Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Preparazione di lamelle da campioni biologici vitreali utilizzando un microscopio elettronico a scansione a doppio raggio per la tomografia crioelettronica

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/62350
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3, 1, 1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London, 2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London, 3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

ERRATUM NOTICE

Summary

Utilizzo della fresatura a fascio ionico focalizzato per produrre lamelle vetrose su griglia da campioni biologici congelati a immersione per la tomografia crioelettronica.

Abstract

Qui è presentato un protocollo per la preparazione di criolamelle da griglie congelate di eritrociti umani infetti da Plasmodium falciparum, che potrebbero essere facilmente adattati per altri campioni biologici. I principi di base per la preparazione dei campioni, la fresatura e la visualizzazione delle lamelle sono comuni a tutti gli strumenti e il protocollo può essere seguito come guida generale alla preparazione della criolamella on-grid per la microscopia crioelettronica (cryoEM) e la tomografia crioelettronica (cryoET). Le griglie di microscopia elettronica che supportano le cellule vengono congelate in etano liquido raffreddato ad azoto liquido utilizzando un congelatore a tuffo manuale o automatico, quindi schermate su un microscopio ottico dotato di un crio-stadio. Le griglie congelate vengono trasferite in un microscopio elettronico a scansione criogenica dotato di un fascio ionico focalizzato (cryoFIB-SEM). Le griglie vengono regolarmente rivestite di sputter prima della fresatura, il che aiuta la dispersione dell'accumulo di carica durante la fresatura. In alternativa, è possibile utilizzare un rivestimento rotativo e-beam per applicare uno strato di carbonio-platino alle griglie, il cui spessore esatto può essere controllato con maggiore precisione. Una volta all'interno del cryoFIB-SEM un ulteriore rivestimento di un composto organoplatino viene applicato sulla superficie della griglia tramite un sistema di iniezione di gas (GIS). Questo strato protegge il bordo anteriore della lamella mentre viene fresata, la cui integrità è fondamentale per ottenere lamelle uniformemente sottili. Le regioni di interesse vengono identificate tramite SEM e la fresatura viene effettuata in modo graduale, riducendo la corrente del fascio ionico man mano che la lamella raggiunge la trasparenza degli elettroni, al fine di evitare un'eccessiva generazione di calore. Una griglia con lamelle multiple viene quindi trasferita a un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) in condizioni criogeniche per l'acquisizione in serie inclinabile. Un flusso di lavoro robusto e privo di contaminazione per la preparazione delle lamelle è un passo essenziale per le tecniche a valle, tra cui la crioEM cellulare, la crioET e la media sub-tomogramma. Lo sviluppo di queste tecniche, in particolare per il sollevamento e la fresatura di campioni congelati ad alta pressione, è altamente prioritario sul campo.

Introduction

Solo il contenuto cellulare di campioni biologici <500 nm di spessore può essere ripreso efficacemente mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) a temperature criogeniche, limitando la gamma di campioni a virus, procarioti, semplici organismi unicellulari e regioni più sottili di cellule eucariotiche più grandi1. La fresatura a fascio ionico focalizzato su griglia (FIB) consente di assottigliare campioni biologici congelati a immersione più spessi in lamelle trasparenti agli elettroni a temperature criogeniche (< -150 °C). Le lamelle risultanti vengono quindi trasferite a un TEM per la visualizzazione e la raccolta di dati tomografici, consentendo ricostruzioni 3D ad alta risoluzione delle caratteristiche cellulari e molecolari all'interno delle cellule (per le revisioni vedi Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163 e Wagner et al., 20204).

La fresatura FIB è emersa dal campo delle scienze dei materiali, dove i campioni vengono regolarmente assottigliati per prepararli all'analisi a valle5. Viene effettuato in un microscopio elettronico a scansione (SEM), che ha due colonne ottiche: ottica convenzionale per microscopio elettronico a scansione e una seconda colonna contenente ottiche in grado di generare e controllare finemente un fascio ionico focalizzato (FIB) - chiamato FIB-SEM. Ciò consente a una regione specifica del campione di essere ablata da ioni generati da una fonte di gallio, rimuovendo il materiale in eccesso e lasciando dietro di sé una lamella6. Il processo di fresatura è guidato dall'imaging SEM della topografia del campione, che viene utilizzato per localizzare le regioni di interesse e monitorare l'avanzamento della fresatura. Per le applicazioni biologiche, la configurazione di base è in gran parte la stessa, ma la fresatura viene eseguita a temperature criogeniche. Ciò ha richiesto che i FIB-SEM standard fossero adattati per avere stadi crioraffreddati che mantengono temperature costanti e bassi tassi di contaminazione superficiale, nonché camere di equilibrio per facilitare il trasferimento dei campioni senza devitrificazione o contaminazione. Anche le navette campione sono state modificate per consentire il montaggio di una serie di supporti diversi all'interno del cryoFIB-SEM, tra cui griglie TEM, planchette e capillari. Diversi gruppi chiave di ricercatori sono stati fondamentali per lo sviluppo di questi metodi e i continui progressi tecnologici in questo settore 7,8,9,10,11,12. Le soluzioni commerciali sono ora più ampiamente disponibili per la fresatura biologica di FIB a temperatura criogenica e la fresatura su griglia delle lamelle sta diventando sempre più di routine, dato un campione ottimizzato.

Una gamma di tecniche a temperatura ambiente e crioEM può essere utilizzata per visualizzare le informazioni cellulari su tutte le scale della vita, da interi organismi multicellulari a risoluzione modesta alla comprensione del contesto di processi complessi a livello cellulare e in modo ancora più dettagliato, alla determinazione di in situ Strutture molecolari13,14,15,16,17,18,19. Le tecniche classiche a temperatura ambiente includono il sezionamento di cellule e tessuti fissi e colorati, incorporati in resina mediante ultramicrotomia per l'analisi della morfologia cellulare mediante TEM (per la revisione vedi Studer et al., 200820). Sono state sviluppate tecniche alternative che sfruttano lo scattering elettronico secondario mediante SEM per visualizzare la superficie di blocchi di cellule conservate, prima di rimuovere progressivamente il materiale con un coltello (serial block face imaging) o un fascio ionico focalizzato.21,22,23. Questa tecnica è stata implementata con successo anche a temperature criogeniche (indicate come imaging crio-volume) con un crioFIB-SEM su blocchi vitreali e non colorati di cellule o tessuti.24. In alternativa, lamelle più spesse (~ 15 μm di spessore) possono essere fresate e studiate mediante imaging STEM25. Utilizzando queste tecniche, interi blocchi contenenti molte cellule possono essere ripresi per raccogliere informazioni sulla popolazione o un intero organo / organismo può essere ripreso e ricostruito in 3D. Tuttavia, per accedere alle informazioni molecolari ad alta risoluzione dalle cellule, i campioni devono essere conservati in uno stato quasi nativo, congelato-idratato e, pertanto, devono essere preparati in condizioni criogeniche. La criomicroscopia elettronica delle sezioni vetrose (CEMOVIS) è una tecnica in cui blocchi congelati ad alta pressione di materiale biologico vengono sezionati in condizioni criogeniche con un ultramicrotomo. Questo produce nastri di criosezioni (40-100 nm di spessore)26, che sono collegati a una griglia EM e ripresi nel TEM. Tuttavia, l'interazione fisica del coltello con il campione vitreo provoca artefatti di crepaccio e compressione che possono distorcere gravemente la struttura cellulare.27,28,29,30. Le sezioni più spesse sono più inclini a questi artefatti, rendendo poco pratico l'uso di sezioni più spesse di ~ 70 nm26. Questa limitazione limita notevolmente la vista 3D della struttura biologica nel tomogramma. La fresatura FIB a temperature criogeniche non presenta questi problemi, ma ha i suoi artefatti causati da velocità di fresatura differenziali tra le parti del campione, portando a spessori variabili all'interno di una lamella - chiamata tenda. Questo problema è mitigato dall'applicazione di uno strato organoplatino applicato tramite un sistema di iniezione di gas (GIS), che protegge il bordo anteriore della lamella durante la fresatura.31. Il limite superiore dello spessore del campione per la fresatura FIB su griglia è definito dalla capacità di congelare a tuffo il campione mantenendolo vetroso32, anche se, con l'introduzione di tecniche di crio-lift-out e di supporti per campioni adattati per campioni biologici, la fresatura FIB può essere utilizzata anche per trattare campioni congelati ad alta pressione31,33,34,35. Inoltre, i campioni congelati non possono essere troppo sottili in quanto deve esserci abbastanza materiale biologico per generare una lamella di dimensioni ragionevoli che fornirà una superficie sufficiente per raccogliere serie di inclinazione all'ingrandimento richiesto. Questo problema può essere alleviato macinando grumi di cellule più piccole, come batteri o lieviti. Lo spessore finale della lamella (~ 100-300 nm) è solitamente dettato dall'integrità del campione e dalla strategia di fresatura. Le lamelle più sottili sono migliori per lavori strutturali ad alta risoluzione, come la media dei sub-tomogrammi, ma le lamelle più spesse contengono volumi cellulari molto più grandi di quelli che possono essere raggiunti da CEMOVIS, fornendo più contesto cellulare in un campione quasi nativamente conservato. La fresatura FIB può anche essere utilizzata per assottigliare cristalli proteici congelati a tuffo per studi di diffrazione elettronica36.

La fresatura FIB delle cellule vitreali vale il tempo e lo sforzo di eseguire se la questione scientifica richiede dettagli molecolari ad alta risoluzione di campioni quasi nativi in situ. Con l'accesso a più strutture per la produzione di routine di lamelle, la fase limitante della velocità è spesso l'ottimizzazione del campione prima della macinazione, in cui è necessario prendere tempo per garantire che il campione sia vetroso e uno spessore appropriato per produrre lamelle robuste e uniformemente sottili. Descritta qui è l'ottimizzazione del campione per i globuli rossi umani congelati con FIB infettati da parassiti Plasmodium falciparum , l'agente eziologico della malaria, ma questo approccio potrebbe essere adattato per qualsiasi campione.

Protocol

Il sangue umano è stato ottenuto da donatori anonimizzati attraverso il servizio nazionale di sangue e trapianto del Regno Unito e viene utilizzato entro 2 settimane dal ricevimento. Non è richiesta alcuna approvazione etica per il suo utilizzo.

1. Preparazione e congelamento dei globuli rossi infetti da Plasmodium falciparum

  1. Isolare schizonti maturi mediante centrifugazione (1.580 x g) su un mezzo con gradiente di densità isotonica del 70% (v/v) (per le procedure standard su come coltivare stadi ematici asessuati di 3D7 Plasmodium falciparum in eritrociti umani vedi Blackman M.J., 199537).
  2. Fissare le pellicole di sangue sottili essiccate all'aria su un vetrino con metanolo al 100% per verificare l'omogeneità morfologica degli schizonti prima di colorare con la colorazione Giemsa al 10% in tampone fosfato da 6,7 mM, pH 7,1.
    NOTA: Per arricchire la preparazione per gli schizonti bloccati in specifici punti di uscita, gli schizonti possono essere ulteriormente sincronizzati con gli inibitori composti 2 ed E64 (vedere Risultati rappresentativi e Figura 1 per una spiegazione dell'effetto di questi inibitori).
    ATTENZIONE: Il Plasmodium falciparum è un agente patogeno umano e deve essere manipolato solo in una struttura di contenimento adeguata seguendo le linee guida locali in materia di salute e sicurezza.
  3. Centrifugare delicatamente gli schizonti (240 x g) per pellettarli e risospenderli in volume 2x del pellet cellulare di RPMI media, ottenendo una sospensione ematocrita del 50%.
  4. Su un impianto di congelamento manuale, applicare 2,5 μL di schizonti sul lato carbonio di una scarica a bagliore (utilizzare le impostazioni dell'unità di scarica del bagliore di 60 s, 30 mA in aria, trattando solo il lato carbonio della griglia) griglia di rame a 200 maglie con un film di carbonio holey 2/4 e asciugare per ~ 20 s dal retro della griglia utilizzando carta da filtro di grado 1 con un bordo strappato. Immergersi nell'etano liquido raffreddato ad azoto liquido e trasferire le griglie allo stoccaggio (vedere la tabella dei materiali per le apparecchiature utilizzate in questo studio).
    NOTA: l'esperimento può essere messo in pausa qui e le griglie possono essere conservate sotto azoto liquido a tempo indeterminato.
    ATTENZIONE: L'azoto liquido è un asfissiante e provoca congelamento; Maneggiare con cura in un ambiente adatto con monitoraggio dell'ossigeno.
    ATTENZIONE: L'etano liquido provoca gravi ustioni ed è infiammabile; Utilizzare in una cappa aspirante lontano da fonti di accensione.
    NOTA: Gli schizonti congelati a tuffo non sono più vitali. Ciò è stato determinato incubando sangue umano con diverse griglie d'oro di schizonti congelati con l'aria e osservando nessuna crescita di parassiti dopo diversi giorni, rispetto ai controlli non congelati. Le griglie congelate di schizonti sono quindi sicure da maneggiare al di fuori delle strutture di contenimento utilizzando le normali procedure di sicurezza e decontaminazione (guanti, sterilizzazione di superfici / utensili con etanolo al >70% e smaltimento delle griglie in etanolo >70%).
  5. Schermare le griglie utilizzando un crio-stadio per un microscopio ottico, prestando particolare attenzione al gradiente di ghiaccio attraverso la griglia. Nelle aree più sottili del ghiaccio, controllare i singoli quadrati della griglia per la copertura cellulare.
    NOTA: i quadrati migliori devono avere uno spessore di una cella al centro del quadrato della griglia (Figura 2). Ciò garantisce che una lamella possa essere fresata attraverso il centro del quadrato senza colpire il ghiaccio più spesso ai bordi contro le barre della griglia. L'esperimento può essere messo in pausa qui e le griglie possono essere immagazzinate sotto azoto liquido a tempo indeterminato. Se le cellule trasportano un marcatore fluorescente, le griglie possono anche essere vagliate da cryoCLEM per localizzare le posizioni X/Y di interesse, che possono essere correlate con le posizioni della griglia nel cryoFIB-SEM alla fresatura diretta.

2. Fresatura FIB su griglia di celle congelate a tuffo

  1. Contrassegnare la parte anteriore dei cerchi autogrid specifici per crioFIB con un pennarello nero indelebile per indicare il centro della sezione di taglio e il lato opposto del cerchio (Figura 3). Impostare la stazione di clipping e le griglie di clip negli anelli contrassegnati con il lato in carbonio verso il basso.
  2. Caricare le griglie nella navetta cryoFIB-SEM (tipicamente 2 griglie, a seconda della navetta) con il lato in carbonio verso l'alto e applicare uno strato di sputter di platino in atmosfera di argon (5 x 10-2 mbar) (5 mA per 60 s - lo spessore è variabile) o un rivestimento rotante e-beam in carbonio / platino (~ 4 nm di spessore) sulla superficie delle celle.
    NOTA: Entrambi i tipi di rivestimenti aiutano la dispersione della carica durante l'imaging SEM. Il vantaggio del rivestimento rotativo e-beam è che è possibile specificare lo spessore esatto del rivestimento.
  3. Caricare la navetta nel cryoFIB-SEM e valutare la distribuzione cellulare su ciascuna griglia tramite SEM a 5 kV (13 pA o 25 pA). Prendi una panoramica a basso ingrandimento (~ 100x) per osservare i gradienti di ghiaccio attraverso la griglia. Quindi, prendi immagini ad alto ingrandimento (~ 5.000x) per guardare i singoli quadrati della griglia e identificare le aree della griglia con caratteristiche cellulari visibili e bassa contaminazione superficiale per fresare.
  4. Applicare uno strato di organoplatino da >2 μm sulla superficie di ciascuna griglia utilizzando il sistema di iniezione di gas (GIS). Per fare ciò, inserire l'ago GIS nella camera sopra la griglia e riscaldare la sorgente organoplatino a una temperatura impostata per un tempo impostato (ad esempio, ~ 27 ° C per 3-10 s) per produrre un flusso di vapore.
    NOTA: L'angolo di applicazione, la temperatura e la tempistica del rivestimento organoplatino tramite l'ago GIS devono essere ottimizzati per massimizzare un rivestimento uniforme. Ciò dipenderà dalla specifica crioFIB-SEM utilizzata (vedere Risultati rappresentativi per ulteriori spiegazioni).
  5. Inclinare il campione in modo che il piano della griglia sia ~10° rispetto all'angolo di incidenza del fascio ionico e spostare il centro di un quadrato della griglia adatto da vedere sia nelle immagini SEM che FIB.
  6. Osserva la griglia usando il fascio di ioni a bassa corrente (nominalmente 1,5 pA, 30 kV) e vai a un ingrandimento abbastanza alto (~ 7.000x) per visualizzare le celle al centro di un quadrato della griglia. Mettere a fuoco il campione alla prima corrente di fresatura (300 pA) e correggere l'astigmatismo. Regolare la luminosità e il contrasto, quindi contrassegnare due motivi rettangolari da fresare, uno sopra e uno sotto una regione protetta spessa 3 μm, il cui centro è la posizione desiderata della lamella finale.
    NOTA: la larghezza scelta dei modelli dipenderà dalla topografia dello strato cellulare circostante e dalla dimensione della cella. 7-20 μm è una larghezza adatta per gli schizonti, ma le lamelle più larghe richiedono più tempo per macinare. L'altezza scelta dei modelli per la prima fase di fresatura dipende dallo spessore del campione, a partire da circa 6 μm; Potrebbe essere necessario regolarlo durante la fresatura. La fresatura viene eseguita direzionalmente dai bordi esterni superiore e inferiore dei modelli verso la faccia della lamella. Questo può essere fatto in parallelo, dove entrambi i modelli vengono fresati contemporaneamente o sequenzialmente, rimuovendo prima il materiale da sopra la lamella e poi da sotto.
  7. Iniziare la fresatura alla prima corrente; monitorare l'avanzamento in tempo reale nella vista del fascio ionico e in modo intermittente tramite SEM (5 kV, 13 o 25 pA). Verificare che il fascio ionico abbia sfondato il campione sopra e sotto la regione protetta. In caso contrario, aumentare l'altezza dei motivi rettangolari per rimuovere più materiale. Fermati quando la superficie sopra e sotto la lamella è completamente liscia nella vista del fascio ionico.
    NOTA: il fascio ionico ha attraversato il campione sopra e sotto la regione protetta quando l'interno dei motivi rettangolari non contiene caratteristiche nel piano focale. Alcune funzioni, ad esempio le barre della griglia, potrebbero essere visibili fuori fuoco in background.
  8. Passaggio alla corrente di fresatura successiva (100 pA); messa a fuoco e regolazione della luminosità/contrasto. Ridurre lo spazio tra i due modelli rettangolari a 1,5 μm e diminuire l'altezza del modello per coprire solo il materiale non fresato. Iniziare la fresatura alla nuova corrente fino a quando la superficie sopra e sotto la lamella è completamente liscia.
  9. Ripetere questo processo gradualmente fino a raggiungere uno spessore di 0,3 μm, riducendo ogni volta la corrente del fascio ionico secondo lo schema di fresatura nella tabella 1.
  10. Fresare diverse lamelle (la quantità dipende dallo spessore del campione e dal tempo disponibile) su una o entrambe le griglie fino a uno spessore di 0,3 μm, registrare la posizione X/Y/Z di ciascuna lamella e riservare ~1-2 h alla fine della sessione per lucidare le lamelle al loro spessore finale (60-200 nm).
  11. Prendete una panoramica SEM a basso ingrandimento dell'intera griglia e pianificate un percorso di lucidatura a partire dalle lamelle nella parte anteriore della griglia (più vicine alla sorgente del fascio ionico) fino alle lamelle nella parte posteriore della griglia (più lontane dalla sorgente del fascio ionico) (Figura 5).
    NOTA: Questo riduce la rideposizione del materiale ablato sulla superficie delle lamelle levigate.
  12. Ridurre lo spazio tra i due modelli rettangolari a 100-200 nm e iniziare la fase finale di lucidatura con una corrente del fascio ionico di 30 pA. Monitorare l'avanzamento tramite SEM a 2-3 kV (13 pA, dwell = 300 n, 3072 x 2048, ~2 s per un full frame) e interrompere la lucidatura quando il contrasto viene perso nella lamella da SEM o quando lo strato organoplatino della lamella stessa inizia a perdere integrità.
  13. Prima di rimuovere le griglie, acquisire un'immagine SEM a basso ingrandimento dell'intera griglia e salvare le immagini di ciascuna lamella. Usali per effettuare un controllo incrociato della griglia più avanti nel TEM. Metti in pausa l'esperimento qui e conserva le griglie con lamelle sotto azoto liquido - maneggiare con cura.
    NOTA: Le griglie possono essere leggermente rivestite di sputter dopo la rimozione dal cryoFIB-SEM, che può aiutare a limitare la deriva e la carica nel TEM ad alto ingrandimento, ma questo dovrebbe essere fatto con cautela poiché troppo rivestimento sputter può oscurare il contenuto biologico all'interno delle lamelle. È possibile esaminare le lamelle per la fluorescenza in questa fase; Tuttavia, ottenere un segnale sufficiente dipenderà dall'abbondanza della proteina marcata all'interno dello spessore della lamella. È necessario prestare molta attenzione alla manipolazione delle griglie per limitare i danni alle lamelle e prevenire la contaminazione superficiale.

3. Acquisizione della serie Tilt e panoramica generale dell'elaborazione dei dati

  1. Caricate le griglie nel TEM, allineando la direzione di fresatura perpendicolarmente all'asse di inclinazione dello stage.
    NOTA: l'allineamento delle griglie viene eseguito ad occhio utilizzando i segni sul bordo della griglia automatica. Un margine di errore di ~ 10 ° è accettabile, altrimenti le pareti della trincea su entrambi i lati della lamella potrebbero oscurare la lamella mentre la griglia è inclinata.
  2. Acquisire una mappa a basso ingrandimento (~150x) dell'intera griglia e localizzare le lamelle; Quindi, acquisire una mappa di ingrandimento medio (~ 1.500x, a seconda delle dimensioni della lamella) di ciascuna lamella e individuare le aree di interesse.
  3. Pre-inclinare la griglia di ±10° per rendere il piano della lamella (non la griglia) perpendicolare all'asse ottico
    NOTA: La direzione della pre-inclinazione può essere determinata dalla posizione del bordo anteriore delle lamelle (cercando il rivestimento organoplatino sinistro) nelle mappe di ingrandimento basso e medio. Per il TEM utilizzato qui, le griglie richiedono una pre-inclinazione di +10° se i bordi anteriori delle lamelle puntano verso l'alto nelle mappe e richiedono una pre-inclinazione di -10° se puntano verso il basso. Ogni griglia può essere diversa a causa di come sono stati prelevati e inseriti nel caricatore automatico.
  4. Acquisire inclinazione a simmetria dose serie38 (ad esempio, da -54° a +54° con un incremento di 3-5°) a una dimensione in pixel che consenta sia il campo visivo che la risoluzione richiesta per la regione di interesse. Utilizzare un intervallo di valori di sfocatura compresi tra -2 e -5 μm. Raccogli filmati con 3-10 fotogrammi ad ogni incremento e per questo, regola questi parametri in base alla dimensione dei pixel per accumulare una dose totale di ~ 150 e-/Å2 (per un TEM da 300 kV).
    NOTA: Le crepe nella lamella devono essere evitate in quanto queste regioni potrebbero andare alla deriva. Anche la contaminazione superficiale dovrebbe essere evitata in quanto potrebbe oscurare la regione di interesse o l'area di messa a fuoco ad alta inclinazione.
  5. Correggere il movimento dei filmati utilizzando un programma come MotionCor239. Applicare un filtro di ponderazione della dose alle immagini corrette (accumulato e-/image)40 e stimare la sfocatura di ciascuna immagine utilizzando un programma come CTFFIND441.
  6. Utilizzare l'allineamento senza fiducia (patch tracking) in un programma come etomo (IMOD)42 per calcolare l'allineamento e la relazione angolare delle immagini in serie di inclinazione.
  7. Immettere le informazioni di allineamento e rotazione, insieme ai valori di sfocatura in un programma in grado di applicare la correzione CTF tridimensionale, ad esempio NovaCTF43. Calcolare un tomogramma corretto per ottenere tomogrammi in uscita con fattori di binning rilevanti per l'analisi a valle.
  8. Analizza le ricostruzioni e preparati per qualsiasi elaborazione a valle, ad esempio filtraggio, segmentazione o media sub-tomogramma.

Representative Results

Preparazione degli schizonti di P. falciparum per il congelamento a tuffo
Gli inibitori composti 2 ed E64 sono usati per bloccare gli schizonti in diversi stadi di uscita, generando una popolazione arricchita di schizonti per studi successivi. Questo è importante perché senza una tecnica correlativa complementare, la fresatura di specifici bersagli subcellulari o tipi di cellule è impegnativa in quanto il processo è essenzialmente cieco. Il composto 2 è un inibitore della protein chinasi che blocca l'uscita prima della rottura del vacuolo. Gli schizonti possono essere sincronizzati sul composto 2 per 4 ore, quindi lavati con mezzi composti 2-free per rimuovere l'inibitore, a quel punto gli schizonti matureranno e usciranno dopo circa 30 minuti. In alternativa, gli schizonti sincronizzati composti 2 possono essere lavati in E64, un inibitore irreversibile della proteasi della cisteina ad ampio spettro, e incubati per circa 1 ora per bloccare l'uscita dopo il punto di rottura del vacuolo, ma prima della rottura della cellula ospite. La morfologia e l'omogeneità degli schizonti trattati devono essere verificate mediante strisci di sangue colorati con Giemsa prima del congelamento a immersione (Figura 1). Gli schizonti possono essere immersi in uno di questi stati usando il metodo descritto in questa pubblicazione.

Figure 1
Figura 1: La morfologia degli schizonti composti 2 e E64-stalled di P. falciparum mediante strisci di sangue colorati di Giemsa. (A) In presenza del composto 2 il vacuolo parassitoforo (PV) è densamente ricco di merozoiti (cerchi viola) con un singolo gruppo di cristalli di emozoina (cerchio marrone scuro). Il confine tra il PV e l'emoglobina circostante nel globulo rosso ospite (hRBC) (banda grigia) è ben definito, così come la membrana hRBC. (B) In presenza di E64, la membrana PV viene rotta e i merozoiti si diffondono all'interno dell'hRBC. Ogni schizonte contiene ancora un singolo gruppo di cristalli di emozoina. La membrana della cellula ospite è permeabile e parzialmente collassata, quindi nessuna emoglobina è visibile all'interno della periferia cellulare e il confine della membrana hRBC non è facilmente visibile. Barra scala, 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Ottimizzazione del congelamento a tuffo
Una serie di griglie con diverse dimensioni dei fori sono state testate durante l'ottimizzazione delle condizioni di blotting per i globuli rossi infetti da P. falciparum, tra cui 2/2, 3/3, 3,5/1 e 5/2 (quadrato) Holey carbonio su griglie a maglia 200 in oro e rame. Le griglie di ricerca in rame a maglie 200 con film di carbonio Holey 2/4 forniscono uno strato di cellule adeguatamente spesso per fresare lunghe lamelle vitreali. Fori più grandi o più piccoli hanno generalmente portato a strati cellulari troppo sottili o spessi, rispettivamente (Figura 2A-C). Con 2/4 di carbonio holey, gli schizonti vengono tirati attraverso i fori da 2 μm cancellando la griglia dal retro (lato non carbonioso), con conseguente fuoriuscita delle cellule sopra e sotto il film di carbonio. Il tratto di carbonio di 4 μm tra i fori si traduce in una striscia di carbonio che attraversa il centro della maggior parte delle lamelle risultanti, aggiungendo forza. Le griglie del Finder sono più adatte per scopi di correlazione e vagliatura44, ma è necessario prestare attenzione per assicurarsi che i numeri / lettere nel design della mesh non siano troppo grandi in quanto ciò bloccherà le aree per la fresatura.

Il tempo di tamponamento su uno stantuffo manuale è di circa 20 s, ma il punto esatto in cui interrompere l'asciugatura è stato giudicato ad occhio quando la goccia di liquido prelevata dalla griglia ha smesso di diffondersi sulla carta da filtro. Era necessario un bordo strappato per rompere la tensione superficiale della goccia per avviare il processo di asciugatura. In questo studio non è stato utilizzato un congelatore automatico a tuffo, ma un punto di partenza ragionevole per questo campione sarebbe quello di utilizzare lo stesso volume di celle e lo stesso tipo di griglia utilizzati per uno stantuffo manuale, assicurandosi di asciugare le griglie dal retro in condizioni di elevata umidità (~ 70%) e temperatura ambiente (~ 25 ° C). I tempi e le condizioni di blotting dovrebbero essere ottimizzati per il particolare sistema automatizzato utilizzato.

Le griglie congelate a tuffo degli schizonti di P. falciparum sono state schermate da un microscopio ottico dotato di un crio-stadio piuttosto che da TEM, perché il campione non era trasmissibile agli elettroni. Per i campioni più sottili, le griglie possono essere vagliate da TEM (intero atlante della griglia con ingrandimento ~ 150x) prima del trasferimento del campione nel cryoFIB-SEM, che può essere un prerequisito per accedere a una struttura nazionale. Particolare attenzione dovrebbe essere prestata al gradiente dello spessore del ghiaccio attraverso la griglia e anche all'interno dei singoli quadrati della griglia. I quadrati della griglia buoni dovrebbero essere spessi una cella o colpire il film di carbonio al loro centro (Figura 2C). Ciò evita la fresatura nel ghiaccio più spesso contro le barre della griglia attorno al bordo del quadrato della griglia e assicurerà che il fascio di ioni si rompa sopra e sotto lo strato cellulare, producendo una lamella libera piuttosto che un cuneo. Una volta ottimizzate le condizioni di blotting riproducibile e di congelamento a tuffo, lo screening di solito non è più necessario prima della fresatura FIB.

Figure 2
Figura 2. Analisi della distribuzione cellulare su griglie di schizonti di P. falciparum congelati a tuffo mediante microscopia crioleggera. (A) Un esempio di ghiaccio troppo spesso attraverso un quadrato della griglia mediante microscopia crioleggera, oscurando le cellule e il film di carbonio. Barra di scala, 10 μm. (B) Un esempio della dimensione del foro (griglia di rame a 300 maglie con pellicola di carbonio Holey quadrata 5/2) è troppo grande per le cellule, risultando in uno strato molto sottile di materiale biologico circondato da regioni vuote senza ghiaccio. Griglie come questa producono lamelle molto corte e instabili. Barra di scala, 10 μm. (C) Un esempio di buona distribuzione delle celle su una griglia di rame a 200 maglie con film di carbonio holey a 2/4. Questi schizonti sono stati trattati con inibitore E64. Le grandi cellule (scatola rossa, ~ 5 μm di diametro) con una periferia ben definita sono globuli rossi infetti che hanno ancora una membrana vacuola intatta. I gruppi di piccole cellule (scatola blu, ~ 1 μm) sono i singoli merozoiti contenuti all'interno di un globulo rosso ospite parzialmente collassato. Ogni schizonte ha una macchia nera al centro, che indica la posizione dei cristalli di emozoina (vedi Figura 1 per ulteriori dettagli). La differenza nella morfologia cellulare non è così facile da vedere una volta all'interno del cryoFIB-SEM; Pertanto, il pre-screening mediante microscopia crioleggera è utile fino al raggiungimento di condizioni di blotting riproducibili. La copertura delle celle attorno ai bordi del quadrato della griglia accanto alle barre della griglia (aree tratteggiate di bianco) è troppo spessa per la fresatura. La regione più sottile al centro del quadrato della griglia (area tratteggiata di giallo) è un luogo ideale per fresare, estendendo la lamella nello strato circostante di cellule. Barra di scala, 6 μm. (D) Immagine di un cerchio autogrid specifico per crioFIB con due segni neri, uno all'interno della sezione di taglio (parentesi nera) e l'altro opposto, a ore 12 e ore 6. La freccia nera rappresenta la direzione di fresatura. (E) Quando le griglie vengono caricate nella cassetta del caricatore automatico, i segni devono essere equidistanti su entrambi i lati delle pinzette di carico, con il risultato che le lamelle giacciono perpendicolarmente all'asse di inclinazione del palco. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Marcatura di cerchi autogrid specifici per crioFIB per la tomografia
Tipicamente, le griglie vengono agganciate ai cerchi della griglia automatica prima della fresatura per facilitare la manipolazione e fornire rigidità, che protegge le lamelle da danni durante le successive fasi di trasferimento. I cerchi autogrid specifici di CryoFIB sono stati progettati con una funzione di taglio per aiutare ad accedere a più della faccia della griglia durante la fresatura. È importante orientare la direzione di fresatura perpendicolarmente all'asse di inclinazione del TEM in modo che l'acquisizione della serie di inclinazione proceda ruotando la lamella lungo la sua lunghezza. Ciò garantisce che le alte pareti della trincea che circonda la lamella non oscurino le informazioni biologiche mentre la griglia è inclinata.

Tipicamente, il cerchio della griglia automatica è contrassegnato per aiutare con l'allineamento visivo all'interno della navetta cryoFIB-SEM e successivamente durante il caricamento del TEM. Per questi campioni, a ore 12 e a ore 6 sono stati applicati due segni con un marcatore indelebile (vedi Tabella dei materiali), uno al centro della sezione di taglio dell'anello della clip e il secondo direttamente opposto (Figura 2D). Durante il caricamento nel TEM (vedere Tabella dei materiali), entrambi i segni devono essere visibili su entrambi i lati delle pinzette di caricamento e allineati di 90° al bordo delle pinzette (Figura 2E). Va notato che il produttore consiglia di allineare le griglie utilizzando i punti incisi sui cerchi della griglia automatica, poiché alcuni inchiostri in prossimità del fascio ionico possono interferire con la fresatura.

Le griglie ritagliate possono essere schermate al microscopio ottico con una cassetta modificata per un crio-stadio, che può essere utile per verificare che il processo di clipping non abbia distrutto il film di carbonio della griglia. A seconda della cassetta del campione, le griglie non tagliate possono anche essere fresate, ma è necessario prestare molta attenzione durante il trasferimento dal crioFIB-SEM al TEM per limitare qualsiasi flessione della griglia in quanto ciò romperebbe le lamelle. Le griglie non agganciate possono essere caricate nel TEM da crio-supporti ad ingresso laterale, ma c'è un'alta probabilità che le lamelle si rompano se il clipping viene eseguito dopo la fresatura.

Rivestimento organoplatino
Il rivestimento organoplatino viene eseguito su una o entrambe le griglie una volta caricate nel cryoFIB-SEM. L'ago del sistema di iniezione di gas (GIS) viene inserito nella camera sopra il campione per dirigere un flusso di vapore organoplatino attraverso la superficie della griglia da una fonte riscaldata per un tempo prestabilito. Il vapore si condensa su superfici fredde e forma uno strato solido (~ 2 μm di spessore). L'integrità di questo strato è fondamentale per consentire la fresatura di lamelle uniformemente sottili. Le condizioni ottimali di applicazione per il rivestimento organoplatino sono solitamente predeterminate dal produttore dello strumento, ma potrebbe essere necessaria una certa ottimizzazione. La maggior parte dei sistemi allinea l'ago GIS vicino alla direzione di fresatura o perpendicolarmente alla direzione di fresatura, a seconda della geometria delle porte sulla camera e dei limiti di rotazione dello stadio. Diverse impostazioni possono essere provate rivestendo la griglia, fresando una piccola regione, inclinando il palcoscenico e misurando lo spessore del rivestimento mediante SEM.

Oltre alla configurazione del cryoFIB-SEM stesso, una serie di altri fattori possono influenzare l'applicazione del rivestimento organoplatino, tra cui 1) la topografia del campione, 2) la contaminazione superficiale sulla griglia e 3) la riproducibilità del flusso di vapore dall'ago GIS. Poiché il flusso GIS è direzionale, la topografia irregolare può causare la rimozione di regioni all'ombra delle cellule o la contaminazione superficiale o un rivestimento più sottile. Ciò può portare a un collasso dello strato di organoplatino durante la lucidatura (Figura 3). Quando si seleziona un'area da fresare, è necessario essere consapevoli della topografia circostante, ad esempio, grandi contaminazioni superficiali, grumi di cellule o carbonio rotto che sporgono dalla superficie della griglia fino a un paio di quadrati di griglia di distanza, possono bloccare il flusso di vapore, creando un'ombra di organoplatino più sottile che può indebolire una lamella. Inoltre, dovrebbero essere evitate particelle molto piccole di contaminazione superficiale vicino al bordo anteriore della lamella in quanto possono staccarsi durante la fresatura, lasciando una macchia indebolita di ghiaccio nudo che può causare lo sviluppo di un foro nella lamella durante la lucidatura. Infine, se la fresatura è iniziata e il rivestimento organoplatino sembra instabile, rivestire di nuovo, più a lungo, o passare su una griglia di riserva.

Figure 3
Figura 3: Un rivestimento organoplatino di buona qualità è fondamentale per ottenere lamelle sottili e uniformemente fresate. (A) Una micrografia del bordo anteriore di una lamella in cui il rivestimento organoplatino (OP, giallo) è stato applicato in modo troppo sottile, causando un foro nel bordo anteriore della lamella che si è sviluppato durante la lucidatura (cerchio verde) e una fresatura irregolare su tutta la larghezza della lamella (striature). La superficie organoplatino è stata tagliata dal fascio ionico, portando a uno spruzzo di materiale dietro il bordo anteriore del rivestimento (linea tratteggiata gialla). (B) Il rivestimento organoplatino (OP) è stato applicato più spesso, ottenendo una lamella più uniformemente assottigliata. L'integrità del mantello è preservata su tutta la larghezza della lamella e l'interfaccia tra il rivestimento organoplatino e il materiale biologico vetrificato è ben definita (linea tratteggiata gialla). Lo strato di carbonio può essere visto correre attraverso la parte posteriore della lamella (arancione). Barre di scala, 1 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Valutazione della qualità della griglia nel cryoFIB-SEM e del processo di fresatura
Una volta che le griglie sono state trasferite al cryoFIB-SEM, l'integrità del film di carbonio e la distribuzione delle celle sulle griglie possono essere vagliate da SEM (Figura 4A-C). I gradienti di ghiaccio, le posizioni delle barre della griglia e la posizione dei numeri di griglia sulle griglie del mirino possono essere controllati da SEM a basso ingrandimento a 30 kV (Figura 4B), ma la tensione dovrebbe essere ridotta a 5 kV mentre si individuano posizioni di fresatura ad alto ingrandimento e si monitora il processo di fresatura per aumentare il contrasto dalla topografia superficiale.

Figure 4
Figura 4: Valutazione della qualità della rete e localizzazione delle aree da fresare nel cryoFIB-SEM . (A) Una panoramica a basso ingrandimento di una rete a 5 kV tramite il SEM. La sezione di taglio del bordo della griglia automatica è visibile nella parte inferiore dell'immagine. Barra di scala, 0,5 mm. (B) La stessa griglia a 30 kV di SEM, che mostra aree di ghiaccio più spesso (quadrati della griglia più scuri) e ghiaccio più sottile (quadrati della griglia più chiari). L'inserto mostra la regione nella casella, con frecce che indicano la numerazione sulla griglia del finder, che è visibile a 30 kV. Barra di scala, 0,5 mm. (C) Una panoramica a medio ingrandimento di due quadrati della griglia che valutano la distribuzione delle celle sul film di carbonio e la posizione delle barre della griglia. Barra di scala, 50 μm. (D) La disposizione dei modelli di fresatura per il primo taglio ad alto ingrandimento (vista del fascio ionico a 1,5 pA e 30 kV). La regione rossa (3 μm di spessore) è protetta, mentre le regioni gialle saranno ablate dal fascio ionico. La linea tratteggiata di bianco indica la posizione della lamella finale. Barra scala, 10 μm. (E) Una vista ad alto ingrandimento a 3 kV tramite il SEM di una lamella levigata spessa 200 nm (10 μm di larghezza x 15 μm di lunghezza). La perdita di contrasto all'interno della lamella a 3 kV indica che è stato raggiunto uno spessore adeguato. Il bordo frontale bianco brillante è lo strato organoplatino rimanente che viene applicato alla griglia tramite il GIS prima della macinazione. Barra della scala, 5 μm. (F) La stessa lamella di (E) vista usando il fascio ionico a 30 kV e 1,5 pA. La sottile linea bianca attraverso il quadrato nero (freccia bianca) è il rivestimento organoplatino rimanente sul bordo anteriore della lamella. Barra scala, 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Una regione da fresare viene selezionata disponendo una coppia di motivi rettangolari su entrambi i lati di una regione protetta ad alto ingrandimento (~ 7.000x per gli schizonti) nella vista del fascio ionico (Figura 4D). È fondamentale che nessuna particella di contaminazione superficiale sia attaccata vicino alla regione di macinazione in quanto potrebbero aver oscurato l'applicazione dello strato protettivo di organoplatino. È anche importante che la topografia della regione sia adatta a sostenere i lati della lamella una volta raggiunto il suo spessore finale.

Per gli schizonti malarici (dimensione della cella: ~ 5 μm di diametro x 2 μm di spessore, forma a disco) è possibile fresare lamelle larghe tra 7-20 μm. Se lo strato cellulare è adeguatamente spesso, le lamelle di solito finiscono per ~ 10-15 μm di lunghezza, catturando più cellule sopra e sotto lo strato di carbonio (Figura 4E-F). Ci si può aspettare di fresare 5-10 lamelle in una sessione di 8 ore (6-7 h di fresatura e 1-2 ore di lucidatura). Questo varierà a seconda dello spessore del campione e della larghezza delle lamelle, con campioni più spessi e lamelle più larghe che richiedono più tempo per macinare. Anche le griglie danneggiate possono essere fresate in quanto richiede solo una manciata di buoni quadrati della griglia per generare una serie di lamelle (Figura 5A). Inoltre, se il campione è più sottile del previsto, ad esempio, a causa di un'eccessiva macchiatura o di una variazione dell'ematocrito della coltura, le lamelle più corte possono essere fresate in tempi relativamente brevi; tuttavia, la loro lunghezza inferiore limiterà l'area disponibile per la raccolta dei dati nel TEM (Figura 5B).

Figure 5
Figura 5: Determinazione del momento in cui è stato raggiunto lo spessore finale della lamella durante la fresatura. (A) Panoramica a basso ingrandimento di una griglia di SEM a 5 kV che mostra il danno al carbonio durante il clipping. Le aree non danneggiate contenevano campioni molto sottili a causa di over-blotting; tuttavia, era ancora possibile fresare sei lamelle su questa griglia (la regione all'interno del contorno tratteggiato di bianco) in una sessione di un'intera giornata sul crioFIBSEM. Barra della scala, 0,5 mm. (B) Una lamella corta (~10 μm di larghezza x 3 μm di lunghezza, escluso lo strato di organoplatino) prodotta da questa griglia (SEM a 3 kV), che forniva ancora due regioni da cui raccogliere le serie inclinate. Barra della scala, 25 μm. (C) Una serie di immagini SEM (3 kV) di una lamella durante la fase finale di lucidatura che mostrano come il contrasto viene perso nella lamella mentre viene assottigliata (spostandosi da sinistra a destra). La linea nera scura attraverso il centro della lamella in tutte le immagini è una striscia di pellicola di carbonio dalla griglia. Le cellule di fronte a questa regione sono state vetrificate sopra il film di carbonio e le cellule dietro questa regione sono state vetrificate sotto il film di carbonio. La fresatura è stata interrotta quando lo strato organoplatino sul lato sinistro del bordo anteriore della lamella stava per perdere l'integrità strutturale. Questo punto di arresto era prima che l'intera lamella fosse portata a uno spessore uniforme, motivo per cui c'è ancora del materiale a contrasto più elevato nella parte posteriore della lamella. (D) Un esempio di un percorso di lucidatura basato sulle lamelle fresate sulla griglia di cui al punto (A). Un percorso di lucidatura dovrebbe iniziare dalle lamelle più vicine alla sorgente FIB, allontanandosi dalla sorgente FIB per limitare la rideposizione di materiale fresato sulla superficie delle lamelle. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Durante la lucidatura, lo spessore finale di una lamella dipenderà dalla struttura del campione nella regione da fresare, dall'integrità dello strato organoplatino e dal tempo disponibile. Idealmente, il campione dovrebbe essere assottigliato fino a quando il contrasto non viene perso su tutta la superficie della lamella da SEM a 3 kV, suggerendo che è uniformemente trasparente agli elettroni e spesso circa 150-200 nm (Figura 5C). Tuttavia, potrebbe essere necessario interrompere la fresatura prima di questo punto se lo strato di organoplatino sviluppa un foro o la lamella inizia a piegarsi. In questo caso, la lamella può essere ancora abbastanza sottile nella parte anteriore e rimanere utile per la tomografia. Al contrario, è possibile assottigliare oltre la fase di perdita di contrasto se la lamella sembra stabile, rendendola ancora più sottile avvicinando i modelli di fresatura (~ 100 nm o meno). Ciò dipenderà dallo spessore, se necessario, per il flusso di lavoro a valle. È necessaria un'immagine SEM a basso ingrandimento per pianificare un percorso di lucidatura, iniziando più vicino alla sorgente del fascio ionico e lavorando lontano (Figura 5D). La direzione del percorso di lucidatura è importante per evitare la rideposizione di materiale ablato su lamelle già finite.

Raccolta ed elaborazione dei dati della serie inclinata
Una volta caricato nel TEM, un montaggio a griglia completa a basso ingrandimento (~150x) identificherà le posizioni delle lamelle, che possono essere correlate all'immagine SEM a basso ingrandimento scattata alla fine della fresatura. Per gli schizonti congelati a tuffo, la maggior parte della griglia non è trasparente agli elettroni, quindi le posizioni delle lamelle appaiono come tacche bianche su uno sfondo nero (Figura 6A). L'angolo delle lamelle rispetto all'asse di inclinazione del microscopio dovrebbe essere notato, poiché più di ~ 10 ° di distanza dalla perpendicolare potrebbe rendere difficile l'acquisizione della serie di inclinazione. Un montaggio a medio ingrandimento (~ 1.500x) nella posizione di ciascuna lamella fornirà una panoramica del contenuto biologico e verificherà la presenza di danni da trasferimento, ghiaccio cristallino o eccessiva contaminazione superficiale (Figura 6B-D). Questo dovrebbe anche essere controllato ad alta inclinazione per garantire che nessuna contaminazione superficiale oscuri l'acquisizione o l'area di messa a fuoco. La scelta di una regione di acquisizione dipenderà non solo dalle caratteristiche biologiche, ma anche dall'integrità strutturale del ghiaccio nella regione circostante, ad esempio, evitando crepe, poiché queste regioni andranno alla deriva, o aree con cortina eccessiva, dove una lamella avrà uno spessore variabile. Prima di acquisire una serie di inclinazione, una pre-inclinazione di ±10° viene applicata alla griglia per rendere il piano delle lamelle (non la griglia) perpendicolare all'asse ottico. La direzione della pre-inclinazione può essere determinata dalla posizione del bordo anteriore delle lamelle (cercando il rivestimento organoplatino sinistro) nel montaggio a medio ingrandimento. Per il TEM usato qui (300 kV Titan Krios), se i bordi anteriori delle lamelle puntavano verso l'alto nella mappa, ciò richiedeva una pre-inclinazione di +10° e se puntavano verso il basso, ciò richiedeva una pre-inclinazione di -10°. Ogni griglia può essere diversa a causa dell'orientamento in cui sono stati prelevati nelle pinzette e inseriti nel caricatore automatico (sezione di taglio rivolta a sinistra o a destra, produce una rotazione di 180°). Un'ultima considerazione è la dimensione dei pixel. Di routine, le serie tilt-series sono raccolte intorno a 2,5-7 Å / pixel, tenendo conto della dimensione della caratteristica di interesse, della risoluzione target dei dati tomografici risultanti e della superficie della lamella, che può limitare la dimensione dell'area di acquisizione. È possibile utilizzare una dimensione di pixel più piccola per ottenere informazioni ad alta risoluzione e il più piccolo che abbiamo usato con successo su questi campioni è 1,4 Å / pixel (dati non mostrati). La deriva sarà più evidente a una dimensione di pixel più piccola ed è davvero adatta solo per lamelle sottili (<100 nm) in cui la massimizzazione della risoluzione è importante nello studio.

Figure 6
Figura 6: Scelta delle regioni di interesse accessibili da cui acquisire la serie di inclinazione (A) Sezione di una mappa TEM a basso ingrandimento che mostra una regione contenente lamelle, che appare come sei tacche bianche su sfondo nero (frecce rosse). I quadrati bianchi sono film di carbonio rotto. (B) Una mappa di medio ingrandimento di una lamella danneggiata e devitrificata. Sul bordo anteriore della lamella (FE) il rivestimento organoplatino si è staccato (1). C'è una chiazza chiara di ghiaccio cristallino al centro della lamella (2). Il fascio ionico non è riuscito a sfondare sul bordo posteriore della lamella (BE) perché il ghiaccio è troppo spesso vicino alle barre della griglia. Solo una piccola porzione della lamella è libera dal ghiaccio circostante al BE (3), creando un cuneo. Lo spessore ha anche causato il taglio di scaffali sopra la lamella (4), che molto probabilmente bloccherà la vista delle celle ad alta inclinazione nel TEM. (C) Montaggio a medio ingrandimento di un'intera lamella vista nel TEM. I problemi tipici o le regioni da evitare quando si raccolgono le serie inclinate dalle lamelle sono le aree: coperte da contaminazione superficiale (SC), coperte dal rivestimento organoplatino (OP, giallo), vicino a crepe (CR e frecce nere), con tenda dovuta a cambiamenti di densità nel materiale biologico (CU e regione entro parentesi blu) e aree indebolite da rotture nel rivestimento organoplatino (cerchio verde). Le uniche aree accessibili per l'acquisizione della serie inclinabile sono le aree all'interno delle due caselle tratteggiate di nero (etichettate 1 e 2). La vista deve essere controllata ad alta inclinazione per assicurarsi che la contaminazione della superficie non oscuri la regione di interesse o l'area di messa a fuoco. (D) Un montaggio a medio ingrandimento di una lamella molto più pulita, ma che presenta ancora crepe (CR) causate dall'assottigliamento del rivestimento organoplatino (cerchio verde) durante la lucidatura. Qui, la regione di interesse è evidenziata dal tipo di cellula osservato all'interno della lamella, che in questo caso sono i singoli merozoiti, posizionati dietro lo strato di carbonio (arancione) verso la parte posteriore della lamella (scatola tratteggiata di nero). Barre della scala, 3 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Acquisizione dei dati crio-ET da lamelle fresate FIB. (A) Una micrografia di una regione di una lamella contenente un globulo rosso che è stata recentemente invasa da un merozoite di P. falciparum. In (B) la stessa immagine è annotata per mostrare il confine del globulo rosso (rosso), un numero di vescicole intracellulari a doppia parete (viola e blu per le membrane interne ed esterne, rispettivamente) e il merozoite (verde) circondato da una seconda membrana derivata dalla cellula ospite (giallo). Una scatola nera mostra l'area in cui è stata acquisita una serie inclinabile. Barra scala, 500 nm. (C) Una media di 20 fette centrali osservate nel piano XY da un tomogramma binned 8x (2,4 Å / pixel) acquisito all'estremità apicale del merozoite e in (D) la sua annotazione, che mostra le due membrane che circondano la cellula (verde e giallo) e quattro membrane impilate all'apice del merozoite (blu) che sono associate a una caratteristica a forma di fungo denso di elettroni (viola). Una freccia rossa indica la giunzione delle pile di membrane nell'apice e la caratteristica a forma di fungo (mostrata anche nella parte F, i). Una freccia nera indica un evento di fusione tra la membrana plasmatica della merozoite e una delle vescicole multistrato all'interno del parassita (mostrata anche nella parte F, ii). Viene mostrata la membrana dei globuli rossi dell'ospite (rosso) e una linea tratteggiata nera mostra la posizione di una sezione trasversale visualizzata nel piano XZ, mostrata in (E). Le caratteristiche nella sezione trasversale (E) sono colorate ed etichettate come nella parte (D), con frecce colorate che puntano alle membrane. Una freccia nera indica la posizione di uno sputter coat applicato alla lamella dopo la fresatura e lo spessore della lamella in indicato. Per le parti (C-E), barra scala, 500 nm. (F) Una visione più dettagliata delle caratteristiche indicate dalle punte delle frecce rosse e nere nella parte (C), che mostra la definizione nei doppi strati lipidici della pila di membrana all'apice del merozoite (i) e l'evento di fusione tra la vescicola multistrato con la membrana plasmatica della merozoite. Barra scala, 75 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

L'obiettivo principale del lavoro è quello di sezionare il percorso di uscita dei merozoiti in P. falciparum Ma dato che la popolazione di cellule utilizzate nello studio non può mai essere completamente omogenea, spesso sono stati osservati altri stadi di sviluppo cellulare all'interno delle lamelle. L'esempio mostrato qui (Grafico 7) contiene un globulo rosso che è stato recentemente invaso da un P. falciparum parassita (merozoite). La lamella utilizzata aveva uno spessore di 240 nm e la griglia era stata leggermente rivestita di platino in un'atmosfera di argon prima dell'inserimento nel TEM, con conseguente contrasto leggermente inferiore a quello che ci si aspetterebbe normalmente. La membrana dei globuli rossi potrebbe essere tracciata nella sua interezza che circonda la cellula. All'interno del globulo rosso c'erano tre strutture racchiuse legate alla membrana, due vescicole, ciascuna circondata da una doppia membrana e una caratteristica a forma di lampadina (1,2 μm x 0,9 μm nelle sue parti più larghe), che è coerente con il fatto che si tratta di un merozoite (Figura 7A-B). Il contenuto delle due vescicole sembrava essere simile in contrasto con quello del contenuto dei globuli rossi, suggerendo che queste vescicole possono contenere emoglobina. La presenza di vescicole all'interno del globulo rosso ospite dopo l'invasione è stata osservata in precedenza45. Si pensa che derivino dalla secrezione di lipidi e altri fattori di virulenza da organelli secretori chiamati roptri nel merozoite, che si scaricano nel globulo rosso ospite durante l'invasione. Il merozoite è circondato da due membrane strettamente associate, la più interna delle quali è presumibilmente la membrana plasmatica nativa del merozoite, sulla quale non vi è alcun rivestimento superficiale visibile, e la parte più esterna deve derivare dalla membrana globularia ospite che avvolge il merozoite mentre invade. Il citoplasma del merozoite contiene molte vescicole multistrato e una caratteristica a forma di fungo densa di elettroni adiacente a una pila di membrane all'apice. Una serie di inclinazioni acquisite su questa regione (2,4 Å/pixel) mostra che contiene una pila di quattro membrane, che sembrano essere collegate alla caratteristica a forma di fungo (Figura 7C-E). Sorprendentemente, questa morfologia è molto diversa dalla normale disposizione degli organelli e delle strutture cellulari nell'estremità apicale di un merozoite maturo. Per valutare ciò, una serie di inclinazioni comparative (2,74 Å/pixel) sull'estremità apicale su un merozoite maturo è stata ottenuta da uno schizonte che era stato trattato con E64 prima del congelamento a tuffo e della fresatura (Grafico 8). Ciò dimostra che l'estremità apicale di un merozoite contiene due importanti organelli secretori a forma di clava chiamati rhoptries annidati all'interno di una serie di tre anelli polari sulla punta apicale della cellula e circondati da un numero di organelli secretori più piccoli chiamati micronemi. L'anello polare più interno è attaccato a una struttura a doppia membrana che è alla base della membrana plasmatica merozoite, chiamata complesso di membrana interna, che contiene proteine motorie che guidano l'invasione. È stato dimostrato che durante l'invasione il contenuto degli organelli secretori viene scaricato sulla superficie dei merozoiti e nel globulo rosso ospite, facilitando l'attaccamento dei merozoiti ai globuli rossi ospiti e avviando il complesso motorio che guida l'invasione.45. I dati qui mostrano che dopo l'invasione, il merozoite non contiene strutture osservabili che assomigliano a rhoptries, micronemi o anelli polari, suggerendo che la morfologia dell'estremità apicale del merozoite cambia drasticamente. La fusione dei ritmi prima dell'invasione è stata dimostrata in precedenza da TEM di sezioni fisse a temperatura ambiente46, che è coerente con la produzione della caratteristica a forma di fungo che osserviamo nel nostro stato post-invasione merozoite. Le pile di membrane collegate a questa caratteristica non sono state osservate in precedenza e poiché non vi è alcuna indicazione di un IMC presente nella merozoite appena invasa, ipotizziamo che le pile di membrane possano essere i resti del macchinario IMC rimasto dopo che l'invasione è completata, ma questo rimane da confermare.

Figure 8
Figura 8: L'estremità apicale dei merozoiti maturi mediante crio-ET di una lamella fresata FIB-e TEM di sezioni plastiche. (A) Una media di 20 fette centrali da un tomogramma binned 8x (2,74 Å/pixel) da una lamella spessa 230 nm che mostra la morfologia tipica dell'estremità apicale di un merozoite maturo. Gli schizonti sono stati trattati con E64 prima del congelamento a tuffo, quindi la membrana PV si è rotta e i merozoiti sono contenuti all'interno del globulo rosso ospite. (B) mostra lo stesso di (A), ma con annotazioni per indicare la membrana dei globuli rossi dell'ospite (RCM, rosso), la membrana plasmatica della merozoite (verde), il complesso della membrana interna (IMC, viola), gli anelli polari (PR, nero), i micronemi (M, giallo), i rometri (R, grigio) e l'involucro nucleare (NE, blu). Una merozoite vicina, che è fuori piano in questa regione del tomogramma è indicata da un triangolo verde. Barra scala, 200 nm. (C) Le caratteristiche cellulari osservate da cryoET sono coerenti con quelle da TEM di schizonti conservati in sezioni plastiche. Caratteristiche cellulari simili sono indicate in un merozoite maturo da uno schizonte che è stato trattato con composto 2, bloccando l'uscita prima della rottura della membrana fotovoltaica. Barra scala, 500 nm. (D) Uno schema annotato di un merozoite che mostra le caratteristiche cellulari in parti (A-C). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Spessore della regione protetta tra i modelli di fresatura rettangolari (μm) Corrente nominale del fascio ionico (pA) a 30 kV
3 300
1.5 100
0.75 50
0.3 30
0,2 - 0,06 (lucidatura finale) 30*

Tabella 1: Strategia di fresatura per produrre lamelle sottili. La fresatura graduale viene eseguita riducendo la corrente del fascio ionico corrispondente allo spessore della regione protetta. Ciò limita il riscaldamento del campione, impedendo la devitrificazione. *La lucidatura deve essere eseguita in parallelo per applicare uniformemente il calore alle lamelle da entrambi i lati, riducendo il rischio che si pieghino o si pieghino quando raggiungono il loro spessore finale. Altri passaggi possono essere eseguiti in sequenza, fresando il modello sopra la lamella e poi sotto la lamella, prima di passare alla corrente del fascio successiva. Il rilevamento della griglia per individuare le posizioni di fresatura deve essere eseguito a una corrente del fascio di 1,5 pA per ridurre al minimo il riscaldamento del campione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Mentre la fresatura crioFIB sta diventando sempre più di routine, la preparazione di campioni ottimali per la fresatura non lo ha fatto; pertanto, la maggior parte dei passaggi critici di questo protocollo si verificano prima che il campione raggiunga il cryoFIB-SEM. L'ottimizzazione del campione mediante cicli multipli di preparazione cellulare, congelamento a tuffo e screening mediante microscopia ottica ed elettronica sono necessari per produrre il miglior campione possibile prima di tentare la macinazione. Avere il miglior campione possibile non solo aumenta le possibilità di successo, ma ottimizza anche l'uso dell'attrezzatura. Per questo motivo, la maggior parte delle strutture nazionali richiede la prova che sia stata effettuata un'ottimizzazione sufficiente prima di concedere tempo sulle proprie macchine. Una volta all'interno del cryoFIB-SEM, massimizzare l'efficacia dello strato organoplatino è fondamentale per produrre lamelle uniformemente sottili. Infine, la pazienza e una buona gestione dei campioni è un'abilità prerequisito da parte dell'utente, che sarà tenuto a sedersi per più giorni producendo e quindi trasferendo griglie contenenti lamelle delicate. Questo potrebbe cambiare con l'introduzione delle strategie di fresatura automatizzate47,48, ma finora, l'intero processo di fresatura è ancora in gran parte manuale nella maggior parte delle strutture.

Mentre il lavoro si è concentrato esclusivamente sugli schizonti di P. falciparum , il metodo qui presentato potrebbe essere facilmente modificato per ottimizzare la preparazione della griglia e la fresatura per altri tipi di cellule. Fattori importanti da considerare sono la densità delle celle applicate alla griglia, il tipo di griglia (il rame è tossico per alcune celle), la dimensione e la spaziatura dei fori nel film di carbonio, il tempo di blotting e il metodo di blotting (mono / doppio lato, manuale o automatizzato). Inoltre, se le cellule vengono coltivate sulle griglie (di solito griglie d'oro con un film di carbonio holey), la confluenza può essere controllata al microscopio ottico prima di tamponare e congelare. La strategia di fresatura dipende da come le celle vengono depositate sulla griglia. Per i globuli rossi infetti dalla malaria, la griglia è essenzialmente rivestita da uno strato ininterrotto di cellule, più spesso in alcune aree e più sottile in altre aree. La fresatura viene eseguita in più punti in una regione lungo questo gradiente in cui lo spessore del ghiaccio genera lamelle di dimensioni adeguate per la tomografia. Questo approccio funziona bene per le cellule più piccole in quanto è possibile produrre lamelle contenenti una fetta attraverso più celle. Per cellule più grandi o grumi di cellule, potrebbe essere il caso che una cellula o un grumo di cellule possa produrre una lamella.

La gestione della rete e il trasferimento dei campioni rimangono una delle principali sfide di questo flusso di lavoro. Le lamelle possono essere perse a causa di rotture o crepe, artefatti che oscurano la biologia, eccessiva contaminazione superficiale e problemi di orientamento della griglia all'interno del TEM, che richiedono un ulteriore passaggio di manipolazione per riposizionare la griglia. Il grado di perdite varia da giorno a giorno e da rete a rete, ma è migliorato attraverso la pratica e l'esperienza di gestione nel tempo. In questo studio, è stato scoperto che le griglie possono essere accuratamente riorientate nel caricatore automatico più volte senza distruggere le lamelle e questo a volte ha il vantaggio di lavare via il ghiaccio superficiale. Un'altra limitazione principale di questo flusso di lavoro è il tempo necessario per produrre lamelle. Poiché la produzione è lenta, è fondamentale disporre di un campione adeguatamente ottimizzato, rendendo la fresatura il più efficiente possibile.

Recentemente sono stati introdotti numerosi adattamenti alla fresatura FIB di campioni biologici vitreali. Un punto di svolta è l'implementazione di strumenti di sollevamento raffreddati criogenicamente all'interno della camera cryoFIB-SEM che consentono di fresare blocchi di materiale più grandi da campioni congelati ad alta pressione. I blocchi possono essere fissati a un'asta metallica o raccolti in una pinza e spostati in una seconda posizione di campionamento, contenente una griglia EM appositamente modificata. I blocchi possono quindi essere rivestiti con organoplatino e fresati per generare lamelle. La capacità di macinare lamelle da materiale congelato ad alta pressione significa che è possibile elaborare cellule e tessuti molto più grandi, mirando specificamente alle aree mediante microscopia a fluorescenza correlativa12. Altri recenti adattamenti al metodo di fresatura FIB includono la riduzione degli artefatti di tenda mediante pre-fresatura a cuneo del campione16, criofissazione microfluidica49 e fotomicropatterning delle griglie di microscopia elettronica per migliorare la distribuzione cellulare50. Inoltre, è stato dimostrato che le lacune di micro-espansione di fresatura su entrambi i lati di una lamella possono alleviare la compressione da parte del campione circostante quando raggiunge la sua sottigliezza finale51. Ciò può essere particolarmente utile quando si fresano strati cellulari continui, come il campione in questo studio, dove la flessione delle lamelle è talvolta osservata durante la fase finale di lucidatura.

Il futuro della microscopia elettronica sarà probabilmente la determinazione delle strutture molecolari in situ mediante media sub-tomogramma e la fresatura FIB è uno strumento importante che faciliterà la produzione di campioni biologici vitrei per questi tipi di flussi di lavoro. Mentre la fresatura FIB è ancora agli inizi per le applicazioni biologiche, lo sviluppo dei metodi sta avvenendo a un ritmo rapido grazie al duro lavoro dei ricercatori, sia accademici che presso le strutture nazionali, oltre agli investimenti commerciali nello sviluppo della tecnologia cryoFIB-SEM per sostenere la ricerca.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata finanziata in tutto o in parte dal Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Ai fini dell'accesso aperto, l'autore ha applicato una licenza di copyright pubblica CC BY a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall'autore derivante da questo invio.

Questo progetto per il quale è stato sviluppato questo metodo è stato finanziato da una sovvenzione MR / P010288 / 1 del Medical Research Council assegnata a Helen R. Saibil, Roland A. Fleck e Michael J. Blackman. Le colture di P. falciparum sono state coltivate al Francis Crick Institute, con il supporto dei membri del gruppo di Michael J. Blackman. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Ser Ying (Michele) Tan per aver fornito le immagini degli schizonti trattati con composti 2 ed E64 in sottili strisci di sangue. La maggior parte delle lamelle sono state prodotte con il supporto del personale di eBIC e siamo grati per l'accesso al crioFIB-SEM a doppio raggio Scios su proposta di ricerca NT21004. Gli autori riconoscono inoltre il sostegno del programma Royal Society Industry Fellowship (INF\R2\202061) nel continuare lo sviluppo della tecnica di fresatura FIB all'interno del CUI. Gli autori desiderano anche ringraziare Helen R. Saibil per le utili discussioni in relazione a questo documento sui metodi e alla supervisione del progetto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
c-clips Thermo Fisher Scientific 1036171
Clipping station Thermo Fisher Scientific n/a Direct quote from Thermo
Clipping station Sub-angstrom CSA-01
Compound 2 n/a n/a Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc
Cryo-FIB specific autogrid rims Thermo Fisher Scientific 1205101
E64 Sigma E3132
Emitech K100X glow discharge unit Quorum n/a
Gibco RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 12633012 Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements
Giemsa Stain VWR International 350864X
Glass slides Thermo Fisher Scientific 11562203
Grid boxes Sub-angstrom PB For clipped grids
Grid boxes Thermo Fisher Scientific n/a For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific
Grid boxes Agar Scientific AGG3727
Home-made manual plunge freezing rig n/a n/a With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.
Human blood n/a n/a UK National Blood and Transplant service
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system JEOL n/a FIB-SEM
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage Leica n/a sputter coater
Leica EM ACE900 Leica n/a e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.
Linkam cryo-stage for light microscope Linkam Model No. CMS196 Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.
Methanol Sigma 179957
Nikon Eclipse E200 light microscope Nikon n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.
Percoll VWR International 17-0891-01 Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids Quantifoil N1-C17nCuH2-01 100 pack
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids Quantifoil N1-C17nCu20-01 100 pack
Quorum PP3010 prep-chamber Quorum n/a sputter coater
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage. FEI n/a FIB-SEM
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen Viking Direct ND538522
TFS Titan Krios 300 kV TEM Thermo Fisher Scientific n/a TEM equipped with a K2 or K3 camera.
Whatmann grade 1 filter paper Sigma WHA1001150
Zeiss Axio Scope A1 light microscope Zeiss n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumeister, W. From proteomic inventory to architecture. FEBS Letters. 579 (4), 933-937 (2005).
  2. Rigort, A., Villa, E., Bäuerlein, F. J. B., Engel, B. D., Plitzko, J. M. Integrative approaches for cellular cryo-electron tomography: Correlative imaging and focused ion beam micromachining. Methods in Cell Biology. 111, 259-281 (2012).
  3. Oikonomou, C. M., Chang, Y. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14, 205-220 (2016).
  4. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  5. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
  6. Narayan, K., Subramaniam, S. Focused ion beams in biology. Nature Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).
  7. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  8. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  9. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: Focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (5), 771-777 (2013).
  10. Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180 (2), 318-326 (2015).
  11. de Winter, D. A. M., et al. In-situ integrity control of frozen-hydrated, vitreous lamellas prepared by the cryo-focused ion beam-scanning electron microscope. Journal of Structural Biology. 183 (1), 11-18 (2013).
  12. Schaffer, M., et al. A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue. Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).
  13. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  14. Albert, S., et al. Proteasomes tether to two distinct sites at the nuclear pore complex. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 114 (52), 13726-13731 (2017).
  15. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705 (2018).
  16. Schaffer, M., et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).
  17. Szwedziak, P., Wang, Q., Bharat, T. A. M., Tsim, M., Löwe, J. Architecture of the ring formed by the tubulin homologue FtsZ in bacterial cell division. eLife. 3, 04601 (2014).
  18. Carlson, L. A., et al. Cryo electron tomography of native HIV-1 budding sites. PLOS Pathogens. 6 (11), 1001173 (2010).
  19. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nature Communications. 11 (1), 5885 (2020).
  20. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  21. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  22. Murphy, G. E., et al. Correlative 3D imaging of whole mammalian cells with light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 176 (3), 268-278 (2012).
  23. Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2012).
  24. Spehner, D., et al. Cryo-FIB-SEM as a promising tool for localizing proteins in 3D. Journal of Structural Biology. 211 (1), 107528 (2020).
  25. Kamino, T., Yaguchi, T., Ohnishi, T., Ishitani, T., Osumi, M. Application of a FIB-STEM system for 3D observation of a resin-embedded yeast cell. Journal of Electron Microscopy. 53 (5), Tokyo. 563-566 (2004).
  26. Han, H., Zuber, B., Dubochet, J. Compression and crevasses in vitreous sections under different cutting conditions. Journal of Microscopy. 230, Pt 2 167-171 (2008).
  27. Matias, V. R. F., Al-amoudi, A., Dubochet, J., Beveridge, T. J. Cryo-transmission electron microscopy of frozen-hydrated sections of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (20), 6112-6118 (2003).
  28. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150 (1), 109-121 (2005).
  29. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. The EMBO Journal. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  30. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: A new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1-2), 43-51 (2006).
  31. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 172 (2), 180-190 (2010).
  32. Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. -J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryoelectron microscopy of vitrified specimens. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer. Berlin Heidelberg. 114-131 (1987).
  33. Hsieh, C., Schmelzer, T., Kishchenko, G., Wagenknecht, T., Marko, M. Practical workflow for cryo focused-ion-beam milling of tissues and cells for cryo-TEM tomography. Journal of Structural Biology. 185 (1), 32-41 (2014).
  34. Harapin, J., et al. Structural analysis of multicellular organisms with cryo-electron tomography. Nature Methods. 12 (7), 634-636 (2015).
  35. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 180 (3), 572-576 (2012).
  36. Duyvesteyn, H. M. E., et al. Machining protein microcrystals for structure determination by electron diffraction. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 115 (38), 9569-9573 (2018).
  37. Blackman, M. J. Purification of Plasmodium falciparum merozoites for analysis of the processing of merozoite surface protein-1. Microbes as Tools for Cell Biology. 45, Academic Press. London, UK. 213-220 (1995).
  38. Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2 - anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  41. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  42. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  43. Turoňová, B., Schur, F. K. M., Wan, W., Briggs, J. A. G. Efficient 3D-CTF correction for cryo-electron tomography using NovaCTF improves subtomogram averaging resolution to 3.4 Å. Journal of Structural Biology. 199 (3), 187-195 (2017).
  44. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3d correlative microscopy. Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).
  45. Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host & Microbe. 9 (1), 9-20 (2011).
  46. Hanssen, E., et al. Electron tomography of Plasmodium falciparum merozoites reveals core cellular events that underpin erythrocyte invasion. Cellular Microbiology. 15 (9), 1457-1472 (2013).
  47. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  48. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife. 9, 52286 (2020).
  49. Fuest, M., et al. In situ microfluidic cryofixation for cryo focused ion beam milling and cryo electron tomography. Scientific Reports. 9 (1), 19133 (2019).
  50. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  51. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208 (3), 107389 (2019).

Tags

Retrazione Numero 174 FIB-milling cryoFIB-SEM lamelle tomografia cryoET cryoEM Plasmodium falciparum

Erratum

Formal Correction: Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography
Posted by JoVE Editors on 09/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. The Authors section was updated from:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

to:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
M. Alejandra Carbajal1
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

Preparazione di lamelle da campioni biologici vitreali utilizzando un microscopio elettronico a scansione a doppio raggio per la tomografia crioelettronica
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bisson, C., Hecksel, C. W.,… More

Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Carbajal, M. A., Fleck, R. A. Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (174), e62350, doi:10.3791/62350 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter