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Biochemistry

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए दोहरी-बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विट्रियस जैविक नमूनों से लैमेला तैयार करना

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/62350
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3, 1, 1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London, 2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London, 3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

ERRATUM NOTICE

Summary

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए जमे हुए जैविक नमूनों से विट्रस ऑन-ग्रिड लैमेला का उत्पादन करने के लिए केंद्रित आयन बीम मिलिंग का उपयोग करना।

Abstract

यहां प्रस्तुत प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम-संक्रमित मानव एरिथ्रोसाइट्स के डुबकी-जमे हुए ग्रिड से क्रायो-लैमेला तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल है, जिसे आसानी से अन्य जैविक नमूनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। नमूने तैयार करने, मिलिंग और लैमेला देखने के लिए बुनियादी सिद्धांत सभी उपकरणों के लिए आम हैं और प्रोटोकॉल का पालन क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) और क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायोईटी) के लिए ऑन-ग्रिड क्रायो-लैमेला तैयारी के लिए एक सामान्य गाइड के रूप में किया जा सकता है। कोशिकाओं का समर्थन करने वाले इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड को मैनुअल या स्वचालित प्लांक फ्रीजर का उपयोग करके तरल नाइट्रोजन-कूल्ड तरल ईथेन में डुबकी हुई होती है, फिर क्रायो-स्टेज से लैस प्रकाश माइक्रोस्कोप पर जांच की जाती है। जमे हुए ग्रिड को एक केंद्रित आयन बीम (क्रायोएफआईबी-एसईएम) से लैस क्रायो-स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित किया जाता है। मिलिंग से पहले ग्रिड को नियमित रूप से स्पटर लेपित किया जाता है, जो मिलिंग के दौरान चार्ज बिल्ड-अप के फैलाव में सहायता करता है। वैकल्पिक रूप से, एक ई-बीम रोटरी कोटर का उपयोग ग्रिड में कार्बन-प्लैटिनम की एक परत को लागू करने के लिए किया जा सकता है, जिसकी सटीक मोटाई को अधिक सटीक रूप से नियंत्रित किया जा सकता है। एक बार क्रायोएफआईबी-एसईएम के अंदर एक गैस इंजेक्शन सिस्टम (जीआईएस) के माध्यम से ग्रिड की सतह पर एक ऑर्गनोप्लाटिनम यौगिक की एक अतिरिक्त कोटिंग लागू की जाती है। यह परत लैमेला के सामने के किनारे की रक्षा करती है क्योंकि यह मिल जाती है, जिसकी अखंडता समान रूप से पतली लैमेला प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। एसईएम के माध्यम से रुचि के क्षेत्रों की पहचान की जाती है और मिलिंग को चरण-वार तरीके से किया जाता है, जिससे आयन बीम की धारा कम हो जाती है क्योंकि लैमेला इलेक्ट्रॉन पारदर्शिता तक पहुंचता है, ताकि अत्यधिक गर्मी उत्पादन से बचा जा सके। कई लैमेला वाले ग्रिड को फिर झुकाव-श्रृंखला अधिग्रहण के लिए क्रायोजेनिक स्थितियों के तहत ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) में स्थानांतरित किया जाता है। लैमेला तैयारी के लिए एक मजबूत और संदूषण-मुक्त वर्कफ़्लो डाउनस्ट्रीम तकनीकों के लिए एक आवश्यक कदम है, जिसमें सेलुलर क्रायोईएम, क्रायोएट और सब-टोमोग्राम औसत शामिल हैं। इन तकनीकों का विकास, विशेष रूप से लिफ्ट-आउट और उच्च दबाव वाले जमे हुए नमूनों की मिलिंग के लिए, क्षेत्र में उच्च प्राथमिकता है।

Introduction

क्रायोजेनिक तापमान पर ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) द्वारा केवल जैविक नमूनों की सेलुलर सामग्री <500 एनएम मोटी को प्रभावी ढंग से चित्रित किया जा सकता है, जिससे नमूनों की सीमा वायरस, प्रोकैरियोट्स, सरल एकल-सेलुलर जीवों और बड़े यूकेरियोटिककोशिकाओं के पतले क्षेत्रों तक सीमित हो जाती है। ऑन-ग्रिड केंद्रित आयन बीम (एफआईबी) -मिलिंग मोटे डुबकी-जमे हुए जैविक नमूनों को क्रायोजेनिक तापमान (< -150 डिग्री सेल्सियस) पर इलेक्ट्रॉन पारदर्शी लैमेला में पतला करने में सक्षम बनाता है। परिणामी लैमेला को तब विज़ुअलाइज़ेशन और टोमोग्राफिक डेटा संग्रह के लिए एक टीईएम में स्थानांतरित किया जाता है, जिससे कोशिकाओं के अंदर सेलुलर और आणविक विशेषताओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी पुनर्निर्माण को सक्षम किया जाता है (समीक्षा ओं के लिए देखें रिगोर्ट एट अल, 20122, ओइकोनोमो एट अल।

एफआईबी-मिलिंग सामग्री विज्ञान के क्षेत्र से उभरा, जहां नमूनों को डाउनस्ट्रीमविश्लेषण के लिए तैयार करने के लिए नियमित रूप से पतला किया जाता है। यह एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) में किया जाता है, जिसमें दो ऑप्टिकल कॉलम होते हैं: पारंपरिक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ऑप्टिक्स और एक दूसरा कॉलम जिसमें ऑप्टिक्स होता है जो एक केंद्रित आयन बीम (एफआईबी) को उत्पन्न करने और बारीक नियंत्रित करने में सक्षम होता है - जिसे एफआईबी-एसईएम कहा जाता है। यह नमूने के एक विशिष्ट क्षेत्र को गैलियम स्रोत द्वारा उत्पन्न आयनों द्वारा अलग करने की अनुमति देता है, अतिरिक्त सामग्री को हटाता है और लैमेला6 को पीछे छोड़ देता है। मिलिंग प्रक्रिया को नमूने की स्थलाकृति के एसईएम इमेजिंग द्वारा निर्देशित किया जाता है, जिसका उपयोग रुचि के क्षेत्रों का पता लगाने और मिलिंग प्रगति की निगरानी के लिए किया जाता है। जैविक अनुप्रयोगों के लिए, मूल सेटअप काफी हद तक समान है, लेकिन मिलिंग क्रायोजेनिक तापमान पर की जाती है। इसके लिए मानक एफआईबी-एसईएम को क्रायो-कूल्ड चरणों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है जो निरंतर तापमान और कम सतह संदूषण दर बनाए रखते हैं, साथ ही साथ एयरलॉक ्स को डेविट्रीफिकेशन या संदूषण के बिना नमूना हस्तांतरण की सुविधा प्रदान करते हैं। नमूना शटल को क्रायोएफआईबी-एसईएम के अंदर विभिन्न वाहकों की एक श्रृंखला को लगाने की अनुमति देने के लिए भी संशोधित किया गया है, जिसमें टीईएम ग्रिड, प्लानचेट्स और केशिकाएं शामिल हैं। शोधकर्ताओं के कई प्रमुख समूह इन विधियों के विकास औरइस क्षेत्र में निरंतर तकनीकी प्रगति 7,8,9,10,11,12 के लिए केंद्रीय रहे हैं। क्रायोजेनिक तापमान पर जैविक एफआईबी-मिलिंग के लिए वाणिज्यिक समाधान अब अधिक व्यापक रूप से उपलब्ध हैं और लैमेला की ऑन-ग्रिड मिलिंग एक अनुकूलित नमूना दी गई है।

कमरे के तापमान और क्रायोईएम तकनीकों की एक श्रृंखला का उपयोग जीवन के सभी पैमानों पर सेलुलर जानकारी की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है, मामूली संकल्प पर पूरे बहुकोशिकीय जीवों से लेकर सेलुलर स्तर पर जटिल प्रक्रियाओं के संदर्भ को समझने के लिए और इससे भी अधिक विस्तार से, in situ आणविक संरचनाएं;13,14,15,16,17,18,19. शास्त्रीय कमरे के तापमान तकनीकों में टीईएम द्वारा सेलुलर आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए अल्ट्रामाइक्रोटॉमी द्वारा स्थिर और दागदार, राल स्थिर कोशिकाओं और ऊतकों को विभाजित करना शामिल है (समीक्षा के लिए देखें स्टडर एट अल।20). वैकल्पिक तकनीकों को एसईएम द्वारा संरक्षित कोशिकाओं के ब्लॉकों की सतह की छवि बनाने के लिए द्वितीयक इलेक्ट्रॉन प्रकीर्णन का फायदा उठाने के लिए विकसित किया गया है, इससे पहले कि सामग्री को चाकू (सीरियल ब्लॉक फेस इमेजिंग) या केंद्रित आयन बीम के साथ धीरे-धीरे हटाया जाए।21,22,23. इस तकनीक को क्रायोजेनिक तापमान (क्रायो-वॉल्यूम इमेजिंग के रूप में संदर्भित) पर भी सफलतापूर्वक लागू किया गया है, जिसमें कोशिकाओं या ऊतकों के विट्रस, बिना दाग वाले ब्लॉकों पर क्रायोएफआईबी-एसईएम है।24. वैकल्पिक रूप से, मोटी लैमेला (~ 15 μm मोटी) को STEM इमेजिंग द्वारा मिलाया और अध्ययन किया जा सकता है।25. इन तकनीकों का उपयोग करके, जनसंख्या की जानकारी इकट्ठा करने के लिए कई कोशिकाओं वाले पूरे ब्लॉक को चित्रित किया जा सकता है या एक पूरे अंग / जीव को 3 डी में चित्रित और पुनर्निर्माण किया जा सकता है। हालांकि, कोशिकाओं से उच्च-रिज़ॉल्यूशन आणविक जानकारी तक पहुंचने के लिए, नमूनों को निकट-देशी, जमे हुए-हाइड्रेटेड अवस्था में संरक्षित करने की आवश्यकता होती है और इसलिए, क्रायोजेनिक परिस्थितियों में तैयार करने की आवश्यकता होती है। क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ऑफ विट्रियस सेक्शन (सीईएमओवीआईएस) एक ऐसी तकनीक है जिसके तहत जैविक सामग्री के उच्च दबाव वाले जमे हुए ब्लॉकों को एक अल्ट्रामाइक्रोटोम के साथ क्रायोजेनिक स्थितियों के तहत वर्गीकृत किया जाता है। यह क्रायो-सेक्शन (40-100 एनएम मोटी) के रिबन का उत्पादन करता है।26, जो एक ईएम ग्रिड से जुड़े होते हैं और टीईएम में चित्रित होते हैं। हालांकि, विट्रियस नमूने के साथ चाकू की शारीरिक बातचीत क्रेवसिंग और संपीड़न कलाकृतियों का कारण बनती है जो सेलुलर संरचना को गंभीर रूप से विकृत कर सकती हैं।27,28,29,30. मोटे खंड इन कलाकृतियों के लिए अधिक प्रवण होते हैं, जिससे ~ 70 एनएम से अधिक मोटे वर्गों का उपयोग करना अव्यावहारिक हो जाता है।26. यह सीमा टोमोग्राम में जैविक संरचना के 3 डी दृश्य को बहुत प्रतिबंधित करती है। क्रायोजेनिक तापमान पर एफआईबी-मिलिंग इन समस्याओं का अनुभव नहीं करता है, लेकिन नमूने के कुछ हिस्सों में अंतर मिलिंग दरों के कारण इसकी अपनी कलाकृतियां होती हैं, जिससे लैमेला के भीतर परिवर्तनीय मोटाई होती है - जिसे पर्दा कहा जाता है। इस समस्या को गैस इंजेक्शन सिस्टम (जीआईएस) के माध्यम से लागू एक ऑर्गनोप्लाटिनम कोट के आवेदन से कम किया जाता है, जो मिलिंग के दौरान लैमेला के सामने के किनारे की रक्षा करता है।31. ऑन-ग्रिड एफआईबी-मिलिंग के लिए नमूना मोटाई की ऊपरी सीमा को नमूना को विट्रियस रखते हुए फ्रीज करने की क्षमता से परिभाषित किया गया है।32हालांकि, क्रायो लिफ्ट-आउट तकनीकों की शुरूआत और जैविक नमूनों के लिए अनुकूलित नमूना वाहक के साथ, एफआईबी-मिलिंग का उपयोग उच्च दबाव वाले जमे हुए नमूनों को संसाधित करने के लिए भी किया जा सकता है।31,33,34,35. इसके अतिरिक्त, जमे हुए नमूने बहुत पतले नहीं हो सकते हैं क्योंकि एक उचित आकार के लैमेला उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त जैविक सामग्री होनी चाहिए जो आवश्यक आवर्धन पर झुकाव-श्रृंखला एकत्र करने के लिए पर्याप्त सतह क्षेत्र प्रदान करेगी। बैक्टीरिया या खमीर जैसे छोटे कोशिकाओं के मिलिंग क्लंप द्वारा इस समस्या को कम किया जा सकता है। अंतिम लैमेला मोटाई (~ 100-300 एनएम) आमतौर पर नमूना अखंडता और मिलिंग रणनीति द्वारा निर्धारित की जाती है। पतली लैमेला उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक कार्य के लिए बेहतर हैं, जैसे कि उप-टोमोग्राम औसत, लेकिन मोटे लैमेला में सीईएमओवीआईएस द्वारा प्राप्त की जा सकने वाली तुलना में बहुत बड़े सेलुलर वॉल्यूम होते हैं, जो मूल रूप से संरक्षित नमूने में अधिक सेलुलर संदर्भ प्रदान करते हैं। इलेक्ट्रॉन विवर्तन अध्ययन के लिए एफआईबी-मिलिंग का उपयोग डुबकी-जमे हुए प्रोटीन क्रिस्टल को पतला करने के लिए भी किया जा सकता है।36.

विट्रियस कोशिकाओं की एफआईबी-मिलिंग समय और प्रयास के लायक है यदि वैज्ञानिक प्रश्न को सीटू में निकट-देशी नमूनों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन आणविक विवरण की आवश्यकता होती है। लैमेला के नियमित उत्पादन के लिए अधिक सुविधाओं तक पहुंच के साथ, दर सीमित कदम अक्सर मिलिंग से पहले नमूने का अनुकूलन होता है, जहां यह सुनिश्चित करने के लिए समय लिया जाना चाहिए कि नमूना विट्रस है और मजबूत और समान रूप से पतली लैमेला का उत्पादन करने के लिए एक उपयुक्त मोटाई है। यहां वर्णित मलेरिया के प्रेरक एजेंट प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम परजीवी से संक्रमित एफआईबी-मिलिंग डुबकी-जमे हुए मानव लाल रक्त कोशिकाओं के लिए नमूना अनुकूलन है, लेकिन इस दृष्टिकोण को किसी भी नमूने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Protocol

मानव रक्त यूके नेशनल ब्लड एंड ट्रांसप्लांट सेवा के माध्यम से अनाम दाताओं से प्राप्त किया गया था और प्राप्ति के 2 सप्ताह के भीतर उपयोग किया जाता है। इसके उपयोग के लिए किसी नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता नहीं है।

1. प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं की तैयारी और ठंड

  1. 70% (v/v) आइसोटोनिक घनत्व ढाल माध्यम पर सेंट्रीफ्यूजेशन (1,580 x g) द्वारा परिपक्व स्किज़ोन्ट्स को अलग करें (मानव एरिथ्रोसाइट्स में 3D7 प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम के अलैंगिक रक्त चरणों को कैसे कल्चर किया जाए, इसके लिए मानक प्रक्रियाओं के लिए, देखें ब्लैकमैन, एमजे, 1995,37)।
  2. 6.7 एमएम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.1 में 10% गिम्सा दाग के साथ धुंधला होने से पहले स्किज़ोन्ट्स की रूपात्मक समरूपता की जांच करने के लिए 100% मेथनॉल के साथ एक ग्लास स्लाइड पर हवा में सूखे पतले रक्त फिल्मों को ठीक करें।
    नोट: उत्सर्जन के विशिष्ट बिंदुओं पर रुके हुए स्किज़ोन्ट्स की तैयारी को समृद्ध करने के लिए, स्किज़ोन्ट्स को यौगिक 2 और ई 64 अवरोधकों के साथ और सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है (इन अवरोधकों के प्रभाव के स्पष्टीकरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम और चित्रा 1 देखें)।
    सावधानी: प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम एक मानव रोगज़नक़ है और इसे केवल स्थानीय स्वास्थ्य और सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करते हुए एक उपयुक्त रोकथाम सुविधा में संभाला जाना चाहिए।
  3. धीरे-धीरे उन्हें पेलेट करने के लिए स्किज़ोन्ट्स (240 x ग्राम) को सेंट्रीफ्यूज करें और आरपीएमआई मीडिया के सेल पेलेट की 2 x मात्रा में पुन: निलंबित करें, जिसके परिणामस्वरूप 50% हेमेटोक्रिट निलंबन होता है।
  4. मैनुअल डुबकी-फ्रीजिंग रिग पर, चमक-निर्वहन के कार्बन पक्ष पर 2.5 μL स्किज़ोन्ट्स लागू करें (60 s, हवा में 30 mA की चमक-निर्वहन इकाई सेटिंग्स का उपयोग करें, केवल ग्रिड के कार्बन पक्ष का इलाज करें) 2/4 छिद्र कार्बन फिल्म के साथ 200 जाल तांबा ग्रिड और फटे किनारे के साथ ग्रेड 1 फिल्टर पेपर का उपयोग करके ग्रिड के पीछे से ~ 20 सेकंड के लिए धब्बा। तरल नाइट्रोजन-कूल्ड तरल ईथेन में डुबकी लगाएं और ग्रिड को भंडारण में स्थानांतरित करें (इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले उपकरणों के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: प्रयोग को यहां रोका जा सकता है, और ग्रिड को तरल नाइट्रोजन के तहत अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है।
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन एक श्वासावरोध है और शीतदंश का कारण बनता है; ऑक्सीजन निगरानी के साथ एक उपयुक्त वातावरण में देखभाल के साथ संभालें।
    सावधानी: तरल ईथेन गंभीर जलन का कारण बनता है और ज्वलनशील होता है; इग्निशन के स्रोतों से दूर फ्यूम हुड में उपयोग करें।
    नोट: जमे हुए स्किज़ोन्ट्स अब व्यवहार्य नहीं हैं। यह मानव रक्त को हवा से पिघले हुए डुबके-जमे हुए स्किज़ोन्ट्स के कई सोने के ग्रिड के साथ इंजेक्ट करके निर्धारित किया गया था और गैर-जमे हुए नियंत्रणों की तुलना में कई दिनों के बाद कोई परजीवी वृद्धि नहीं देखी गई थी। इसलिए स्किज़ोन्ट्स के जमे हुए ग्रिड सामान्य सुरक्षा और परिशोधन प्रक्रियाओं (दस्ताने, >70% इथेनॉल के साथ सतह / उपकरण नसबंदी और >70% इथेनॉल में ग्रिड का निपटान) का उपयोग करके रोकथाम सुविधाओं के बाहर संभालना सुरक्षित हैं।
  5. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के लिए क्रायो-स्टेज का उपयोग करके स्क्रीन ग्रिड, ग्रिड में बर्फ की ढाल पर विशेष ध्यान देना। बर्फ के पतले क्षेत्रों में, सेल कवरेज के लिए अलग-अलग ग्रिड वर्गों की जांच करें।
    नोट: सबसे अच्छा वर्ग ग्रिड वर्ग के केंद्र में एक सेल मोटा होना चाहिए (चित्रा 2)। यह सुनिश्चित करता है कि ग्रिड सलाखों के खिलाफ किनारों पर मोटी बर्फ से टकराने के बिना एक लैमेला को स्क्वायर के केंद्र में मिलाया जा सकता है। प्रयोग को यहां रोका जा सकता है, और ग्रिड को तरल नाइट्रोजन के तहत अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है। यदि कोशिकाएं फ्लोरोसेंट मार्कर ले जाती हैं, तो ग्रिड को क्रायोसीएलईएम द्वारा एक्स / वाई रुचि की स्थिति का पता लगाने के लिए भी जांचा जा सकता है, जिसे क्रायोएफआईबी-एसईएम में ग्रिड स्थानों के साथ प्रत्यक्ष मिलिंग के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता है।

2. जमे हुए कोशिकाओं की ऑन-ग्रिड एफआईबी-मिलिंग

  1. क्रायोएफआईबी-विशिष्ट ऑटोग्रिड रिम के सामने को एक काले अमिट मार्कर पेन के साथ चिह्नित करें ताकि कटवे सेक्शन के केंद्र और रिम के विपरीत तरफ को इंगित किया जा सके (चित्रा 3)। क्लिपिंग स्टेशन और क्लिप ग्रिड को चिह्नित रिंग्स कार्बन साइड डाउन में सेटअप करें।
  2. क्रायोएफआईबी-एसईएम शटल (आमतौर पर शटल के आधार पर 2 ग्रिड) कार्बन साइड में ग्रिड लोड करें और आर्गन वातावरण (5 x 10-2 मिलीबार) में प्लैटिनम स्पटर कोट (60 एस के लिए 5 एमए - मोटाई परिवर्तनशील है) या कोशिकाओं की सतह पर कार्बन / प्लैटिनम ई-बीम रोटरी कोट (~ 4 एनएम मोटाई) लागू करें।
    नोट: दोनों प्रकार के कोटिंग्स एसईएम इमेजिंग के दौरान चार्ज फैलाव में सहायता करते हैं। ई-बीम रोटरी कोटर का लाभ यह है कि कोटिंग की सटीक मोटाई निर्दिष्ट की जा सकती है।
  3. शटल को क्रायोएफआईबी-एसईएम में लोड करें और एसईएम द्वारा प्रत्येक ग्रिड पर सेल वितरण का आकलन 5 केवी (13 पीए या 25 पीए) पर करें। ग्रिड में बर्फ ग्रेडिएंट को देखने के लिए कम-आवर्धन अवलोकन (~ 100x) लें। फिर, अलग-अलग ग्रिड वर्गों को देखने के लिए उच्च-आवर्धन (~ 5,000x) छवियां लें और दृश्य सेलुलर विशेषताओं और कम सतह संदूषण के साथ ग्रिड के क्षेत्रों की पहचान करें।
  4. गैस इंजेक्शन सिस्टम (जीआईएस) का उपयोग करके प्रत्येक ग्रिड की सतह पर >2 μm ऑर्गेनोप्लाटिनम कोट लागू करें। ऐसा करने के लिए, ग्रिड के ऊपर कक्ष में जीआईएस सुई डालें और वाष्प के प्रवाह का उत्पादन करने के लिए एक निर्धारित समय (उदाहरण के लिए, 3-10 सेकंड के लिए ~ 27 डिग्री सेल्सियस) के लिए एक निर्धारित तापमान पर ऑर्गनोप्लाटिनम स्रोत को गर्म करें।
    नोट: जीआईएस सुई के माध्यम से ऑर्गनोप्लाटिनम कोट के आवेदन, तापमान और समय के कोण को सम कोटिंग को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह उपयोग किए गए विशिष्ट क्रायोएफआईबी-एसईएम पर निर्भर करेगा (आगे के स्पष्टीकरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
  5. नमूने को झुकाएं ताकि ग्रिड का तल आयन बीम के घटना कोण से ~ 10 ° हो और एसईएम और एफआईबी छवियों दोनों में देखने के लिए एक उपयुक्त ग्रिड वर्ग के केंद्र को स्थानांतरित करें।
  6. कम धारा (नाममात्र 1.5 पीए, 30 केवी) पर आयन बीम का उपयोग करके ग्रिड का सर्वेक्षण करें और ग्रिड वर्ग के केंद्र में कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए उच्च पर्याप्त आवर्धन (~ 7,000x) पर जाएं। नमूने को पहले मिलिंग करंट (300 पीए) पर फोकस में लाएं और अस्थिरता के लिए सही हों। चमक और कंट्रास्ट को समायोजित करें, फिर मिल के लिए दो आयताकार पैटर्न चिह्नित करें, एक ऊपर और एक 3 μm मोटी संरक्षित क्षेत्र के नीचे, जिसका केंद्र अंतिम लैमेला का वांछित स्थान है।
    नोट: पैटर्न की चुनी हुई चौड़ाई आसपास की सेल परत की स्थलाकृति और सेल आकार पर निर्भर करेगी। 7-20 μm स्किज़ोन्ट्स के लिए एक उपयुक्त चौड़ाई है, लेकिन व्यापक लैमेला मिल जाने में अधिक समय लेता है। पहले मिलिंग चरण के लिए पैटर्न की चुनी हुई ऊंचाई नमूना मोटाई पर निर्भर करती है, जो लगभग 6 μm से शुरू होती है; इसे मिलिंग के दौरान समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। मिलिंग लैमेला के चेहरे की ओर पैटर्न के बाहरी शीर्ष और निचले किनारों से दिशात्मक रूप से किया जाता है। यह समानांतर में किया जा सकता है, जहां दोनों पैटर्न समवर्ती या क्रमिक रूप से मिल जाते हैं, पहले लैमेला के ऊपर से और फिर नीचे से सामग्री को हटाते हैं।
  7. पहले करंट पर मिलिंग शुरू करें; आयन बीम दृश्य में लाइव प्रगति की निगरानी करें और एसईएम (5 केवी, 13 या 25 पीए) द्वारा रुक-रुक कर। जांचें कि आयन बीम संरक्षित क्षेत्र के ऊपर और नीचे नमूने के माध्यम से टूट गया है। यदि नहीं, तो अधिक सामग्री को हटाने के लिए आयताकार पैटर्न की ऊंचाई बढ़ाएं। जब लैमेला के ऊपर और नीचे की सतह आयन बीम दृश्य में पूरी तरह से चिकनी हो जाती है तो रुक जाएं।
    नोट: आयन बीम संरक्षित क्षेत्र के ऊपर और नीचे नमूने के माध्यम से टूट गया है जब आयताकार पैटर्न के अंदर फोकल प्लेन में कोई विशेषता नहीं होती है। कुछ सुविधाएँ, जैसे ग्रिड बार, पृष्ठभूमि में फ़ोकस से बाहर दिखाई दे सकती हैं।
  8. अगले मिलिंग करंट (100 पीए) में बदलें; फोकस करें और चमक / कंट्रास्ट को समायोजित करें। दो आयताकार पैटर्न के बीच की जगह को 1.5 μm तक कम करें और केवल अन-मिल्ड सामग्री को कवर करने के लिए पैटर्न ऊंचाई कम करें। नए प्रवाह पर मिलिंग शुरू करें जब तक कि लैमेला के ऊपर और नीचे की सतह पूरी तरह से चिकनी न हो जाए।
  9. तालिका 1 में मिलिंग योजना के अनुसार हर बार आयन बीम प्रवाह को कम करते हुए, 0.3 μm की मोटाई तक पहुंचने तक इस प्रक्रिया को चरणबद्ध रूप से दोहराएं।
  10. एक या दोनों ग्रिड पर कई लैमेला (मात्रा नमूने की मोटाई और उपलब्ध समय पर निर्भर है) को 0.3 μm की मोटाई तक मिलाएं, प्रत्येक लैमेला की X / Y / Z स्थिति रिकॉर्ड करें और सत्र के अंत में ~ 1-2 घंटे आरक्षित करें ताकि लैमेला को उनकी अंतिम मोटाई (60-200 एनएम) तक चमकाया जा सके।
  11. पूरे ग्रिड का कम-आवर्धन एसईएम अवलोकन लें और ग्रिड के सामने (आयन बीम स्रोत के करीब) लैमेला से शुरू होकर ग्रिड के पीछे लैमेला (आयन बीम स्रोत से सबसे दूर) तक एक पॉलिशिंग मार्ग की योजना बनाएं (चित्रा 5)।
    नोट: यह पॉलिश किए गए लैमेला की सतह पर एब्लेटेड सामग्री के पुन: जमाव को कम करता है।
  12. दो आयताकार पैटर्न के बीच की जगह को 100-200 एनएम तक कम करें और 30 पीए के आयन बीम करंट पर अंतिम पॉलिशिंग चरण शुरू करें। 2-3 केवी (13 पीए, डीवेल = 300 एन, 3072 x 2048, ~ 2 एस एक पूर्ण फ्रेम के लिए) पर एसईएम द्वारा प्रगति की निगरानी करें और जब एसईएम द्वारा लैमेला में कंट्रास्ट खो जाता है या जब लैमेला का ऑर्गनोप्लाटिनम कोट स्वयं अखंडता खोना शुरू कर देता है तो पॉलिश करना बंद कर दें।
  13. ग्रिड को हटाने से पहले, पूरे ग्रिड की कम-आवर्धन एसईएम छवि प्राप्त करें और प्रत्येक लैमेला की छवियों को सहेजें। TEM में बाद में ग्रिड को क्रॉस-चेक करने के लिए उनका उपयोग करें। यहां प्रयोग को रोकें और तरल नाइट्रोजन के तहत लैमेला के साथ ग्रिड स्टोर करें - देखभाल के साथ संभालें।
    नोट: क्रायोएफआईबी-एसईएम से हटाने पर ग्रिड को हल्के से स्पटर लेपित किया जा सकता है, जो उच्च-आवर्धन पर टीईएम में बहाव और चार्जिंग को सीमित करने में मदद कर सकता है, लेकिन यह सावधानी से किया जाना चाहिए क्योंकि बहुत अधिक स्पटर कोटिंग लैमेला के अंदर जैविक सामग्री को अस्पष्ट कर सकती है। इस स्तर पर प्रतिदीप्ति के लिए लैमेला को स्क्रीन करना संभव है; हालांकि, पर्याप्त संकेत प्राप्त करना लैमेला की मोटाई के भीतर लेबल प्रोटीन की प्रचुरता पर निर्भर करेगा। लैमेला को नुकसान को सीमित करने और सतह संदूषण को रोकने के लिए ग्रिड को संभालने में बहुत सावधानी बरतनी चाहिए।

3. टिल्ट-सीरीज़ अधिग्रहण और डेटा प्रोसेसिंग का सामान्य अवलोकन।

  1. ग्रिड को टीईएम में लोड करें, मंच के झुकाव अक्ष के लंबवत मिलिंग दिशा को संरेखित करें।
    नोट: ग्रिड का संरेखण ऑटोग्रिड रिम पर निशान का उपयोग करके आंख से किया जाता है। त्रुटि का ~ 10 ° मार्जिन स्वीकार्य है, अन्यथा लैमेला के दोनों ओर खाई की दीवारें लैमेला को अस्पष्ट कर सकती हैं क्योंकि ग्रिड झुका हुआ है।
  2. पूरे ग्रिड का कम-आवर्धन मानचित्र (~ 150x) प्राप्त करें और लैमेला का पता लगाएं; फिर, प्रत्येक लैमेला का एक मध्यम-आवर्धन मानचित्र (~ 1,500x, लैमेला आकार के आधार पर) प्राप्त करें और रुचि के क्षेत्रों का पता लगाएं।
  3. लैमेला (ग्रिड नहीं) के विमान को ऑप्टिकल अक्ष के लंबवत बनाने के लिए ग्रिड को ±10° से पूर्व-झुकाएं।
    नोट: पूर्व-झुकाव की दिशा कम और मध्यम आवर्धन मानचित्रों में लैमेला के सामने के किनारे की स्थिति (बचे हुए ऑर्गोप्लाटिनम कोट की तलाश) से निर्धारित की जा सकती है। यहां उपयोग किए जाने वाले टीईएम के लिए, ग्रिड को +10 ° पूर्व-झुकाव की आवश्यकता होती है यदि लैमेला के सामने के किनारे नक्शे में ऊपर की ओर इशारा करते हैं और यदि वे नीचे इंगित करते हैं तो -10 ° पूर्व-झुकाव की आवश्यकता होती है। प्रत्येक ग्रिड अलग-अलग हो सकता है क्योंकि उन्हें कैसे उठाया गया और ऑटोलोडर में डाला गया।
  4. एक पिक्सेल आकार पर खुराक-सममित झुकाव-श्रृंखला38 (उदाहरण के लिए, 3-5 ° की वृद्धि के साथ -54 ° से +54 ° तक) प्राप्त करें जो रुचि के क्षेत्र के लिए आवश्यक दृश्य और रिज़ॉल्यूशन दोनों की अनुमति देता है। -2 और -5 μm के बीच डीफोकस मानों की एक श्रृंखला का उपयोग करें। प्रत्येक वेतन वृद्धि पर 3-10 फ्रेम के साथ फिल्में एकत्र करें और इसके लिए, पिक्सेल आकार के आधार पर इन मापदंडों को समायोजित करें ताकि ~ 150 e-/A2 (300 kV TEM के लिए) की कुल खुराक जमा हो सके।
    नोट: लैमेला में दरारें आने से बचना चाहिए क्योंकि ये क्षेत्र बह सकते हैं। सतह संदूषण से भी बचा जाना चाहिए क्योंकि यह रुचि के क्षेत्र या उच्च झुकाव पर फोकस क्षेत्र को अस्पष्ट कर सकता है।
  5. मोशन कोर 239 जैसे प्रोग्राम का उपयोग करके फिल्मों को सही करें। सही की गई छवियों (संचित ई-/इमेज) 40 पर एक खुराक भार फ़िल्टर लागू करें और CTFFIND441 जैसे प्रोग्राम का उपयोग करके प्रत्येक छवि के डीफोकस का अनुमान लगाएं।
  6. झुकाव-श्रृंखला में छवियों के संरेखण और कोणीय संबंध की गणना करने के लिए एटोमो (आईएमओडी) 42 जैसे प्रोग्राम में फिड्यूशियल-कम संरेखण (पैच ट्रैकिंग) का उपयोग करें।
  7. एक प्रोग्राम में डीफोकस मानों के साथ संरेखण और रोटेशन जानकारी इनपुट करें जो तीन आयामी सीटीएफ सुधार लागू कर सकता है, उदाहरण के लिए, नोवासीटीएफ43। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए प्रासंगिक बिनिंग कारकों के साथ आउटपुट टोमोग्राम प्राप्त करने के लिए एक सही टोमोग्राम की गणना करें।
  8. पुनर्निर्माण का विश्लेषण करें और किसी भी डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए तैयार करें, उदाहरण के लिए, फ़िल्टरिंग, विभाजन, या उप-टोमोग्राम औसत।

Representative Results

पी फाल्सीपेरम स्किज़ोन्ट्स को ठंड के लिए तैयार करना।
यौगिक 2 और ई 64 अवरोधकों का उपयोग प्रवेश के विभिन्न चरणों में स्किज़ोन्ट्स को रोकने के लिए किया जाता है, जिससे बाद के अध्ययन के लिए स्किज़ोन्ट्स की समृद्ध आबादी पैदा होती है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि पूरक सह-सापेक्ष तकनीक के बिना, विशिष्ट उप-सेलुलर लक्ष्यों या सेल-प्रकारों को मिलिंग करना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि प्रक्रिया अनिवार्य रूप से अंधी है। यौगिक 2 एक प्रोटीन काइनेज अवरोधक है जो रिक्तिका टूटने से पहले प्रवेश को रोकता है। स्किज़ोन्ट्स को 4 घंटे के लिए यौगिक 2 पर सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है, फिर अवरोधक को हटाने के लिए यौगिक 2-मुक्त मीडिया के साथ धोया जा सकता है, जिस बिंदु पर स्किज़ोन्ट्स परिपक्व होंगे और लगभग 30 मिनट के बाद प्रवेश करेंगे। वैकल्पिक रूप से, यौगिक 2 सिंक्रनाइज़ किए गए स्किज़ोन्ट्स को ई 64, एक अपरिवर्तनीय ब्रॉड-स्पेक्ट्रम सिस्टीन प्रोटीज अवरोधक में धोया जा सकता है, और रिक्तिका टूटने के बिंदु के बाद प्रवेश को रोकने के लिए लगभग 1 घंटे तक इनक्यूबेट किया जा सकता है, लेकिन मेजबान सेल टूटने से पहले। उपचारित स्किज़ोन्ट्स की आकृति विज्ञान और समरूपता को डुबकी ठंड से पहले गिम्सा-दाग वाले रक्त स्मीयर द्वारा जांचा जाना चाहिए (चित्र 1)। इस प्रकाशन में वर्णित विधि का उपयोग करके स्किज़ोन्ट्स को इनमें से किसी भी राज्य में जमे हुए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: गिम्सा-सना हुआ रक्त स्मीयर द्वारा यौगिक 2 और ई 64-रुके हुए पी फाल्सीपेरम स्किज़ोन्ट्स की आकृति विज्ञान। (ए) यौगिक 2 की उपस्थिति में पैरासिटोफोरस रिक्तिका (पीवी) हेमोज़ोइन क्रिस्टल (गहरे भूरे घेरे) के एकल समूह के साथ मेरोज़ोइट्स (बैंगनी सर्कल) के साथ घनी होती है। मेजबान लाल रक्त कोशिका (एचआरबीसी) (ग्रे बैंड) में पीवी और आसपास के हीमोग्लोबिन के बीच की सीमा अच्छी तरह से परिभाषित है, साथ ही एचआरबीसी झिल्ली भी। (बी) ई 64 की उपस्थिति में, पीवी झिल्ली टूट जाती है और एमआरबीसी के भीतर मेरोज़ोइट्स फैल जाते हैं। प्रत्येक स्किज़ोनेट में अभी भी हेमोज़ोइन क्रिस्टल का एक समूह होता है। मेजबान कोशिका झिल्ली लीक और आंशिक रूप से ढह जाती है, इसलिए, कोशिका परिधि के भीतर कोई हीमोग्लोबिन दिखाई नहीं देता है और एचआरबीसी झिल्ली की सीमा आसानी से दिखाई नहीं देती है। स्केल बार, 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

डुबकी ठंड का अनुकूलन
फाल्सीपेरम संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं के लिए ब्लोटिंग स्थितियों के अनुकूलन के दौरान विभिन्न छेद आकारों वाले ग्रिड की एक श्रृंखला का परीक्षण किया गया, जिसमें सोने और तांबे के 200 जाल ग्रिड पर 2/2, 3/3, 3.5/1 और 5/2 (वर्ग) छिद्रित कार्बन शामिल थे। 2/4 छिद्र कार्बन फिल्म के साथ 200 जाल तांबा खोजक ग्रिड लंबे विट्रस लैमेला को मिल जाने के लिए कोशिकाओं की एक उपयुक्त मोटी परत प्रदान करते हैं। बड़े या छोटे छेदों के परिणामस्वरूप आम तौर पर सेल परतें होती हैं जो क्रमशः बहुत पतली या मोटी होती हैं (चित्रा 2 ए-सी)। 2/4 छिद्र वाले कार्बन के साथ, स्किज़ोन्ट्स को पीछे (गैर-कार्बन साइड) से ग्रिड को सोखकर 2 μm छेद ों के माध्यम से खींचा जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाएं कार्बन फिल्म के ऊपर और नीचे निकलती हैं। छिद्रों के बीच कार्बन के 4 μm खिंचाव के परिणामस्वरूप कार्बन की एक पट्टी अधिकांश परिणामी लैमेला के बीच से चलती है, जिससे ताकत बढ़ जाती है। फाइंडर ग्रिड सह-संबंधी औरस्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए सबसे उपयुक्त हैं, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि जाल डिजाइन में संख्या / अक्षर बहुत बड़े नहीं हैं क्योंकि यह मिलिंग के लिए क्षेत्रों को अवरुद्ध करेगा।

मैनुअल प्लंजर पर ब्लॉटिंग का समय लगभग 20 सेकंड है, लेकिन सोख्ता को रोकने के लिए सटीक बिंदु को आंखों से आंका गया था जब ग्रिड से खींची जा रही तरल की बूंद ने फिल्टर पेपर पर फैलना बंद कर दिया था। ब्लोटिंग प्रक्रिया शुरू करने के लिए ड्रॉप की सतह के तनाव को तोड़ने के लिए एक फटे हुए किनारे की आवश्यकता थी। इस अध्ययन में एक स्वचालित डुबकी फ्रीजर का उपयोग नहीं किया गया था, लेकिन इस नमूने के लिए एक उचित प्रारंभिक बिंदु कोशिकाओं और ग्रिड प्रकार की उसी मात्रा का उपयोग करना होगा जैसा कि मैनुअल प्लंजर के लिए उपयोग किया जाता है, जिससे उच्च आर्द्रता (~ 70%) और परिवेश के तापमान (~ 25 डिग्री सेल्सियस) वाली स्थितियों में ग्रिड को पीछे से धब्बा लगाना सुनिश्चित होता है। ब्लॉटिंग समय और शर्तों को उपयोग किए जाने वाले विशेष स्वचालित सिस्टम के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी।

फाल्सीपेरम स्किज़ोन्ट्स के जमे हुए ग्रिड को टीईएम के बजाय क्रायो-स्टेज से लैस एक प्रकाश माइक्रोस्कोप द्वारा जांचा गया था, क्योंकि नमूना इलेक्ट्रॉनों के लिए पारगम्य नहीं था। पतले नमूनों के लिए, क्रायोएफआईबी-एसईएम में नमूना हस्तांतरण से पहले टीईएम (~ 150 x आवर्धन पर पूरे ग्रिड एटलस) द्वारा ग्रिड की जांच की जा सकती है, जो राष्ट्रीय सुविधा तक पहुंचने के लिए एक पूर्व-आवश्यकता हो सकती है। ग्रिड में और अलग-अलग ग्रिड वर्गों के भीतर भी बर्फ की मोटाई की ढाल पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। अच्छे ग्रिड वर्ग एक सेल मोटे होने चाहिए या उनके केंद्र में कार्बन फिल्म से टकराते हैं (चित्रा 2 सी)। यह ग्रिड स्क्वायर के किनारे के चारों ओर ग्रिड सलाखों के खिलाफ मोटी बर्फ में मिलिंग से बचता है और यह सुनिश्चित करेगा कि आयन बीम सेल परत के ऊपर और नीचे टूट जाए, जिससे वेज के बजाय एक मुक्त लैमेला का उत्पादन हो। एक बार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ब्लॉटिंग और डुबकी ठंड की स्थिति को अनुकूलित करने के बाद, आमतौर पर एफआईबी-मिलिंग से पहले स्क्रीनिंग आवश्यक नहीं होती है।

Figure 2
चित्र 2. क्रायो-लाइट माइक्रोस्कोपी द्वारा जमे हुए पी फाल्सीपेरम स्किज़ोन्ट्स के ग्रिड पर सेल वितरण का विश्लेषण करना। (ए) क्रायो-लाइट माइक्रोस्कोपी द्वारा ग्रिड स्क्वायर में बर्फ के बहुत मोटे होने का एक उदाहरण, कोशिकाओं और कार्बन फिल्म को धुंधला करता है। (बी) छेद के आकार का एक उदाहरण (5/2 वर्ग छेद कार्बन फिल्म के साथ 300 जाल तांबा ग्रिड) कोशिकाओं के लिए बहुत बड़ा है, जिसके परिणामस्वरूप जैविक सामग्री की एक बहुत पतली परत खाली क्षेत्रों से घिरी हुई है जिसमें कोई बर्फ नहीं है। इस तरह के ग्रिड बहुत छोटे, अस्थिर लैमेला का उत्पादन करते हैं। स्केल बार, 10 μm. (C) 2/4 छिद्र कार्बन फिल्म के साथ 200-जाल तांबा ग्रिड पर अच्छे सेल वितरण का एक उदाहरण। इन स्किज़ोन्ट्स का इलाज ई 64 अवरोधक के साथ किया गया था। एक अच्छी तरह से परिभाषित परिधि के साथ बड़ी कोशिकाएं (लाल बॉक्स, ~ 5 μm व्यास) संक्रमित लाल रक्त कोशिकाएं हैं जिनमें अभी भी एक बरकरार रिक्तिका झिल्ली है। छोटी कोशिकाओं के समूह (ब्लू बॉक्स, ~ 1 μm) आंशिक रूप से ध्वस्त मेजबान लाल रक्त कोशिका के भीतर निहित व्यक्तिगत मेरोज़ोइट्स हैं। प्रत्येक स्किज़ोंट के केंद्र में एक काला धब्बा होता है, जो हेमोज़ोइन क्रिस्टल की स्थिति को दर्शाता है (अतिरिक्त विवरण के लिए चित्र 1 देखें)। कोशिका आकृति विज्ञान में अंतर क्रायोएफआईबी-एसईएम के अंदर एक बार देखना उतना आसान नहीं है; इसलिए, क्रायो-लाइट माइक्रोस्कोपी द्वारा प्री-स्क्रीनिंग तब तक फायदेमंद होती है जब तक कि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सोख्ता की स्थिति तक नहीं पहुंच जाती है। ग्रिड बार (सफेद-डैश ्ड क्षेत्रों) के बगल में ग्रिड स्क्वायर के किनारों के आसपास सेल कवरेज मिलिंग के लिए बहुत मोटा है। ग्रिड स्क्वायर (पीला-डैश्ड क्षेत्र) के केंद्र में पतला क्षेत्र लैमेला को कोशिकाओं की आसपास की परत में विस्तारित करने के लिए एक आदर्श स्थान है। स्केल बार, 6 μm. (D) क्रायोएफआईबी-विशिष्ट ऑटोग्रिड रिम की छवि जिसमें दो काले निशान हैं, एक कटवे सेक्शन (ब्लैक ब्रैकेट) के भीतर और दूसरा विपरीत, 12 बजे और 6 बजे। काला तीर मिलिंग दिशा का प्रतिनिधित्व करता है। (ई) जब ग्रिड को ऑटोलोडर कैसेट में लोड किया जाता है, तो निशान लोडिंग चिमटी के दोनों ओर समान दूरी पर होने की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप लैमेला मंच के झुकाव अक्ष के लंबवत होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

टोमोग्राफी के लिए क्रायोएफआईबी-विशिष्ट ऑटोग्रिड रिम को चिह्नित करना।
आमतौर पर, हैंडलिंग को आसान बनाने और कठोरता प्रदान करने के लिए मिलिंग से पहले ग्रिड को ऑटोग्रिड रिम में दबा दिया जाता है, जो बाद के स्थानांतरण चरणों के दौरान लैमेला को नुकसान से बचाता है। क्रायोएफआईबी-विशिष्ट ऑटोग्रिड रिम को मिलिंग के दौरान ग्रिड फेस तक पहुंचने में मदद करने के लिए एक कटवे फीचर के साथ इंजीनियर किया गया है। टीईएम के झुकाव-अक्ष के लंबवत मिलिंग दिशा को उन्मुख करना महत्वपूर्ण है ताकि झुकाव-श्रृंखला अधिग्रहण लैमेला को इसकी लंबाई के साथ घुमाकर आगे बढ़े। यह सुनिश्चित करता है कि लैमेला के आसपास की खाई की ऊंची दीवारें जैविक जानकारी को अस्पष्ट नहीं करती हैं क्योंकि ग्रिड झुका हुआ है।

आमतौर पर, ऑटोग्रिड रिम को क्रायोएफआईबी-एसईएम शटल के भीतर दृश्य संरेखण में मदद करने के लिए चिह्नित किया जाता है और बाद में टीईएम लोड करते समय। इन नमूनों के लिए, एक अमिट मार्कर (सामग्री की तालिका देखें) के साथ 12 बजे और 6 बजे दो निशान लगाए गए थे, एक क्लिप रिंग के कटवे अनुभाग के केंद्र के भीतर और दूसरा सीधे विपरीत (चित्रा 2 डी)। टीईएम में लोड करते समय ( सामग्री की तालिका देखें), दोनों निशान लोडिंग चिमटी के दोनों ओर दिखाई देने चाहिए और चिमटी के किनारे पर 90 ° संरेखित होना चाहिए (चित्रा 2 ई)। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि निर्माता ऑटोग्रिड रिम पर उत्कीर्ण डॉट्स का उपयोग करके ग्रिड को संरेखित करने की सिफारिश करता है, क्योंकि आयन बीम के निकटता में कुछ स्याही मिलिंग में हस्तक्षेप कर सकती हैं।

स्लिप्ड ग्रिड को क्रायो-स्टेज के लिए एक संशोधित कैसेट के साथ प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा स्क्रीन किया जा सकता है, जो यह जांचने के लिए फायदेमंद हो सकता है कि क्लिपिंग प्रक्रिया ने ग्रिड की कार्बन फिल्म को नष्ट नहीं किया है। नमूना कैसेट के आधार पर, अनस्लिप्ड ग्रिड को भी मिलाया जा सकता है, लेकिन ग्रिड के किसी भी झुकाव को सीमित करने के लिए क्रायोएफआईबी-एसईएम से टीईएम में स्थानांतरण के दौरान बहुत सावधानी बरतनी चाहिए क्योंकि यह लैमेला को तोड़ देगा। साइड-एंट्री क्रायो-होल्डर्स द्वारा टीईएम में अनस्लिप्ड ग्रिड लोड किए जा सकते हैं, लेकिन एक उच्च संभावना है कि मिलिंग के बाद क्लिपिंग किए जाने पर लैमेला टूट जाएगा।

ऑर्गनोप्लाटिनम कोटिंग
ऑर्गोप्लाटिनम कोटिंग एक या दोनों ग्रिडों पर की जाती है जब उन्हें क्रायोएफआईबी-एसईएम में लोड किया जाता है। गैस इंजेक्शन सिस्टम (जीआईएस) की सुई को एक निर्धारित समय के लिए गर्म स्रोत से ग्रिड की सतह पर ऑर्गेनोप्लाटिनम वाष्प के प्रवाह को निर्देशित करने के लिए नमूने के ऊपर कक्ष में डाला जाता है। वाष्प ठंडी सतहों पर संघनित होता है और एक ठोस परत (~ 2 μm मोटी) बनाता है। समान रूप से पतली लैमेला को मिलाने में सक्षम करने के लिए इस कोट की अखंडता महत्वपूर्ण है। ऑर्गनोप्लाटिनम कोट के लिए इष्टतम आवेदन की स्थिति आमतौर पर उपकरण के निर्माता द्वारा पूर्व-निर्धारित की जाती है, लेकिन कुछ अनुकूलन अभी भी आवश्यक हो सकते हैं। अधिकांश प्रणालियां या तो जीआईएस सुई को मिलिंग दिशा के करीब या मिलिंग दिशा के लंबवत संरेखित करती हैं, जो कक्ष पर बंदरगाहों की ज्यामिति और मंच की घूर्णी सीमाओं पर निर्भर करती हैं। ग्रिड को कोटिंग करके, एक छोटे से क्षेत्र को मिलिंग करके, मंच को झुकाकर और एसईएम द्वारा कोट की मोटाई को मापकर विभिन्न सेटिंग्स का परीक्षण किया जा सकता है।

क्रायोएफआईबी-एसईएम के सेटअप के साथ-साथ, कई अन्य कारक ऑर्गनोप्लाटिनम कोट के आवेदन को प्रभावित कर सकते हैं जिसमें 1) नमूने की स्थलाकृति, 2) ग्रिड पर सतह संदूषण और 3) जीआईएस सुई से वाष्प प्रवाह की प्रजनन क्षमता शामिल है। चूंकि जीआईएस प्रवाह दिशात्मक है, असमान स्थलाकृति कोशिकाओं या सतह संदूषण की छाया में क्षेत्रों को अनकोटेड या पतला कोट होने का कारण बन सकती है। इससे पॉलिशिंग के दौरान ऑर्गनोप्लाटिनम परत का पतन हो सकता है (चित्रा 3)। मिल के लिए एक क्षेत्र का चयन करते समय, आसपास की स्थलाकृति के प्रति सावधान रहना आवश्यक है, उदाहरण के लिए, बड़ी सतह संदूषण, कोशिकाओं के झुरमुट या टूटे हुए कार्बन जो ग्रिड की सतह से कुछ ग्रिड वर्ग दूर तक प्रोजेक्ट करते हैं, वाष्प प्रवाह को अवरुद्ध कर सकते हैं, जिससे पतले ऑर्गेनोप्लाटिनम की छाया बन सकती है जो एक लैमेला को कमजोर कर सकती है। इसके अतिरिक्त, लैमेला के सामने के किनारे के पास सतह संदूषण के बहुत छोटे कणों से भी बचा जाना चाहिए क्योंकि वे मिलिंग के दौरान पॉप-ऑफ कर सकते हैं, जिससे नंगे बर्फ का एक कमजोर पैच निकल सकता है जिसके परिणामस्वरूप पॉलिशिंग के दौरान लैमेला में छेद विकसित हो सकता है। अंत में, यदि मिलिंग शुरू हो गई है और ऑर्गनोप्लाटिनम कोट अस्थिर दिखता है, तो लंबे समय तक फिर से कोट करें, या बैक-अप ग्रिड पर स्वैप करें।

Figure 3
चित्रा 3: पतली, समान रूप से मिल्ड लैमेला प्राप्त करने के लिए एक अच्छी गुणवत्ता वाली ऑर्गनोप्लाटिनम कोटिंग महत्वपूर्ण है। (ए) एक लैमेला के सामने के किनारे का एक माइक्रोग्राफ जहां ऑर्गनोप्लाटिनम कोटिंग (ओपी, पीला) बहुत पतली रूप से लागू की गई है, जिससे लैमेला के सामने के किनारे में एक छेद हो जाता है जो लैमेला (हरे सर्कल) को चमकाने और लैमेला (लकीरों) की पूरी चौड़ाई में असमान मिलिंग के दौरान विकसित होता है। ऑर्गोप्लाटिनम की सतह को आयन बीम द्वारा काट दिया गया है, जिससे कोटिंग के सामने के किनारे (पीली-डैश्ड लाइन) के पीछे सामग्री का स्प्रे हो गया है। (बी) ऑर्गनोप्लाटिनम कोट (ओपी) को अधिक मोटा रूप से लागू किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप अधिक समान रूप से पतला लैमेला होता है। कोट की अखंडता लैमेला की पूरी चौड़ाई में संरक्षित है और ऑर्गनोप्लाटिनम कोट और विट्रीफाइड जैविक सामग्री के बीच इंटरफ़ेस अच्छी तरह से परिभाषित है (पीली-डैश्ड लाइन)। कार्बन परत को लैमेला (नारंगी) के पीछे से चलते हुए देखा जा सकता है। स्केल बार, 1 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

क्रायोएफआईबी-एसईएम में ग्रिड की गुणवत्ता और मिलिंग की प्रक्रिया का आकलन
एक बार ग्रिड को क्रायोएफआईबी-एसईएम में स्थानांतरित कर दिया गया है, तो कार्बन फिल्म की अखंडता और ग्रिड पर कोशिकाओं के वितरण को एसईएम (चित्रा 4 ए-सी) द्वारा जांचा जा सकता है। बर्फ ग्रेडिएंट, ग्रिड बार की स्थिति और फाइंडर ग्रिड पर ग्रिड नंबरों के स्थान को 30 केवी (चित्रा 4 बी) पर कम-आवर्धन एसईएम द्वारा जांचा जा सकता है, लेकिन उच्च-आवर्धन पर मिलिंग स्थितियों का पता लगाते समय वोल्टेज को वापस 5 केवी तक कम किया जाना चाहिए और सतह स्थलाकृति से विपरीत को बढ़ाने के लिए मिलिंग प्रक्रिया की निगरानी की जानी चाहिए।

Figure 4
चित्रा 4: क्रायोएफआईबी-एसईएम में ग्रिड की गुणवत्ता का आकलन करना और मिल के क्षेत्रों का पता लगाना। ऑटोग्रिड रिम का कटवे सेक्शन छवि के निचले भाग में दिखाई दे रहा है। स्केल बार, 0.5 मिमी (बी) एसईएम द्वारा 30 केवी पर एक ही ग्रिड, मोटी बर्फ (गहरे ग्रिड वर्ग) और पतली बर्फ (हल्के ग्रिड वर्ग) के क्षेत्रों को दर्शाता है। इनसेट बॉक्स में क्षेत्र को दर्शाता है, जिसमें तीर खोजक ग्रिड पर नंबरिंग का संकेत देते हैं, जो 30 केवी पर दिखाई देता है। स्केल बार, 0.5 मिमी (सी) कार्बन फिल्म और ग्रिड बार के स्थान पर कोशिकाओं के वितरण का आकलन करने वाले दो ग्रिड वर्गों का एक मध्यम-आवर्धन अवलोकन। स्केल बार, 50 μm. (D) उच्च-आवर्धन पर पहले कट के लिए मिलिंग पैटर्न की व्यवस्था (1.5 pA और 30 kV पर आयन बीम दृश्य)। लाल क्षेत्र (3 μm मोटा) संरक्षित है, जबकि पीले क्षेत्रों को आयन बीम द्वारा नष्ट किया जाएगा। सफेद-डैश ्ड लाइन अंतिम लैमेला की स्थिति को इंगित करती है। स्केल बार, 10 μm. (E) पॉलिश किए गए 200 nm मोटी लैमेला (10 μm चौड़े x 15 μm लंबे) के SEM के माध्यम से 3 kV पर एक उच्च-आवर्धन दृश्य। 3 केवी पर लैमेला के भीतर कंट्रास्ट का नुकसान इंगित करता है कि एक उपयुक्त मोटाई तक पहुंच गया है। उज्ज्वल-सफेद फ्रंट किनारा शेष ऑर्गनोप्लाटिनम परत है जिसे मिलिंग से पहले जीआईएस के माध्यम से ग्रिड पर लागू किया जाता है। स्केल बार, 5 μm. (F) से एक ही लैमेला (E) 30 kV और 1.5 pA पर आयन बीम का उपयोग करके देखा जाता है। काले वर्ग (सफेद तीर) के पार पतली सफेद रेखा लैमेला के सामने के किनारे पर शेष ऑर्गेनोप्लाटिनम कोट है। स्केल बार, 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

आयन बीम दृश्य (चित्रा 4 डी) में उच्च-आवर्धन (स्किज़ोन्ट्स के लिए ~ 7,000x) पर एक संरक्षित क्षेत्र के दोनों ओर आयताकार पैटर्न की एक जोड़ी बिछाकर एक क्षेत्र का चयन किया जाता है। यह महत्वपूर्ण है कि मिलिंग क्षेत्र के पास सतह संदूषण के कोई कण जुड़े नहीं हैं क्योंकि ये सुरक्षात्मक ऑर्गोप्लाटिनम कोट के आवेदन को अस्पष्ट कर सकते हैं। यह भी महत्वपूर्ण है कि क्षेत्र की स्थलाकृति लैमेला के किनारों का समर्थन करने के लिए उपयुक्त है जब इसकी अंतिम मोटाई हासिल हो गई है।

मलेरिया स्किज़ोन्ट्स (सेल आकार: ~ 5 μm व्यास x 2 μm मोटी, डिस्क के आकार) के लिए 7-20 μm चौड़े लैमेला को मिलाया जा सकता है। यदि सेल परत उपयुक्त रूप से मोटी है, तो लैमेला आमतौर पर लंबाई में ~ 10-15 μm हो जाएगा, जो कार्बन परत के ऊपर और नीचे कई कोशिकाओं को कैप्चर करेगा (चित्रा 4E-F)। 8 घंटे के सत्र (6-7 घंटे मिलिंग और 1-2 घंटे पॉलिशिंग) में 5-10 लैमेला मिल जाने की उम्मीद की जा सकती है। यह नमूने की मोटाई और लैमेला की चौड़ाई के आधार पर अलग-अलग होगा, मोटे नमूने और व्यापक लैमेला मिल में अधिक समय लेते हैं। यहां तक कि क्षतिग्रस्त ग्रिड को भी मिल सकता है क्योंकि लैमेला का एक सेट उत्पन्न करने के लिए केवल मुट्ठी भर अच्छे ग्रिड वर्गों की आवश्यकता होती है (चित्रा 5 ए)। इसके अतिरिक्त, यदि नमूना अपेक्षा से पतला है, उदाहरण के लिए, संस्कृति के हेमेटोक्रिट में ओवर-ब्लोटिंग या भिन्नता के कारण, छोटे लैमेला को अपेक्षाकृत जल्दी से मिलाया जा सकता है; हालाँकि, उनकी छोटी लंबाई टीईएम (चित्रा 5 बी) में डेटा संग्रह के लिए उपलब्ध क्षेत्र को सीमित कर देगी।

Figure 5
चित्रा 5: यह निर्धारित करना कि मिलिंग के दौरान अंतिम लैमेला मोटाई कब पहुंच गई है। (ए) 5 केवी पर एसईएम द्वारा ग्रिड का कम-आवर्धन अवलोकन जो क्लिपिंग के दौरान कार्बन क्षति को दर्शाता है। अति-सोख्ता के कारण क्षतिग्रस्त क्षेत्रों में बहुत पतला नमूना होता है; हालांकि, क्रायोएफआईबीएसईएम पर पूरे दिन के सत्र में इस ग्रिड (व्हाइट-डैश्ड रूपरेखा के भीतर क्षेत्र) पर छह लैमेला को मिलना अभी भी संभव था। स्केल बार, 0.5 मिमी (बी) इस ग्रिड (3 केवी पर एसईएम) से उत्पादित एक छोटी लैमेला (~ 10 μm चौड़ा x 3 μm लंबा, जिसमें ऑर्गनोप्लाटिनम परत शामिल नहीं है), जो अभी भी दो क्षेत्र प्रदान करता है जहां से झुकाव-श्रृंखला एकत्र की जाती है। (सी) अंतिम पॉलिशिंग चरण के दौरान एक लैमेला की एसईएम छवियों (3 केवी) की एक श्रृंखला दिखाती है कि लैमेला में कंट्रास्ट कैसे खो जाता है क्योंकि यह पतला होता है (बाएं से दाएं चलता है)। सभी छवियों में लैमेला के बीच में गहरे काले रंग की रेखा ग्रिड से कार्बन फिल्म की एक पट्टी है। इस क्षेत्र के सामने की कोशिकाओं को कार्बन फिल्म के ऊपर विट्रीफाइड किया गया था और इस क्षेत्र के पीछे की कोशिकाओं को कार्बन फिल्म के नीचे विट्रीफाइड किया गया था। मिलिंग को रोक दिया गया था जब लैमेला के सामने के किनारे के बाईं ओर ऑर्गनोप्लाटिनम कोट संरचनात्मक अखंडता खोने के करीब था। यह स्टॉपिंग पॉइंट पूरे लैमेला को एक समान मोटाई में लाने से पहले था, यही कारण है कि लैमेला के पीछे अभी भी कुछ उच्च कंट्रास्ट सामग्री है। (डी) ग्रिड पर मिले लैमेला के आधार पर पॉलिशिंग मार्ग का एक उदाहरण (ए) में दिखाया गया है। एक पॉलिशिंग मार्ग एफआईबी स्रोत के पास लैमेला से शुरू होना चाहिए, जो लैमेला की सतह पर मिल्ड सामग्री के पुन: जमाव को सीमित करने के लिए एफआईबी स्रोत से दूर जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पॉलिशिंग के दौरान, एक लैमेला की अंतिम मोटाई मिल रहे क्षेत्र में नमूने की संरचना, ऑर्गनोप्लाटिनम कोट की अखंडता और उपलब्ध समय पर निर्भर करेगी। आदर्श रूप से, नमूने को तब तक पतला किया जाना चाहिए जब तक कि 3 केवी पर एसईएम द्वारा लैमेला की पूरी सतह पर कंट्रास्ट खो न जाए, यह सुझाव देते हुए कि यह समान रूप से इलेक्ट्रॉन पारदर्शी और लगभग 150-200 एनएम मोटा है (चित्रा 5 सी)। हालांकि, इस बिंदु से पहले मिलिंग को रोकना आवश्यक हो सकता है यदि ऑर्गनोप्लाटिनम परत एक छेद विकसित करती है या लैमेला झुकना शुरू कर देता है। इस मामले में, लैमेला अभी भी सामने की ओर काफी पतला हो सकता है और टोमोग्राफी के लिए उपयोगी रह सकता है। इसके विपरीत, यदि लैमेला स्थिर दिखता है, तो कंट्रास्ट चरण के नुकसान को पतला करना संभव है, जिससे मिलिंग पैटर्न को एक साथ ले जाकर (~ 100 एनएम या उससे कम) इसे और भी पतला बना दिया जाता है। यह इस बात पर निर्भर करेगा कि डाउनस्ट्रीम वर्कफ़्लो के लिए यदि आवश्यक है तो मोटाई क्या है। पॉलिशिंग मार्ग की योजना बनाने के लिए एक कम-आवर्धन एसईएम छवि की आवश्यकता होती है, जो आयन बीम स्रोत के करीब शुरू होती है और दूर काम करती है (चित्रा 5 डी)। पॉलिशिंग मार्ग की दिशा लैमेला पर एब्लेटेड सामग्री के पुन: जमाव को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है जो पहले ही समाप्त हो चुकी है।

झुकाव-श्रृंखला डेटा एकत्र करना और संसाधित करना
एक बार टीईएम में लोड होने के बाद, एक कम-आवर्धन पूर्ण ग्रिड मोंटाज (~ 150x) लैमेला की स्थितियों की पहचान करेगा, जिसे मिलिंग के अंत में ली गई कम-आवर्धन एसईएम छवि से सहसंबद्ध किया जा सकता है। जमे हुए स्किज़ोन्ट्स के लिए, अधिकांश ग्रिड इलेक्ट्रॉनों के लिए पारदर्शी नहीं है, इसलिए लैमेला की स्थिति एक काली पृष्ठभूमि पर सफेद डिग्री के रूप में दिखाई देती है (चित्रा 6 ए)। माइक्रोस्कोप के झुकाव अक्ष के संबंध में लैमेला के कोण पर ध्यान दिया जाना चाहिए, क्योंकि लंबवत से ~ 10 ° से अधिक दूरी झुकाव-श्रृंखला अधिग्रहण को मुश्किल बना सकती है। प्रत्येक लैमेला के स्थान पर एक मध्यम-आवर्धन मोंटाज (~ 1,500x) जैविक सामग्री का अवलोकन देगा और हस्तांतरण क्षति, क्रिस्टलीय बर्फ, या अत्यधिक सतह संदूषण की जांच करेगा (चित्रा 6 बी-डी)। यह सुनिश्चित करने के लिए उच्च-झुकाव पर भी जांच की जानी चाहिए कि कोई सतह संदूषण अधिग्रहण या फोकस क्षेत्र को अस्पष्ट नहीं करता है। अधिग्रहण क्षेत्र चुनना न केवल जैविक विशेषताओं पर निर्भर करेगा, बल्कि आसपास के क्षेत्र में बर्फ की संरचनात्मक अखंडता पर भी निर्भर करेगा, उदाहरण के लिए, दरारों से बचना, क्योंकि ये क्षेत्र बह जाएंगे, या अत्यधिक पर्दे वाले क्षेत्र, जहां एक लैमेला की मोटाई परिवर्तनीय होगी। झुकाव-श्रृंखला प्राप्त करने से पहले, लैमेला (ग्रिड नहीं) के विमान को ऑप्टिकल अक्ष के लंबवत बनाने के लिए ग्रिड पर ±10 ° पूर्व-झुकाव लागू किया जाता है। पूर्व-झुकाव की दिशा मध्यम-आवर्धन मोंटाज में लैमेला के सामने के किनारे की स्थिति (बचे हुए ऑर्गनोप्लाटिनम कोट की तलाश) से निर्धारित की जा सकती है। यहां उपयोग किए जाने वाले टीईएम (300 केवी टाइटन क्रिओस) के लिए, यदि लैमेला के सामने के किनारों को मानचित्र में इंगित किया गया है, तो इसके लिए +10 ° पूर्व-झुकाव की आवश्यकता होती है और यदि वे नीचे इंगित करते हैं, तो इसके लिए -10 ° पूर्व-झुकाव की आवश्यकता होती है। प्रत्येक ग्रिड उस अभिविन्यास के कारण अलग हो सकता है जिसमें उन्हें चिमटी में उठाया गया था और ऑटोलोडर में डाला गया था (बाएं या दाएं की ओर कटवे खंड, 180 डिग्री रोटेशन पैदा करता है)। एक अंतिम विचार पिक्सेल आकार है। नियमित रूप से, झुकाव श्रृंखला को 2.5-7 ° / पिक्सेल के आसपास एकत्र किया जाता है, ब्याज की सुविधा के आकार, परिणामी टोमोग्राफिक डेटा के लक्ष्य रिज़ॉल्यूशन और लैमेला के सतह क्षेत्र को ध्यान में रखते हुए, जो अधिग्रहण क्षेत्र के आकार को सीमित कर सकता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन जानकारी प्राप्त करने के लिए एक छोटे पिक्सेल आकार का उपयोग करना संभव है और इन नमूनों पर हमने सफलतापूर्वक जो सबसे छोटा उपयोग किया है वह 1.4 ° / पिक्सेल (डेटा नहीं दिखाया गया है) है। बहाव एक छोटे पिक्सेल आकार में अधिक स्पष्ट होगा और केवल पतली (<100 एनएम) लैमेला के लिए वास्तव में उपयुक्त है जहां अध्ययन में रिज़ॉल्यूशन को अधिकतम करना महत्वपूर्ण है।

Figure 6
चित्र 6: झुकाव श्रृंखला प्राप्त करने के लिए रुचि के सुलभ क्षेत्रों का चयन (ए) कम-आवर्धन टीईएम मानचित्र का एक खंड जिसमें लैमेला युक्त एक क्षेत्र दिखाया गया है, जो एक काली पृष्ठभूमि (लाल तीर) पर छह सफेद पायदान के रूप में दिखाई देता है। सफेद वर्ग टूटी हुई कार्बन फिल्म हैं। (बी) एक क्षतिग्रस्त और डेविट्रीफाइड लैमेला का एक मध्यम-आवर्धन मानचित्र। लैमेला (एफई) के सामने के किनारे पर ऑर्गनोप्लाटिनम कोट टूट गया है (1). लैमेला के केंद्र में क्रिस्टलीय बर्फ का एक स्पष्ट पैच है (2). आयन बीम लैमेला (बीई) के पिछले किनारे पर टूटने में विफल रहा है क्योंकि ग्रिड सलाखों के बगल में बर्फ बहुत मोटी है। लैमेला का केवल एक छोटा सा हिस्सा बीई (3) में आसपास की बर्फ से मुक्त होता है, जिससे एक वेज बनता है। मोटाई ने अलमारियों को लैमेला (4) के ऊपर काट दिया है, जो टीईएम में उच्च-झुकाव पर कोशिकाओं के दृश्य को अवरुद्ध करेगा। (सी) टीईएम में देखे गए पूरे लैमेला का मध्यम-आवर्धन मोंटाज। लैमेला से झुकाव-श्रृंखला एकत्र करते समय टाली जाने वाली विशिष्ट समस्याएं या क्षेत्र ऐसे क्षेत्र हैं: सतह संदूषण (एससी) से ढके हुए, ऑर्गनोप्लाटिनम कोट (ओपी, पीले), दरारों (सीआर और काले तीर) के पास, जैविक सामग्री (सीयू और नीले कोष्ठक के भीतर क्षेत्र) में घनत्व परिवर्तन के कारण पर्दे के साथ, और ऑर्गेनोप्लाटिनम कोट (हरे घेरे) में टूटने से कमजोर क्षेत्र। झुकाव-श्रृंखला अधिग्रहण के लिए सुलभ एकमात्र क्षेत्र दो ब्लैक-डैश्ड बॉक्स (लेबल 1 और 2) के भीतर के क्षेत्र हैं। दृश्य को उच्च-झुकाव पर जांचा जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सतह संदूषण रुचि के क्षेत्र या फोकस क्षेत्र को अस्पष्ट नहीं करता है। (डी) एक बहुत अधिक क्लीनर लैमेला का एक मध्यम-आवर्धन मोंटाज, लेकिन जिसमें अभी भी पॉलिशिंग के दौरान ऑर्गनोप्लाटिनम कोट (हरे सर्कल) के पतले होने के कारण दरारें (सीआर) हैं। यहां, रुचि के क्षेत्र को लैमेला के भीतर देखे गए सेल प्रकार द्वारा उजागर किया गया है, जो इस मामले में अलग-अलग मेरोज़ोइट्स हैं, जो लैमेला (ब्लैक-डैश्ड बॉक्स) के पीछे कार्बन परत (नारंगी) के पीछे स्थित हैं। स्केल बार, 3 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: एफआईबी-मिल्ड लैमेला से क्रायो-ईटी डेटा प्राप्त करना। (ए) एक लैमेला के एक क्षेत्र का माइक्रोग्राफ जिसमें एक लाल रक्त कोशिका होती है जिस पर हाल ही में पी फाल्सीपेरम मेरोज़ोइट द्वारा आक्रमण किया गया है। (बी) में एक ही छवि को लाल रक्त कोशिका (लाल), कई डबल-दीवार वाले इंट्रासेल्युलर पुटिकाओं (क्रमशः आंतरिक और बाहरी झिल्ली के लिए बैंगनी और नीला) और मेरोज़ोइट (हरा) मेजबान कोशिका (पीले) से प्राप्त दूसरी झिल्ली से घिरा हुआ दिखाने के लिए एनोटेट किया गया है। एक ब्लैक बॉक्स उस क्षेत्र को दर्शाता है जहां एक झुकाव-श्रृंखला का अधिग्रहण किया गया था। स्केल बार, 500 एनएम। (सी) मेरोज़ोइट के एपिकल छोर पर प्राप्त 8x बिन्ड टोमोग्राम (2.4 °/पिक्सेल) से एक्सवाई विमान में औसतन 20 केंद्रीय स्लाइस देखे गए और (डी) इसके एनोटेशन में, सेल के आसपास की दो झिल्लियों (हरे और पीले) और मेरोज़ोइट (नीले) के शीर्ष में ढेर की गई चार झिल्लियों को दिखाया गया है जो इलेक्ट्रॉन घने मशरूम के आकार की विशेषता (बैंगनी) से जुड़े हैं। एक लाल तीर शीर्ष में झिल्ली के ढेर के जंक्शन और मशरूम के आकार की विशेषता को इंगित करता है (भाग एफ, आई में भी दिखाया गया है)। एक काला तीर मेरोज़ोइट प्लाज्मा झिल्ली और परजीवी के भीतर बहु-स्तरित पुटिकाओं में से एक के बीच एक संलयन घटना को इंगित करता है (भाग एफ, ii में भी दिखाया गया है)। मेजबान लाल रक्त कोशिका झिल्ली को दिखाया गया है (लाल) और एक काली-डैश्ड रेखा एक्सजेड विमान में देखे गए क्रॉस-सेक्शन की स्थिति को दर्शाती है, जिसे (ई) में दिखाया गया है। क्रॉस-सेक्शन (ई) में विशेषताओं को रंगीन किया जाता है और भाग (डी) के समान लेबल किया जाता है, जिसमें रंगीन तीर झिल्ली की ओर इशारा करते हैं। एक काला तीर मिलिंग के बाद लैमेला पर लगाए गए स्पटर कोट की स्थिति और संकेत में लैमेला की मोटाई को इंगित करता है। भागों (सी-ई) के लिए, स्केल बार, 500 एनएम। (एफ) भाग (सी) में लाल और काले तीर के सिर द्वारा इंगित विशेषताओं का अधिक विस्तृत दृश्य, मेरोज़ोइट (आई) के शीर्ष में झिल्ली स्टैक की लिपिड द्वि-परतों में परिभाषा और मेरोज़ोइट प्लाज्मा झिल्ली के साथ बहु-स्तरित पुटिका के बीच संलयन घटना को दर्शाता है। स्केल बार, 75 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

काम का प्राथमिक फोकस मेरोज़ोइट के मार्ग को विच्छेदित करना है P. falciparum लेकिन यह देखते हुए कि अध्ययन में उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की आबादी कभी भी पूरी तरह से समरूप नहीं हो सकती है, अक्सर लैमेला के भीतर कोशिका विकास के अन्य चरण देखे गए थे। उदाहरण यहाँ दिखाया गया है (चित्र 7) में एक लाल रक्त कोशिका होती है जिस पर हाल ही में एक द्वारा आक्रमण किया गया है P. falciparum परजीवी (मेरोज़ोइट)। इस्तेमाल किया गया लैमेला 240 एनएम मोटा था और ग्रिड को टीईएम में सम्मिलन से पहले आर्गन वातावरण में प्लैटिनम के साथ हल्के से स्पटर लेपित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप सामान्य रूप से उम्मीद से थोड़ा कम कंट्रास्ट होता था। लाल रक्त कोशिका झिल्ली को कोशिका के चारों ओर इसकी संपूर्णता में पता लगाया जा सकता है। लाल रक्त कोशिका के भीतर तीन संलग्न झिल्ली-बाध्य संरचनाएं थीं, दो पुटिकाएं, प्रत्येक एक डबल झिल्ली और एक लाइटबल्ब के आकार की विशेषता (1.2 μm x 0.9 μm अपने सबसे चौड़े हिस्सों पर) से घिरा हुआ था, जो कि मेरोज़ोइट (चित्र 7A-B). दो पुटिकाओं की सामग्री लाल रक्त कोशिका की सामग्री के विपरीत समान प्रतीत होती है, यह सुझाव देते हुए कि इन पुटिकाओं में हीमोग्लोबिन हो सकता है। आक्रमण के बाद मेजबान लाल रक्त कोशिका के भीतर पुटिकाओं की उपस्थिति पहले देखी गई है।45. माना जाता है कि वे मेरोज़ोइट में रोप्ट्रीनामक स्रावी ऑर्गेनेल से लिपिड और अन्य विषाणु कारकों के स्राव से उत्पन्न होते हैं, जो आक्रमण के दौरान मेजबान लाल कोशिका में निर्वहन करते हैं। मेरोज़ोइट दो निकटता से जुड़े झिल्ली से घिरा हुआ है, जिनमें से सबसे भीतरी-संभवतः मेरोज़ोइट की मूल प्लाज्मा झिल्ली है, जिस पर कोई दिखाई देने वाली सतह कोट नहीं है, और सबसे बाहरी को मेजबान लाल कोशिका झिल्ली से प्राप्त करना चाहिए जो मेरोज़ोइट को घेरता है क्योंकि यह आक्रमण करता है। मेरोज़ोइट के साइटोप्लाज्म में कई बहु-स्तरित पुटिकाएं और शीर्ष पर झिल्ली के ढेर से सटे एक इलेक्ट्रॉन घने मशरूम के आकार की विशेषता होती है। इस क्षेत्र (2.4 ° / पिक्सेल) पर अधिग्रहित एक झुकाव-श्रृंखला से पता चलता है कि इसमें चार झिल्ली का एक ढेर होता है, जो मशरूम के आकार की विशेषता (चित्र 7C-E). आश्चर्यजनक रूप से, यह आकृति विज्ञान एक परिपक्व मेरोज़ोइट के एपिकल छोर में ऑर्गेनेल और सेलुलर संरचनाओं की सामान्य व्यवस्था से काफी अलग है। इसका आकलन करने के लिए, एक परिपक्व मेरोज़ोइट पर एपिकल छोर पर एक तुलनात्मक झुकाव-श्रृंखला (2.74 ° / पिक्सेल) एक स्किज़ोनेट से प्राप्त की गई थी, जिसे ठंड और मिलिंग से पहले ई 64 के साथ इलाज किया गया था (चित्र 8). इससे पता चलता है कि एक मेरोज़ोइट के एपिकल छोर में दो प्रमुख क्लब के आकार के स्रावी अंग होते हैं जिन्हें रोप्ट्रीज कहा जाता है जो कोशिका के एपिकल सिरे पर तीन ध्रुवीय छल्ले के एक सेट के भीतर बसे होते हैं और माइक्रोनेम नामक कई छोटे स्रावी जीवों से घिरे होते हैं। आंतरिक-सबसे ध्रुवीय अंगूठी एक डबल झिल्ली संरचना से जुड़ी होती है जो मेरोज़ोइट प्लाज्मा झिल्ली को रेखांकित करती है, जिसे आंतरिक झिल्ली परिसर कहा जाता है, जिसमें मोटर प्रोटीन होते हैं जो आक्रमण को चलाते हैं। यह दिखाया गया है कि आक्रमण के दौरान स्रावी ऑर्गेनेल की सामग्री को मेरोज़ोइट सतह पर और मेजबान लाल रक्त कोशिका में छोड़ दिया जाता है, जिससे मेजबान लाल कोशिकाओं के लिए मेरोज़ोइट्स के लगाव की सुविधा मिलती है और मोटर कॉम्प्लेक्स शुरू होता है जो आक्रमण को चलाता है।45. यहां डेटा से पता चलता है कि आक्रमण के बाद, मेरोज़ोइट में कोई अवलोकन योग्य संरचना नहीं होती है जो रोप्ट्री, माइक्रोनेम या ध्रुवीय छल्ले से मिलती-जुलती होती है, यह सुझाव देते हुए कि मेरोज़ोइट के एपिकल छोर की आकृति विज्ञान नाटकीय रूप से बदल जाता है। आक्रमण से पहले रोप्ट्री का संलयन पहले टीईएम द्वारा निश्चित, कमरे के तापमान वर्गों के रूप में दिखाया गया है।46, जो मशरूम के आकार की विशेषता के उत्पादन के अनुरूप है जिसे हम अपने आक्रमण के बाद की स्थिति मेरोज़ोइट में देखते हैं। इस सुविधा से जुड़े झिल्ली के ढेर को पहले नहीं देखा गया है और चूंकि नए आक्रमण किए गए मेरोज़ोइट में मौजूद आईएमसी का कोई संकेत नहीं है, इसलिए हम अनुमान लगाते हैं कि झिल्ली के ढेर आक्रमण पूरा होने के बाद बचे हुए आईएमसी मशीनरी के अवशेष हो सकते हैं, लेकिन इसकी पुष्टि की जानी बाकी है।

Figure 8
चित्रा 8: प्लास्टिक वर्गों के एफआईबी-मिल्ड लैमेला और टीईएम के क्रायो-ईटी द्वारा परिपक्व मेरोज़ोइट्स का एपिकल छोर। (ए) 230 एनएम मोटी लैमेला से 8x बिन्ड टोमोग्राम (2.74 ° / पिक्सेल) से औसतन 20 केंद्रीय स्लाइस एक परिपक्व मेरोज़ोइट के एपिकल छोर की विशिष्ट आकृति विज्ञान को दर्शाते हैं। स्किज़ोन्ट्स को डुबकी ठंड से पहले ई 64 के साथ इलाज किया गया था, इस प्रकार पीवी झिल्ली टूट गई है और मेरोज़ोइट्स मेजबान लाल कोशिका के भीतर निहित हैं। (बी) (ए) के समान दिखाता है, लेकिन मेजबान लाल रक्त कोशिका झिल्ली (आरसीएम, लाल), मेरोज़ोइट प्लाज्मा झिल्ली (हरा), आंतरिक झिल्ली परिसर (आईएमसी, बैंगनी), ध्रुवीय छल्ले (पीआर, काला), माइक्रोनेम (एम, पीला), रोप्ट्रीज (आर, ग्रे), और परमाणु लिफाफा (एनई, नीला) को इंगित करने के लिए एनोटेशन के साथ। एक पड़ोसी मेरोज़ोइट, जो टोमोग्राम के इस क्षेत्र में विमान से बाहर है, एक हरे त्रिकोण द्वारा इंगित किया गया है। स्केल बार, 200 एनएम। (ग) क्रायोएट द्वारा देखी गई कोशिकीय विशेषताएं प्लास्टिक खंडों में संरक्षित स्किज़ोन्ट्स के टीईएम के अनुरूप हैं। इसी तरह की सेलुलर विशेषताओं को एक स्किज़ोनेट से एक परिपक्व मेरोज़ोइट में इंगित किया जाता है जिसे यौगिक 2 के साथ इलाज किया गया है, पीवी झिल्ली टूटने से पहले प्रवेश को रोकता है। स्केल बार, 500 एनएम। (डी) एक मेरोज़ोइट का एक एनोटेट योजनाबद्ध जो भागों (ए-सी) में सेलुलर विशेषताओं को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

आयताकार मिलिंग पैटर्न (μm) के बीच संरक्षित क्षेत्र की मोटाई 30 kV पर नोमिकल आयन बीम धारा (pA)
3 300
1.5 100
0.75 50
0.3 30
0.2 - 0.06 (अंतिम पॉलिशिंग) 30*

तालिका 1: पतली लैमेला का उत्पादन करने के लिए मिलिंग रणनीति। संरक्षित क्षेत्र की मोटाई के अनुरूप आयन बीम प्रवाह को कम करके चरण-वार मिलिंग की जाती है। यह नमूना हीटिंग को सीमित करता है, डेविट्रीफिकेशन को रोकता है। * लैमेला को दोनों तरफ से समान रूप से गर्मी लागू करने के लिए समानांतर में पॉलिशिंग की जानी चाहिए, जिससे उनकी अंतिम मोटाई तक पहुंचने पर उनके झुकने या झुकने का खतरा कम हो जाता है। अन्य चरणों को क्रमिक रूप से किया जा सकता है, अगले बीम प्रवाह पर जाने से पहले, लैमेला के ऊपर और फिर लैमेला के नीचे पैटर्न को मिलिंग करना। नमूना हीटिंग को कम करने के लिए मिलिंग की स्थिति का पता लगाने के लिए ग्रिड का सर्वेक्षण 1.5 पीए बीम करंट पर किया जाना चाहिए। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

जबकि क्रायोएफआईबी-मिलिंग अधिक नियमित हो रही है, मिलिंग के लिए इष्टतम नमूने तैयार नहीं किए गए हैं; इसलिए, इस प्रोटोकॉल में अधिकांश महत्वपूर्ण कदम नमूना क्रायोएफआईबी-एसईएम तक पहुंचने से पहले होते हैं। मिलिंग का प्रयास करने से पहले सर्वोत्तम संभव नमूना तैयार करने के लिए सेल तैयारी, डुबकी ठंड, और प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा स्क्रीनिंग के कई दौर द्वारा नमूना अनुकूलन की आवश्यकता होती है। सबसे अच्छा नमूना संभव होने से न केवल सफलता की संभावना बढ़ जाती है, बल्कि उपकरणों के उपयोग को भी अनुकूलित किया जाता है। इस कारण से, अधिकांश राष्ट्रीय सुविधाओं को सबूत की आवश्यकता होती है कि उनकी मशीनों पर समय देने से पहले पर्याप्त अनुकूलन किया गया है। एक बार क्रायोएफआईबी-एसईएम के अंदर, समान रूप से पतली लैमेला का उत्पादन करने के लिए ऑर्गनोप्लाटिनम कोट की प्रभावशीलता को अधिकतम करना महत्वपूर्ण है। अंत में, धैर्य और अच्छा नमूना हैंडलिंग उपयोगकर्ता से एक शर्त कौशल है, जिसे कई दिनों तक बैठने और फिर नाजुक लैमेला युक्त ग्रिड को स्थानांतरित करने की आवश्यकता होगी। यह स्वचालित मिलिंग रणनीतियों47,48 की शुरूआत के साथ बदल सकता है, लेकिन अभी तक, पूरी मिलिंग प्रक्रिया अभी भी अधिकांश सुविधाओं में काफी हद तक मैनुअल है।

जबकि काम पूरी तरह से पी फाल्सीपेरम स्किज़ोन्ट्स पर केंद्रित था, यहां प्रस्तुत विधि को अन्य सेल प्रकारों के लिए ग्रिड तैयारी और मिलिंग को अनुकूलित करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है। विचार करने के लिए महत्वपूर्ण कारक ग्रिड पर लागू होने वाली कोशिकाओं का घनत्व, ग्रिड प्रकार (तांबा कुछ कोशिकाओं के लिए विषाक्त है), कार्बन फिल्म में छेद का आकार और अंतराल, ब्लॉटिंग समय और ब्लॉटिंग की विधि (एकल / दो पक्षीय, मैनुअल, या स्वचालित) हैं। इसके अतिरिक्त, यदि कोशिकाओं को ग्रिड (आमतौर पर एक छिद्रित कार्बन फिल्म के साथ सोने के ग्रिड) पर उगाया जा रहा है, तो सोख्ता और ठंड से पहले प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कंफ्लुएंसी की जांच की जा सकती है। मिलिंग रणनीति इस बात पर निर्भर करती है कि ग्रिड पर कोशिकाओं को कैसे जमा किया जाता है। मलेरिया संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं के लिए, ग्रिड अनिवार्य रूप से कोशिकाओं की एक अटूट परत द्वारा लेपित होता है, कुछ क्षेत्रों में मोटा और अन्य क्षेत्रों में पतला होता है। मिलिंग इस ढाल के साथ एक क्षेत्र में कई बिंदुओं पर किया जाता है जहां बर्फ की मोटाई लैमेला उत्पन्न करती है जो टोमोग्राफी के लिए उपयुक्त आकार है। यह दृष्टिकोण छोटी कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से काम करता है क्योंकि आप कई कोशिकाओं के माध्यम से एक टुकड़ा युक्त लैमेला का उत्पादन कर सकते हैं। बड़ी कोशिकाओं या कोशिकाओं के झुरमुट के लिए, यह मामला हो सकता है कि एक सेल या सेल क्लंप एक लैमेला का उत्पादन कर सकता है।

ग्रिड हैंडलिंग और नमूना स्थानांतरण इस वर्कफ़्लो की मुख्य चुनौतियों में से एक है। लैमेला टूटने या दरारों के कारण खो सकता है, जीव विज्ञान को प्रभावित करने वाली कलाकृतियों को पर्दे पर उतारना, अत्यधिक सतह संदूषण, साथ ही टीईएम के भीतर ग्रिड अभिविन्यास समस्याओं के कारण, ग्रिड को पुनर्स्थापित करने के लिए एक अतिरिक्त हैंडलिंग कदम की आवश्यकता होती है। नुकसान की डिग्री दिन-प्रतिदिन और ग्रिड-टू-ग्रिड से भिन्न होती है, लेकिन समय के साथ अभ्यास और हैंडलिंग अनुभव के माध्यम से इसमें सुधार होता है। इस अध्ययन में, यह पाया गया कि लैमेला को नष्ट किए बिना कई बार ऑटोलोडर में ग्रिड को सावधानीपूर्वक पुन: स्थापित किया जा सकता है और इससे कभी-कभी सतह की बर्फ को धोने का लाभ होता है। इस वर्कफ़्लो की एक और मुख्य सीमा लैमेला का उत्पादन करने में लगने वाला समय है। चूंकि उत्पादन धीमा है, इसलिए उचित रूप से अनुकूलित नमूना होना महत्वपूर्ण है, जिससे मिलिंग यथासंभव कुशल हो सके।

विट्रियस जैविक नमूनों के एफआईबी-मिलिंग के लिए कई अनुकूलन हाल ही में पेश किए गए हैं। एक गेम-चेंजर क्रायोएफआईबी-एसईएम चैंबर के भीतर क्रायोजेनिक रूप से ठंडा लिफ्ट-आउट टूल का कार्यान्वयन है जो सामग्री के बड़े ब्लॉकों को उच्च दबाव वाले जमे हुए नमूनों से मिलाने में सक्षम बनाता है। ब्लॉकों को धातु की छड़ से जोड़ा जा सकता है या ग्रिपर में उठाया जा सकता है और एक विशेष रूप से संशोधित ईएम ग्रिड युक्त दूसरी नमूना स्थिति में ले जाया जा सकता है। ब्लॉकों को तब ऑर्गनोप्लाटिनम के साथ लेपित किया जा सकता है और लैमेला उत्पन्न करने के लिए मिल किया जा सकता है। उच्च दबाव वाली जमी हुई सामग्री से लैमेला को मिलाने की क्षमता का मतलब है कि बहुत बड़ी कोशिकाओं और ऊतकों को संसाधित किया जा सकता है, विशेष रूप से कोररिलेटिव फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी12 द्वारा क्षेत्रों को लक्षित किया जा सकता है। एफआईबी-मिलिंग विधि के अन्य हालिया अनुकूलन में नमूना16 को वेज प्री-मिलिंग करके पर्दे की कलाकृतियों को कम करना, माइक्रोफ्लुइडिक क्रायो-फिक्सेशन49 और सेल वितरण50 में सुधार के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड की फोटो-माइक्रोपैटर्निंग शामिल है। इसके अलावा, यह प्रदर्शित किया गया है कि लैमेला के दोनों तरफ मिलिंग माइक्रो-विस्तार अंतराल आसपास के नमूने द्वारा संपीड़न को कम कर सकता है क्योंकि यह अपनी अंतिम पतलीता51 तक पहुंचता है। यह विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब निरंतर सेल परतों को मिलिंग किया जाता है, जैसे कि इस अध्ययन में नमूना, जहां लैमेला का झुकना कभी-कभी अंतिम पॉलिशिंग चरण के दौरान देखा जाता है।

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का भविष्य संभवतः उप-टोमोग्राम औसत द्वारा सीटू आणविक संरचनाओं का निर्धारण होगा और एफआईबी-मिलिंग एक महत्वपूर्ण उपकरण है जो इस प्रकार के वर्कफ़्लो के लिए विट्रस जैविक नमूनों के उत्पादन की सुविधा प्रदान करेगा। जबकि एफआईबी-मिलिंग अभी भी जैविक अनुप्रयोगों के लिए अपनी प्रारंभिक अवस्था में है, विधियों का विकास अकादमिक और राष्ट्रीय सुविधाओं दोनों में शोधकर्ताओं की कड़ी मेहनत के कारण तेजी से हो रहा है, साथ ही अनुसंधान का समर्थन करने के लिए क्रायोएफआईबी-एसईएम प्रौद्योगिकी विकसित करने में वाणिज्यिक निवेश भी है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को वेलकम ट्रस्ट (212916 / जेड / 18 / जेड) द्वारा पूरे या आंशिक रूप से वित्त पोषित किया गया था। खुली पहुंच के उद्देश्य से, लेखक ने इस सबमिशन से उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए एक सीसी बीवाई सार्वजनिक कॉपीराइट लाइसेंस लागू किया है।

यह परियोजना जिसके लिए इस पद्धति को विकसित किया गया था, को हेलेन आर सैबिल, रोलैंड ए फ्लेक और माइकल जे ब्लैकमैन को दिए गए मेडिकल रिसर्च काउंसिल अनुदान एमआर / P010288/1 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। फाल्सीपेरम की संस्कृतियों को फ्रांसिस क्रिक इंस्टीट्यूट में उगाया गया था, माइकल जे ब्लैकमैन के समूह के सदस्यों के समर्थन से। सेर यिंग (मिशेल) टैन को पतले रक्त स्मीयर में यौगिक 2 और ई 64-उपचारित स्किज़ोन्ट्स की छवियां प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। अधिकांश लैमेला का उत्पादन ईबीआईसी में कर्मचारियों के समर्थन से किया गया था और हम अनुसंधान प्रस्ताव NT21004 पर स्किओस डुअल-बीम क्रायोएफआईबी-एसईएम तक पहुंच के लिए आभारी हैं। लेखक सीयूआई के भीतर एफआईबी-मिलिंग तकनीक के विकास को जारी रखने में रॉयल सोसाइटी इंडस्ट्री फैलोशिप योजना (आईएनएफ\R2\202061) के समर्थन को भी स्वीकार करते हैं। लेखक इस मेथड्स पेपर के संबंध में उपयोगी चर्चा ओं और परियोजना की निगरानी के लिए हेलेन आर साइबिल को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
c-clips Thermo Fisher Scientific 1036171
Clipping station Thermo Fisher Scientific n/a Direct quote from Thermo
Clipping station Sub-angstrom CSA-01
Compound 2 n/a n/a Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc
Cryo-FIB specific autogrid rims Thermo Fisher Scientific 1205101
E64 Sigma E3132
Emitech K100X glow discharge unit Quorum n/a
Gibco RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 12633012 Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements
Giemsa Stain VWR International 350864X
Glass slides Thermo Fisher Scientific 11562203
Grid boxes Sub-angstrom PB For clipped grids
Grid boxes Thermo Fisher Scientific n/a For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific
Grid boxes Agar Scientific AGG3727
Home-made manual plunge freezing rig n/a n/a With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.
Human blood n/a n/a UK National Blood and Transplant service
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system JEOL n/a FIB-SEM
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage Leica n/a sputter coater
Leica EM ACE900 Leica n/a e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.
Linkam cryo-stage for light microscope Linkam Model No. CMS196 Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.
Methanol Sigma 179957
Nikon Eclipse E200 light microscope Nikon n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.
Percoll VWR International 17-0891-01 Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids Quantifoil N1-C17nCuH2-01 100 pack
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids Quantifoil N1-C17nCu20-01 100 pack
Quorum PP3010 prep-chamber Quorum n/a sputter coater
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage. FEI n/a FIB-SEM
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen Viking Direct ND538522
TFS Titan Krios 300 kV TEM Thermo Fisher Scientific n/a TEM equipped with a K2 or K3 camera.
Whatmann grade 1 filter paper Sigma WHA1001150
Zeiss Axio Scope A1 light microscope Zeiss n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.

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References

  1. Baumeister, W. From proteomic inventory to architecture. FEBS Letters. 579 (4), 933-937 (2005).
  2. Rigort, A., Villa, E., Bäuerlein, F. J. B., Engel, B. D., Plitzko, J. M. Integrative approaches for cellular cryo-electron tomography: Correlative imaging and focused ion beam micromachining. Methods in Cell Biology. 111, 259-281 (2012).
  3. Oikonomou, C. M., Chang, Y. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14, 205-220 (2016).
  4. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  5. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
  6. Narayan, K., Subramaniam, S. Focused ion beams in biology. Nature Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).
  7. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  8. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  9. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: Focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (5), 771-777 (2013).
  10. Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180 (2), 318-326 (2015).
  11. de Winter, D. A. M., et al. In-situ integrity control of frozen-hydrated, vitreous lamellas prepared by the cryo-focused ion beam-scanning electron microscope. Journal of Structural Biology. 183 (1), 11-18 (2013).
  12. Schaffer, M., et al. A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue. Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).
  13. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  14. Albert, S., et al. Proteasomes tether to two distinct sites at the nuclear pore complex. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 114 (52), 13726-13731 (2017).
  15. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705 (2018).
  16. Schaffer, M., et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).
  17. Szwedziak, P., Wang, Q., Bharat, T. A. M., Tsim, M., Löwe, J. Architecture of the ring formed by the tubulin homologue FtsZ in bacterial cell division. eLife. 3, 04601 (2014).
  18. Carlson, L. A., et al. Cryo electron tomography of native HIV-1 budding sites. PLOS Pathogens. 6 (11), 1001173 (2010).
  19. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nature Communications. 11 (1), 5885 (2020).
  20. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  21. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  22. Murphy, G. E., et al. Correlative 3D imaging of whole mammalian cells with light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 176 (3), 268-278 (2012).
  23. Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2012).
  24. Spehner, D., et al. Cryo-FIB-SEM as a promising tool for localizing proteins in 3D. Journal of Structural Biology. 211 (1), 107528 (2020).
  25. Kamino, T., Yaguchi, T., Ohnishi, T., Ishitani, T., Osumi, M. Application of a FIB-STEM system for 3D observation of a resin-embedded yeast cell. Journal of Electron Microscopy. 53 (5), Tokyo. 563-566 (2004).
  26. Han, H., Zuber, B., Dubochet, J. Compression and crevasses in vitreous sections under different cutting conditions. Journal of Microscopy. 230, Pt 2 167-171 (2008).
  27. Matias, V. R. F., Al-amoudi, A., Dubochet, J., Beveridge, T. J. Cryo-transmission electron microscopy of frozen-hydrated sections of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (20), 6112-6118 (2003).
  28. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150 (1), 109-121 (2005).
  29. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. The EMBO Journal. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  30. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: A new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1-2), 43-51 (2006).
  31. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 172 (2), 180-190 (2010).
  32. Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. -J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryoelectron microscopy of vitrified specimens. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer. Berlin Heidelberg. 114-131 (1987).
  33. Hsieh, C., Schmelzer, T., Kishchenko, G., Wagenknecht, T., Marko, M. Practical workflow for cryo focused-ion-beam milling of tissues and cells for cryo-TEM tomography. Journal of Structural Biology. 185 (1), 32-41 (2014).
  34. Harapin, J., et al. Structural analysis of multicellular organisms with cryo-electron tomography. Nature Methods. 12 (7), 634-636 (2015).
  35. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 180 (3), 572-576 (2012).
  36. Duyvesteyn, H. M. E., et al. Machining protein microcrystals for structure determination by electron diffraction. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 115 (38), 9569-9573 (2018).
  37. Blackman, M. J. Purification of Plasmodium falciparum merozoites for analysis of the processing of merozoite surface protein-1. Microbes as Tools for Cell Biology. 45, Academic Press. London, UK. 213-220 (1995).
  38. Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2 - anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  41. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  42. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  43. Turoňová, B., Schur, F. K. M., Wan, W., Briggs, J. A. G. Efficient 3D-CTF correction for cryo-electron tomography using NovaCTF improves subtomogram averaging resolution to 3.4 Å. Journal of Structural Biology. 199 (3), 187-195 (2017).
  44. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3d correlative microscopy. Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).
  45. Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host & Microbe. 9 (1), 9-20 (2011).
  46. Hanssen, E., et al. Electron tomography of Plasmodium falciparum merozoites reveals core cellular events that underpin erythrocyte invasion. Cellular Microbiology. 15 (9), 1457-1472 (2013).
  47. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  48. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife. 9, 52286 (2020).
  49. Fuest, M., et al. In situ microfluidic cryofixation for cryo focused ion beam milling and cryo electron tomography. Scientific Reports. 9 (1), 19133 (2019).
  50. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  51. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208 (3), 107389 (2019).

Tags

वापसी अंक 174 एफआईबी-मिलिंग क्रायोएफआईबी-एसईएम लैमेला टोमोग्राफी क्रायोईटी क्रायोईएम प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम।

Erratum

Formal Correction: Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography
Posted by JoVE Editors on 09/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. The Authors section was updated from:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

to:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
M. Alejandra Carbajal1
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए दोहरी-बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विट्रियस जैविक नमूनों से लैमेला तैयार करना
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Bisson, C., Hecksel, C. W.,… More

Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Carbajal, M. A., Fleck, R. A. Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (174), e62350, doi:10.3791/62350 (2021).

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