Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/62350
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3, 1, 1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London, 2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London, 3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

ERRATUM NOTICE

Summary

Met behulp van gefocusseerde ionenbundelfrezen om glasvochtlamellen op het rooster te produceren uit bevroren biologische monsters voor cryo-elektronentomografie.

Abstract

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het bereiden van cryo-lamellen uit diepgevroren roosters van Plasmodium falciparum-geïnfecteerde menselijke erytrocyten, die gemakkelijk kunnen worden aangepast voor andere biologische monsters. De basisprincipes voor het voorbereiden van monsters, het frezen en bekijken van lamellen zijn gemeenschappelijk voor alle instrumenten en het protocol kan worden gevolgd als een algemene gids voor cryo-lamellenpreparatie op het rooster voor cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) en cryo-elektronentomografie (cryoET). Elektronenmicroscopieroosters die de cellen ondersteunen, worden met behulp van een handmatige of geautomatiseerde duikvriezer ondergedompeld in vloeibaar stikstofgekoeld vloeibaar ethaan en vervolgens gescreend op een lichtmicroscoop uitgerust met een cryotrap. Bevroren roosters worden overgebracht naar een cryo-scanning elektronenmicroscoop uitgerust met een gefocusseerde ionenbundel (cryoFIB-SEM). Roosters worden routinematig gesputterd voorafgaand aan het frezen, wat de verspreiding van ladingsopbouw tijdens het frezen bevordert. Als alternatief kan een e-beam roterende coater worden gebruikt om een laag koolstof-platina op de roosters aan te brengen, waarvan de exacte dikte nauwkeuriger kan worden geregeld. Eenmaal in de cryoFIB-SEM wordt een extra coating van een organoplatinumverbinding op het oppervlak van het net aangebracht via een gasinjectiesysteem (GIS). Deze laag beschermt de voorrand van de lamellen terwijl deze wordt gefreesd, waarvan de integriteit van cruciaal belang is voor het bereiken van gelijkmatig dunne lamellen. Gebieden van belang worden geïdentificeerd via SEM en het frezen wordt stapsgewijs uitgevoerd, waardoor de stroom van de ionenbundel wordt verminderd naarmate de lamellen elektronentransparantie bereiken, om overmatige warmteontwikkeling te voorkomen. Een rooster met meerdere lamellen wordt vervolgens overgebracht naar een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) onder cryogene omstandigheden voor tilt-serie acquisitie. Een robuuste en contaminatievrije workflow voor lamellenpreparatie is een essentiële stap voor downstream-technieken, waaronder cellulaire cryoEM, cryoET en subtomogrammiddeling. De ontwikkeling van deze technieken, met name voor het optillen en frezen van hogedrukbevroren monsters, heeft in het veld een hoge prioriteit.

Introduction

Alleen de cellulaire inhoud van biologische monsters < 500 nm dik kan effectief worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) bij cryogene temperaturen, waardoor het bereik van monsters wordt beperkt tot virussen, prokaryoten, eenvoudige eencellige organismen en dunnere gebieden van grotere eukaryote cellen1. On-grid focused ion beam (FIB)-frezen maakt het mogelijk om dikkere diepgevroren biologische monsters te verdund tot elektronentransparante lamellen bij cryogene temperaturen (< -150 °C). De resulterende lamellen worden vervolgens overgebracht naar een TEM voor visualisatie en tomografische gegevensverzameling, waardoor 3D-reconstructies met hoge resolutie van de cellulaire en moleculaire kenmerken in cellen mogelijk worden (voor beoordelingen zie Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163 en Wagner et al., 20204).

FIB-frezen is voortgekomen uit het veld van de materiaalwetenschappen, waar monsters routinematig worden verdund om ze voor te bereiden op downstream-analyse5. Het wordt uitgevoerd in een scanning elektronenmicroscoop (SEM), die twee optische kolommen heeft: conventionele scanning elektronenmicroscoopoptica en een tweede kolom met optica die in staat is om een gefocusseerde ionenbundel (FIB) te genereren en fijn te regelen - een FIB-SEM genoemd. Hierdoor kan een specifiek deel van het monster worden geablateerd door ionen die worden gegenereerd door een galliumbron, waardoor overtollig materiaal wordt verwijderd en een lamellen6 achterblijven. Het freesproces wordt geleid door SEM-beeldvorming van de topografie van het monster, die wordt gebruikt om interessante gebieden te lokaliseren en de voortgang van het frezen te volgen. Voor biologische toepassingen is de basisopstelling grotendeels hetzelfde, maar het frezen wordt uitgevoerd bij cryogene temperaturen. Dit vereiste dat standaard FIB-SEM's werden aangepast om cryogekoelde trappen te hebben die constante temperaturen en lage oppervlakteverontreinigingssnelheden handhaven, evenals luchtsluizen om monsteroverdracht te vergemakkelijken zonder afwijking of verontreiniging. Sample shuttles zijn ook aangepast om een reeks verschillende dragers in de cryoFIB-SEM te kunnen monteren, waaronder TEM-roosters, planchettes en haarvaten. Verschillende belangrijke groepen onderzoekers hebben centraal gestaan bij de ontwikkeling van deze methoden en de voortdurende technologische vooruitgang op dit gebied 7,8,9,10,11,12. Commerciële oplossingen zijn nu op grotere schaal beschikbaar voor biologisch FIB-frezen bij cryogene temperatuur en on-grid frezen van lamellen wordt steeds routineuzer, gegeven een geoptimaliseerd monster.

Een reeks kamertemperatuur- en cryoEM-technieken kan worden gebruikt om cellulaire informatie over alle schalen van het leven te visualiseren, van hele meercellige organismen met een bescheiden resolutie tot het begrijpen van de context van complexe processen op cellulair niveau en in nog meer detail, tot de bepaling van in situ moleculaire structuren13,14,15,16,17,18,19. Klassieke kamertemperatuurtechnieken omvatten secties gefixeerd en gekleurd, hars ingebedde cellen en weefsels door ultramicrotomie voor analyse van cellulaire morfologie door TEM (voor beoordeling zie Studer et al., 200820). Er zijn alternatieve technieken ontwikkeld die gebruik maken van secundaire elektronenverstrooiing door SEM om het oppervlak van blokken geconserveerde cellen in beeld te brengen, voordat materiaal geleidelijk wordt verwijderd met een mes (seriële blokgezichtsbeeldvorming) of een gerichte ionenbundel21,22,23. Deze techniek is ook met succes geïmplementeerd bij cryogene temperaturen (aangeduid als cryo-volume imaging) met een cryoFIB-SEM op glasachtige, niet-gekleurde blokken cellen of weefsels24. Als alternatief kunnen dikkere lamellen (~ 15 μm dik) worden gefreesd en bestudeerd door STEM-beeldvorming25. Met behulp van deze technieken kunnen hele blokken met veel cellen in beeld worden gebracht om populatie-informatie te verzamelen of kan een heel orgaan / organisme in 3D worden afgebeeld en gereconstrueerd. Om toegang te krijgen tot moleculaire informatie met hoge resolutie van cellen, moeten monsters echter worden bewaard in een bijna inheemse, bevroren gehydrateerde toestand en moeten daarom worden bereid onder cryogene omstandigheden. Cryo-elektronenmicroscopie van glasvochtsecties (CEMOVIS) is een techniek waarbij hogedruk bevroren blokken biologisch materiaal onder cryogene omstandigheden worden doorsneden met een ultramicrotoom. Dit levert linten van cryo-secties op (40-100 nm dik)26, die zijn bevestigd aan een EM-raster en worden afgebeeld in de TEM. De fysieke interactie van het mes met het glasvochtmonster veroorzaakt echter crevassing- en compressieartefacten die de cellulaire structuur ernstig kunnen verstoren27,28,29,30. Dikkere secties zijn meer vatbaar voor deze artefacten, waardoor het onpraktisch is om secties dikker dan ~ 70 nm te gebruiken26. Deze beperking beperkt de 3D-weergave van de biologische structuur in het tomogram aanzienlijk. FIB-frezen bij cryogene temperaturen ondervindt deze problemen niet, maar heeft zijn eigen artefacten veroorzaakt door differentiële freessnelheden over delen van het monster, wat leidt tot variabele diktes binnen een lamellen - gordijnen genoemd. Dit probleem wordt verzacht door het aanbrengen van een organoplatinum laag aangebracht via een gasinjectiesysteem (GIS), dat de voorrand van de lamellen beschermt tijdens het frezen31. De bovengrens van de monsterdikte voor on-grid FIB-frezen wordt bepaald door de mogelijkheid om het monster te bevriezen terwijl het glasachtig blijft32, hoewel, met de introductie van cryo lift-out technieken en aangepaste monsterdragers voor biologische monsters, FIB-frezen ook kan worden gebruikt om hogedruk bevroren monsters te verwerken31,33,34,35. Bovendien mogen diepvriesmonsters niet te dun zijn, omdat er voldoende biologisch materiaal moet zijn om een redelijk grote lamellen te genereren die voldoende oppervlak bieden om kantelseries bij de vereiste vergroting te verzamelen. Dit probleem kan worden verlicht door klonten van kleinere cellen, zoals bacteriën of gisten, te malen. De uiteindelijke lamellendikte (~ 100-300 nm) wordt meestal bepaald door de integriteit van het monster en de freesstrategie. Dunnere lamellen zijn beter voor structureel werk met hoge resolutie, zoals sub-tomogrammiddeling, maar dikkere lamellen bevatten veel grotere cellulaire volumes dan kan worden bereikt door CEMOVIS, waardoor meer cellulaire context wordt geboden in een bijna tot native bewaard monster. FIB-frezen kan ook worden gebruikt om diepgevroren eiwitkristallen te verdunnen voor elektronendiffractiestudies36.

FIB-frezen van glasvochtcellen is de tijd en moeite waard om uit te voeren als de wetenschappelijke vraag moleculaire details met hoge resolutie van near-native specimens in situ vereist. Met toegang tot meer faciliteiten voor de routinematige productie van lamellen, is de snelheidsbeperkende stap vaak de optimalisatie van het monster voorafgaand aan het malen, waarbij de tijd moet worden genomen om ervoor te zorgen dat het monster glasachtig is en een geschikte dikte heeft om robuuste en gelijkmatig dunne lamellen te produceren. Hier wordt de monsteroptimalisatie beschreven voor FIB-frezen van diepgevroren menselijke rode bloedcellen die zijn geïnfecteerd met Plasmodium falciparum-parasieten , de veroorzaker van malaria, maar deze aanpak kan voor elk bepaald monster worden aangepast.

Protocol

Menselijk bloed werd verkregen van geanonimiseerde donoren via de Britse National Blood and Transplant service en wordt binnen 2 weken na ontvangst gebruikt. Er is geen ethische goedkeuring vereist voor het gebruik ervan.

1. Bereiding en ondervriezing van met Plasmodium falciparum geïnfecteerde rode bloedcellen

  1. Isoleer volwassen schizonts door centrifugatie (1.580 x g) over een 70% (v/v) isotone dichtheidsgradiëntmedium (voor standaardprocedures voor het kweken van ongeslachtelijke bloedstadia van 3D7 Plasmodium falciparum in menselijke erytrocyten zie Blackman M.J., 199537).
  2. Bevestig de aan de lucht gedroogde dunne bloedfilms op een glasglaasje met 100% methanol om de morfologische homogeniteit van de schizonten te controleren voordat u kleurt met 10% Giemsa-vlek in 6,7 mM fosfaatbuffer, pH 7,1.
    OPMERKING: Om de voorbereiding voor schizonts die vastlopen op specifieke punten van uitgang te verrijken, kunnen schizonts verder worden gesynchroniseerd met samengestelde 2- en E64-remmers (zie Representatieve resultaten en Figuur 1 voor een uitleg van het effect van deze remmers).
    LET OP: Plasmodium falciparum is een pathogeen voor de mens en mag alleen worden behandeld in een geschikte inperkingsfaciliteit volgens de lokale gezondheids- en veiligheidsrichtlijnen.
  3. Centrifugeer schizonts (240 x g) voorzichtig om ze te pelleteren en resuspendien in 2x volume van de celpellet van RPMI-media, wat resulteert in een 50% hematocrietsuspensie.
  4. Breng op een handmatige duikvriesinstallatie 2,5 μL schizonts aan op de koolstofzijde van een gloeiontladen (gebruik instellingen van de gloeiontladingseenheid van 60 s, 30 mA in lucht, waarbij alleen de koolstofzijde van het rooster wordt behandeld) 200 mesh koperen rooster met een 2/4 gatachtige koolstoffilm en dep gedurende ~ 20 s vanaf de achterkant van het rooster met behulp van filterpapier van klasse 1 met een gescheurde rand. Duik in vloeibaar stikstofgekoeld vloeibaar ethaan en breng de roosters over naar opslag (zie tabel met materialen voor apparatuur die in dit onderzoek wordt gebruikt).
    OPMERKING: Het experiment kan hier worden gepauzeerd en rasters kunnen voor onbepaalde tijd onder vloeibare stikstof worden opgeslagen.
    LET OP: Vloeibare stikstof is een verstikkend middel en veroorzaakt bevriezing; Ga voorzichtig om in een geschikte omgeving met zuurstofbewaking.
    LET OP: Vloeibaar ethaan veroorzaakt ernstige brandwonden en is ontvlambaar; Gebruik in een zuurkast uit de buurt van ontstekingsbronnen.
    OPMERKING: Diepgevroren schizonts zijn niet langer levensvatbaar. Dit werd bepaald door menselijk bloed te incuberen met verschillende gouden roosters van lucht-ontdooide diepgevroren schizonts en geen parasietgroei na enkele dagen te observeren, in vergelijking met niet-bevroren controles. Bevroren roosters van schizonts zijn daarom veilig te hanteren buiten de containmentfaciliteiten met behulp van normale veiligheids- en decontaminatieprocedures (handschoenen, sterilisatie van oppervlakken / gereedschappen met >70% ethanol en verwijdering van roosters in >70% ethanol).
  5. Schermrasters met behulp van een cryo-trap voor een lichtmicroscoop, met bijzondere aandacht voor de gradiënt van ijs over het raster. Controleer in de dunnere delen van ijs individuele rastervierkanten op celdekking.
    OPMERKING: De beste vierkanten moeten één cel dik zijn in het midden van het rastervierkant (figuur 2). Dit zorgt ervoor dat een lamellen over het midden van het vierkant gefreesd kunnen worden zonder het dikkere ijs aan de randen tegen de roosterbalken te raken. Het experiment kan hier worden gepauzeerd en roosters kunnen voor onbepaalde tijd onder vloeibare stikstof worden opgeslagen. Als cellen een fluorescerende marker dragen, kunnen roosters ook worden gescreend door cryoCLEM om X / Y-posities van belang te lokaliseren, die kunnen worden gecorreleerd met rasterlocaties in de cryoFIB-SEM om direct te frezen.

2. On-grid FIB-frezen van diepgevroren cellen

  1. Markeer de voorkant van cryoFIB-specifieke autogrid-velgen met een zwarte onuitwisbare markeerstift om het midden van het weggesneden gedeelte en de andere kant van de velg aan te geven (figuur 3). Stel het knipstation in en knip de rasters in de gemarkeerde ringen met de carbon kant naar beneden.
  2. Laad roosters in de cryoFIB-SEM shuttle (meestal 2 roosters, afhankelijk van de shuttle) koolstofzijde naar boven en breng een platina sputterlaag aan in een argonatmosfeer (5 x 10-2 mbar) (5 mA voor 60 s - dikte is variabel) of een koolstof / platina e-beam roterende laag (~ 4 nm dikte) op het oppervlak van de cellen.
    OPMERKING: Beide soorten coatings helpen de ladingsdispersie tijdens SEM-beeldvorming. Het voordeel van de e-beam roterende coater is dat de exacte dikte van de coating kan worden gespecificeerd.
  3. Laad de shuttle in de cryoFIB-SEM en beoordeel de celverdeling op elk rooster door SEM bij 5 kV (13 pA of 25 pA). Neem een overzicht van lage vergrotingen (~ 100x) om ijsgradiënten over het raster te bekijken. Maak vervolgens afbeeldingen met een hogere vergroting (~ 5.000x) om naar individuele rastervierkanten te kijken en de gebieden van het raster te identificeren met zichtbare cellulaire kenmerken en lage oppervlakteverontreiniging om te frezen.
  4. Breng een organoplatinumlaag van >2 μm aan op het oppervlak van elk rooster met behulp van het gasinjectiesysteem (GIS). Om dit te doen, steekt u de GIS-naald in de kamer boven het rooster en verwarmt u de organoplatinum-bron tot een ingestelde temperatuur gedurende een ingestelde tijd (bijvoorbeeld ~ 27 ° C voor 3-10 s) om een dampstroom te produceren.
    OPMERKING: De aanbrenghoek, temperatuur en timing van de organoplatinum-laag via de GIS-naald moeten worden geoptimaliseerd om een gelijkmatige coating te maximaliseren. Dit is afhankelijk van de specifieke cryoFIB-SEM die wordt gebruikt (zie Representatieve resultaten voor verdere uitleg).
  5. Kantel het monster zodat het vlak van het raster ~10° is ten opzichte van de invalshoek van de ionenbundel en verplaats het midden van een geschikt rastervierkant dat te zien is in zowel de SEM- als de FIB-afbeeldingen.
  6. Onderzoek het raster met behulp van de ionenbundel bij lage stroom (nominaal 1,5 pA, 30 kV) en ga naar een voldoende hoge vergroting (~ 7.000x) om de cellen in het midden van een rastervierkant te visualiseren. Breng het monster in beeld bij de eerste maalstroom (300 pA) en corrigeer voor astigmatisme. Pas de helderheid en het contrast aan en markeer vervolgens twee rechthoekige patronen om te frezen, een boven en een onder een 3 μm dik beschermd gebied, waarvan het midden de gewenste locatie van de uiteindelijke lamellen is.
    OPMERKING: De gekozen breedte van de patronen is afhankelijk van de topografie van de omringende cellaag en de celgrootte. 7-20 μm is een geschikte breedte voor schizonts, maar bredere lamellen doen er langer over om te frezen. De gekozen hoogte van de patronen voor de eerste freesstap is afhankelijk van de dikte van het monster, beginnend rond 6 μm; Dit kan tijdens het frezen moeten worden aangepast. Frezen wordt gericht uitgevoerd vanaf de buitenste boven- en onderrand van de patronen naar het gezicht van de lamellen. Dit kan parallel worden gedaan, waarbij beide patronen gelijktijdig of sequentieel worden gefreesd, waarbij eerst materiaal van boven de lamellen en vervolgens van onderaf wordt verwijderd.
  7. Begin met frezen bij de eerste stroom; bewaak de live voortgang in de ionenbundelweergave en met tussenpozen via SEM (5 kV, 13 of 25 pA). Controleer of de ionenbundel door het monster boven en onder het beschermde gebied is gebroken. Zo niet, verhoog dan de hoogte van de rechthoekige patronen om meer materiaal te verwijderen. Stop wanneer het oppervlak boven en onder de lamellen volledig glad is in het zicht van de ionenbundel.
    OPMERKING: De ionenbundel is door het monster boven en onder het beschermde gebied gebroken wanneer de binnenkant van de rechthoekige patronen geen kenmerken in het brandpuntsvlak bevat. Sommige functies, zoals rasterbalken, zijn mogelijk onscherp zichtbaar op de achtergrond.
  8. Overschakelen naar de volgende freesstroom (100 pA); scherpstellen en de helderheid/het contrast aanpassen. Verklein de ruimte tussen de twee rechthoekige patronen tot 1,5 μm en verlaag de patroonhoogte om alleen het niet-gefreesde materiaal te bedekken. Begin met frezen bij de nieuwe stroom totdat het oppervlak boven en onder de lamellen volledig glad is.
  9. Herhaal dit proces stapsgewijs totdat een dikte van 0,3 μm is bereikt, waarbij de ionenbundelstroom telkens wordt verminderd volgens het freesschema in tabel 1.
  10. Fres verschillende lamellen (de hoeveelheid is afhankelijk van de dikte van het monster en de beschikbare tijd) op een of beide roosters tot een dikte van 0,3 μm, noteer de X/Y/Z-positie van elke lamellen en reserveer ~1-2 uur aan het einde van de sessie om de lamellen tot hun uiteindelijke dikte (60-200 nm) te polijsten.
  11. Neem een SEM-overzicht met lage vergroting van het hele raster en plan een polijstroute vanaf lamellen aan de voorkant van het rooster (dichter bij de ionenbundelbron) tot lamellen aan de achterkant van het raster (het verst verwijderd van de ionenbundelbron) (figuur 5).
    OPMERKING: Dit vermindert de herplaatsing van geableerd materiaal terug op het oppervlak van gepolijste lamellen.
  12. Verklein de ruimte tussen de twee rechthoekige patronen tot 100-200 nm en begin met de laatste polijststap bij een ionenbundelstroom van 30 pA. Bewaak de voortgang door SEM bij 2-3 kV (13 pA, verblijf = 300 n, 3072 x 2048, ~ 2 s voor een volledig frame) en stop met polijsten wanneer het contrast verloren gaat in de lamellen door SEM of wanneer de organoplatinum laag van de lamellen zelf integriteit begint te verliezen.
  13. Voordat u de rasters verwijdert, verkrijgt u een SEM-afbeelding met lage vergroting van het hele raster en slaat u afbeeldingen van elke lamellen op. Gebruik ze om het raster later in de TEM te controleren. Pauzeer het experiment hier en bewaar de roosters met lamellen onder vloeibare stikstof - behandel het met zorg.
    OPMERKING: Rasters kunnen licht sputteren bij verwijdering van de cryoFIB-SEM, wat kan helpen bij het beperken van drift en opladen in de TEM bij hoge vergroting, maar dit moet voorzichtig worden gedaan omdat te veel sputtercoating de biologische inhoud in de lamellen kan verbergen. Het is mogelijk om lamellen in dit stadium te screenen op fluorescentie; Het verkrijgen van voldoende signaal hangt echter af van de overvloed van het gelabelde eiwit binnen de dikte van de lamellen. Er moet grote zorg worden besteed aan het omgaan met de roosters om schade aan de lamellen te beperken en oppervlakteverontreiniging te voorkomen.

3. Tilt-serie acquisitie en algemeen overzicht van gegevensverwerking

  1. Laad de roosters in de TEM en lijn de freesrichting loodrecht op de kantelas van het podium uit.
    OPMERKING: Het uitlijnen van de roosters gebeurt met het oog met behulp van de markeringen op de autogrid-velg. Een foutmarge van ~10° is acceptabel, anders kunnen de wanden van de geul aan weerszijden van de lamellen de lamellen verduisteren als het rooster wordt gekanteld.
  2. Verkrijg een kaart met lage vergroting (~ 150x) van het hele raster en lokaliseer de lamellen; Verkrijg vervolgens een middelgrote vergrotingskaart (~ 1.500x, afhankelijk van de lamellengrootte) van elke lamellen en lokaliseer de interessegebieden.
  3. Kantel het rooster ±10° om het vlak van de lamellen (niet het rooster) loodrecht op de optische as te maken
    OPMERKING: De richting van de voorkanteling kan worden bepaald door de positie van de voorrand van de lamellen (op zoek naar de overgebleven organoplatinum-laag) in de lage en gemiddelde vergrotingskaarten. Voor de TEM die hier wordt gebruikt, vereisen rasters een +10 ° voorkanteling als de voorranden van de lamellen omhoog wijzen in de kaarten en vereisen een -10 ° voorkanteling als ze naar beneden wijzen. Elk raster kan anders zijn vanwege de manier waarop ze zijn opgepikt en in de autoloader zijn geplaatst.
  4. Verkrijg dosissymmetrische tilt-serie38 (bijvoorbeeld -54° tot +54° met een toename van 3-5°) bij een pixelgrootte die zowel het gezichtsveld als de resolutie mogelijk maakt die vereist zijn voor het betreffende gebied. Gebruik een bereik van onscherptewaarden tussen -2 en -5 μm. Verzamel films met 3-10 frames bij elke stap en pas hiervoor deze parameters aan afhankelijk van de pixelgrootte om een totale dosis van ~ 150 e-/Å2 (voor een TEM van 300 kV) te accumuleren.
    OPMERKING: Scheuren in de lamellen moeten worden vermeden omdat deze regio's kunnen afdrijven. Oppervlakteverontreiniging moet ook worden vermeden, omdat dit het interessegebied of het focusgebied bij hoge kanteling kan verduisteren.
  5. Corrigeer de films met een programma zoals MotionCor239. Pas een dosiswegingsfilter toe op de gecorrigeerde afbeeldingen (geaccumuleerde e-/afbeelding)40 en schat de onscherpte van elke afbeelding met behulp van een programma zoals CTFFIND441.
  6. Gebruik fiduciele-loze uitlijning (patch tracking) in een programma zoals at etomo (IMOD)42 om de uitlijning en hoekrelatie van de beelden in tilt-series te berekenen.
  7. Voer de uitlijnings- en rotatiegegevens samen met de onscherptewaarden in een programma in dat driedimensionale CTF-correctie kan toepassen, bijvoorbeeld NovaCTF43. Bereken een gecorrigeerd tomogram om outputtomogrammen te krijgen met binningfactoren die relevant zijn voor downstream-analyse.
  8. Analyseer de reconstructies en bereid u voor op eventuele downstream-verwerking, bijvoorbeeld filtering, segmentatie of sub-tomogrammiddeling.

Representative Results

P . falciparum schizonts voorbereiden op het ondervriezen
Samengestelde 2- en E64-remmers worden gebruikt om schizonts in verschillende stadia van uitgang te blokkeren, waardoor een verrijkte populatie van schizonts wordt gegenereerd voor vervolgonderzoek. Dit is belangrijk omdat zonder een complementaire correlatieve techniek het frezen van specifieke subcellulaire doelen of celtypen een uitdaging is, omdat het proces in wezen blind is. Verbinding 2 is een eiwitkinaseremmer die de uitgang blokkeert voorafgaand aan vacuoleruptuur. Schizonts kunnen gedurende 4 uur op verbinding 2 worden gesynchroniseerd en vervolgens worden gewassen met verbinding 2-vrije media om de remmer te verwijderen, waarna schizonten na ongeveer 30 minuten rijpen en uitstappen. Als alternatief kunnen verbinding 2 gesynchroniseerde schizonten worden gewassen in E64, een onomkeerbare breedspectrum cysteïneproteaseremmer, en gedurende ongeveer 1 uur worden geïncubeerd om de uitgang te vertragen na het punt van vacuoleruptuur, maar vóór het scheuren van de gastheercel. De morfologie en homogeniteit van behandelde schizonten moeten worden gecontroleerd met Giemsa-gekleurde bloeduitstrijkjes voordat ze worden ingevroren (figuur 1). Schizonts kunnen in elk van deze toestanden worden ondergevroren met behulp van de methode die in deze publicatie wordt beschreven.

Figure 1
Figuur 1: De morfologie van verbinding 2 en E64-vastgelopen P. falciparum schizonts door Giemsa-gekleurde bloeduitstrijkjes. (A) In aanwezigheid van verbinding 2 is de parasitofore vacuole (PV) dicht opeengepakt met merozoïeten (paarse cirkels) met een enkele cluster van hemozoïnekristallen (donkerbruine cirkel). De grens tussen de PV en het omringende hemoglobine in de rode bloedcel (hRBC) (grijze band) van de gastheer is goed gedefinieerd, evenals het hRBC-membraan. (B) In aanwezigheid van E64 wordt het PV-membraan gescheurd en verspreiden de merozoïeten zich binnen de hRBC. Elke schizont bevat nog steeds een enkele cluster van hemozoïnekristallen. Het membraan van de gastheercel is lek en gedeeltelijk ingestort, daarom is er geen hemoglobine zichtbaar in de periferie van de cel en is de grens van het hRBC-membraan niet gemakkelijk zichtbaar. Schaalbalk, 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Optimalisatie van plunge freezing
Een reeks roosters met verschillende gatgroottes werden getest tijdens de optimalisatie van de blottingcondities voor met P. falciparum geïnfecteerde rode bloedcellen, waaronder 2/2, 3/3, 3,5/1 en 5/2 (vierkante) gatkoolstof op gouden en koperen 200 mesh-roosters. 200 mesh koperen vindroosters met 2/4 gatachtige koolstoffilm zorgen voor een voldoende dikke laag cellen om lange glasvochtlamellen te frezen. Grotere of kleinere gaten resulteerden over het algemeen in te dunne of te dikke cellagen (figuur 2A-C). Met 2/4 gatkoolstof worden schizonten door de gaten van 2 μm getrokken door het rooster van de achterkant (niet-koolstofzijde) te vegen, wat resulteert in cellen die boven en onder de koolstoffilm uitsteken. De 4 μm strook koolstof tussen de gaten resulteert in een strook koolstof die door het midden van de meeste van de resulterende lamellen loopt, wat kracht toevoegt. Vinderroosters zijn het meest geschikt voor correlatie- en zeefdoeleinden44, maar er moet voor worden gezorgd dat de cijfers / letters in het gaasontwerp niet te groot zijn, omdat dit gebieden voor frezen blokkeert.

De vlektijd op een handmatige zuiger is ongeveer 20 s, maar het exacte punt waarop moet worden gestopt met vlekken werd met het oog beoordeeld toen de druppel vloeistof die uit het rooster werd getrokken, stopte met zich uit te spreiden op het filterpapier. Een gescheurde rand was nodig om de oppervlaktespanning van de druppel te breken om het blottingproces te starten. Een geautomatiseerde duikvriezer werd niet gebruikt in deze studie, maar een redelijk uitgangspunt voor dit monster zou zijn om hetzelfde volume cellen en roostertype te gebruiken als gebruikt voor een handmatige zuiger, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de roosters van achteren worden afgeveegd in omstandigheden met een hoge luchtvochtigheid (~ 70%) en omgevingstemperatuur (~ 25 ° C). De blottingtijden en -omstandigheden zouden moeten worden geoptimaliseerd voor het specifieke geautomatiseerde systeem dat wordt gebruikt.

Diepgevroren roosters van P. falciparum schizonts werden gescreend door een lichtmicroscoop uitgerust met een cryo-stadium in plaats van door TEM, omdat het monster niet overdraagbaar was op elektronen. Voor dunnere monsters kunnen rasters worden gescreend door TEM (hele rasteratlas bij ~ 150x vergroting) voorafgaand aan de overdracht van het monster naar de cryoFIB-SEM, wat een voorwaarde kan zijn voor toegang tot een nationale faciliteit. Speciale aandacht moet worden besteed aan de gradiënt van ijsdikte over het raster en ook binnen individuele rastervierkanten. Goede rastervierkanten moeten één cel dik zijn of de koolstoffilm in het midden raken (figuur 2C). Dit voorkomt frezen in het dikkere ijs tegen de roosterstaven rond de rand van het rastervierkant en zorgt ervoor dat de ionenbundel boven en onder de cellaag doorbreekt, waardoor een vrije lamellen ontstaan in plaats van een wig. Zodra reproduceerbare blotting- en dompelvriesomstandigheden zijn geoptimaliseerd, is zeven meestal niet langer nodig voorafgaand aan FIB-frezen.

Figure 2
Figuur 2. Analyse van de celverdeling op roosters van bevroren P. falciparum schizonts door cryo-lichtmicroscopie. (A) Een voorbeeld van ijs dat te dik is over een rastervierkant door cryo-lichtmicroscopie, waardoor de cellen en de koolstoffilm worden verduisterd. Schaalbalk, 10 μm. (B) Een voorbeeld van de gatgrootte (300 mazen koperen rooster met 5/2 vierkante gatkoolstoffilm) die te groot is voor de cellen, wat resulteert in een zeer dunne laag biologisch materiaal omgeven door lege gebieden zonder ijs. Roosters zoals deze produceren zeer korte, onstabiele lamellen. Schaalbalk, 10 μm. (C) Een voorbeeld van een goede celverdeling op een koperen rooster met 200 mazen met 2/4 gatkoolstoffilm. Deze schizonten werden behandeld met E64-remmer. De grote cellen (rode doos, ~5 μm diameter) met een goed gedefinieerde periferie zijn geïnfecteerde rode bloedcellen die nog steeds een intact vacuole membraan hebben. De clusters van kleine cellen (blauwe doos, ~ 1 μm) zijn de individuele merozoites in een gedeeltelijk ingeklapte rode bloedcel van de gastheer. Elke schizont heeft een zwarte vlek in het midden, wat de positie van de hemozoïnekristallen aangeeft (zie figuur 1 voor aanvullende details). Het verschil in celmorfologie is niet zo gemakkelijk te zien als het eenmaal in de cryoFIB-SEM zit; Daarom is pre-screening door cryo-lichtmicroscopie gunstig totdat reproduceerbare blottingcondities zijn bereikt. De celbedekking rond de randen van het rastervierkant naast de rasterbalken (wit-gestreepte gebieden) is te dik om te frezen. Het dunnere gebied in het midden van het rastervierkant (geel onderbroken gebied) is een ideale plek om van te frezen, waardoor de lamellen worden uitgebreid naar de omliggende laag cellen. Schaalbalk, 6 μm. (D) Afbeelding van een cryoFIB-specifieke autogrid-velg met twee zwarte vlekken, één binnen het weggesneden gedeelte (zwarte beugel) en de andere tegenover, om 12 uur en 6 uur. De zwarte pijl geeft de freesrichting aan. (E) Wanneer de roosters in de autoloadercassette worden geladen, moeten de markeringen aan weerszijden van het laadpincet op gelijke afstand staan, waardoor de lamellen loodrecht op de kantelas van het podium liggen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Markering van cryoFIB-specifieke autogrid-velgen voor tomografie
Meestal worden roosters voorafgaand aan het frezen in autogrid-velgen geknipt om de hantering te vergemakkelijken en stijfheid te bieden, waardoor de lamellen worden beschermd tegen schade tijdens de volgende overdrachtsstappen. CryoFIB-specifieke autogrid-velgen zijn ontworpen met een cutaway-functie om toegang te krijgen tot meer van het rastervlak tijdens het frezen. Het is belangrijk om de freesrichting loodrecht op de kantelas van de TEM te oriënteren, zodat de verwerving van de kantelserie verloopt door de lamellen over de lengte te draaien. Dit zorgt ervoor dat de hoge wanden van de geul rond de lamellen de biologische informatie niet verdoezelen omdat het rooster wordt gekanteld.

Meestal wordt de autogrid-velg gemarkeerd om te helpen bij de visuele uitlijning binnen de cryoFIB-SEM-shuttle en later bij het laden van de TEM. Voor deze monsters werden twee markeringen aangebracht op 12 uur en 6 uur met een onuitwisbare marker (zie materiaaltabel), één in het midden van het weggesneden gedeelte van de clipring en de tweede recht tegenover (figuur 2D). Bij het laden in de TEM (zie materiaaltabel) moeten beide markeringen zichtbaar zijn aan weerszijden van het laadpincet en 90° zijn uitgelijnd op de rand van het pincet (figuur 2E). Opgemerkt moet worden dat de fabrikant aanbeveelt om roosters uit te lijnen met behulp van de gegraveerde stippen op de autogrid-velgen, omdat bepaalde inkten in de buurt van de ionenbundel het frezen kunnen verstoren.

Geknipte rasters kunnen worden gescreend door lichtmicroscopie met een aangepaste cassette voor een cryotrap, wat nuttig kan zijn om te controleren of het knipproces de koolstoffilm van het raster niet heeft vernietigd. Afhankelijk van de monstercassette kunnen ook niet-geclipte roosters worden gefreesd, maar tijdens de overdracht van de cryoFIB-SEM naar de TEM moet grote zorg worden besteed aan het beperken van het buigen van het rooster, omdat dit de lamellen zal breken. Niet-geclipte roosters kunnen in de TEM worden geladen door cryohouders aan de zijkant, maar de kans is groot dat de lamellen breken als het knippen na het frezen wordt uitgevoerd.

Organoplatinum coating
Organoplatinum coating wordt uitgevoerd op een of beide roosters zodra ze in de cryoFIB-SEM zijn geladen. De naald van het gasinjectiesysteem (GIS) wordt in de kamer boven het monster gestoken om gedurende een bepaalde tijd een stroom organoplatinumdamp over het oppervlak van het rooster van een verwarmde bron te leiden. De damp condenseert op koude oppervlakken en vormt een vaste laag (~2 μm dik). De integriteit van deze laag is van cruciaal belang om gelijkmatig dunne lamellen te kunnen frezen. De optimale toepassingsomstandigheden voor de organoplatinum-laag worden meestal vooraf bepaald door de fabrikant van het instrument, maar enige optimalisatie kan nog steeds nodig zijn. De meeste systemen richten de GIS-naald dicht bij de freesrichting of loodrecht op de freesrichting, afhankelijk van de geometrie van poorten op de kamer en de rotatiegrenzen van het podium. Verschillende instellingen kunnen worden getest door het rooster te coaten, een klein gebied te frezen, het podium te kantelen en de dikte van de laag door SEM te meten.

Naast de opstelling van de cryoFIB-SEM zelf, kunnen een aantal andere factoren van invloed zijn op de toepassing van de organoplatinum-laag, waaronder 1) de topografie van het monster, 2) oppervlakteverontreiniging op het rooster en 3) de reproduceerbaarheid van de dampstroom uit de GIS-naald. Omdat de GIS-stroom directioneel is, kan ongelijke topografie ervoor zorgen dat gebieden in de schaduw van cellen of oppervlakteverontreiniging ongecoat zijn of een dunnere laag hebben. Dit kan leiden tot een instorting van de organoplatinumlaag tijdens het polijsten (figuur 3). Bij het selecteren van een gebied om te frezen, is het noodzakelijk om rekening te houden met de omringende topografie, bijvoorbeeld grote oppervlakteverontreiniging, klonten cellen of gebroken koolstof die uit het oppervlak van het raster steken tot een paar rastervierkanten verderop, kunnen de dampstroom blokkeren, waardoor een schaduw van dunner organoplatinum ontstaat die een lamellen kan verzwakken. Bovendien moeten zeer kleine deeltjes oppervlakteverontreiniging in de buurt van de voorrand van de lamellen ook worden vermeden, omdat ze tijdens het frezen kunnen losbarsten, waardoor een verzwakt stuk kaal ijs achterblijft dat kan resulteren in het ontwikkelen van een gat in de lamellen tijdens het polijsten. Ten slotte, als het frezen is begonnen en de organoplatinum-laag er onstabiel uitziet, coatt u opnieuw, langer of wisselt u op een back-uprooster.

Figure 3
Figuur 3: Een organoplatinumcoating van goede kwaliteit is van cruciaal belang om dunne, gelijkmatig gefreesde lamellen te verkrijgen. (A) Een microfoto van de voorrand van een lamellen waarbij de organoplatinum-coating (OP, geel) te dun is aangebracht, wat leidt tot een gat in de voorrand van de lamellen dat zich ontwikkelde tijdens het polijsten (groene cirkel) en ongelijkmatig frezen over de gehele breedte van de lamellen (strepen). Het organoplatinum-oppervlak is afgeschoren door de ionenbundel, wat leidt tot een spray van materiaal achter de voorrand van de coating (geel-gestreepte lijn). (B) De organoplatinum coat (OP) is dikker aangebracht, wat resulteert in een gelijkmatiger verdunde lamellen. De integriteit van de vacht blijft over de gehele breedte van de lamellen behouden en het raakvlak tussen de organoplatinum vacht en het verglaasde biologische materiaal is goed gedefinieerd (geel-stippellijn). De koolstoflaag loopt door de achterkant van de lamellen (oranje). Schaalstaven, 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Beoordeling van de netkwaliteit in de cryoFIB-SEM en het freesproces
Zodra roosters zijn overgebracht naar de cryoFIB-SEM, kan de integriteit van de koolstoffilm en de verdeling van de cellen op de roosters worden gescreend door SEM (figuur 4A-C). IJsgradiënten, de posities van rasterstaven en de locatie van rasternummers op zoekerroosters kunnen worden gecontroleerd door SEM met lage vergroting bij 30 kV (figuur 4B), maar de spanning moet worden teruggebracht tot 5 kV terwijl de freesposities bij hoge vergroting worden gelokaliseerd en het freesproces wordt bewaakt om het contrast met de oppervlaktetopografie te vergroten.

Figure 4
Figuur 4: Beoordeling van de netkwaliteit en lokaliseren van te frezen gebieden in de cryoFIB-SEM . (A) Een overzicht van lage vergroting van een rooster bij 5 kV via de SEM. Het uitgesneden gedeelte van de autogrid-velg is zichtbaar aan de onderkant van de afbeelding. Schaalbalk, 0,5 mm. (B) Hetzelfde raster bij 30 kV door SEM, met gebieden van dikker ijs (donkerdere rastervierkanten) en dunner ijs (lichtere rastervierkanten). De inzet toont het gebied in het vak, met pijlen die de nummering op het zoekerraster aangeven, dat zichtbaar is bij 30 kV. Schaalbalk, 0,5 mm. (C) Een middelgroot vergrotingsoverzicht van twee rastervierkanten die de verdeling van de cellen op de koolstoffilm en de locatie van de rasterbalken beoordelen. Schaalbalk, 50 μm. (D) De opstelling van freespatronen voor de eerste snede bij hoge vergroting (ionenbundelweergave bij 1,5 pA en 30 kV). Het rode gebied (3 μm dik) wordt beschermd, terwijl de gele gebieden worden geblurd door de ionenbundel. De witgestreepte lijn geeft de positie van de laatste lamellen aan. Schaalbalk, 10 μm. (E) Een weergave met hoge vergroting bij 3 kV via de SEM van een gepolijste lamellen van 200 nm dik (10 μm breed x 15 μm lang). Het verlies van contrast binnen de lamellen bij 3 kV geeft aan dat een geschikte dikte is bereikt. De helderwitte voorrand is de resterende organoplatinumlaag die voorafgaand aan het frezen via het GIS op het rooster wordt aangebracht. Schaalbalk, 5 μm. (F) Dezelfde lamellen van (E) bekeken met behulp van de ionenbundel bij 30 kV en 1,5 pA. De dunne witte lijn over het zwarte vierkant (witte pijl) is de resterende organoplatinum vacht aan de voorrand van de lamellen. Schaalbalk, 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een te frezen gebied wordt geselecteerd door een paar rechthoekige patronen aan weerszijden van een beschermd gebied met een hoge vergroting (~ 7.000x voor schizonts) in de ionenbundelweergave te leggen (figuur 4D). Het is van cruciaal belang dat er geen deeltjes van oppervlakteverontreiniging in de buurt van het maalgebied worden bevestigd, omdat deze de toepassing van de beschermende organoplatinumlaag kunnen hebben verduisterd. Het is ook belangrijk dat de topografie van het gebied geschikt is om de zijkanten van de lamellen te ondersteunen zodra de uiteindelijke dikte is bereikt.

Voor malaria schizonts (celgrootte: ~5 μm diameter x 2 μm dik, schijfvorm) kunnen lamellen tussen 7-20 μm breed worden gefreesd. Als de cellaag voldoende dik is, zullen de lamellen meestal ~ 10-15 μm lang worden en meerdere cellen boven en onder de koolstoflaag vangen (figuur 4E-F). Er kan worden verwacht dat het 5-10 lamellen frezen in een sessie van 8 uur (6-7 uur frezen en 1-2 uur polijsten). Dit zal variëren afhankelijk van de dikte van het monster en de breedte van de lamellen, waarbij dikkere monsters en bredere lamellen er langer over doen om te frezen. Zelfs beschadigde roosters kunnen worden gefreesd omdat er slechts een handvol goede rastervierkanten nodig zijn om een set lamellen te genereren (figuur 5A). Bovendien, als het monster dunner is dan verwacht, bijvoorbeeld als gevolg van over-blotting of variatie in de hematocriet van de cultuur, kunnen kortere lamellen relatief snel worden gemalen; hun kortere lengte zal echter het gebied beperken dat beschikbaar is voor gegevensverzameling in de TEM (figuur 5B).

Figure 5
Figuur 5: Bepalen wanneer de uiteindelijke lamellendikte is bereikt tijdens het frezen. (A) Overzicht van lage vergroting van een rooster door SEM bij 5 kV met koolstofschade tijdens het knippen. De onbeschadigde gebieden bevatten zeer dun monster als gevolg van over-blotting; het was echter nog steeds mogelijk om zes lamellen op dit rooster (het gebied binnen de witgestreepte omtrek) te frezen in een volledige dagsessie op de cryoFIBSEM. Schaalbalk, 0,5 mm. (B) Een korte lamellen (~10 μm breed x 3 μm lang, exclusief organoplatinumlaag) geproduceerd uit dit rooster (SEM bij 3 kV), dat nog steeds twee gebieden bood om tilt-series te verzamelen. Schaalbalk, 25 μm. (C) Een reeks SEM-beelden (3 kV) van een lamellen tijdens de laatste polijststap die laten zien hoe het contrast verloren gaat in de lamellen als deze wordt verdund (van links naar rechts bewegen). De donkere zwarte lijn over het midden van de lamellen in alle afbeeldingen is een strook koolstoffilm van het raster. Cellen voor dit gebied werden verglaasd boven de koolstoffilm en cellen achter dit gebied werden verglaasd onder de koolstoffilm. Het frezen werd gestopt toen de organoplatinumlaag aan de linkerkant van de voorrand van de lamellen bijna de structurele integriteit verloor. Dit stoppunt was voordat de hele lamellen op een gelijkmatige dikte werden gebracht, daarom zit er nog wat contrastrijker materiaal in de achterkant van de lamellen. D) Een voorbeeld van een polijstroute op basis van de lamellen die op het onder A) afgebeelde rooster zijn gefreesd. Een polijstroute moet beginnen bij lamellen dichter bij de FIB-bron, weg van de FIB-bron om herplaatsing van gefreesd materiaal op het oppervlak van de lamellen te beperken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tijdens het polijsten hangt de uiteindelijke dikte van een lamellen af van de structuur van het monster in het gebied dat wordt gefreesd, de integriteit van de organoplatinum-laag en de beschikbare tijd. Idealiter moet het monster worden verdund totdat het contrast over het hele oppervlak van de lamellen verloren gaat door SEM bij 3 kV, wat suggereert dat het gelijkmatig elektronentransparant is en ongeveer 150-200 nm dik (figuur 5C). Het kan echter nodig zijn om vóór dit punt te stoppen met frezen als de organoplatinumlaag een gat ontwikkelt of de lamellen begint te buigen. In dit geval kunnen de lamellen aan de voorkant nog dun genoeg zijn en nuttig blijven voor tomografie. Omgekeerd is het mogelijk om voorbij het verlies van contrastfase te dunnen als de lamellen er stabiel uitzien, waardoor deze nog dunner wordt door de freespatronen dichter bij elkaar te plaatsen (~ 100 nm of minder). Dit is afhankelijk van de dikte indien nodig voor de downstream-workflow. Een SEM-beeld met lage vergroting is vereist om een polijstroute te plannen, dichter bij de ionenbundelbron te beginnen en weg te werken (figuur 5D). De richting van de polijstroute is belangrijk om te voorkomen dat het geableerde materiaal opnieuw wordt geplaatst op lamellen die al zijn afgewerkt.

Verzamelen en verwerken van tilt-serie data
Eenmaal geladen in de TEM, zal een volledige rastermontage met lage vergroting (~ 150x) de posities van de lamellen identificeren, die kunnen worden gecorreleerd aan de SEM-afbeelding met lage vergroting die aan het einde van het frezen is gemaakt. Voor diepgevroren schizonten is het grootste deel van het raster niet transparant voor elektronen, dus de lamellenposities verschijnen als witte inkepingen op een zwarte achtergrond (figuur 6A). De hoek van de lamellen ten opzichte van de kantelas van de microscoop moet worden opgemerkt, omdat meer dan ~ 10 ° verwijderd van de loodlijn de verwerving van kantelseries moeilijk zou kunnen maken. Een mediumvergrotingsmontage (~ 1.500x) ter plaatse van elke lamellen geeft een overzicht van de biologische inhoud en controleert op overdrachtsschade, kristallijn ijs of overmatige oppervlakteverontreiniging (figuur 6B-D). Dit moet ook worden gecontroleerd bij hoge kanteling om ervoor te zorgen dat geen oppervlakteverontreiniging het verwervings- of focusgebied verduistert. Het kiezen van een acquisitiegebied hangt niet alleen af van de biologische kenmerken, maar ook van de structurele integriteit van het ijs in de omliggende regio, bijvoorbeeld het vermijden van scheuren, omdat deze regio's zullen afdrijven, of gebieden met overmatige gordijnvorming, waar een lamellen een variabele dikte zullen hebben. Voordat een tilt-serie wordt aangeschaft, wordt een ±10° pre-tilt op het rooster aangebracht om het vlak van de lamellen (niet het raster) loodrecht op de optische as te maken. De richting van de voorkanteling kan worden bepaald door de positie van de voorrand van de lamellen (op zoek naar de overgebleven organoplatinum-laag) in de mediumvergrotingsmontage. Voor de hier gebruikte TEM (300 kV Titan Krios), als de voorranden van de lamellen omhoog wezen in de kaart, vereiste dit een +10° pre-tilt en als ze naar beneden wezen, vereiste dit een -10° pre-tilt. Elk raster kan anders zijn vanwege de oriëntatie waarin ze in het pincet zijn opgepakt en in de autoloader zijn geplaatst (uitsparingsgedeelte naar links of rechts gericht, produceert een rotatie van 180 °). Een laatste overweging is de pixelgrootte. Routinematig worden tilt-series verzameld rond 2,5-7 Å / pixel, rekening houdend met de grootte van het interessekenmerk, de doelresolutie van de resulterende tomografische gegevens en het oppervlak van de lamellen, wat de grootte van het acquisitiegebied kan beperken. Het is mogelijk om een kleinere pixelgrootte te gebruiken om informatie met een hoge resolutie te verkrijgen en de kleinste die we met succes op deze voorbeelden hebben gebruikt, is 1,4 Å / pixel (gegevens worden niet weergegeven). Drift zal duidelijker zijn bij een kleinere pixelgrootte en is alleen echt geschikt voor dunne (<100 nm) lamellen waar het maximaliseren van de resolutie van belang is in het onderzoek.

Figure 6
Figuur 6: Toegankelijke gebieden van belang kiezen waaruit de tilt-serie kan worden verkregen (A) Een gedeelte van een TEM-kaart met lage vergroting met een gebied dat lamellen bevat, weergegeven als zes witte inkepingen op een zwarte achtergrond (rode pijlen). De witte vierkanten zijn gebroken koolstoffilm. (B) Een middelgrote kaart van een beschadigde en afwijkende lamellen. Aan de voorrand van de lamellen (FE) is de organoplatinum vacht afgeknapt (1). Er is een duidelijk stukje kristallijn ijs in het midden van de lamellen (2). De ionenbundel is aan de achterrand van de lamellen (BE) niet doorgebroken omdat het ijs te dik is naast de roosterbalken. Slechts een klein deel van de lamellen is vrij van het omringende ijs bij de BE (3), waardoor een wig ontstaat. De dikte heeft er ook voor gezorgd dat planken boven de lamellen (4) zijn gesneden, wat hoogstwaarschijnlijk het zicht op de cellen bij hoge kanteling in de TEM zal blokkeren. (C) Mediumvergrotingsmontage van een hele lamellen bekeken in de TEM. Typische problemen of gebieden die moeten worden vermeden bij het verzamelen van kantelseries van lamellen zijn gebieden: bedekt met oppervlakteverontreiniging (SC), bedekt met de organoplatinumlaag (OP, geel), in de buurt van scheuren (CR en zwarte pijlen), met gordijnen als gevolg van dichtheidsveranderingen in biologisch materiaal (CU en gebied binnen blauwe haakjes), en gebieden verzwakt door breuken in de organoplatinumlaag (groene cirkel). De enige gebieden die toegankelijk zijn voor tilt-series acquisitie zijn de gebieden binnen de twee zwart-onderbroken dozen (gelabeld 1 en 2). Het zicht moet bij hoge kanteling worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat oppervlakteverontreiniging het interessegebied of het focusgebied niet verduistert. (D) Een mediumvergrotingsmontage van een veel schonere lamellen, maar die nog steeds scheuren (CR) vertoont die worden veroorzaakt door het dunner worden van de organoplatinumlaag (groene cirkel) tijdens het polijsten. Hier wordt het interessegebied gemarkeerd door het celtype dat in de lamellen wordt waargenomen, in dit geval de individuele merozoïeten, gepositioneerd achter de koolstoflaag (oranje) naar de achterkant van de lamellen (zwart gestreepte doos). Schaalbalken, 3 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Verkrijgen van cryo-ET-gegevens van FIB-gefreesde lamellen. (A) Een microfoto van een gebied van een lamellen met een rode bloedcel die onlangs is binnengedrongen door een P. falciparum merozoiet. In (B) is dezelfde afbeelding geannoteerd om de grens van de rode bloedcel (rood), een aantal dubbelwandige intracellulaire blaasjes (paars en blauw voor respectievelijk de binnenste en buitenste membranen) en het merozoiet (groen) te tonen, omringd door een tweede membraan afgeleid van de gastheercel (geel). Een zwarte doos toont het gebied waar een tilt-serie is verkregen. Schaalbalk, 500 nm. (C) Gemiddeld 20 centrale plakjes bekeken in het XY-vlak van een 8x binned tomogram (2,4 Å/pixel) verkregen aan het apicale uiteinde van het merozoiet en in (D) de annotatie, met de twee membranen rond de cel (groen en geel) en vier membranen gestapeld in de top van het merozoiet (blauw) die geassocieerd zijn met een elektronendicht paddestoelvormig kenmerk (paars). Een rode pijl geeft de kruising aan van de membraanstapels in de apex en het paddestoelvormige kenmerk (ook weergegeven in deel F, i). Een zwarte pijl duidt op een fusiegebeurtenis tussen het merozoietplasmamembraan en een van de meerlagige blaasjes in de parasiet (ook weergegeven in deel F, ii). Het rode bloedcelmembraan van de gastheer wordt weergegeven (rood) en een zwart onderbroken lijn toont de positie van een doorsnede bekeken in het XZ-vlak, weergegeven in (E). De kenmerken in de doorsnede (E) zijn gekleurd en gelabeld als in deel (D), met gekleurde pijlen die naar de membranen wijzen. Een zwarte pijl geeft de positie aan van een sputterlaag die na het frezen op de lamellen is aangebracht en de dikte van de lamellen is aangegeven. Voor onderdelen (C-E), schaalbalk, 500 nm. (F) Een meer gedetailleerd overzicht van de kenmerken die worden aangegeven door de rode en zwarte pijlpunten in deel (C), met de definitie in de lipide bi-lagen van de membraanstapel in de top van het merozoiet (i) en de fusiegebeurtenis tussen het meerlagige blaasje met het merozoietplasmamembraan. Schaalbalk, 75 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De primaire focus van het werk is om het pad van merozoietuitgang in P. falciparum Maar aangezien de populatie van cellen die in de studie worden gebruikt nooit volledig homogeen kan zijn, werden vaak andere stadia van celontwikkeling binnen de lamellen waargenomen. Het hier getoonde voorbeeld (Figuur 7) bevat een rode bloedcel die onlangs is binnengedrongen door een P. falciparum parasiet (merozoiet). De gebruikte lamellen waren 240 nm dik en het rooster was licht gesputterd met platina in een argonatmosfeer voordat het in de TEM werd ingebracht, wat resulteerde in iets minder contrast dan normaal zou worden verwacht. Het membraan van de rode bloedcellen kon in zijn geheel rond de cel worden getraceerd. In de rode bloedcel bevonden zich drie ingesloten membraangebonden structuren, twee blaasjes, elk omgeven door een dubbel membraan en een gloeilampvormig kenmerk (1,2 μm x 0,9 μm op de breedste delen), wat overeenkomt met het feit dat het een merozoiet is (Figuur 7A-B). De inhoud van de twee blaasjes leek vergelijkbaar te zijn in tegenstelling tot die van de inhoud van de rode bloedcel, wat suggereert dat deze blaasjes hemoglobine kunnen bevatten. De aanwezigheid van blaasjes in de rode bloedcel van de gastheer na invasie is eerder waargenomen45. Men denkt dat ze voortkomen uit de afscheiding van lipiden en andere virulentiefactoren van secretoire organellen genaamd rhoptries in de merozoiet, die tijdens de invasie in de rode cel van de gastheer ontladen. Het merozoiet is omgeven door twee nauw verwante membranen, waarvan de binnenste vermoedelijk het inheemse plasmamembraan van het merozoiet is, waarop zich geen zichtbare oppervlaktelaag bevindt, en de buitenste moet afkomstig zijn van het rode celmembraan van de gastheer dat het merozoiet omhult terwijl het binnendringt. Het cytoplasma van het merozoliet bevat veel meerlagige blaasjes en een elektronendicht paddestoelvormig kenmerk naast een stapel membranen aan de top. Een over dit gebied verkregen kantelreeks (2,4 Å/pixel) laat zien dat het een stapeling van vier membranen bevat, die verbonden lijken te zijn met het paddestoelvormige kenmerk (Figuur 7C-E). Opvallend is dat deze morfologie heel anders is dan de normale rangschikking van organellen en cellulaire structuren in het apicale uiteinde van een volwassen merozoiet. Om dit te beoordelen, werd een vergelijkende kantelreeks (2,74 Å/pixel) over het apicale uiteinde op een volwassen merozoiet verkregen uit een schizont die met E64 was behandeld voordat het werd ingevroren en gemalen (Figuur 8). Dit toont aan dat het apicale uiteinde van een merozoiet twee prominente knotsvormige secretoire organellen bevat, rhoptries genaamd, genesteld in een set van drie polaire ringen aan de apicale punt van de cel en omringd door een aantal kleinere secretoire organellen die micronemen worden genoemd. De binnenste polaire ring is bevestigd aan een dubbele membraanstructuur die ten grondslag ligt aan het merozoietplasmamembraan, het binnenmembraancomplex genoemd, dat motoreiwitten bevat die invasie aandrijven. Het is aangetoond dat tijdens invasie de inhoud van de secretoire organellen wordt geloosd op het merozoietoppervlak en in de rode bloedcel van de gastheer, waardoor de hechting van merozoites aan rode bloedcellen van de gastheer wordt vergemakkelijkt en het motorische complex wordt geïnitieerd dat de invasie aandrijft45. De gegevens hier tonen aan dat na invasie het merozoiet geen waarneembare structuren bevat die lijken op roptries, micronemen of polaire ringen, wat suggereert dat de morfologie van het apicale uiteinde van de merozoiet dramatisch verandert. Fusie van rhoptries voorafgaand aan invasie is eerder aangetoond door TEM van vaste secties op kamertemperatuur46, wat consistent is met de productie van het paddestoelvormige kenmerk dat we waarnemen in onze post-invasietoestand merozoiet. De stapels membranen die met deze functie zijn verbonden, zijn niet eerder waargenomen en aangezien er geen aanwijzingen zijn voor een IMC die aanwezig is in het nieuw binnengedrongen merozoiet, veronderstellen we dat de membraanstapels de overblijfselen kunnen zijn van de IMC-machinerie die overblijft nadat de invasie is voltooid, maar dit moet nog worden bevestigd.

Figure 8
Figuur 8: Het apicale uiteinde van volwassen merozoites door cryo-ET van een FIB-gefreesde lamellen en TEM van kunststof secties. (A) Gemiddeld 20 centrale plakjes van een 8x binned tomogram (2,74 Å/pixel) van een 230 nm dikke lamellen die de typische morfologie van het apicale uiteinde van een volwassen merozoiet laten zien. De schizonten werden behandeld met E64 voordat ze werden ondergedompeld, dus het PV-membraan is gescheurd en de merozoïeten bevinden zich in de rode bloedcel van de gastheer. (B) toont hetzelfde als in (A), maar met annotaties om het rode bloedcelmembraan van de gastheer (RCM, rood), het membraan van merozietplasma (groen), het binnenmembraancomplex (IMC, paars), polaire ringen (PR, zwart), micronemen (M, geel), rhoptries (R, grijs) en de nucleaire envelop (NE, blauw) aan te geven. Een naburige merozoiet, die buiten het vlak is in dit gebied van tomogram, wordt aangegeven door een groene driehoek. Schaalbalk, 200 nm. (C) De cellulaire kenmerken waargenomen door cryoET zijn consistent met die van TEM van schizonten bewaard in plastic secties. Vergelijkbare cellulaire kenmerken worden aangegeven in een volwassen merozoiet van een schizont dat is behandeld met verbinding 2, waarbij de uitgang vóór de PV-membraanbreuk vastloopt. Schaalbalk, 500 nm. (D) Een geannoteerd schema van een merozoiet met de cellulaire kenmerken in delen (A-C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Dikte van het beschermde gebied tussen de rechthoekige freespatronen (μm) Nominale ionenbundelstroom (pA) bij 30 kV
3 300
1.5 100
0.75 50
0.3 30
0,2 - 0,06 (laatste polijsten) 30*

Tabel 1: Freesstrategie voor de productie van dunne lamellen. Stapsgewijs frezen wordt uitgevoerd door de ionenbundelstroom te verminderen die overeenkomt met de dikte van het beschermde gebied. Dit beperkt de verhitting van het monster, waardoor afwijkingen worden voorkomen. * Polijsten moet parallel worden uitgevoerd om de lamellen van beide kanten gelijkmatig te verwarmen, waardoor het risico dat ze buigen of buigen als ze hun uiteindelijke dikte bereiken, wordt verminderd. Andere stappen kunnen sequentieel worden uitgevoerd, waarbij het patroon boven de lamellen en vervolgens onder de lamellen wordt gefreesd, voordat u naar de volgende straalstroom gaat. Het meten van het rooster om freesposities te lokaliseren moet worden uitgevoerd met een straalstroom van 1,5 pA om de opwarming van het monster te minimaliseren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Terwijl cryoFIB-frezen steeds routineuzer wordt, is de voorbereiding van optimale monsters voor het frezen dat niet; daarom vinden de meeste kritieke stappen in dit protocol plaats voordat het monster de cryoFIB-SEM bereikt. Monsteroptimalisatie door meerdere rondes celvoorbereiding, dompelbevriezing en screening door licht- en elektronenmicroscopie zijn vereist om het best mogelijke monster te produceren voordat het frezen wordt geprobeerd. Het hebben van de best mogelijke steekproef verhoogt niet alleen de kans op succes, maar optimaliseert ook het gebruik van de apparatuur. Om deze reden vereisen de meeste nationale faciliteiten bewijs dat er voldoende optimalisatie is uitgevoerd voordat tijd op hun machines wordt toegekend. Eenmaal in de cryoFIB-SEM is het maximaliseren van de effectiviteit van de organoplatinum-laag van cruciaal belang om uniform dunne lamellen te produceren. Ten slotte is geduld en een goede monsterbehandeling een vereiste vaardigheid van de gebruiker, die meerdere dagen moet zitten om roosters met delicate lamellen te produceren en vervolgens over te brengen. Dit kan veranderen met de introductie van geautomatiseerde freesstrategieën47,48, maar vooralsnog is het hele freesproces bij de meeste faciliteiten nog grotendeels handmatig.

Hoewel het werk zich uitsluitend richtte op P. falciparum schizonts, kon de hier gepresenteerde methode gemakkelijk worden aangepast om de rastervoorbereiding en het frezen voor andere celtypen te optimaliseren. Belangrijke factoren om te overwegen zijn de dichtheid van de cellen die op het rooster worden toegepast, het rastertype (koper is giftig voor sommige cellen), de grootte en afstand van gaten in de koolstoffilm, de blottingtijd en de methode van blotting (enkel/ dubbelzijdig, handmatig of geautomatiseerd). Bovendien, als de cellen worden gekweekt op de roosters (meestal gouden roosters met een gatachtige koolstoffilm), kan de samenvloeiing worden gecontroleerd door lichtmicroscopie voordat ze worden gevlekt en bevroren. De freesstrategie hangt af van hoe de cellen op het rooster worden afgezet. Voor met malaria geïnfecteerde rode bloedcellen is het rooster in wezen bedekt met een ononderbroken laag cellen, dikker in sommige gebieden en dunner in andere gebieden. Het frezen wordt uitgevoerd op meerdere punten op één gebied langs deze gradiënt waar de ijsdikte lamellen genereert die een geschikte grootte hebben voor tomografie. Deze aanpak werkt goed voor kleinere cellen, omdat je lamellen kunt produceren die een plak door meerdere cellen bevatten. Voor grotere cellen of klonten cellen kan het zijn dat één cel of celklomp één lamellen kan produceren.

Rasterverwerking en monsteroverdracht blijven een van de belangrijkste uitdagingen van deze workflow. Lamellen kunnen verloren gaan als gevolg van breuken of scheuren, gordijnartefacten die de biologie verduisteren, overmatige oppervlakteverontreiniging, evenals rasteroriëntatieproblemen binnen de TEM, waardoor een extra handlingstap nodig is om het raster te herpositioneren. De mate van verliezen varieert van dag tot dag en van net-tot-net, maar het wordt verbeterd door oefening en hanteringservaring in de loop van de tijd. In deze studie bleek dat de roosters meerdere keren zorgvuldig kunnen worden geheroriënteerd in de autoloader zonder lamellen te vernietigen en dit heeft soms het voordeel van het afwassen van oppervlakte-ijs. Een andere belangrijke beperking van deze workflow is de tijd die nodig is om lamellen te produceren. Omdat de productie traag is, is het van cruciaal belang om een goed geoptimaliseerd monster te hebben, waardoor het frezen zo efficiënt mogelijk is.

Onlangs zijn een aantal aanpassingen aan het FIB-malen van glasvochtmonsters ingevoerd. Een game-changer is de implementatie van cryogeen gekoelde lift-out tools in de cryoFIB-SEM-kamer waarmee grotere blokken materiaal kunnen worden gefreesd uit hogedrukbevroren monsters. De blokken kunnen aan een metalen staaf worden bevestigd of in een grijper worden opgepakt en naar een tweede monsterpositie worden verplaatst, met een speciaal aangepast EM-rooster. De blokken kunnen vervolgens worden gecoat met organoplatinum en gemalen om lamellen te genereren. De mogelijkheid om lamellen te frezen uit hogedruk bevroren materiaal betekent dat veel grotere cellen en weefsels kunnen worden verwerkt, specifiek gericht op gebieden door correlatieve fluorescentiemicroscopie12. Andere recente aanpassingen aan de FIB-freesmethode omvatten het verminderen van gordijnartefacten door het voorfrezen van het monster16, microfluïdische cryofixatie49 en foto-micropatterning van elektronenmicroscopieroosters om de celdistributiete verbeteren 50. Ook is aangetoond dat het frezen van micro-expansieopeningen aan weerszijden van een lamellen de compressie door het omringende monster kan verlichten als het zijn uiteindelijke dunheid bereikt51. Dit kan met name nuttig zijn bij het frezen van continue cellagen, zoals het monster in dit onderzoek, waar soms buiging van lamellen wordt gezien tijdens de laatste polijststap.

De toekomst van elektronenmicroscopie zal waarschijnlijk de bepaling van in situ moleculaire structuren zijn door sub-tomogram middeling en FIB-frezen is een belangrijk hulpmiddel dat de productie van glasvocht biologische monsters voor dit soort workflows zal vergemakkelijken. Terwijl FIB-frezen nog in de kinderschoenen staat voor biologische toepassingen, vindt de ontwikkeling van methoden in een snel tempo plaats dankzij het harde werk van onderzoekers, zowel academische als nationale faciliteiten, plus commerciële investeringen in de ontwikkeling van cryoFIB-SEM-technologie om onderzoek te ondersteunen.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd geheel of gedeeltelijk gefinancierd door de Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Met het oog op open toegang heeft de auteur een CC BY publieke auteursrechtlicentie toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortvloeit uit deze inzending.

Dit project waarvoor deze methode werd ontwikkeld, werd gefinancierd door een Medical Research Council-subsidie MR / P010288 / 1 toegekend aan Helen R. Saibil, Roland A. Fleck en Michael J. Blackman. Culturen van P. falciparum werden gekweekt in het Francis Crick Institute, met de steun van leden van de groep van Michael J. Blackman. De auteurs willen Dr. Ser Ying (Michele) Tan bedanken voor het verstrekken van de afbeeldingen van met verbinding 2 en E64 behandelde schizonten in dunne bloeduitstrijkjes. De meeste lamellen werden geproduceerd met ondersteuning van het personeel van eBIC en we zijn dankbaar voor de toegang tot de Scios dual-beam cryoFIB-SEM op onderzoeksvoorstel NT21004. De auteurs erkennen ook de steun van het Royal Society Industry Fellowship-programma (INF \ R2 \ 202061) bij het voortzetten van de ontwikkeling van de FIB-freestechniek binnen de CUI. De auteurs willen ook Helen R. Saibil bedanken voor de nuttige discussies met betrekking tot dit methodedocument en het begeleiden van het project.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
c-clips Thermo Fisher Scientific 1036171
Clipping station Thermo Fisher Scientific n/a Direct quote from Thermo
Clipping station Sub-angstrom CSA-01
Compound 2 n/a n/a Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc
Cryo-FIB specific autogrid rims Thermo Fisher Scientific 1205101
E64 Sigma E3132
Emitech K100X glow discharge unit Quorum n/a
Gibco RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 12633012 Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements
Giemsa Stain VWR International 350864X
Glass slides Thermo Fisher Scientific 11562203
Grid boxes Sub-angstrom PB For clipped grids
Grid boxes Thermo Fisher Scientific n/a For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific
Grid boxes Agar Scientific AGG3727
Home-made manual plunge freezing rig n/a n/a With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.
Human blood n/a n/a UK National Blood and Transplant service
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system JEOL n/a FIB-SEM
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage Leica n/a sputter coater
Leica EM ACE900 Leica n/a e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.
Linkam cryo-stage for light microscope Linkam Model No. CMS196 Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.
Methanol Sigma 179957
Nikon Eclipse E200 light microscope Nikon n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.
Percoll VWR International 17-0891-01 Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids Quantifoil N1-C17nCuH2-01 100 pack
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids Quantifoil N1-C17nCu20-01 100 pack
Quorum PP3010 prep-chamber Quorum n/a sputter coater
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage. FEI n/a FIB-SEM
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen Viking Direct ND538522
TFS Titan Krios 300 kV TEM Thermo Fisher Scientific n/a TEM equipped with a K2 or K3 camera.
Whatmann grade 1 filter paper Sigma WHA1001150
Zeiss Axio Scope A1 light microscope Zeiss n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumeister, W. From proteomic inventory to architecture. FEBS Letters. 579 (4), 933-937 (2005).
  2. Rigort, A., Villa, E., Bäuerlein, F. J. B., Engel, B. D., Plitzko, J. M. Integrative approaches for cellular cryo-electron tomography: Correlative imaging and focused ion beam micromachining. Methods in Cell Biology. 111, 259-281 (2012).
  3. Oikonomou, C. M., Chang, Y. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14, 205-220 (2016).
  4. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  5. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
  6. Narayan, K., Subramaniam, S. Focused ion beams in biology. Nature Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).
  7. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  8. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  9. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: Focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (5), 771-777 (2013).
  10. Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180 (2), 318-326 (2015).
  11. de Winter, D. A. M., et al. In-situ integrity control of frozen-hydrated, vitreous lamellas prepared by the cryo-focused ion beam-scanning electron microscope. Journal of Structural Biology. 183 (1), 11-18 (2013).
  12. Schaffer, M., et al. A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue. Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).
  13. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  14. Albert, S., et al. Proteasomes tether to two distinct sites at the nuclear pore complex. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 114 (52), 13726-13731 (2017).
  15. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705 (2018).
  16. Schaffer, M., et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).
  17. Szwedziak, P., Wang, Q., Bharat, T. A. M., Tsim, M., Löwe, J. Architecture of the ring formed by the tubulin homologue FtsZ in bacterial cell division. eLife. 3, 04601 (2014).
  18. Carlson, L. A., et al. Cryo electron tomography of native HIV-1 budding sites. PLOS Pathogens. 6 (11), 1001173 (2010).
  19. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nature Communications. 11 (1), 5885 (2020).
  20. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  21. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  22. Murphy, G. E., et al. Correlative 3D imaging of whole mammalian cells with light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 176 (3), 268-278 (2012).
  23. Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2012).
  24. Spehner, D., et al. Cryo-FIB-SEM as a promising tool for localizing proteins in 3D. Journal of Structural Biology. 211 (1), 107528 (2020).
  25. Kamino, T., Yaguchi, T., Ohnishi, T., Ishitani, T., Osumi, M. Application of a FIB-STEM system for 3D observation of a resin-embedded yeast cell. Journal of Electron Microscopy. 53 (5), Tokyo. 563-566 (2004).
  26. Han, H., Zuber, B., Dubochet, J. Compression and crevasses in vitreous sections under different cutting conditions. Journal of Microscopy. 230, Pt 2 167-171 (2008).
  27. Matias, V. R. F., Al-amoudi, A., Dubochet, J., Beveridge, T. J. Cryo-transmission electron microscopy of frozen-hydrated sections of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (20), 6112-6118 (2003).
  28. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150 (1), 109-121 (2005).
  29. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. The EMBO Journal. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  30. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: A new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1-2), 43-51 (2006).
  31. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 172 (2), 180-190 (2010).
  32. Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. -J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryoelectron microscopy of vitrified specimens. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer. Berlin Heidelberg. 114-131 (1987).
  33. Hsieh, C., Schmelzer, T., Kishchenko, G., Wagenknecht, T., Marko, M. Practical workflow for cryo focused-ion-beam milling of tissues and cells for cryo-TEM tomography. Journal of Structural Biology. 185 (1), 32-41 (2014).
  34. Harapin, J., et al. Structural analysis of multicellular organisms with cryo-electron tomography. Nature Methods. 12 (7), 634-636 (2015).
  35. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 180 (3), 572-576 (2012).
  36. Duyvesteyn, H. M. E., et al. Machining protein microcrystals for structure determination by electron diffraction. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 115 (38), 9569-9573 (2018).
  37. Blackman, M. J. Purification of Plasmodium falciparum merozoites for analysis of the processing of merozoite surface protein-1. Microbes as Tools for Cell Biology. 45, Academic Press. London, UK. 213-220 (1995).
  38. Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2 - anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  41. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  42. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  43. Turoňová, B., Schur, F. K. M., Wan, W., Briggs, J. A. G. Efficient 3D-CTF correction for cryo-electron tomography using NovaCTF improves subtomogram averaging resolution to 3.4 Å. Journal of Structural Biology. 199 (3), 187-195 (2017).
  44. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3d correlative microscopy. Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).
  45. Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host & Microbe. 9 (1), 9-20 (2011).
  46. Hanssen, E., et al. Electron tomography of Plasmodium falciparum merozoites reveals core cellular events that underpin erythrocyte invasion. Cellular Microbiology. 15 (9), 1457-1472 (2013).
  47. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  48. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife. 9, 52286 (2020).
  49. Fuest, M., et al. In situ microfluidic cryofixation for cryo focused ion beam milling and cryo electron tomography. Scientific Reports. 9 (1), 19133 (2019).
  50. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  51. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208 (3), 107389 (2019).

Tags

Retractie FIB-frezen cryoFIB-SEM lamellen tomografie cryoET cryoEM Plasmodium falciparum

Erratum

Formal Correction: Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography
Posted by JoVE Editors on 09/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. The Authors section was updated from:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

to:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
M. Alejandra Carbajal1
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bisson, C., Hecksel, C. W.,… More

Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Carbajal, M. A., Fleck, R. A. Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (174), e62350, doi:10.3791/62350 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter