и 2 GFP и Cherry на цитоплазматической стороне плазматической мембраны. На изображении показаны различные значения FRET на плазматической мембране по сравнению с внутриклеточными везикулами. Удаление домена стебля RHL1 (GFP-RHL1Δstalk), который, как считается, опосредует тесное взаимодействие между двумя субъединицами, снижает обнаруженную эффективность FRET. На рисунке 2E средняя клеточная эффективность FRET клеток, экспрессирующих GFP-RHL1 и Cherry-RHL2, а также GFP-RHL1Δstalk и Cherry-RHL2, построены в зависимости от молекулярного отношения акцептора к донору (NA /N D). Для дальнейшего анализа FRET этой рецепторной системы читатель может обратиться к предыдущей публикации5.

Figure 1
Рисунок 1: Репрезентативные изображения клеток, экспрессирующих флуоресцентные белки. Клетки, экспрессирующие только GFP (A), только вишню (B), коэкспрессию GFP и вишни (C) и слитый белок GFP-вишни (D). Изображения в канале 1 (488, 505-530 нм), канале 2 (488, >585 нм) и канале 3 (561, >585 нм) соответственно. Изображения были получены с 63-кратным масляным объективом и 3-кратным увеличением. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Количественная оценка изображений FRET. Средняя клеточная эффективность FRET для клеток, экспрессирующих слитый белок GFP-Cherry, построена в зависимости от отношения интенсивности акцептор-донор (Q) (A) и от молекулярного отношения акцептор-донор (N A / ND) для клеток, совместно экспрессирующих GFP и Cherry (B). Толстая линия с открытым кругом представляет собой одну клетку, экспрессирующую слитый белок GFP-Cherry. Тонкая линия с открытым кругом представляет собой клетку, совместно экспрессирующую GFP и вишню. Заметим, что при более высоких соотношениях N A/N D доля полезного сигнала, сенсибилизированного излучения (I, D, Eα) в передаточном канале становится все меньше и меньше относительно прямого возбуждения акцептора (I, A, S2). Это приводит к большей погрешности в определении Е. Попиксельные изображения FRET рассчитываются с использованием представленного алгоритма (C). Эта панель иллюстрирует клетку, совместно экспрессирующую GFP и Cherry, отрицательный контроль, в донорском канале, канале передачи и акцепторном канале. Он также показывает возможную схему интересующей области, избегая перинуклеарных везикул с высокой автофлуоресценцией, что может отрицательно повлиять на точность расчета FRET. (D) Вся эффективность FRET была нормализована до эффективности слитого белка GFP-Cherry. Слева направо: слитый белок GFP-Cherry (положительный контроль), коэкспрессия GFP Cherry (отрицательный контроль), GFP-RHL1 и Cherry-RHL2, а также GFP-RHL1Δstalk и Cherry-RHL2. Масштабная линейка: 10 мкм. Шкала с цветовой кодировкой: нормализованная средняя эффективность FRET (нормализованная к среднему значению положительного контроля, белка слияния GFP-Cherry). (E) Эта панель показывает среднюю клеточную эффективность FRET для клеток, экспрессирующих GFP-RHL1 и Cherry-RHL2, а также GFP-RHL1Δstalk и Cherry-RHL2, построенных по сравнению с молекулярным отношением акцептора к донору (N, A/N,D). Замкнутый серый круг представляет собой одну клетку, экспрессирующую GFP-RHL1 и Cherry-RHL2. Замкнутый черный круг представляет собой клетку, экспрессирующую GFP-RHL1Δstalk и Cherry-RHL2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Алгоритм для других пар донор-акцептор. Алгоритм для других пар донор-акцептор, таких как различные версии голубых (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) и желтых (EYFP, Citrine, Venus, SYFP2, YPet) флуоресцентных белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Электронная таблица с представленным алгоритмом FRET и использованием белка слияния GFP-Cherry для количественной оценки FRET путем сенсибилизированного излучения акцептора и донорного гашения. Ячейки A2, B2, C2: средние фоновые сигналы (B 1, B 2, B 3) в каналах 1, 2 и 3 соответственно. Ячейки D2 и E2: средние значения коэффициентов перекрестных помех S 1 и S2. Ячейка G2: Значение коэффициента Equation 11вымирания. Ячейки I1 и I2: коэффициенты экстинкции GFP и Cherry при лазерном луче с длиной волны 488 нм. Ячейка J2: Среднее значение для множителя. Столбец C (C5 и выше): измеренная интенсивность флуоресценции клетки, экспрессирующей GFP в канале 1. Столбец D (D5 и выше): измеренная интенсивность флуоресценции клетки, экспрессирующей GFP в канале 2. Столбец E (E5 и выше): измеренная интенсивность флуоресценции клетки, экспрессирующей GFP в канале 3. Столбцы F, G и H (F5, G5, H5 и выше соответственно): измеренные интенсивности флуоресценции, вычитаемые из средней интенсивности фона во всех 3 каналах. Колонка I (I5 и выше): расчетный коэффициент перекрестных помех S1. Столбец M (M5 и выше): измеренная интенсивность флуоресценции клетки, экспрессирующей вишню в канале 1. Столбец N (N5 и выше): измерена интенсивность флуоресценции клетки, экспрессирующей вишню в канале 2. Столбец O (O5 и выше): измерена интенсивность флуоресценции клетки, экспрессирующей вишню в канале 3. Столбцы P, Q и R (P5, Q5, R5 и выше соответственно): измеренные интенсивности флуоресценции, вычитаемые из средних интенсивностей фона во всех 3 каналах. Столбец S (S5 и выше): Расчетный коэффициент перекрестных помех S2. Столбец W (W5 и выше): измеренная интенсивность флуоресценции не- или имитационной трансфицированной клетки в канале 1. Столбец X (X5 и выше): измеренная интенсивность флуоресценции не- или имитационной трансфицированной клетки в канале 2. Столбец Y (Y5 и выше): измеренная интенсивность флуоресценции не- или имитационной трансфицированной клетки в канале 3.Столбец AD (AD5 и выше): измеренная интенсивность флуоресценции клетки, экспрессирующей слитый белок GFP-Cherry (или коэкспрессирующий GFP и Cherry, или любую интересующую пару белков) в канале 1. Столбец AE (AE5 и выше): измеренная интенсивность флуоресценции клетки, экспрессирующей слитый белок GFP-Cherry (или коэкспрессирующий GFP и Cherry, или любую интересующую белковую пару) в канале 2. Колонка AF (AF5 и выше): измеряла интенсивность флуоресценции клетки, экспрессирующей слитый белок GFP-Cherry (или коэкспрессирующий GFP и Cherry, или любую интересующую белковую пару) в канале 3. Столбцы AG, AH и AI (AG5, AH5, AI5 и выше соответственно): измеренные интенсивности флуоресценции, вычитаемые из средней интенсивности фона во всех 3 каналах. Столбец AJ (AJ5 и выше): рассчитывается α коэффициент. Колонка AK (AK 5 и выше): Расчетная средняя эффективность FRET E. Столбец AL (AL5 и выше): рассчитанное скорректированное отношение интенсивности акцептора к донору (Q). Примеры вычисленных параметров из эксперимента FRET, выраженных в виде среднего значения и стандартного отклонения: S1 = 0,2232 ± 0,0060. S2 = 0,2039 ± 0,0074. α = 1.9463 ± 0.1409. E = 0,2713 ± 0,0220. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 1: Спектры поглощения и излучения GFP и Cherry. Нормализованные спектры поглощения и флуоресцентного излучения eGFP и mCherry. Линии возбуждающего лазера (488 и 543 нм) и пропускания фильтра, используемые для донорного канала (ch1: 505-530 нм) и передаточных/акцепторных каналов (ch2 и 3: >585 нм) в конфокальном микроскопе, отмечены затенением. Для возбуждения акцептора также могут использоваться лазерные линии 561 или 590 нм. Источник базы данных флуоресцентных белков (fpbase.org). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В представленном протоколе подробно описано использование генетически связанного взаимно-однозначного калибровочного зонда флуоресцентного белка для количественной оценки FRET с использованием детектирования сенсибилизированного излучения акцептора и гашения донорной молекулы методом конфокальной микроскопии. Этот метод может быть применен для оценки белковых взаимодействий в физиологическом контексте живой клетки в различных субклеточных компартментах. Пространственное разрешение может быть дополнительно улучшено путем применения представленного алгоритма для расчета эффективности FRET в каждом пикселе изображения (попиксельный FRET). Определение абсолютной эффективности FRET на основе интенсивности требует определения перекрестных помех, количественно определяемых здесь с помощью S-факторов, и эффективности обнаружения молекул-доноров и акцепторов с помощью данной микроскопической установки, количественно определяемой фактором α. Здесь предоставляется протокол, который позволяет количественно оценить эффективность как перекрестных помех, так и обнаружения. Прямое сцепление генетической информации флуоресцентного белка гарантирует эквимолярную экспрессию в живых клетках и, таким образом, делает возможным определение фактора α. Знание α фактора, в свою очередь, является необходимым условием для количественной оценки эффективности FRET в живых клетках. Важнейшими этапами в представленном протоколе являются надлежащее клонирование непосредственно связанной флуоресцентной белковой химеры, достаточное время после трансфекции для обеспечения созревания флуоресцентного белка, использование флуоресцентных белков в аналогичном клеточном микроокружении, например, флуоресцентных белков в цитоплазме и на цитоплазматической стороне плазматической мембраны, а также стабильная установка микроскопа.

Экспериментальная установка и алгоритм, представленные здесь, предназначены для пары GFP-Cherry FRET. В дополнительном файле 1 мы приводим алгоритм для различных версий голубых (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) и желтых флуоресцентных белков (EYFP, Citrine, Venus, SYFP2, YPet). Преимуществом этих флуоресцентных белковых пар является большее спектральное перекрытие между спектром излучения голубого и спектром поглощения желтого белка (по сравнению с GFP-Cherry), что приводит к несколько более высоким значениям R0 и большей эффективности FRET. Однако по той же причине число немалых коэффициентов перекрестных помех и их величины также больше (см. Дополнительный текст).

Необходимо учитывать и обсуждать ограничения количественного микроскопического ратиометрического FRET в живых клетках. Обязательным условием использования FRET для детектирования молекулярных взаимодействий является применение флуоресцентных меток. В нашем протоколе используются генетически кодируемые флуоресцентные белки. Поскольку эти флуоресцентные белки могут быть сопоставимы по размеру (27 кДа) с интересующим меченым белком, они могут изменять локализацию и функцию интересующего белка. Следовательно, как локализация, так и функциональность любого меченого белка, представляющего интерес, должны быть проверены и сравнены с таковыми эндогенного немеченого белка. Еще одним важным моментом, о котором следует помнить, является эндогенный немеченый пул интересующего белка. Взаимодействие меченых с немечеными эндогенными белками уменьшит сигнал FRET. В идеале все интересующие белки помечены. Это может быть достигнуто с помощью клеток, которые не имеют интересующего белка эндогенно (например, в примере, приведенном на рисунке 2C и 2E ), с использованием клеток, полученных от мышей-нокаутов, с использованием модифицированных CRISPR клеток и т.д. Даже при использовании попиксельного FRET сигнал молекул-доноров и акцепторов будет усреднен по пятну с дифракционным ограничением, пределу разрешения конфокального микроскопа. Таким образом, невозможно разрешить различные популяции доноров в пределах места, ограниченного дифракцией. Могут быть доноры без акцептора или доноры с несколькими акцепторами, вносящими вклад в средний сигнал FRET. Для анализа различных молекулярных субпопуляций с помощью FRET требуется флуоресцентная визуализация в течение всего срока службы22. Другой проблемой, особенно при высоких уровнях экспрессии, является так называемый случайный FRET между флуорофорами в непосредственной близости без основного взаимодействия интересующих белков23. Этот случайный FRET может быть значимым в плазматической мембране, учитывая 2-D конфайнмент мембранных белков по сравнению со свободно диффузионными цитоплазматическими белками. Поэтому всегда следует проводить контрольные эксперименты, такие как удаление доменов, которые опосредуют предполагаемое взаимодействие между молекулами, и проверка на снижение обнаруженного сигнала FRET.

Неопределенность точных стехиометрий взаимодействующих белков в живых клетках ограничивает использование FRET в качестве спектроскопической линейки для оценки молекулярных расстояний между белками в живых клетках. Даже в случае строгого взаимодействия «один к одному» (i) гибкость линкера, присоединяющего флуоресцентный белок к интересующему белку, а также (ii) отсутствие знаний об относительной ориентации дипольных моментов красителей (определение так называемого коэффициента κ2 ) может исказить точные измерения расстояния. Исследования конструкций акцепторного слияния с жесткими линкерами разной длины, разделяющими два флуорофора и демонстрирующими различную эффективность FRET, были представлены в другом месте12. И наоборот, оценка стехиометрии с измерениями FRET в живых клетках сложна, однако возможна с использованием представленной логометрической количественной оценки FRET. Склонного читателя можно отсылать к предыдущей работе, в которой подробно описывается осуществимый подход5.

Таким образом, количественный подход FRET, представленный здесь, позволяет обнаруживать (i) белковые взаимодействия в физиологическом контексте живой клетки, (ii) изменения в белковых взаимодействиях с течением времени и (iii) различия во взаимодействиях в разных субклеточных компартментах вплоть до попиксельного уровня конфокального изображения и (iv) зависимость обнаруженного сигнала FRET от молекулярного отношения акцептора к донору, выраженного в живой клетке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Службу визуализации неврологии в Медицинской школе Стэнфордского университета за предоставление оборудования и места для этого проекта. Это исследование было поддержано очным финансированием Стэнфордского института рака и отделения гинекологической онкологии Стэнфорда, а также GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 от Национального управления исследований, разработок и инноваций, Венгрия.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) Thermo Fisher Scientific 15400054
Clontech mCherry N1 vector Addgene 3553
DMEM without phenol red Thermo Fisher Scientific 11054020
Fugene 6 Promega E2691
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080
LabTek 8-well chambers #1.0 Thermo Fisher Scientific 12565470
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific 25030081

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
  2. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  3. Mekler, V. M. A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer. Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).
  4. Vamosi, G., et al. Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study. Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).
  5. Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).
  6. van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).
  7. Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).
  8. Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors. Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).
  9. Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry Part A. , 24194 (2020).
  10. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  11. Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173, 1 Spec No 33-38 (1996).
  12. Nagy, P., et al. Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins. Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).
  13. Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).
  14. Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy. Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).
  15. Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).
  16. Sebestyen, Z., et al. Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).
  17. Szaloki, N., et al. High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).
  18. McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).
  19. Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Scott, B. L., Hoppe, A. D. Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells. Science Reports. 5, 10270 (2015).
  22. Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it. Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).
  23. King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments. Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).

Tags

Биология выпуск 170 визуализация живых клеток FRET количественная флуоресцентная микроскопия флуорофор белковое взаимодействие сенсибилизированное излучение

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

to:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

Оценка белковых взаимодействий в живых клетках с FRET-сенсибилизированным излучением
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vámosi, G., Miller, S., Sinha,… More

Vámosi, G., Miller, S., Sinha, M., Fernandez, M. K., Mocsár, G., Renz, M. Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. J. Vis. Exp. (170), e62241, doi:10.3791/62241 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter