Preparação de Lamelas a partir de Amostras Biológicas Vítreas Usando um Microscópio Eletrônico de Varredura de Feixe Duplo para Tomografia Crio-Eletrônica

Summary

Usando fresagem por feixe de íons focalizado para produzir lamelas vítreas on-grid a partir de amostras biológicas congeladas por imersão para tomografia crio-eletrônica.

Abstract

Apresenta-se aqui um protocolo para o preparo de crio-lamelas a partir de grades congeladas por imersão de eritrócitos humanos infectados por Plasmodium falciparum, que poderia ser facilmente adaptado para outras amostras biológicas. Os princípios básicos para a preparação de amostras, moagem e visualização de lamelas são comuns a todos os instrumentos e o protocolo pode ser seguido como um guia geral para a preparação de crio-lamelas em grade para microscopia crioeletrônica (cryoEM) e tomografia crioeletrônica (cryoET). As grades de microscopia eletrônica que suportam as células são congeladas em etano líquido resfriado por nitrogênio líquido usando um freezer de imersão manual ou automatizado e, em seguida, rastreadas em um microscópio de luz equipado com um estágio criográfico. Grades congeladas são transferidas para um microscópio eletrônico de criovarredura equipado com um feixe de íons focalizado (cryoFIB-SEM). As grades são rotineiramente revestidas com pulverização antes da fresagem, o que ajuda na dispersão do acúmulo de carga durante a fresagem. Alternativamente, um revestidor rotativo de feixe eletrônico pode ser usado para aplicar uma camada de carbono-platina às grades, cuja espessura exata pode ser controlada com mais precisão. Uma vez dentro do cryoFIB-SEM, um revestimento adicional de um composto organoplatina é aplicado à superfície da rede através de um sistema de injeção de gás (GIS). Esta camada protege a borda frontal da lamela à medida que é fresada, cuja integridade é crítica para alcançar lamelas uniformemente finas. As regiões de interesse são identificadas via MEV e a fresagem é realizada de forma escalonada, reduzindo a corrente do feixe de íons à medida que a lamela atinge a transparência eletrônica, a fim de evitar a geração excessiva de calor. Uma grade com múltiplas lamelas é então transferida para um microscópio eletrônico de transmissão (MET) sob condições criogênicas para aquisição em série tilt. Um fluxo de trabalho robusto e livre de contaminação para a preparação de lamelas é uma etapa essencial para técnicas a jusante, incluindo crioEM celular, crioET e média de subtomograma. O desenvolvimento dessas técnicas, especialmente para levantamento e fresagem de amostras congeladas de alta pressão, é de alta prioridade no campo.

Introduction

Somente o conteúdo celular de amostras biológicas com <500 nm de espessura pode ser obtido efetivamente por microscopia eletrônica de transmissão (MET) em temperaturas criogênicas, limitando a gama de espécimes a vírus, procariontes, organismos unicelulares simples e regiões mais finas de células eucarióticas^maiores1. A fresagem por feixe de íons focalizado na grade (FIB) permite que amostras biológicas congeladas por imersão mais espessas sejam desbastadas para lamelas transparentes de elétrons a temperaturas criogênicas (< -150 °C). As lamelas resultantes são então transferidas para um MET para visualização e coleta de dados tomográficos, permitindo reconstruções 3D de alta resolução das características celulares e moleculares dentro das células (para revisões ver Rigort et al., 2012², Oikonomou et al., 2016³ e Wagner et al., 2020⁴).

A moagem FIB surgiu no campo das ciências dos materiais, onde as amostras são rotineiramente desbastadas para prepará-las para análise a jusante⁵. É realizado em um microscópio eletrônico de varredura (MEV), que possui duas colunas ópticas: óptica convencional de varredura eletrônica e uma segunda coluna contendo óptica capaz de gerar e controlar finamente um feixe de íons focalizados (FIB) - chamado de FIB-SEM. Isso permite que uma região específica da amostra seja ablidada por íons gerados por uma fonte de gálio, removendo o excesso de material e deixando para trás uma lamela⁶. O processo de moagem é guiado por imagens por MEV da topografia da amostra, que é usada para localizar regiões de interesse e monitorar o progresso da moagem. Para aplicações biológicas, a configuração básica é basicamente a mesma, mas a moagem é realizada em temperaturas criogênicas. Isso exigiu que os FIB-SEMs padrão fossem adaptados para ter estágios crio-resfriados que mantêm temperaturas constantes e baixas taxas de contaminação da superfície, bem como bloqueios de ar para facilitar a transferência de amostras sem desvirtuamento ou contaminação. Os ônibus espaciais de amostra também foram modificados para permitir que uma variedade de diferentes suportes sejam montados dentro do cryoFIB-SEM, incluindo grades TEM, planchettes e capilares. Vários grupos-chave de pesquisadores têm sido centrais para o desenvolvimento desses métodos e para os contínuos avanços tecnológicos nessa área7,8,9,10,11,12. Soluções comerciais estão agora mais amplamente disponíveis para moagem biológica de FIB em temperatura criogênica e a moagem on-grid de lamelas está se tornando mais rotineira, dada uma amostra otimizada.

Uma gama de técnicas de temperatura ambiente e crioEM pode ser usada para visualizar informações celulares em todas as escalas de vida, desde organismos multicelulares inteiros em resolução modesta até a compreensão do contexto de processos complexos no nível celular e, em detalhes ainda maiores, até a determinação de in situ estruturas moleculares^{13,14,15,16,17,18,19}. As técnicas clássicas de temperatura ambiente incluem a seccionação de células e tecidos fixos e corados, embutidos em resina por ultramicrotomia para análise da morfologia celular por TEM (para revisão ver Studer et al., 2008²⁰). Técnicas alternativas têm sido desenvolvidas explorando o espalhamento secundário de elétrons por MEV para obter imagens da superfície de blocos de células preservadas, antes de remover progressivamente o material com uma faca (serial block face imaging) ou um feixe de íons focalizado^21,22,23. Esta técnica também foi implementada com sucesso em temperaturas criogênicas (conhecidas como imagens criovolume) com uma crioFIB-MEV em blocos vítreos e não corados de células ou tecidos²⁴. Alternativamente, lamelas mais espessas (~15 μm de espessura) podem ser fresadas e estudadas por imagens STEM²⁵. Usando essas técnicas, blocos inteiros contendo muitas células podem ser fotografados para coletar informações populacionais ou um órgão/organismo inteiro pode ser fotografado e reconstruído em 3D. No entanto, para acessar informações moleculares de alta resolução das células, as amostras precisam ser preservadas em um estado quase nativo, congelado-hidratado e, portanto, precisam ser preparadas sob condições criogênicas. A microscopia crioeletrônica de seções vítreas (CEMOVIS) é uma técnica pela qual blocos congelados de alta pressão de material biológico são seccionados sob condições criogênicas com um ultramicrótomo. Isso produz fitas de crioseções (40-100 nm de espessura)²⁶, que são anexados a uma grade EM e fotografados no MET. No entanto, a interação física da faca com a amostra vítrea causa artefatos de fenda e compressão que podem distorcer severamente a estrutura celular^27,28,29,30. Seções mais grossas são mais propensas a esses artefatos, tornando impraticável o uso de seções mais grossas do que ~70 nm²⁶. Essa limitação restringe muito a visão 3D da estrutura biológica no tomograma. A moagem FIB em temperaturas criogênicas não experimenta esses problemas, mas tem seus próprios artefatos causados por taxas de moagem diferenciais em partes do corpo-de-prova, levando a espessuras variáveis dentro de uma lamela - chamada de cortina. Esse problema é amenizado pela aplicação de uma camada de organoplatina aplicada através de um sistema de injeção de gás (SIG), que protege a borda frontal da lamela durante a fresagem³¹. O limite superior da espessura da amostra para a fresagem FIB na grade é definido pela capacidade de mergulhar, congelar o corpo de prova, mantendo-o vítreo³², embora, com a introdução de técnicas de cryo lift-out e transportadores de amostras adaptados para amostras biológicas, a moagem FIB também possa ser usada para processar amostras congeladas de alta pressão^31,33,34,35. Além disso, as amostras congeladas de imersão não podem ser muito finas, pois deve haver material biológico suficiente para gerar uma lamela de tamanho razoável que forneça área de superfície suficiente para coletar séries de inclinação na ampliação necessária. Esse problema pode ser amenizado pela moagem de aglomerados de células menores, como bactérias ou leveduras. A espessura final da lamela (~100-300 nm) é geralmente ditada pela integridade da amostra e pela estratégia de fresagem. Lamelas mais finas são melhores para trabalhos estruturais de alta resolução, como a média do subtomograma, mas lamelas mais espessas contêm volumes celulares muito maiores do que podem ser alcançados pelo CEMOVIS, fornecendo mais contexto celular em uma amostra próxima à nativamente preservada. A moagem FIB também pode ser usada para finar cristais de proteína congelados por imersão para estudos de difração de elétrons³⁶.

A moagem FIB de células vítreas vale a pena o tempo e o esforço para realizar se a questão científica exigir detalhes moleculares de alta resolução de espécimes quase nativos in situ. Com acesso a mais instalações para a produção rotineira de lamelas, a etapa de limitação da taxa é muitas vezes a otimização da amostra antes da moagem, onde o tempo deve ser tomado para garantir que a amostra seja vítrea e uma espessura apropriada para produzir lamelas robustas e uniformemente finas. Descreve-se aqui a otimização da amostra para hemácias humanas congeladas com FIB infectadas com parasitas do Plasmodium falciparum , o agente causador da malária, mas essa abordagem poderia ser adaptada para qualquer amostra.

Protocol

O sangue humano foi obtido de doadores anônimos através do Serviço Nacional de Sangue e Transplante do Reino Unido e é usado dentro de 2 semanas após o recebimento. Não é necessária aprovação ética para sua utilização.

1. Preparação e congelamento por imersão de hemácias infectadas por Plasmodium falciparum

1. Isolar esquizontos maduros por centrifugação (1.580 x g) sobre um meio de gradiente de densidade isotônico de 70% (v/v) (para procedimentos padrão sobre como cultivar estágios sanguíneos assexuados de Plasmodium falciparum 3D7 em eritrócitos humanos, ver Blackman M.J., 1995³⁷).
2. Fixar os filmes finos de sangue secos ao ar em uma lâmina de vidro com metanol a 100% para verificar a homogeneidade morfológica dos esquizontos antes de corar com coloração de Giemsa a 10% em tampão fosfato 6,7 mM, pH 7,1.
   NOTA: Para enriquecer a preparação para esquizontos estacionados em pontos específicos de saída, os esquizontos podem ser sincronizados com os inibidores dos compostos 2 e E64 (consulte Resultados Representativos e Figura 1 para obter uma explicação do efeito desses inibidores).
   CUIDADO: O Plasmodium falciparum é um patógeno humano e só deve ser manuseado em uma instalação de contenção adequada seguindo as diretrizes locais de saúde e segurança.
3. Centrifugar suavemente os esquizontes (240 x g) para pelletá-los e ressuspender em 2x volume do pellet celular do meio RPMI, resultando em uma suspensão de hematócrito a 50%.
4. Em uma plataforma de congelamento manual, aplique 2,5 μL de esquizontos no lado de carbono de uma descarga de brilho (Use configurações de unidade de descarga de brilho de 60 s, 30 mA no ar, tratando apenas o lado de carbono da grade) Grade de cobre de malha 200 com um filme de carbono de 2/4 holey e mancha por ~20 s da parte de trás da grade usando papel de filtro de grau 1 com uma borda rasgada. Mergulhe em etano líquido resfriado por nitrogênio líquido e transfira as grades para armazenamento (consulte Tabela de materiais para equipamentos usados neste estudo).
   NOTA: O experimento pode ser pausado aqui, e as grades podem ser armazenadas sob nitrogênio líquido indefinidamente.
   CUIDADO: O nitrogênio líquido é um asfixiante e causa congelamento; manusear com cuidado em um ambiente adequado com monitoramento de oxigênio.
   CUIDADO: O etano líquido causa queimaduras graves e é inflamável; Utilização num exaustor de fumos longe de fontes de ignição.
   NOTA: Mergulhar esquizontes congelados não são mais viáveis. Isso foi determinado incubando o sangue humano com várias grades de ouro de esquizontes congelados por imersão descongelados e descongelados pelo ar e não observando nenhum crescimento do parasita após vários dias, em comparação com controles não congelados. As grades congeladas de esquizontos são, portanto, seguras para manusear fora das instalações de contenção usando procedimentos normais de segurança e descontaminação (luvas, esterilização de superfícies/ferramentas com etanol >70% e descarte de grades em etanol >70%).
5. Grades de tela usando um estágio criogênico para um microscópio de luz, prestando especial atenção ao gradiente de gelo através da grade. Nas áreas mais finas de gelo, verifique os quadrados de grade individuais para cobertura celular.
   NOTA: Os melhores quadrados devem ter uma célula de espessura no centro do quadrado da grade (Figura 2). Isso garante que uma lamela possa ser fresada no centro do quadrado sem atingir o gelo mais espesso nas bordas contra as barras de grade. O experimento pode ser pausado aqui, e as grades podem ser armazenadas sob nitrogênio líquido indefinidamente. Se as células carregam um marcador fluorescente, as grades também podem ser rastreadas por crioCLEM para localizar posições X/Y de interesse, que podem ser correlacionadas com a localização da grade no crioFIB-MEV para fresagem direta.

2. Moagem FIB on-grid de células congeladas por imersão

1. Marque a frente das jantes de grelha automática específicas para crioFIB com uma caneta de marcação preta indelével para indicar o centro da secção de corte e o lado oposto da jante (Figura 3). Configure a estação de recorte e as grades de clipe nos anéis marcados de lado para baixo.
2. Carregue grades no vaivém cryoFIB-SEM (normalmente 2 grades, dependendo do vaivém) e aplique uma camada de pulverização de platina em uma atmosfera de argônio (5 x 10-2 mbar) (5 mA para 60 s ^- a espessura é variável) ou uma camada rotativa de feixe eletrônico de carbono/platina (~4 nm de espessura) na superfície das células.
   NOTA: Ambos os tipos de revestimentos auxiliam a dispersão da carga durante a obtenção de imagens por MEV. O benefício do revestidor rotativo e-beam é que a espessura exata do revestimento pode ser especificada.
3. Coloque o vaivém no microscopia eletrônica de varredura e avalie a distribuição celular em cada grade por MEV a 5 kV (13 pA ou 25 pA). Faça uma visão geral de baixa ampliação (~100x) para observar os gradientes de gelo em toda a grade. Em seguida, tire imagens de maior ampliação (~5.000x) para examinar quadrados de grade individuais e identificar as áreas da grade com características celulares visíveis e baixa contaminação da superfície para moer.
4. Aplicar uma camada de organoplatina de >2 μm na superfície de cada grelha utilizando o sistema de injecção de gás (SIG). Para fazer isso, insira a agulha GIS na câmara acima da grade e aqueça a fonte de organoplatina a uma temperatura definida por um tempo definido (por exemplo, ~27 °C por 3-10 s) para produzir um fluxo de vapor.
   NOTA: O ângulo de aplicação, a temperatura e o tempo do revestimento de organoplatina através da agulha GIS devem ser otimizados para maximizar um revestimento uniforme. Isso dependerá do crioFIB-MEV específico usado (consulte Resultados Representativos para maiores explicações).
5. Incline a amostra de modo que o plano da grade seja ~10° do ângulo de incidência do feixe de íons e mova o centro de um quadrado de grade adequado para ser visto nas imagens MEV e FIB.
6. Pesquise a grade usando o feixe de íons em baixa corrente (nominalmente 1,5 pA, 30 kV) e vá para uma ampliação alta o suficiente (~7.000x) para visualizar as células no centro de um quadrado de grade. Coloque a amostra em foco na primeira corrente de fresagem (300 pA) e corrija o astigmatismo. Ajuste o brilho e o contraste e, em seguida, marque dois padrões retangulares para moer, um acima e outro abaixo de uma região protegida de 3 μm de espessura, cujo centro é o local desejado da lamela final.
   Observação : a largura escolhida dos padrões dependerá da topografia da camada de célula circundante e do tamanho da célula. 7-20 μm é uma largura adequada para esquizontes, mas lamelas mais largas levam mais tempo para moer. A altura escolhida dos padrões para a primeira etapa de fresagem depende da espessura da amostra, iniciando em torno de 6 μm; Isso pode precisar ser ajustado durante a fresagem. A fresagem é realizada direcionalmente das bordas externas superior e inferior dos padrões em direção à face da lamela. Isso pode ser feito em paralelo, onde ambos os padrões são fresados simultaneamente ou sequencialmente, primeiro removendo o material de cima da lamela e depois de baixo.
7. Iniciar a fresagem na primeira corrente; monitorar o progresso ao vivo na visão do feixe de íons e intermitentemente por MEV (5 kV, 13 ou 25 pA). Verifique se o feixe de íons rompeu a amostra acima e abaixo da região protegida. Caso contrário, aumente a altura dos padrões retangulares para remover mais material. Pare quando a superfície acima e abaixo da lamela estiver completamente lisa na visão do feixe de íons.
   NOTA: O feixe de íons rompeu a amostra acima e abaixo da região protegida quando o interior dos padrões retangulares não contém características no plano focal. Alguns recursos, como barras de grade, podem estar visíveis fora de foco em segundo plano.
8. Mudança para a próxima corrente de fresagem (100 pA); Foco e ajuste o brilho/contraste. Diminua o espaço entre os dois padrões retangulares para 1,5 μm e diminua a altura do padrão para cobrir apenas o material não fresado. Comece a fresar na nova corrente até que a superfície acima e abaixo da lamela esteja completamente lisa.
9. Repita este processo passo a passo até atingir uma espessura de 0,3 μm, reduzindo a corrente do feixe de íons a cada vez de acordo com o esquema de moagem da Tabela 1.
10. Moer várias lamelas (a quantidade depende da espessura da amostra e do tempo disponível) em uma ou ambas as grades até uma espessura de 0,3 μm, registrar a posição X/Y/Z de cada lamela e reservar ~1-2 h no final da sessão para polir as lamelas até sua espessura final (60-200 nm).
11. Faça uma visão geral de MEV de baixa ampliação de toda a grade e planeje uma rota de polimento partindo de lamelas na frente da grade (mais próximas da fonte do feixe de íons) até lamelas na parte de trás da grade (mais distante da fonte do feixe de íons) (Figura 5).
    NOTA: Isso reduz a reposição de material ablado, de volta à superfície das lamelas polidas.
12. Reduza o espaço entre os dois padrões retangulares para 100-200 nm e inicie a etapa final de polimento com uma corrente de feixe de íons de 30 pA. Monitore o progresso por MEV a 2-3 kV (13 pA, permanência = 300 n, 3072 x 2048, ~2 s para um quadro completo) e pare de polir quando o contraste é perdido na lamela por MEV ou quando a camada organoplatina da própria lamela começa a perder integridade.
13. Antes de remover as grades, adquira uma imagem SEM de baixa ampliação de toda a grade e salve as imagens de cada lamela. Use-os para cruzar a grade mais tarde no TEM. Pause o experimento aqui e armazene as grades com lamelas sob nitrogênio líquido - manuseie com cuidado.
    NOTA: As grades podem ser levemente revestidas após a remoção do cryoFIB-SEM, o que pode ajudar a limitar a deriva e a carga no MET em alta ampliação, mas isso deve ser feito com cautela, pois muito revestimento de pulverização pode obscurecer o conteúdo biológico dentro das lamelas. É possível rastrear lamelas para fluorescência nesta fase; no entanto, a obtenção de sinal suficiente dependerá da abundância da proteína marcada dentro da espessura da lamela. Muito cuidado deve ser tomado ao manusear as grades para limitar os danos às lamelas e evitar a contaminação da superfície.

3. Aquisição da série Tilt e visão geral do processamento de dados

1. Carregue as grades no MET, alinhando a direção de fresagem perpendicularmente ao eixo de inclinação do estágio.
   NOTA: O alinhamento das grades é feito a olho nu usando as marcas no aro da grade automática. Uma margem de erro de ~10° é aceitável, caso contrário, as paredes da trincheira de ambos os lados da lamela podem obscurecer a lamela à medida que a grade é inclinada.
2. Adquira um mapa de baixa ampliação (~150x) de toda a grade e localize as lamelas; Em seguida, adquira um mapa de ampliação média (~1.500x, dependendo do tamanho da lamela) de cada lamela e localize as áreas de interesse.
3. Pré-incline a grade em ±10° para tornar o plano da lamela (não a grade) perpendicular ao eixo óptico
   NOTA: A direção da pré-inclinação pode ser determinada pela posição da borda frontal das lamelas (procurando a sobra sobre a camada organoplatina) nos mapas de ampliação baixa e média. Para o MET usado aqui, as grades exigem uma pré-inclinação de +10° se as bordas frontais das lamelas apontarem para cima nos mapas e requerem uma pré-inclinação de -10° se apontarem para baixo. Cada grade pode ser diferente devido à forma como foram pegas e inseridas no carregador automático.
4. Adquira a série de inclinação simétrica de dose³⁸ (por exemplo, -54° a +54° com um incremento de 3-5°) em um tamanho de pixel que permita o campo de visão e a resolução necessários para a região de interesse. Use um intervalo de valores de desfocagem entre -2 e -5 μm. Colete filmes com 3-10 quadros em cada incremento e, para isso, ajuste esses parâmetros dependendo do tamanho do pixel para acumular uma dose total de ~150 e^-/Ų (para um MET de 300 kV).
   NOTA: Rachaduras na lamela devem ser evitadas, pois essas regiões podem se afastar. A contaminação da superfície também deve ser evitada, pois pode obscurecer a região de interesse ou a área de foco em alta inclinação.
5. Corrija o movimento dos filmes usando um programa como o MotionCor2³⁹. Aplicar um filtro de ponderação de dose às imagens corrigidas (e^-/imagem acumulada)⁴⁰ e estimar o desfoco de cada imagem usando um programa como o CTFFIND4⁴¹.
6. Use o alinhamento fiducial-less (patch tracking) em um programa como o etomo (IMOD)⁴² para calcular o alinhamento e a relação angular das imagens em tilt-series.
7. Insira as informações de alinhamento e rotação, juntamente com os valores de desfocagem em um programa que pode aplicar a correção de CTF tridimensional, por exemplo, NovaCTF⁴³. Calcule um tomograma corrigido para obter tomogramas de saída com fatores de ligação relevantes para a análise a jusante.
8. Analise as reconstruções e prepare-se para qualquer processamento downstream, por exemplo, filtragem, segmentação ou média de subtomograma.

Representative Results

Preparação de esquizontos de P. falciparum para congelamento por imersão
Os inibidores dos compostos 2 e E64 são usados para estancar esquizontos em diferentes estágios de saída, gerando uma população enriquecida de esquizontos para estudo posterior. Isso é importante porque, sem uma técnica correlativa complementar, a fresagem de alvos subcelulares específicos ou tipos celulares é um desafio, pois o processo é essencialmente cego. O composto 2 é um inibidor da proteína quinase que paralisa a saída antes da ruptura do vacúolo. Os esquizontes podem ser sincronizados no composto 2 por 4 h, depois lavados com o meio composto 2-free para remover o inibidor, momento em que os esquizontes amadurecerão e sairão após aproximadamente 30 min. Alternativamente, esquizontos sincronizados com o composto 2 podem ser lavados em E64, um inibidor irreversível de cisteína protease de amplo espectro, e incubados por aproximadamente 1 h para estancar a saída após o ponto de ruptura do vacúolo, mas antes da ruptura da célula hospedeira. A morfologia e a homogeneidade dos esquizontos tratados devem ser verificadas por esfregaços sanguíneos corados com Giemsa antes do congelamento por imersão (Figura 1). Schizonts podem ser congelados em qualquer um desses estados usando o método descrito nesta publicação.

Figura 1: Morfologia dos esquizontes de P. falciparum dos compostos 2 e E64 por esfregaços sanguíneos corados com Giemsa. (A) Na presença do composto 2, o vacúolo parasitóforo (PV) é densamente repleto de merozoítos (círculos roxos) com um único aglomerado de cristais de hemozoína (círculo marrom escuro). O limite entre o PV e a hemoglobina circundante na hemácia do hospedeiro (hRBC) (banda cinzenta) é bem definido, assim como a membrana dos eritrócitos. (B) Na presença de E64, a membrana PV é rompida e os merozoítos se espalham dentro do hRBC. Cada esquizonto ainda contém um único aglomerado de cristais de hemozoína. A membrana da célula hospedeira é vazada e parcialmente colapsada, portanto, nenhuma hemoglobina é visível dentro da periferia celular e o limite da membrana das hemácias não é facilmente visível. Barra de escala, 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Otimização do congelamento por imersão
Uma variedade de grades com diferentes tamanhos de furos foi testada durante a otimização das condições de blotting para hemácias infectadas por P. falciparum, incluindo 2/2, 3/3, 3,5/1 e 5/2 (quadrado) holey carbono em barras de ouro e cobre 200 malhas. As grades de 200 malhas de cobre com filme de carbono 2/4 holey fornecem uma camada adequadamente espessa de células para moer lamelas vítreas longas. Orifícios maiores ou menores geralmente resultavam em camadas celulares muito finas ou espessas, respectivamente (Figura 2A-C). Com 2/4 de carbono holey, os esquizontes são puxados através dos buracos de 2 μm manchando a grade de trás (lado não-carbono), resultando em células surgindo acima e abaixo do filme de carbono. O trecho de 4 μm de carbono entre os furos resulta em uma faixa de carbono correndo pelo meio da maioria das lamelas resultantes, adicionando força. As grades do localizador são mais adequadas para fins de correlação e peneiramento⁴⁴, mas deve-se tomar cuidado para garantir que os números/letras no projeto da malha não sejam muito grandes, pois isso bloqueará as áreas para fresagem.

O tempo de mancha em um êmbolo manual é de aproximadamente 20 s, mas o ponto exato em que parar de manchar foi julgado a olho nu quando a gota de líquido que estava sendo retirada da grade parou de se espalhar no papel de filtro. Uma borda rasgada foi necessária para quebrar a tensão superficial da gota para iniciar o processo de blotting. Um freezer de imersão automatizado não foi usado neste estudo, mas um ponto de partida razoável para esta amostra seria usar o mesmo volume de células e tipo de grade usado para um êmbolo manual, certificando-se de manchar as grades de trás em condições com alta umidade (~70%) e temperatura ambiente (~25 °C). Os tempos e condições de blotting precisariam ser otimizados para o sistema automatizado específico usado.

Grades congeladas de P. falciparum schizonts foram triadas por um microscópio de luz equipado com um estágio criogênico em vez de MET, porque a amostra não era transmissível a elétrons. Para amostras mais finas, as grades podem ser rastreadas por TEM (atlas de grade inteira com ampliação de ~150x) antes da transferência da amostra para o cryoFIB-SEM, o que pode ser um pré-requisito para acessar uma instalação nacional. Atenção especial deve ser dada ao gradiente de espessura do gelo ao longo da grade e também dentro de quadrados de grade individuais. Bons quadrados de grade devem ter uma célula de espessura ou atingir o filme de carbono em seu centro (Figura 2C). Isso evita a moagem no gelo mais espesso contra as barras de grade ao redor da borda do quadrado da grade e garantirá que o feixe de íons rompa acima e abaixo da camada celular, produzindo uma lamela livre em vez de uma cunha. Uma vez que as condições reprodutíveis de blotting e plunge freezing tenham sido otimizadas, a triagem geralmente não é mais necessária antes da moagem FIB.

Gráfico 2. Análise da distribuição celular em grades de esquizontos de P. falciparum congelados por imersão por microscopia crio-óptica. (A) Um exemplo de gelo sendo muito espesso através de uma grade quadrada por microscopia crio-luz, obscurecendo as células e o filme de carbono. Barra de escala, 10 μm. (B) Um exemplo do tamanho do furo (grade de cobre de malha 300 com filme de carbono holey 5/2 quadrado) ser muito grande para as células, resultando em uma camada muito fina de material biológico cercada por regiões vazias sem gelo. Grades como essa produzem lamelas muito curtas e instáveis. Barra de escala, 10 μm. (C) Um exemplo de boa distribuição celular em uma grade de cobre de 200 malhas com filme de carbono 2/4 holey. Esses esquizontos foram tratados com inibidor E64. As grandes células (caixa vermelha, ~5 μm de diâmetro) com uma periferia bem definida são hemácias infectadas que ainda têm uma membrana de vacúolo intacta. Os aglomerados de pequenas células (caixa azul, ~1 μm) são os merozoítos individuais contidos dentro de um glóbulo vermelho hospedeiro parcialmente colapsado. Cada esquizonta tem uma mancha preta em seu centro, indicando a posição dos cristais de hemozoína (Veja a Figura 1 para detalhes adicionais). A diferença na morfologia celular não é tão fácil de ver uma vez dentro do cryoFIB-SEM; portanto, a pré-triagem por crioscopia de luz é benéfica até que condições reprodutíveis de blotting tenham sido alcançadas. A cobertura da célula ao redor das bordas do quadrado da grade ao lado das barras de grade (áreas tracejadas em branco) é muito espessa para fresagem. A região mais fina no centro do quadrado da grade (área tracejada em amarelo) é um lugar ideal para moer, estendendo a lamela para a camada circundante de células. Barra de escala, 6 μm. (D) Imagem de um aro autogrid específico para crioFIB com duas marcas pretas, uma dentro da seção de corte (suporte preto) e outra oposta, às 12 horas e 6 horas. A seta preta representa a direção da fresagem. (E) Quando as grades são carregadas no do carregador automático, as marcas precisam estar equidistantes de cada lado da pinça de carga, resultando nas lamelas perpendiculares ao eixo de inclinação do estágio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Marcação de jantes autogrid específicas para crioFIB para tomografia
Normalmente, as grades são cortadas em jantes de rede automática antes da fresagem, a fim de facilitar o manuseio e fornecer rigidez, o que protege as lamelas de danos durante as etapas de transferência subsequentes. As jantes de rede automática específicas da CryoFIB foram concebidas com uma funcionalidade de corte para ajudar a aceder a mais face da grelha durante a fresagem. É importante orientar a direção de fresagem perpendicularmente ao eixo de inclinação do MET para que a aquisição da série de inclinação prossiga girando a lamela ao longo de seu comprimento. Isso garante que as paredes altas da trincheira ao redor da lamela não obscureçam a informação biológica à medida que a grade é inclinada.

Normalmente, o aro da autogrid é marcado para ajudar no alinhamento visual dentro do vaivém cryoFIB-SEM e, posteriormente, ao carregar o MET. Para essas amostras, foram aplicadas duas marcações, às 12 horas e às 6 horas, com um marcador indelével (ver Tabela de Materiais), uma no centro da seção de corte do anel do clipe e a segunda diretamente oposta (Figura 2D). Ao carregar no ETM (ver Tabela de Materiais), ambas as marcas devem estar visíveis de ambos os lados da pinça de carga e alinhadas 90° à borda da pinça (Figura 2E). Deve-se notar que o fabricante recomenda o alinhamento de grades usando os pontos gravados nas jantes da grelha automática, uma vez que certas tintas próximas do feixe de iões podem interferir na fresagem.

As grades cortadas podem ser filtradas por microscopia de luz com um modificado para um estágio criogênico, o que pode ser benéfico para verificar se o processo de clipagem não destruiu o filme de carbono da grade. Dependendo do da amostra, grades não cortadas também podem ser fresadas, mas muito cuidado deve ser tomado durante a transferência do cryoFIB-SEM para o MET para limitar qualquer flexão da grade, pois isso quebrará as lamelas. Grades não cortadas podem ser carregadas no MET por crio-suportes de entrada lateral, mas há uma grande chance de que as lamelas se rompam se o corte for realizado após a fresagem.

Revestimento organoplatina
O revestimento de organoplatina é realizado em uma ou ambas as grades depois de carregadas no cryoFIB-SEM. A agulha do sistema de injeção de gás (SIG) é inserida na câmara acima da amostra para direcionar um fluxo de vapor organoplatina através da superfície da rede a partir de uma fonte aquecida por um tempo determinado. O vapor condensa-se em superfícies frias e forma uma camada sólida (~2 μm de espessura). A integridade desta pelagem é fundamental para permitir que lamelas uniformemente finas sejam moídas. As condições ideais de aplicação para o revestimento de organoplatina são geralmente pré-determinadas pelo fabricante do instrumento, mas alguma otimização ainda pode ser necessária. A maioria dos sistemas alinha a agulha SIG próxima à direção de fresagem ou perpendicularmente à direção de fresagem, dependendo da geometria das portas na câmara e dos limites de rotação do estágio. Diferentes configurações podem ser testadas revestindo a grade, fresando uma pequena região, inclinando o estágio e medindo a espessura da camada por MEV.

Além da configuração do crioFIB-MEV em si, uma série de outros fatores pode afetar a aplicação do revestimento de organoplatina, incluindo 1) a topografia da amostra, 2) a contaminação da superfície na grade e 3) a reprodutibilidade do fluxo de vapor da agulha SIG. Como o fluxo GIS é direcional, a topografia irregular pode fazer com que regiões à sombra das células ou contaminação da superfície não sejam revestidas ou tenham uma camada mais fina. Isso pode levar a um colapso da camada organoplatina durante o polimento (Figura 3). Ao selecionar uma área para moer, é necessário estar atento à topografia circundante, por exemplo, grandes contaminações superficiais, aglomerados de células ou carbono quebrado que se projetam da superfície da grade até alguns quadrados de grade de distância, podem bloquear o fluxo de vapor, criando uma sombra de organoplatina mais fina que pode enfraquecer uma lamela. Além disso, partículas muito pequenas de contaminação superficial perto da borda frontal da lamela também devem ser evitadas, pois podem estourar durante a fresagem, deixando uma mancha enfraquecida de gelo nu que pode resultar em um buraco se desenvolvendo na lamela durante o polimento. Finalmente, se a moagem tiver começado e a pelagem organoplatina parecer instável, revestir novamente, por mais tempo, ou trocar para uma grade de reserva.

Figura 3: Um revestimento organoplatina de boa qualidade é fundamental para obter lamelas finas e uniformemente fresadas. (A) Uma micrografia da borda frontal de uma lamela onde o revestimento organoplatina (OP, amarelo) foi aplicado muito fino, levando a um buraco na borda frontal da lamela que se desenvolveu durante o polimento (círculo verde) e fresagem irregular em toda a largura da lamela (estrias). A superfície organoplatina foi cortada pelo feixe de íons, levando a uma pulverização de material atrás da borda frontal do revestimento (linha tracejada amarela). (B) O revestimento organoplatina (OP) foi aplicado de forma mais espessa, resultando em uma lamela mais uniformemente afinada. A integridade da pelagem é preservada em toda a largura da lamela e a interface entre a camada organoplatina e o material biológico vitrificado é bem definida (linha tracejada amarela). A camada de carbono pode ser vista correndo através da parte traseira da lamela (laranja). Barras de escala, 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Avaliação da qualidade da grade no cryoFIB-SEM e no processo de fresagem
Uma vez que as grades tenham sido transferidas para o cryoFIB-SEM, a integridade do filme de carbono e a distribuição das células nas grades podem ser peneiradas por MEV (Figura 4A-C). Os gradientes de gelo, as posições das barras de grade e a localização dos números de grade nas grades do localizador podem ser verificados por MEV de baixa ampliação a 30 kV (Figura 4B), mas a tensão deve ser reduzida de volta para 5 kV ao localizar posições de fresagem em alta ampliação e monitorar o processo de fresagem para aumentar o contraste da topografia da superfície.

Figura 4: Avaliação da qualidade da rede e localização de áreas a serem moídas no cryoFIB-SEM . (A) Uma visão geral de baixa ampliação de uma grade a 5 kV através do MEV. A seção de corte do aro da grade automática é visível na parte inferior da imagem. Barra de escala, 0,5 mm. (B) A mesma grade a 30 kV por MEV, mostrando áreas de gelo mais espesso (quadrados de grade mais escuros) e gelo mais fino (quadrados de grade mais claros). A inserção mostra a região na caixa, com setas indicando a numeração na grade do localizador, que é visível em 30 kV. Barra de escala, 0,5 mm. (C) Uma visão geral de ampliação média de dois quadrados de grade avaliando a distribuição das células no filme de carbono e a localização das barras de grade. Barra de escala, 50 μm. (D) Arranjo dos padrões de fresagem para o primeiro corte em alta ampliação (visão do feixe de íons a 1,5 pA e 30 kV). A região vermelha (3 μm de espessura) é protegida, enquanto as regiões amarelas serão ablidas, pelo feixe de íons. A linha tracejada em branco indica a posição da lamela final. Barra de escala, 10 μm. (E) Uma visão de alta ampliação a 3 kV através da MEV de uma lamela polida de 200 nm de espessura (10 μm de largura x 15 μm de comprimento). A perda de contraste dentro da lamela a 3 kV indica que uma espessura adequada foi atingida. A borda frontal branca brilhante é a camada organoplatina restante que é aplicada à grade através do SIG antes da fresagem. Barra de escala, 5 μm. (F) A mesma lamela de (E) visualizada usando o feixe de íons a 30 kV e 1,5 pA. A fina linha branca ao longo do quadrado preto (seta branca) é a camada organoplatina remanescente na borda frontal da lamela. Barra de escala, 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma região a ser fresada é selecionada colocando-se um par de padrões retangulares de cada lado de uma região protegida em alta ampliação (~7.000x para esquizontos) na visão do feixe de íons (Figura 4D). É fundamental que nenhuma partícula de contaminação superficial esteja aderida próxima à região de moagem, pois estas podem ter obscurecido a aplicação do revestimento protetor organoplatina. Também é importante que a topografia da região seja adequada para suportar as laterais da lamela uma vez atingida sua espessura final.

Para esquizontos de malária (tamanho da célula: ~5 μm de diâmetro x 2 μm de espessura, forma de disco) podem ser fresadas lamelas entre 7-20 μm de largura. Se a camada celular for adequadamente espessa, as lamelas geralmente terminarão ~10-15 μm de comprimento, capturando várias células acima e abaixo da camada de carbono (Figura 4E-F). Pode-se esperar moer 5-10 lamelas em uma sessão de 8 h (6-7 h de moagem e 1-2 h de polimento). Isso varia de acordo com a espessura da amostra e a largura das lamelas, com amostras mais grossas e lamelas mais largas levando mais tempo para moer. Mesmo grades danificadas podem ser fresadas, pois requer apenas um punhado de bons quadrados de grade para gerar um conjunto de lamelas (Figura 5A). Além disso, se a amostra for mais fina do que o esperado, por exemplo, devido ao excesso de manchas ou variação no hematócrito da cultura, lamelas mais curtas podem ser moídas relativamente rapidamente; no entanto, seu menor comprimento limitará a área disponível para coleta de dados no ETM (Figura 5B).

Figura 5: Determinação de quando a espessura final da lamela foi atingida durante a fresagem. (A) Visão geral de baixa ampliação de uma grade por MEV a 5 kV mostrando danos de carbono durante o clipping. As áreas não danificadas continham amostra muito fina devido ao excesso de manchas; no entanto, ainda era possível moer seis lamelas nesta grade (a região dentro do contorno branco) em uma sessão de dia inteiro no crioFIBSEM. Barra de escala, 0,5 mm. (B) Uma lamela curta (~10 μm de largura x 3 μm de comprimento, não incluindo a camada organoplatina) produzida a partir dessa grade (MEV a 3 kV), que ainda fornecia duas regiões para coletar séries de inclinação. Barra de escala, 25 μm. (C) Uma série de imagens de MEV (3 kV) de uma lamela durante a etapa final de polimento mostrando como o contraste é perdido na lamela à medida que ela é afinada (movendo-se da esquerda para a direita). A linha preta escura no meio da lamela em todas as imagens é uma tira de filme de carbono da grade. As células na frente dessa região foram vitrificadas acima do filme de carbono e as células atrás dessa região foram vitrificadas abaixo do filme de carbono. A fresagem foi interrompida quando o revestimento organoplatina no lado esquerdo da borda frontal da lamela estava perto de perder a integridade estrutural. Este ponto de parada foi antes de toda a lamela ser levada a uma espessura uniforme, e é por isso que ainda há algum material de maior contraste na parte traseira da lamela. (D) Um exemplo de uma rota de polimento baseada nas lamelas fresadas na grade mostrada em (A). Uma rota de polimento deve começar nas lamelas mais próximas da fonte FIB, afastando-se da fonte FIB para limitar a reposição do material fresado na superfície das lamelas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Durante o polimento, a espessura final de uma lamela dependerá da estrutura da amostra na região a ser moída, da integridade do revestimento organoplatina e do tempo disponível. Idealmente, a amostra deve ser adelgaçada até que o contraste seja perdido em toda a superfície da lamela por MEV a 3 kV, sugerindo que ela é uniformemente transparente e com cerca de 150-200 nm de espessura (Figura 5C). No entanto, pode ser necessário parar a moagem antes deste ponto se a camada de organoplatina desenvolver um buraco ou a lamela começar a dobrar. Neste caso, a lamela ainda pode ser fina o suficiente na frente e permanecer útil para a tomografia. Por outro lado, é possível ultrapassar o estágio de perda de contraste se a lamela parecer estável, tornando-a ainda mais fina ao aproximar os padrões de fresagem (~100 nm ou menos). Isso dependerá da espessura, se necessário, para o fluxo de trabalho downstream. Uma imagem de MEV de baixa magnificação é necessária para planejar uma rota de polimento, começando mais perto da fonte do feixe de íons e trabalhando fora (Figura 5D). A direção da rota de polimento é importante para evitar a reposição de material ablado, em lamelas já finalizadas.

Coleta e processamento de dados da série tilt
Uma vez carregada no MET, uma montagem de grade completa de baixa ampliação (~150x) identificará as posições das lamelas, que podem ser correlacionadas com a imagem de MEV de baixa magnificação obtida no final da fresagem. Para esquizontos congelados de imersão, a maior parte da grade não é transparente para elétrons, de modo que as posições das lamelas aparecem como entalhes brancos em um fundo preto (Figura 6A). O ângulo das lamelas em relação ao eixo de inclinação do microscópio deve ser observado, pois mais de ~10° de distância da perpendicular poderia dificultar a aquisição da série de inclinação. Uma montagem de ampliação média (~1.500x) no local de cada lamela dará uma visão geral do conteúdo biológico e verificará se há danos de transferência, gelo cristalino ou contaminação superficial excessiva (Figura 6B-D). Isso também deve ser verificado em alta inclinação para garantir que nenhuma contaminação da superfície obscureça a área de aquisição ou foco. A escolha de uma região de aquisição dependerá não apenas das características biológicas, mas também da integridade estrutural do gelo na região circundante, por exemplo, evitando rachaduras, pois essas regiões irão se afastar, ou áreas com cortina excessiva, onde uma lamela terá espessura variável. Antes de adquirir uma série de inclinação, uma pré-inclinação de ±10° é aplicada à grade para tornar o plano das lamelas (não a grade) perpendicular ao eixo óptico. A direção da pré-inclinação pode ser determinada pela posição da borda frontal das lamelas (procurando a sobra do revestimento organoplatinado) na montagem de média ampliação. Para o MET usado aqui (300 kV Titan Krios), se as bordas frontais das lamelas apontassem para cima no mapa, isso exigia uma pré-inclinação de +10° e, se apontassem para baixo, isso exigia uma pré-inclinação de -10°. Cada grade pode ser diferente devido à orientação em que foram captadas na pinça e inseridas no carregador automático (seção de corte voltada para a esquerda ou direita, produz uma rotação de 180°). Uma consideração final é o tamanho do pixel. Rotineiramente, séries de inclinação são coletadas em torno de 2,5-7 Å/pixel, levando-se em consideração o tamanho da característica de interesse, a resolução alvo dos dados tomográficos resultantes e a área superficial da lamela, o que pode limitar o tamanho da área de aquisição. É possível usar um tamanho de pixel menor para obter informações de alta resolução e o menor que usamos com sucesso nessas amostras é 1,4 Å/pixel (dados não mostrados). A deriva será mais aparente em um tamanho de pixel menor e só é realmente adequada para lamelas finas (<100 nm), onde maximizar a resolução é importante no estudo.

Figura 6: Escolhendo regiões de interesse acessíveis a partir das quais adquirir a série de inclinação (A) Uma seção de um mapa de ETM de baixa ampliação mostrando uma região contendo lamelas, aparecendo como seis entalhes brancos em um fundo preto (setas vermelhas). Os quadrados brancos são filmes de carbono quebrados. (B) Um mapa de ampliação média de uma lamela danificada e desviada. Na borda frontal da lamela (FE) a pelagem organoplatina se desprendeu (1). Há uma mancha clara de gelo cristalino no centro da lamela (2). O feixe de íons não conseguiu romper na borda traseira da lamela (BE) porque o gelo é muito espesso ao lado das barras da grade. Apenas uma pequena porção da lamela está livre do gelo circundante no BE (3), criando uma cunha. A espessura também fez com que prateleiras fossem cortadas acima da lamela (4), o que provavelmente bloqueará a visão das células em alta inclinação no MET. (C) Montagem de média ampliação de uma lamela inteira visualizada no MET. Problemas típicos ou regiões a serem evitadas ao coletar séries de inclinação das lamelas são áreas: cobertas com contaminação superficial (SC), cobertas pelo revestimento organoplatina (OP, amarelo), próximas a fissuras (CR e setas pretas), com cortinamento devido a mudanças de densidade no material biológico (UC e região dentro de braquetes azuis) e áreas enfraquecidas por quebras no revestimento organoplatina (círculo verde). As únicas regiões acessíveis para aquisição da série de inclinação são as áreas dentro das duas caixas tracejadas pretas (rotuladas como 1 e 2). A visão deve ser verificada em alta inclinação para garantir que a contaminação da superfície não obscureça a região de interesse ou a área de foco. (D) Montagem de média ampliação de uma lamela muito mais limpa, mas que ainda apresenta fissuras (CR) causadas pelo afinamento da pelagem organoplatina (círculo verde) durante o polimento. Aqui, a região de interesse é destacada pelo tipo celular observado dentro da lamela, que neste caso são os merozoítos individuais, posicionados atrás da camada de carbono (laranja) em direção à parte posterior da lamela (caixa tracejada preta). Barras de escala, 3 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Aquisição de dados de crio-ET a partir de lamela moída por FIB. (A) Micrografia de uma região de uma lamela contendo uma hemácia que foi recentemente invadida por um merozoíto de P. falciparum. Em (B) a mesma imagem é anotada para mostrar o limite do glóbulo vermelho (vermelho), um número de vesículas intracelulares de parede dupla (roxo e azul para as membranas interna e externa, respectivamente) e o merozoíto (verde) cercado por uma segunda membrana derivada da célula hospedeira (amarelo). Uma caixa preta mostra a área onde uma série de inclinação foi adquirida. Barra de escala, 500 nm. (C) Uma média de 20 cortes centrais visualizados no plano XY a partir de um tomograma binned 8x (2,4 Å/pixel) adquirido na extremidade apical do merozoíto e em (D) sua anotação, mostrando as duas membranas ao redor da célula (verde e amarelo) e quatro membranas empilhadas no ápice do merozoíto (azul) que estão associadas a uma característica em forma de cogumelo denso de elétrons (roxo). Uma seta vermelha indica a junção das pilhas de membrana no ápice e a característica em forma de cogumelo (também mostrada na parte F, i). Uma seta preta indica um evento de fusão entre a membrana plasmática do merozoíto e uma das vesículas multicamadas dentro do parasita (também mostrado na parte F, ii). A membrana dos glóbulos vermelhos do hospedeiro é mostrada (vermelho) e uma linha tracejada em preto mostra a posição de uma seção transversal vista no plano XZ, mostrada em (E). As feições na seção transversal (E) são coloridas e rotuladas da mesma forma que na parte (D), com setas coloridas apontando para as membranas. Uma seta preta indica a posição de uma camada de pulverização aplicada à lamela após a moagem e a espessura da lamela em indicada. Para peças (C-E), barra de escala, 500 nm. (F) Uma visão mais detalhada das características indicadas pelas cabeças de seta vermelha e preta na parte (C), mostrando a definição nas bicamadas lipídicas da pilha de membrana no ápice do merozoíto (i) e o evento de fusão entre a vesícula multicamadas com a membrana plasmática do merozoíto. Barra de escala, 75 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O foco principal do trabalho é dissecar o caminho de saída de merozoítos em P. falciparum Mas, dado que a população de células usada no estudo nunca pode ser totalmente homogênea, muitas vezes outros estágios de desenvolvimento celular dentro das lamelas foram observados. O exemplo mostrado aqui (Figura 7) contém um glóbulo vermelho que foi recentemente invadido por um P. falciparum parasita (merozoíto). A lamela utilizada tinha 240 nm de espessura e a grade havia sido levemente revestida com platina em atmosfera de argônio antes da inserção no MET, resultando em um contraste ligeiramente menor do que seria normalmente esperado. A membrana dos glóbulos vermelhos pode ser rastreada em sua totalidade ao redor da célula. Dentro da hemácia, havia três estruturas fechadas ligadas à membrana, duas vesículas, cada uma circundada por uma membrana dupla e uma característica em forma de lâmpada (1,2 μm x 0,9 μm em suas partes mais largas), o que é consistente com o fato de ser um merozoíto (Figura 7A-B). O conteúdo das duas vesículas pareceu ser semelhante em contraste com o conteúdo da hemácia, sugerindo que essas vesículas podem conter hemoglobina. A presença de vesículas dentro da hemácia do hospedeiro após a invasão foi observada anteriormente⁴⁵. Acredita-se que eles surjam da secreção de lipídios e outros fatores de virulência de organelas secretoras chamadas rhoptrias no merozoíto, que descarregam no célula vermelha do hospedeiro durante a invasão. O merozoíto é cercado por duas membranas intimamente associadas, a mais interna das quais é presumivelmente a membrana plasmática nativa do merozoíto, na qual não há revestimento superficial visível, e a mais externa deve derivar da membrana de células vermelhas do hospedeiro que envolve o merozoíto à medida que ele invade. O citoplasma do merozoíto contém muitas vesículas multicamadas e uma característica em forma de cogumelo denso de elétrons adjacente a uma pilha de membranas no ápice. Uma série de inclinação adquirida sobre essa região (2,4 Å/pixel) mostra que ela contém uma pilha de quatro membranas, que parecem estar conectadas à característica em forma de cogumelo (Figura 7C-E). Surpreendentemente, esta morfologia é bastante diferente do arranjo normal de organelas e estruturas celulares na extremidade apical de um merozoíto maduro. Para avaliar isso, uma série de inclinação comparativa (2,74 Å/pixel) sobre a extremidade apical em um merozoíto maduro foi obtida de um esquizonto que havia sido tratado com E64 antes do congelamento e moagem por imersão (Figura 8). Isso mostra que a extremidade apical de um merozoíto contém duas organelas secretoras proeminentes em forma de clube chamadas rhoptrys aninhadas dentro de um conjunto de três anéis polares na ponta apical da célula e cercadas por um número de organelas secretoras menores chamadas micronemes. O anel polar mais interno está ligado a uma estrutura de membrana dupla que está subjacente à membrana plasmática do merozoíto, chamada de complexo de membrana interna, que contém proteínas motoras que impulsionam a invasão. Foi demonstrado que, durante a invasão, o conteúdo das organelas secretoras é descarregado na superfície do merozoíto e na hemácia do hospedeiro, facilitando a ligação dos merozoítos às hemácias do hospedeiro e iniciando o complexo motor que impulsiona a invasão⁴⁵. Os dados aqui mostram que, após a invasão, o merozoíto não contém estruturas observáveis que se assemelham a ropópteros, micronemas ou anéis polares, sugerindo que a morfologia da extremidade apical do merozoíto muda drasticamente. A fusão de rhoptrias antes da invasão foi demonstrada previamente por MET de seções fixas à temperatura ambiente⁴⁶, o que é consistente com a produção da característica em forma de cogumelo que observamos em nosso merozoíto de estado pós-invasão. As pilhas de membranas conectadas a esta característica não foram observadas anteriormente e, como não há indicação de um IMC presente no merozoíto recém-invadido, levantamos a hipótese de que as pilhas de membrana podem ser os restos da maquinaria IMC que sobrou após a invasão ser concluída, mas isso ainda precisa ser confirmado.

Figura 8: Extremidade apical de merozoítos maduros por crio-ET de uma lamela moída com FIB e MET de seções plásticas. (A) Uma média de 20 cortes centrais de um tomograma binned de 8x (2,74 Å/pixel) de uma lamela de 230 nm de espessura mostrando a morfologia típica da extremidade apical de um merozoíto maduro. Os esquizontes foram tratados com E64 antes do congelamento por imersão, portanto, a membrana PV se rompeu e os merozoítos estão contidos na hemácia hospedeira. (B) mostra o mesmo que em (A), mas com anotações para indicar a membrana eritrocitária do hospedeiro (RCM, vermelho), a membrana plasmática do merozoíto (verde), o complexo de membrana interna (IMC, roxo), anéis polares (PR, preto), micronemas (M, amarelo), rhoptrias (R, cinza) e o envelope nuclear (NE, azul). Um merozoíto vizinho, que está fora do plano nesta região do tomograma é indicado por um triângulo verde. Barra de escala, 200 nm. (C) As características celulares observadas pelo crioET são consistentes com as do ETM de esquizontos preservados em cortes plásticos. Características celulares semelhantes são indicadas em um merozoíto maduro de um esquizoíto que foi tratado com o composto 2, estagnação da saída antes da ruptura da membrana PV. Barra de escala, 500 nm. (D) Um esquema anotado de um merozoíto mostrando as características celulares em partes (A-C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Espessura da região protegida entre os padrões de moagem retangular (μm)	Corrente de feixe de íons (pA) nomical a 30 kV
3	300
1.5	100
0.75	50
0.3	30
0,2 - 0,06 (polimento final)	30*

Tabela 1: Estratégia de moagem para produção de lamela fina. A fresagem escalonada é realizada através da redução da corrente do feixe de íons correspondente à espessura da região protegida. Isso limita o aquecimento da amostra, impedindo a desvirtuação. *O polimento deve ser realizado em paralelo para aplicar uniformemente calor nas lamelas de ambos os lados, reduzindo o risco de elas se dobrarem ou se curvarem ao atingirem sua espessura final. Outras etapas podem ser feitas sequencialmente, fresando o padrão acima da lamela e depois abaixo da lamela, antes de passar para a corrente do feixe seguinte. O levantamento da grade para localizar as posições de fresagem deve ser realizado com corrente de feixe de 1,5 pA para minimizar o aquecimento da amostra. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

Embora a fresagem crioFIB esteja se tornando mais rotineira, a preparação de amostras ideais para moagem não; portanto, a maioria das etapas críticas deste protocolo ocorre antes que a amostra atinja o crioFIB-MEV. A otimização da amostra por várias rodadas de preparação celular, congelamento por imersão e triagem por microscopia de luz e eletrônica são necessárias para produzir a melhor amostra possível antes que a moagem seja tentada. Ter a melhor amostra possível não só aumenta as chances de sucesso, mas também otimiza o uso do equipamento. Por esta razão, a maioria das instalações nacionais exige evidências de que foi realizada otimização suficiente antes de conceder tempo em suas máquinas. Uma vez dentro do cryoFIB-SEM, maximizar a eficácia do revestimento de organoplatina é fundamental para produzir lamelas uniformemente finas. Finalmente, paciência e bom manuseio de amostras é uma habilidade pré-requisito do usuário, que será obrigado a sentar por vários dias produzindo e depois transferindo grades contendo lamelas delicadas. Isso pode mudar com a introdução de estratégias de fresagem automatizada^47,48, mas, até o momento^, todo o processo de fresagem ainda é em grande parte manual na maioria das instalações.

Enquanto o trabalho se concentrou apenas em esquizontos de P. falciparum , o método aqui apresentado pode ser facilmente modificado para otimizar a preparação da grade e a moagem para outros tipos celulares. Fatores importantes a serem considerados são a densidade das células que estão sendo aplicadas à grade, o tipo de grade (o cobre é tóxico para algumas células), o tamanho e o espaçamento dos furos no filme de carbono, o tempo de blotting e o método de blotting (face simples/dupla, manual ou automatizado). Além disso, se as células estão sendo cultivadas nas grades (geralmente grades de ouro com um filme de carbono holey), a confluência pode ser verificada por microscopia de luz antes de manchar e congelar. A estratégia de moagem depende de como as células são depositadas na grade. Para os glóbulos vermelhos infectados pela malária, a grade é essencialmente revestida por uma camada ininterrupta de células, mais espessa em algumas áreas e mais fina em outras. A fresagem é realizada em vários pontos em uma região ao longo desse gradiente, onde a espessura do gelo gera lamelas de tamanho adequado para a tomografia. Essa abordagem funciona bem para células menores, pois você pode produzir lamelas contendo uma fatia através de várias células. Para células maiores ou aglomerados de células, pode ser o caso de uma célula ou aglomerado de células produzir uma lamela.

O manuseio da grade e a transferência de amostras continuam sendo um dos principais desafios desse fluxo de trabalho. Lamelas podem ser perdidas devido a quebras ou rachaduras, artefatos de cortina obscurecendo a biologia, contaminação superficial excessiva, bem como problemas de orientação da grade dentro do MET, exigindo uma etapa extra de manuseio para reposicionar a grade. O grau de perdas varia de dia para dia e de grade para rede, mas é melhorado através da prática e experiência de manuseio ao longo do tempo. Neste estudo, verificou-se que as grades podem ser cuidadosamente reorientadas no carregador automático várias vezes sem destruir lamelas e isso às vezes tem o benefício de lavar o gelo da superfície. Outra limitação principal desse fluxo de trabalho é o tempo necessário para produzir lamelas. Como a produção é lenta, é fundamental ter uma amostra devidamente otimizada, tornando a moagem o mais eficiente possível.

Uma série de adaptações à moagem FIB de amostras biológicas vítreas tem sido recentemente introduzida. Um divisor de águas é a implementação de ferramentas de elevação resfriadas criogenicamente dentro da câmara crioFIB-SEM que permitem que blocos maiores de material sejam fresados a partir de amostras congeladas de alta pressão. Os blocos podem ser fixados a uma haste metálica ou apanhados em uma garra e movidos para uma segunda posição de amostra, contendo uma grade EM especialmente modificada. Os blocos podem então ser revestidos com organoplatina e moídos para gerar lamelas. A capacidade de moer lamelas a partir de material congelado de alta pressão significa que células e tecidos muito maiores podem ser processados, visando especificamente áreas por microscopia de fluorescência correlativa¹². Outras adaptações recentes ao método de moagem FIB incluem a redução de artefatos de cortina por pré-moagem em cunha da amostra¹⁶, criofixação microfluídica⁴⁹ e foto-micropadronização de grades de microscopia eletrônica para melhorar a distribuição celular⁵⁰. Além disso, foi demonstrado que as lacunas de microexpansão de fresagem de ambos os lados de uma lamela podem aliviar a compressão pela amostra circundante à medida que ela atinge sua finura final⁵¹. Isso pode ser particularmente útil ao fresar camadas contínuas de células, como a amostra deste estudo, onde a flexão das lamelas às vezes é vista durante a etapa final de polimento.

O futuro da microscopia eletrônica provavelmente será a determinação de estruturas moleculares in situ pela média do subtomograma e a moagem por FIB é uma importante ferramenta que facilitará a produção de amostras biológicas vítreas para esses tipos de fluxos de trabalho. Embora a moagem FIB ainda esteja em sua infância para aplicações biológicas, o desenvolvimento de métodos está acontecendo em um ritmo acelerado graças ao trabalho árduo de pesquisadores, tanto acadêmicos quanto em instalações nacionais, além do investimento comercial no desenvolvimento da tecnologia cryoFIB-SEM para apoiar a pesquisa.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
c-clips	Thermo Fisher Scientific	1036171
Clipping station	Thermo Fisher Scientific	n/a	Direct quote from Thermo
Clipping station	Sub-angstrom	CSA-01
Compound 2	n/a	n/a	Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc
Cryo-FIB specific autogrid rims	Thermo Fisher Scientific	1205101
E64	Sigma	E3132
Emitech K100X glow discharge unit	Quorum	n/a
Gibco RPMI 1640 media	Thermo Fisher Scientific	12633012	Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements
Giemsa Stain	VWR International	350864X
Glass slides	Thermo Fisher Scientific	11562203
Grid boxes	Sub-angstrom	PB	For clipped grids
Grid boxes	Thermo Fisher Scientific	n/a	For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific
Grid boxes	Agar Scientific	AGG3727
Home-made manual plunge freezing rig	n/a	n/a	With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.
Human blood	n/a	n/a	UK National Blood and Transplant service
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system	JEOL	n/a	FIB-SEM
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage	Leica	n/a	sputter coater
Leica EM ACE900	Leica	n/a	e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.
Linkam cryo-stage for light microscope	Linkam	Model No. CMS196	Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.
Methanol	Sigma	179957
Nikon Eclipse E200 light microscope	Nikon	n/a	with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.
Percoll	VWR International	17-0891-01	Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids	Quantifoil	N1-C17nCuH2-01	100 pack
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids	Quantifoil	N1-C17nCu20-01	100 pack
Quorum PP3010 prep-chamber	Quorum	n/a	sputter coater
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage.	FEI	n/a	FIB-SEM
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen	Viking Direct	ND538522
TFS Titan Krios 300 kV TEM	Thermo Fisher Scientific	n/a	TEM equipped with a K2 or K3 camera.
Whatmann grade 1 filter paper	Sigma	WHA1001150
Zeiss Axio Scope A1 light microscope	Zeiss	n/a	with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.