Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Förbereda lameller från glaskroppsbiologiska prover med hjälp av ett dubbelstråleskanningselektronmikroskop för kryoelektrontomografi

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/62350
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3, 1, 1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London, 2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London, 3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

ERRATUM NOTICE

Summary

Använda fokuserad jonstrålefräsning för att producera glasartade lameller på nätet från frysta biologiska prover för kryoelektrontomografi.

Abstract

Här presenteras ett protokoll för beredning av kryolameller från djupfrysta galler av Plasmodium falciparum-infekterade humana erytrocyter, som lätt kan anpassas för andra biologiska prover. De grundläggande principerna för beredning av prover, fräsning och visning av lameller är gemensamma för alla instrument och protokollet kan följas som en allmän guide till kryo-lamellberedning på nätet för kryoelektronmikroskopi (kryo-elektronmikroskopi) och kryoelektrontomografi (kryoET). Elektronmikroskopigaller som stöder cellerna fryses i flytande kvävekyld flytande etan med hjälp av en manuell eller automatiserad frys och screenas sedan på ett ljusmikroskop utrustat med ett kryosteg. Frysta galler överförs till ett kryo-skanningselektronmikroskop utrustat med en fokuserad jonstråle (cryoFIB-SEM). Galler är rutinmässigt sputterbelagda före fräsning, vilket underlättar spridning av laddningsuppbyggnad under fräsning. Alternativt kan en e-balk roterande beläggning användas för att applicera ett lager kol-platina på gallren, vars exakta tjocklek kan kontrolleras mer exakt. Väl inne i kryoFIB-SEM appliceras en ytterligare beläggning av en organoplatinaförening på nätets yta via ett gasinjektionssystem (GIS). Detta skikt skyddar lamellens framkant när den fräss, vars integritet är avgörande för att uppnå jämnt tunna lameller. Intressanta regioner identifieras via SEM och fräsning utförs stegvis, vilket minskar jonstrålens ström när lamellen når elektrontransparens för att undvika överdriven värmeproduktion. Ett galler med flera lameller överförs sedan till ett transmissionselektronmikroskop (TEM) under kryogena förhållanden för insamling av tilt-serier. Ett robust och kontamineringsfritt arbetsflöde för lamellberedning är ett viktigt steg för nedströmstekniker, inklusive cellulär kryoEM, kryoET och subtomogrammedelvärde. Utveckling av dessa tekniker, särskilt för lyftning och malning av högtrycksfrysta prover, är av hög prioritet i fält.

Introduction

Endast det cellulära innehållet i biologiska prover < 500 nm tjockt kan avbildas effektivt genom transmissionselektronmikroskopi (TEM) vid kryogena temperaturer, vilket begränsar provintervallet till virus, prokaryoter, enkla encelliga organismer och tunnare regioner av större eukaryota celler1. On-grid-fokuserad jonstrålefräsning (FIB) gör det möjligt att tunnas ut tjockare djupfrysta biologiska prover till elektrontransparenta lameller vid kryogena temperaturer (< -150 °C). De resulterande lamellerna överförs sedan till en TEM för visualisering och tomografisk datainsamling, vilket möjliggör högupplösta 3D-rekonstruktioner av cellulära och molekylära egenskaper inuti celler (för recensioner se Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163 och Wagner et al., 20204).

FIB-fräsning uppstod från materialvetenskapen, där prover rutinmässigt gallras för att förbereda dem för nedströmsanalys5. Det utförs i ett svepelektronmikroskop (SEM), som har två optiska kolumner: konventionell skanningselektronmikroskopoptik och en andra kolonn som innehåller optik som kan generera och finstyra en fokuserad jonstråle (FIB) - kallad FIB-SEM. Detta gör att en specifik region av provet kan ableras av joner genererade av en galliumkälla, avlägsna överflödigt material och lämna efter sig en lamell6. Fräsningsprocessen styrs av SEM-avbildning av provets topografi, som används för att lokalisera intressanta regioner och övervaka fräsningsförloppet. För biologiska tillämpningar är grundinställningen i stort sett densamma, men malning utförs vid kryogena temperaturer. Detta har krävt att standard FIB-SEM anpassas för att ha kryokylda steg som upprätthåller konstanta temperaturer och låga ytkontamineringshastigheter, samt luftslussar för att underlätta provöverföring utan devitrifiering eller kontaminering. Provskyttlar har också modifierats för att tillåta en rad olika bärare att monteras inuti kryoFIB-SEM, inklusive TEM-galler, planchetter och kapillärer. Flera nyckelgrupper av forskare har varit centrala för utvecklingen av dessa metoder och de fortsatta tekniska framstegen inom detta område 7,8,9,10,11,12. Kommersiella lösningar är nu mer allmänt tillgängliga för biologisk FIB-fräsning vid kryogen temperatur och malning av lameller på nätet blir mer rutinmässigt, givet ett optimerat prov.

En rad rumstemperatur- och kryoEM-tekniker kan användas för att visualisera cellulär information över alla livsskalor, från hela flercelliga organismer med blygsam upplösning till att förstå sammanhanget för komplexa processer på cellulär nivå och i ännu större detalj, till bestämning av in situ Molekylära strukturer13,14,15,16,17,18,19. Klassiska rumstemperaturtekniker inkluderar sektionering av fixerade och färgade, hartsinbäddade celler och vävnader genom ultramikrotomi för analys av cellulär morfologi med TEM (för granskning se Studer et al., 200820). Alternativa tekniker har utvecklats genom att utnyttja sekundär elektronspridning av SEM för att avbilda ytan på block av bevarade celler, innan material gradvis avlägsnas antingen med en kniv (seriell blockavbildning) eller en fokuserad jonstråle21,22,23. Denna teknik har också framgångsrikt implementerats vid kryogena temperaturer (kallad kryovolymavbildning) med en kryoFIB-SEM på glasaktiga, ofärgade block av celler eller vävnader24. Alternativt kan tjockare lameller (~ 15 μm tjocka) fräsas och studeras genom STEM-avbildning25. Med hjälp av dessa tekniker kan hela block som innehåller många celler avbildas för att samla befolkningsinformation eller ett helt organ / organism kan avbildas och rekonstrueras i 3D. För att få tillgång till högupplöst molekylär information från celler måste prover dock bevaras i ett nästan inhemskt, fryst hydratiserat tillstånd och måste därför beredas under kryogena förhållanden. Kryoelektronmikroskopi av glaskroppssektioner (CEMOVIS) är en teknik där högtrycksfrysta block av biologiskt material skärs under kryogena förhållanden med en ultramikrotom. Detta ger band av kryosektioner (40-100 nm tjocka)26, som är anslutna till ett EM-rutnät och avbildade i TEM. Knivens fysiska interaktion med glaskroppsprovet orsakar emellertid sprickor och kompressionsartefakter som allvarligt kan snedvrida cellulär struktur27,28,29,30. Tjockare sektioner är mer benägna att dessa artefakter, vilket gör det opraktiskt att använda sektioner tjockare än ~ 70 nm26. Denna begränsning begränsar kraftigt 3D-vyn av den biologiska strukturen i tomogrammet. FIB-fräsning vid kryogena temperaturer upplever inte dessa problem, men har sina egna artefakter orsakade av olika fräshastigheter över delar av provet, vilket leder till varierande tjocklekar inom en lamell - kallad gardin. Detta problem mildras genom applicering av en organoplatinabeläggning applicerad via ett gasinsprutningssystem (GIS), som skyddar lamellens framkant under fräsning31. Den övre gränsen för provtjocklek för FIB-fräsning på nätet definieras av förmågan att frysa provet samtidigt som det förblir glasaktigt32, men med införandet av kryolyftningstekniker och anpassade provbärare för biologiska prover kan FIB-fräsning också användas för att bearbeta frysta prover med högt tryck31,33,34,35. Dessutom kan frysta prover inte vara för tunna eftersom det måste finnas tillräckligt med biologiskt material för att generera en lagom stor lamell som ger tillräckligt med yta för att samla lutningsserier vid önskad förstoring. Detta problem kan lindras genom att mala klumpar av mindre celler, såsom bakterier eller jäst. Slutlig lamelltjocklek (~ 100-300 nm) dikteras vanligtvis av provets integritet och fräsningsstrategi. Tunnare lameller är bättre för högupplöst strukturellt arbete, såsom subtomogrammedelvärde, men tjockare lameller innehåller mycket större cellulära volymer än vad som kan uppnås med CEMOVIS, vilket ger mer cellulärt sammanhang i ett nära till naturligt bevarat prov. FIB-fräsning kan också användas för att tunna djupfrysta proteinkristaller för elektrondiffraktionsstudier36.

FIB-fräsning av glasceller är värt tiden och ansträngningen att utföra om den vetenskapliga frågan kräver högupplösta molekylära detaljer av nära inhemska prover in situ. Med tillgång till fler anläggningar för rutinproduktion av lameller är det hastighetsbegränsande steget ofta optimering av provet före malning, där tid måste tas för att säkerställa att provet är glasaktigt och en lämplig tjocklek för att producera robusta och jämnt tunna lameller. Här beskrivs provoptimeringen för FIB-fräsning av djupfrysta humana röda blodkroppar infekterade med Plasmodium falciparum-parasiter , malarians orsakssamband, men detta tillvägagångssätt kan anpassas för ett givet prov.

Protocol

Humant blod erhölls från anonymiserade givare genom UK National Blood and Transplant service och används inom 2 veckor efter mottagandet. Inget etiskt godkännande krävs för dess användning.

1. Beredning och djupfrysning av Plasmodium falciparum-infekterade röda blodkroppar

  1. Isolera mogna schizonter genom centrifugering (1,580 x g) över ett 70% (v / v) isotoniskt densitetsgradientmedium (för standardprocedurer för hur man odlar asexuella blodstadier av 3D7 Plasmodium falciparum i humana erytrocyter, se Blackman M.J., 1995:37).
  2. Fixera de lufttorkade tunna blodfilmerna på en glasskiva med 100% metanol för att kontrollera schizonternas morfologiska homogenitet innan du färgar med 10% Giemsa-fläck i 6,7 mM fosfatbuffert, pH 7,1.
    OBS: För att berika preparatet för schizonter som stannar vid specifika utgångspunkter kan schizonter synkroniseras ytterligare med förening 2 och E64-hämmare (se representativa resultat och figur 1 för en förklaring av effekten av dessa hämmare).
    VARNING: Plasmodium falciparum är en humanpatogen och får endast hanteras i en lämplig inneslutningsanläggning enligt lokala hälso- och säkerhetsriktlinjer.
  3. Centrifugera försiktigt schizonter (240 x g) för att pellet dem och återsuspendera i 2x volym av cellpelleten av RPMI-media, vilket resulterar i en 50% hematokritsuspension.
  4. På en manuell dykfrysrigg, applicera 2,5 μL schizonts på kolsidan av en glödurladdad (Använd glödurladdningsenhetsinställningar på 60 s, 30 mA i luft, behandla endast kolsidan av gallret) 200 mesh kopparnät med en 2/4 hålig kolfilm och blotta i ~ 20 s från baksidan av gallret med hjälp av klass 1 filterpapper med en sönderriven kant. Doppa i flytande kvävekyld flytande etan och överför gallren till lagring (se materialtabell för utrustning som används i denna studie).
    OBS: Experimentet kan pausas här, och galler kan lagras under flytande kväve på obestämd tid.
    VARNING: Flytande kväve är kvävande och orsakar frostskador; Hantera varsamt i lämplig miljö med syrgasövervakning.
    VARNING: Flytande etan orsakar allvarliga brännskador och är brandfarligt; Använd i en dragskåp borta från antändningskällor.
    OBS: Doppfrysta schizonter är inte längre livskraftiga. Detta bestämdes genom att inkubera humant blod med flera guldgaller av lufttinade doppfrysta schizonter och observera ingen parasittillväxt efter flera dagar, jämfört med ofrysta kontroller. Frysta galler av schizonter är därför säkra att hantera utanför inneslutningsanläggningar med normala säkerhets- och dekontamineringsprocedurer (handskar, yt-/verktygssterilisering med >70% etanol och bortskaffande av galler i >70% etanol).
  5. Skärmgaller med hjälp av ett kryosteg för ett ljusmikroskop, med särskild uppmärksamhet på isens lutning över gallret. I de tunnare isområdena, kontrollera enskilda rutnätrutor för celltäckning.
    OBS: De bästa rutorna ska vara en cell tjock i mitten av rutnätet (figur 2). Detta säkerställer att en lamell kan fräsas över mitten av torget utan att träffa den tjockare isen vid kanterna mot gallerstängerna. Experimentet kan pausas här, och galler kan lagras under flytande kväve på obestämd tid. Om celler bär en fluorescerande markör kan galler också screenas av kryoCLEM för att lokalisera X / Y-positioner av intresse, vilket kan korreleras med rutnätplatser i kryoFIB-SEM för direkt fräsning.

2. FIB-fräsning på nätet av djupfrysta celler

  1. Markera framsidan av kryoFIB-specifika autogridfälgar med en svart outplånlig markeringspenna för att indikera mitten av cutaway-sektionen och motsatt sida av fälgen (figur 3). Ställ in urklippsstationen och klippgallren i de markerade ringarna med kolsidan nedåt.
  2. Ladda galler i kryoFIB-SEM-skytteln (vanligtvis 2 galler, beroende på skytteln) kolsidan uppåt och applicera en platina-sputterbeläggning i en argonatmosfär (5 x 10-2 mbar) (5 mA i 60 s - tjockleken är variabel) eller en kol / platina e-stråle roterande beläggning (~ 4 nm tjocklek) på cellens yta.
    OBS: Båda typerna av beläggningar hjälper laddningsspridning under SEM-avbildning. Fördelen med e-balkens roterande beläggning är att beläggningens exakta tjocklek kan specificeras.
  3. Ladda skytteln i kryoFIB-SEM och bedöm cellfördelningen på varje rutnät med SEM vid 5 kV (13 pA eller 25 pA). Ta en översikt över låg förstoring (~ 100x) för att titta på isgradienter över rutnätet. Ta sedan bilder med högre förstoring (~ 5 000x) för att titta på enskilda rutnätsrutor och identifiera de områden i rutnätet med synliga cellulära funktioner och låg ytkontaminering att mala.
  4. Applicera ett >2 μm organoplatinaskikt på ytan av varje galler med hjälp av gasinsprutningssystemet (GIS). För att göra detta, sätt in GIS-nålen i kammaren ovanför gallret och värm organoplatinakällan till en inställd temperatur under en viss tid (till exempel ~ 27 ° C i 3-10 s) för att producera ett flöde av ånga.
    OBS: Appliceringsvinkeln, temperaturen och tidpunkten för organoplatinumbeläggningen via GIS-nålen bör optimeras för att maximera en jämn beläggning. Detta beror på den specifika kryoFIB-SEM som används (se Representativa resultat för ytterligare förklaring).
  5. Luta provet så att rutnätets plan är ~10° från jonstrålens infallsvinkel och flytta mitten av en lämplig rutnätskvadrat som ska ses i både SEM- och FIB-bilderna.
  6. Kartlägg nätet med hjälp av jonstrålen vid låg ström (nominellt 1,5 pA, 30 kV) och gå till tillräckligt hög förstoring (~ 7 000x) för att visualisera cellerna i mitten av ett rutnät. Ta provet i fokus vid den första fräsströmmen (300 pA) och korrigera för astigmatism. Justera ljusstyrkan och kontrasten och markera sedan ut två rektangulära mönster för att fräsa, ett ovanför och ett under ett 3 μm tjockt skyddat område, vars mitt är den önskade platsen för den slutliga lamellen.
    OBS: Den valda bredden på mönstren beror på topografin i det omgivande cellskiktet och cellstorleken. 7-20 μm är en lämplig bredd för schizonter, men bredare lameller tar längre tid att mala. Den valda höjden på mönstren för det första frässteget beror på provets tjocklek, med början runt 6 μm; Detta kan behöva justeras under fräsningen. Fräsning utförs riktningsmässigt från utsidans övre och nedre kanter av mönstren mot lamellens yta. Detta kan göras parallellt, där båda mönstren fräss samtidigt eller sekventiellt, först avlägsna material ovanför lamellen och sedan underifrån.
  7. Börja fräsa vid den första strömmen; övervaka förloppet i jonstrålevyn och intermittent med SEM (5 kV, 13 eller 25 pA). Kontrollera att jonstrålen har brutit igenom provet ovanför och under det skyddade området. Om inte, öka höjden på de rektangulära mönstren för att ta bort mer material. Stanna när ytan ovanför och under lamellen är helt slät i jonstrålvyn.
    OBS: Jonstrålen har brutit igenom provet ovanför och under det skyddade området när insidan av de rektangulära mönstren inte innehåller några detaljer i fokalplanet. Vissa funktioner, till exempel rutnätsfält, kan vara synliga utanför fokus i bakgrunden.
  8. Byt till nästa fräsström (100 pA); Fokusera och justera ljusstyrkan/kontrasten. Minska utrymmet mellan de två rektangulära mönstren till 1,5 μm och minska mönsterhöjden så att den endast täcker det ofrästa materialet. Börja fräsa vid den nya strömmen tills ytan ovanför och under lamellen är helt slät.
  9. Upprepa denna process stegvis tills en tjocklek på 0,3 μm uppnås, vilket minskar jonstrålströmmen varje gång enligt frässchemat i tabell 1.
  10. Mal flera lameller (mängden beror på provets tjocklek och den tillgängliga tiden) på ett eller båda gallren till en tjocklek av 0,3 μm, registrera X / Y / Z-positionen för varje lamell och reservera ~ 1-2 timmar i slutet av sessionen för att polera lamellerna till deras slutliga tjocklek (60-200 nm).
  11. Ta en SEM-översikt med låg förstoring av hela rutnätet och planera en poleringsväg från lameller längst fram på gallret (närmare jonstrålkällan) till lameller längst bak i gallret (längst bort från jonstrålkällan) (figur 5).
    OBS: Detta minskar återavsättning av ablerat material tillbaka på ytan av polerade lameller.
  12. Minska utrymmet mellan de två rektangulära mönstren till 100-200 nm och börja det sista poleringssteget vid en jonstrålström på 30 pA. Övervaka framstegen med SEM vid 2-3 kV (13 pA, bo = 300 n, 3072 x 2048, ~ 2 s för en hel ram) och sluta polera när kontrasten går förlorad i lamellen av SEM eller när själva lamellens organoplatinabeläggning börjar förlora integriteten.
  13. Innan du tar bort rutnätet, skaffa en SEM-bild med låg förstoring av hela rutnätet och spara bilder av varje lamell. Använd dem för att dubbelkontrollera rutnätet senare i TEM. Pausa experimentet här och förvara gallret med lameller under flytande kväve - hantera försiktigt.
    OBS: Galler kan lätt sprutas belagda vid borttagning från kryoFIB-SEM, vilket kan bidra till att begränsa drift och laddning i TEM vid hög förstoring, men detta bör göras försiktigt eftersom för mycket sputterbeläggning kan dölja det biologiska innehållet inuti lamellerna. Det är möjligt att screena lameller för fluorescens i detta skede; Att få tillräckligt med signal beror emellertid på överflödet av det märkta proteinet inom lamellens tjocklek. Stor försiktighet måste iakttas vid hantering av gallren för att begränsa skador på lamellerna och förhindra ytkontaminering.

3. Insamling av tilt-serier och allmän översikt över databehandling

  1. Fyll på stödrastren i TEM och rikta in fräsriktningen vinkelrätt mot stegets lutningsaxel.
    OBS: Justering av rutnäten görs med ögat med hjälp av märkena på autogridfälgen. En ~ 10 ° felmarginal är acceptabel, annars kan väggarna i diket på vardera sidan av lamellen dölja lamellen när gallret lutas.
  2. Skaffa en karta med låg förstoring (~ 150x) av hela rutnätet och lokalisera lamellerna; Skaffa sedan en medelförstoringskarta (~ 1 500x, beroende på lamellstorlek) för varje lamell och hitta intressanta områden.
  3. Vinkla rutnätet ±10° så att lamellplanet (inte rutnätet) är vinkelrätt mot den optiska axeln
    OBS: Förlutningens riktning kan bestämmas av positionen för lamellernas framkant (letar efter den överblivna organoplatinabeläggningen) i kartorna med låg och medelhög förstoring. För det varvtalsskydd som används här kräver rutnät +10° förlutning om lamellernas framkanter pekar uppåt på kartorna och kräver en förlutning på -10° om de pekar nedåt. Varje rutnät kan vara annorlunda på grund av hur de plockades upp och sattes in i autoladdaren.
  4. Hämta dossymmetrisk lutningsserie38 (till exempel -54° till +54° med en ökning på 3-5°) vid en pixelstorlek som tillåter både synfält och upplösning som krävs för det berörda området. Använd ett intervall med oskärpevärden mellan -2 och -5 μm. Samla filmer med 3-10 bilder vid varje steg och för detta, justera dessa parametrar beroende på pixelstorleken för att ackumulera en total dos på ~ 150 e-/Å2 (för en 300 kV TEM).
    OBS: Sprickor i lamellen bör undvikas eftersom dessa regioner kan driva. Ytkontaminering bör också undvikas eftersom det kan skymma intresseområdet eller fokusområdet vid hög lutning.
  5. Rörelsekorrigera filmerna med ett program som MotionCor239. Använd ett dosviktningsfilter på de korrigerade bilderna (ackumulerad e-/bild)40 och uppskatta varje bilds oskärpa med hjälp av ett program som CTFFIND441.
  6. Använd fiducial-less alignment (patch tracking) i ett program som etomo (IMOD)42 för att beräkna justeringen och vinkelförhållandet mellan bilderna i tilt-serien.
  7. Ange justerings- och rotationsinformation, tillsammans med defokusvärdena i ett program som kan tillämpa tredimensionell CTF-korrigering, till exempel NovaCTF43. Beräkna ett korrigerat tomogram för att få utdatatomogram med binning-faktorer som är relevanta för nedströmsanalys.
  8. Analysera rekonstruktionerna och förbereda för eventuell nedströmsbearbetning, till exempel filtrering, segmentering eller sub-tomogrammedelvärde.

Representative Results

Förbereda P. falciparum schizonts för doppfrysning
Förening 2 och E64-hämmare används för att stoppa schizonter vid olika stadier av utgång, vilket genererar en berikad population av schizonter för efterföljande studier. Detta är viktigt eftersom utan en komplementär korrelativ teknik är fräsning av specifika subcellulära mål eller celltyper utmanande eftersom processen i huvudsak är blind. Förening 2 är en proteinkinashämmare som stannar ut före vakuolbrott. Schizonter kan synkroniseras på förening 2 i 4 timmar, tvättas sedan med förening 2-fria medier för att avlägsna hämmaren, vid vilken tidpunkt schizonter kommer att mogna och gå ut efter cirka 30 minuter. Alternativt kan förening 2 synkroniserade schizonter tvättas till E64, en irreversibel bredspektrumcysteinproteashämmare, och inkuberas i cirka 1 timme för att stoppa utgången efter vakuolbrottet, men före värdcellbrottet. Morfologin och homogeniteten hos behandlade schizonter bör kontrolleras med Giemsa-färgade blodutstryk före nedfrysning (figur 1). Schizonts kan frysas i något av dessa tillstånd med hjälp av den metod som beskrivs i denna publikation.

Figure 1
Figur 1: Morfologin hos förening 2 och E64-stallade P. falciparum schizonts av Giemsa-färgade blodutstryk. (A) I närvaro av förening 2 är den parasitofora vakuolen (PV) tätt packad med merozoiter (lila cirklar) med ett enda kluster av hemozoinkristaller (mörkbrun cirkel). Gränsen mellan PV och det omgivande hemoglobinet i värdens röda blodkroppar (hRBC) (grått band) är väldefinierad, liksom hRBC-membranet. (B) I närvaro av E64 bryts solcellsmembranet och merozoiterna sprids ut inom hRBC. Varje schizont innehåller fortfarande ett enda kluster av hemozoinkristaller. Värdcellmembranet är läckande och delvis kollapsat, därför är inget hemoglobin synligt inom cellperiferin och gränsen för hRBC-membranet är inte lätt synlig. Skalstång, 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Optimering av doppfrysning
En rad galler med olika hålstorlekar testades under optimeringen av blottningsförhållandena för P. falciparum-infekterade röda blodkroppar, inklusive 2/2, 3/3, 3,5/1 och 5/2 (kvadrat) håligt kol på guld- och kopparnät 200 nät. 200 mesh kopparsökare med 2/4 hålig kolfilm ger ett lämpligt tjockt lager av celler för att fräsa långa glasartade lameller. Större eller mindre hål resulterade i allmänhet i cellskikt som var för tunna respektive tjocka (figur 2A-C). Med 2/4 håligt kol dras schizonter genom 2 μm-hålen genom att blotta gallret från baksidan (icke-kolsidan), vilket resulterar i att celler sticker ut över och under kolfilmen. Kolsträckan på 4 μm mellan hålen resulterar i en kolremsa som löper genom mitten av de flesta av de resulterande lamellerna, vilket ger styrka. Finder-galler är mest lämpade för korrelativa och screeningändamål44, men man måste se till att siffrorna / bokstäverna i nätdesignen inte är för stora eftersom detta kommer att blockera områden för fräsning.

Blottningstiden på en manuell kolv är cirka 20 s, men den exakta punkten för att stoppa blotting bedömdes av ögat när vätskedroppen som drogs från gallret slutade sprida sig ut på filterpapperet. En sönderriven kant krävdes för att bryta droppens ytspänning för att starta blottningsprocessen. En automatiserad frys användes inte i denna studie, men en rimlig utgångspunkt för detta prov skulle vara att använda samma volym celler och gallertyp som används för en manuell kolv, se till att torka gallren bakifrån under förhållanden med hög luftfuktighet (~ 70%) och omgivningstemperatur (~ 25 ° C). Blottningstiderna och villkoren måste optimeras för det specifika automatiserade systemet som används.

Djupfrysta galler av P. falciparum schizonts screenades av ett ljusmikroskop utrustat med ett kryostadium snarare än av TEM, eftersom provet inte var överförbart till elektroner. För tunnare prover kan galler screenas med TEM (hel rutnätatlas vid ~ 150x förstoring) före provöverföring till kryoFIB-SEM, vilket kan vara en förutsättning för åtkomst till en nationell anläggning. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt gradienten av istjocklek över rutnätet och även inom enskilda rutnätrutor. Bra rutnät rutor ska vara en cell tjock eller slå kolfilmen i mitten (Figur 2C). Detta undviker fräsning i den tjockare isen mot gallerstängerna runt kanten av gallertorget och kommer att säkerställa att jonstrålen bryter igenom över och under cellskiktet, vilket ger en fri lamell snarare än en kil. När reproducerbara blottnings- och dykfrysningsförhållanden har optimerats är screening vanligtvis inte längre nödvändig före FIB-fräsning.

Figure 2
Figur 2. Analys av cellfördelningen på galler av djupfrysta P. falciparum schizonts med kryo-ljusmikroskopi. (A) Ett exempel på att is är för tjock över ett rutnät genom kryoljusmikroskopi, vilket döljer cellerna och kolfilmen. Skalstång, 10 μm. (B) Ett exempel på att hålstorleken (koppargaller med 300 maskor med 5/2 kvadratisk hålig kolfilm) är för stor för cellerna, vilket resulterar i ett mycket tunt lager av biologiskt material omgivet av tomma områden utan is. Galler som detta producerar mycket korta, instabila lameller. Skalstång, 10 μm. (C) Ett exempel på god cellfördelning på ett 200-maskigt kopparnät med 2/4 hålig kolfilm. Dessa schizonter behandlades med E64-hämmare. De stora cellerna (röd låda, ~ 5 μm diameter) med en väldefinierad periferi är infekterade röda blodkroppar som fortfarande har ett intakt vakuolmembran. Klyftorna av små celler (blå låda, ~ 1 μm) är de enskilda merozoiterna som finns i en delvis kollapsad värdröd blodkropp. Varje schizont har en svart fläck i mitten, vilket indikerar hemozoinkristallernas position (se figur 1 för ytterligare detaljer). Skillnaden i cellmorfologi är inte lika lätt att se en gång inuti kryoFIB-SEM; Därför är förscreening med kryoljusmikroskopi fördelaktig tills reproducerbara blottningsförhållanden har uppnåtts. Celltäckningen runt kanterna på rutnätsrutan bredvid rutnätsstrecken (vitstreckade områden) är för tjock för fräsning. Det tunnare området i mitten av rutnätet (gulstreckat område) är en idealisk plats att fräsa från och förlänga lamellen till det omgivande lagret av celler. Skalstång, 6 μm. (D) Bild av en kryoFIB-specifik autogridfälg med två svarta märken, en inom cutaway-sektionen (svart fäste) och den andra motsatt, klockan 12 och klockan 6. Den svarta pilen representerar fräsningsriktningen. (E) När gallren laddas i kassetten med automatisk laddare måste märkena vara lika långt från vardera sidan av laddningspincetten, vilket resulterar i att lamellerna ligger vinkelrätt mot scenens lutningsaxel. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Märkning av kryoFIB-specifika autogridfälgar för tomografi
Vanligtvis klipps galler i autogridfälgar före fräsning för att underlätta hanteringen och ge styvhet, vilket skyddar lamellerna från skador under de efterföljande överföringsstegen. CryoFIB-specifika autogridfälgar har konstruerats med en cutaway-funktion för att hjälpa till att komma åt mer av gallerytan under fräsning. Det är viktigt att rikta fräsriktningen vinkelrätt mot lutningsaxeln på det tvärgående elektromagnetiska underlaget så att anskaffningen av lutningsserier fortskrider genom att lamellen roteras längs dess längd. Detta säkerställer att de höga väggarna i diket som omger lamellen inte döljer den biologiska informationen när gallret lutas.

Vanligtvis är autogridfälgen markerad för att hjälpa till med visuell inriktning inom kryoFIB-SEM-skytteln och senare vid lastning av TEM. För dessa prover applicerades två märken klockan 12 och klockan 6 med en outplånlig markör (se materialförteckning), en i mitten av klippringens avskurna sektion och den andra mittemot (figur 2D). Vid laddning i TEM (se materialförteckning) ska båda märkena vara synliga på vardera sidan av laddningspincetten och riktade 90° mot pincettens kant (figur 2E). Det bör noteras att tillverkaren rekommenderar att man justerar galler med hjälp av de graverade prickarna på autogridfälgarna, eftersom vissa bläck i närheten av jonstrålen kan störa fräsningen.

Klippta galler kan screenas med ljusmikroskopi med en modifierad kassett för ett kryosteg, vilket kan vara fördelaktigt för att kontrollera att klippningsprocessen inte har förstört kolfilmen i gallret. Beroende på provkassetten kan oklippta galler också fräsas, men stor försiktighet måste iakttas under överföringen från kryoFIB-SEM till TEM för att begränsa eventuell böjning av gallret eftersom detta kommer att bryta lamellerna. Oklippta galler kan laddas i TEM med kryohållare med sidoingång, men det finns en stor chans att lamellerna går sönder om klippning utförs efter fräsning.

Organoplatinum beläggning
Organoplatinum-beläggning utförs på ett eller båda gallren när de har laddats i kryoFIB-SEM. Nålen i gasinjektionssystemet (GIS) sätts in i kammaren ovanför provet för att rikta ett flöde av organoplatinaånga över nätets yta från en uppvärmd källa under en bestämd tid. Ångan kondenserar på kalla ytor och bildar ett fast skikt (~ 2 μm tjockt). Integriteten hos denna päls är avgörande för att möjliggöra jämnt tunna lameller som kan fräsas. De optimala appliceringsförhållandena för organoplatinumbeläggningen är vanligtvis förutbestämda av tillverkaren av instrumentet, men viss optimering kan fortfarande krävas. De flesta system justerar antingen GIS-nålen nära fräsriktningen eller vinkelrätt mot fräsriktningen, beroende på geometrin hos portarna på kammaren och stegets rotationsgränser. Olika inställningar kan testas genom att belägga gallret, fräsa ett litet område, luta scenen och mäta tjockleken på beläggningen med SEM.

Förutom installationen av själva kryoFIB-SEM kan ett antal andra faktorer påverka appliceringen av organoplatinabeläggningen, inklusive 1) provets topografi, 2) ytförorening på gallret och 3) reproducerbarheten av ångflödet från GIS-nålen. Eftersom GIS-flödet är riktat kan ojämn topografi orsaka att regioner i skuggan av celler eller ytföroreningar blir obelagda eller har en tunnare beläggning. Detta kan leda till en kollaps av organoplatinaskiktet under polering (figur 3). När du väljer ett område att mala är det nödvändigt att vara uppmärksam på den omgivande topografin, till exempel kan stora ytföroreningar, klumpar av celler eller brutet kol som skjuter ut från nätets yta så långt som ett par rutnät bort, blockera ångflödet, vilket skapar en skugga av tunnare organoplatinum som kan försvaga en lamell. Dessutom bör mycket små partiklar av ytkontaminering nära lamellens framkant också undvikas eftersom de kan dyka upp under fräsning och lämna en försvagad fläck av bar is som kan leda till att ett hål utvecklas i lamellen under polering. Slutligen, om fräsningen har börjat och organoplatinumbeläggningen ser instabil ut, täck igen, längre, eller byt till ett reservgaller.

Figure 3
Figur 3: En organoplatinabeläggning av god kvalitet är avgörande för att få tunna, jämnt malda lameller. (A) En mikrografi av framkanten av en lamell där organoplatinabeläggningen (OP, gul) har applicerats för tunt, vilket leder till ett hål i lamellens framkant som utvecklats under polering (grön cirkel) och ojämn fräsning över hela lamellens bredd (ränder). Den organoplatina ytan har klippts av jonstrålen, vilket leder till en spray av material bakom beläggningens framkant (gulstreckad linje). (B) Organoplatinaskiktet (OP) har applicerats tjockare, vilket resulterar i en jämnare förtunnad lamell. Pälsens integritet bevaras över hela lamellens bredd och gränssnittet mellan organoplatinabeläggningen och det förglasade biologiska materialet är väldefinierat (gulstreckad linje). Kolskiktet kan ses springa genom baksidan av lamellen (orange). Skalstänger, 1 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bedömning av gallerkvalitet i kryoFIB-SEM och malningsprocessen
När galler har överförts till kryoFIB-SEM kan kolfilmens integritet och fördelningen av cellerna på gallren screenas av SEM (figur 4A-C). Isgradienter, positionerna för rutnätsstaplar och placering av rutnätnummer på sökargaller kan kontrolleras med SEM med låg förstoring vid 30 kV (figur 4B), men spänningen bör minskas tillbaka till 5 kV medan fräspositioner lokaliseras vid hög förstoring och övervakning av fräsningsprocessen för att öka kontrasten från yttopografin.

Figure 4
Figur 4: Bedömning av nätkvalitet och lokalisering av områden att fräsa i kryoFIB-SEM . (A) En översikt över låg förstoring av ett nät vid 5 kV via SEM. Den bortklippta delen av autogridfälgen visas längst ned i bilden. Skalstång, 0,5 mm. (B) Samma rutnät vid 30 kV vid SEM, som visar områden med tjockare is (mörkare rutnätsrutor) och tunnare is (ljusare rutnätsrutor). Infällningen visar området i rutan, med pilar som anger numreringen i sökrutnätet, som är synligt vid 30 kV. Skalstång, 0,5 mm. (C) En medelförstoringsöversikt över två rutnätsrutor som bedömer fördelningen av cellerna på kolfilmen och placeringen av rutnätsstängerna. Skalstång, 50 μm. (D) Placeringen av fräsmönster för det första snittet vid hög förstoring (jonstrålvy vid 1,5 pA och 30 kV). Det röda området (3 μm tjockt) skyddas, medan de gula områdena ableras av jonstrålen. Den vitstreckade linjen indikerar positionen för den slutliga lamellen. Skalstång, 10 μm. (E) En höghöjdsvy vid 3 kV via SEM av en polerad 200 nm tjock lamell (10 μm bred x 15 μm lång). Förlusten av kontrast i lamellen vid 3 kV indikerar att en lämplig tjocklek har uppnåtts. Den ljusvita framkanten är det återstående organoplatinaskiktet som appliceras på gallret via GIS före fräsning. Skalstång, 5 μm. (F) Samma lamell från (E) sedd med jonstrålen vid 30 kV och 1,5 pA. Den tunna vita linjen över den svarta fyrkanten (vit pil) är den återstående organoplatinum-beläggningen på lamellens framkant. Skalstång, 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

En region som ska fräsas väljs genom att lägga ut ett par rektangulära mönster på vardera sidan av ett skyddat område vid hög förstoring (~ 7 000x för schizonter) i jonstrålvyn (figur 4D). Det är viktigt att inga partiklar av ytkontaminering fästs nära fräsområdet eftersom dessa kan ha skymt appliceringen av den skyddande organoplatinabeläggningen. Det är också viktigt att regionens topografi är lämplig för att stödja lamellens sidor när dess slutliga tjocklek har uppnåtts.

För malariala schizonter (cellstorlek: ~5 μm diameter x 2 μm tjock, skivform) kan lameller mellan 7-20 μm breda fräsas. Om cellskiktet är lämpligt tjockt kommer lamellerna vanligtvis att hamna ~ 10-15 μm i längd och fånga flera celler ovanför och under kolskiktet (figur 4E-F). Det kan förväntas fräsa 5-10 lameller i en 8 h session (6-7 h fräsning och 1-2 h polering). Detta kommer att variera beroende på provets tjocklek och lamellernas bredd, med tjockare prover och bredare lameller som tar längre tid att mala. Även skadade galler kan fräsas eftersom det bara krävs en handfull bra rutnät för att generera en uppsättning lameller (figur 5A). Dessutom, om provet är tunnare än förväntat, till exempel på grund av överblottning eller variation i kulturens hematokrit, kan kortare lameller malas relativt snabbt; Deras kortare längd kommer dock att begränsa det område som är tillgängligt för datainsamling i TEM (figur 5B).

Figure 5
Figur 5: Bestämning av när slutlig lamelltjocklek har uppnåtts under malningen. (A) Lågförstoringsöversikt över ett nät av SEM vid 5 kV som visar koldioxidskador under klippning. De oskadade områdena innehöll mycket tunt prov på grund av överblottning; Det var dock fortfarande möjligt att fräsa sex lameller på detta rutnät (regionen inom den vita streckade konturen) under en hel dagssession på kryoFIBSEM. Skalstång, 0,5 mm. (B) En kort lamell (~10 μm bred x 3 μm lång, exklusive organoplatinaskikt) framställd från detta galler (SEM vid 3 kV), som fortfarande gav två regioner att samla lutningsserier från. Skalstång, 25 μm. (C) En serie SEM-bilder (3 kV) av en lamell under det sista poleringssteget som visar hur kontrasten går förlorad i lamellen när den tunnas ut (rör sig från vänster till höger). Den mörka svarta linjen över mitten av lamellen i alla bilder är en remsa kolfilm från gallret. Celler framför denna region förglasades ovanför kolfilmen och cellerna bakom denna region förglasades under kolfilmen. Fräsningen stoppades när organoplatinabeläggningen på vänster sida av lamellens framkant var nära att förlora strukturell integritet. Denna stopppunkt var innan hela lamellen bringades till en jämn tjocklek, varför det fortfarande finns lite högre kontrastmaterial på baksidan av lamellen. d) Ett exempel på en poleringsväg baserad på lamellerna som malts på det galler som visas i (A). En poleringsväg bör börja vid lameller närmare FIB-källan och röra sig bort från FIB-källan för att begränsa återdeponering av fräst material på lamellernas yta. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Under polering beror den slutliga tjockleken på en lamell på provets struktur i området som mals, organoplatinabeläggningens integritet och den tillgängliga tiden. Helst bör provet tunnas ut tills kontrasten går förlorad över hela lamellytan genom SEM vid 3 kV, vilket tyder på att den är jämnt elektrontransparent och cirka 150-200 nm tjock (figur 5C). Det kan dock vara nödvändigt att sluta fräsa före denna punkt om organoplatinaskiktet utvecklar ett hål eller lamellen börjar böjas. I detta fall kan lamellen fortfarande vara tunn nog på framsidan och förbli användbar för tomografi. Omvänt är det möjligt att tunna förbi förlusten av kontraststeg om lamellen ser stabil ut, vilket gör den ännu tunnare genom att flytta fräsmönstren närmare varandra (~ 100 nm eller mindre). Detta beror på vilken tjocklek om det behövs för det underordnade arbetsflödet. En SEM-bild med låg förstoring krävs för att planera en poleringsväg, börja närmare jonstrålkällan och arbeta bort (figur 5D). Poleringsvägens riktning är viktig för att förhindra återavsättning av ablaterat material på lameller som redan har avslutats.

Insamling och bearbetning av tilt-seriedata
När det har laddats in i TEM kommer ett lågförstoringsmontage med full rutnät (~ 150x) att identifiera lamellernas positioner, vilket kan korreleras med SEM-bilden med låg förstoring som tagits i slutet av fräsningen. För doppfrysta schizonter är det mesta av gallret inte transparent för elektroner, så lamellpositionerna visas som vita skåror på en svart bakgrund (figur 6A). Lamellernas vinkel i förhållande till mikroskopets lutningsaxel bör noteras, eftersom mer än ~ 10 ° bort från vinkelrätheten kan göra lutningsserieförvärv svårt. Ett montage med medelförstoring (~1 500x) på platsen för varje lamell ger en översikt över det biologiska innehållet och kontrollerar överföringsskador, kristallin is eller överdriven ytkontaminering (figur 6B-D). Detta bör också kontrolleras vid hög lutning för att säkerställa att ingen ytkontaminering döljer förvärvs- eller fokusområdet. Att välja en förvärvsregion beror inte bara på de biologiska egenskaperna utan också isens strukturella integritet i den omgivande regionen, till exempel att undvika sprickor, eftersom dessa regioner kommer att driva eller områden med överdriven gardin, där en lamell kommer att ha varierande tjocklek. Innan en lutningsserie förvärvas appliceras en ±10° förlutning på gallret för att göra lamellplanet (inte gallret) vinkelrätt mot den optiska axeln. Förlutningens riktning kan bestämmas av positionen för lamellernas framkant (letar efter den kvarvarande organoplatinabeläggningen) i medelförstoringsmontaget. För det TEM som används här (300 kV Titan Krios), om lamellernas framkanter pekade uppåt på kartan, krävde detta en +10° förlutning och om de pekade nedåt krävde detta en -10° förlutning. Varje rutnät kan vara annorlunda på grund av orienteringen i vilken de plockades upp i pincetten och sattes in i autoladdaren (cutaway-sektionen vänd åt vänster eller höger, ger en 180 ° rotation). Ett sista övervägande är pixelstorlek. Rutinmässigt samlas tilt-serier in runt 2,5-7 Å/pixel, med hänsyn till storleken på den intressanta egenskapen, målupplösningen för de resulterande tomografiska data och lamellens yta, vilket kan begränsa storleken på upptagningsområdet. Det är möjligt att använda en mindre pixelstorlek för att få högupplöst information och den minsta vi har använt framgångsrikt på dessa prover är 1,4 Å/pixel (data visas inte). Drift blir tydligare vid en mindre pixelstorlek och är egentligen bara lämplig för tunna (<100 nm) lameller där maximering av upplösning är av betydelse i studien.

Figure 6
Figur 6: Val av tillgängliga regioner av intresse att hämta lutningsserier från (A) Ett avsnitt av en TEM-karta med låg förstoring som visar ett område som innehåller lameller, som visas som sex vita skåror på svart bakgrund (röda pilar). De vita rutorna är trasig kolfilm. B) En medelstor förstoringskarta över en skadad och devitrifierad lamell. I framkanten av lamellen (FE) har organoplatinapälsen knäppts av (1). Det finns en klar fläck av kristallin is i mitten av lamellen (2). Jonstrålen har misslyckats med att bryta igenom vid lamellens bakkant (BE) eftersom isen är för tjock bredvid gallerstängerna. Endast en liten del av lamellen är fri från den omgivande isen vid BE (3), vilket skapar en kil. Tjockleken har också orsakat att hyllor skärs ovanför lamellen (4), vilket sannolikt kommer att blockera sikten för cellerna vid hög lutning i TEM. (C) Montage med medelförstoring av en hel lamell sedd i TEM. Typiska problem eller regioner som bör undvikas vid insamling av lutningsserier från lameller är områden: täckta med ytkontaminering (SC), täckt av organoplatinabeläggningen (OP, gul), nära sprickor (CR och svarta pilar), med gardin på grund av densitetsförändringar i biologiskt material (CU och region inom blå parenteser) och områden som försvagats av brott i organoplatinabeläggningen (grön cirkel). De enda regioner som är tillgängliga för förvärv av tiltserier är områdena inom de två svarta streckade rutorna (märkta 1 och 2). Vyn måste kontrolleras vid hög lutning för att säkerställa att ytföroreningar inte skymmer intresseområdet eller fokusområdet. (D) Ett medium förstoringsmontage av en mycket renare lamell, men som fortfarande har sprickor (CR) orsakad av gallring av organoplatinabeläggningen (grön cirkel) under polering. Här markeras intresseområdet av den celltyp som observeras i lamellen, som i detta fall är de enskilda merozoiterna, placerade bakom kolskiktet (orange) mot baksidan av lamellen (svartstreckad låda). Skalstänger, 3 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Inhämtning av kryo-ET-data från FIB-malda lameller. a) En mikrografi av en region av en lamell innehållande en röd blodkropp som nyligen har invaderats av en P. falciparum merozoit. I (B) är samma bild kommenterad för att visa gränsen för de röda blodkropparna (röd), ett antal dubbelväggiga intracellulära vesiklar (lila och blå för de inre respektive yttre membranen) och merozoiten (grön) omgiven av ett andra membran härrörande från värdcellen (gul). En svart ruta visar området där en tilt-serie förvärvades. Skalstång, 500 nm. (C) I genomsnitt 20 centrala skivor sedda i XY-planet från ett 8x binned tomogram (2,4 Å/pixel) förvärvat vid den apikala änden av merozoiten och i (D) dess anteckning, som visar de två membranen som omger cellen (grön och gul) och fyra membran staplade i toppen av merozoiten (blå) som är associerade med en elektrontät svampformad funktion (lila). En röd pil indikerar korsningen mellan membranstaplarna i toppen och den svampformade funktionen (visas också i del F, i). En svart pil indikerar en fusionshändelse mellan merozoitplasmamembranet och en av de flerskiktade vesiklarna i parasiten (visas också i del F, ii). Värdens röda blodkroppsmembran visas (rött) och en svartstreckad linje visar positionen för ett tvärsnitt sett i XZ-planet, som visas i (E). Funktionerna i tvärsnittet (E) är färgade och märkta på samma sätt som i del (D), med färgade pilar som pekar på membranen. En svart pil anger positionen för en sputterbeläggning som appliceras på lamellen efter fräsning och lamellens tjocklek i indikerad. För detaljer (C-E), skalstång, 500 nm. (F) En mer detaljerad bild av de egenskaper som indikeras av de röda och svarta pilspetsarna i del (C), som visar definitionen i lipid-biskikten av membranstacken i toppen av merozoiten (i) och fusionshändelsen mellan flerskiktad vesikel och merozoitplasmamembranet. Skalstång, 75 nm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Arbetets primära fokus är att dissekera vägen för merozoitutgång i P. falciparum Men med tanke på att populationen av celler som används i studien aldrig kan vara helt homogen, observerades ofta andra stadier av cellutveckling inom lamellerna. Exemplet som visas här (Figur 7) innehåller en röd blodkropp som nyligen har invaderats av en P. falciparum parasit (merozoit). Lamellen som användes var 240 nm tjock och gallret hade varit lätt sputterat belagt med platina i en argonatmosfär innan det infördes i TEM, vilket resulterade i något mindre kontrast än vad som normalt skulle förväntas. Det röda blodkroppsmembranet kunde spåras i sin helhet som omger cellen. Inuti de röda blodkropparna fanns tre slutna membranbundna strukturer, två vesiklar, var och en omgiven av ett dubbelmembran och en glödlampaformad egenskap (1,2 μm x 0,9 μm vid dess bredaste delar), vilket överensstämmer med att det är en merozoit (Figur 7A-B). Innehållet i de två vesiklarna tycktes vara liknande i motsats till innehållet i de röda blodkropparna, vilket tyder på att dessa vesiklar kan innehålla hemoglobin. Förekomsten av vesiklar i värdens röda blodkroppar efter invasion har observerats tidigare45. De tros uppstå från utsöndringen av lipider och andra virulensfaktorer från sekretoriska organeller som kallas rhoptries i merozoiten, som släpper ut i värdens röda blodkroppar under invasionen. Merozoiten är omgiven av två nära associerade membran, varav det innersta förmodligen är merozoitens ursprungliga plasmamembran, på vilket det inte finns någon synlig ytbeläggning, och det yttre måste härröra från värdens röda cellmembran som omsluter merozoiten när den invaderar. Merozoitens cytoplasma innehåller många flerskiktiga vesiklar och en elektrontät svampformad funktion intill en stapel membran vid toppen. En lutningsserie som förvärvats över detta område (2,4 Å/pixel) visar att den innehåller en stapel med fyra membran, som verkar vara kopplade till den svampformade funktionen (Figur 7C-E). Slående är denna morfologi helt annorlunda än det normala arrangemanget av organeller och cellulära strukturer i den apikala änden av en mogen merozoit. För att bedöma detta erhölls en jämförande lutningsserie (2,74 Å/pixel) över den apikala änden på en mogen merozoit från en schizont som hade behandlats med E64 före djupfrysning och malning (Figur 8). Detta visar att den apikala änden av en merozoit innehåller två framträdande klubbformade sekretoriska organeller som kallas rhoptries inbäddat i en uppsättning av tre polära ringar vid cellens apikala spets och omgiven av ett antal mindre sekretoriska organeller som kallas mikronemer. Den innersta polära ringen är fäst vid en dubbel membranstruktur som ligger till grund för merozoitplasmamembranet, kallat det inre membrankomplexet, som innehåller motorproteiner som driver invasion. Det har visats att under invasionen släpps innehållet i de sekretoriska organellerna ut på merozoitytan och in i värdens röda blodkroppar, vilket underlättar fästning av merozoiter till värdröda blodkroppar och initierar motorkomplexet som driver invasion45. Uppgifterna här visar att merozoiten efter invasionen inte innehåller några observerbara strukturer som liknar rhoptries, mikronemer eller polära ringar, vilket tyder på att morfologin hos den apikala änden av merozoiten dramatiskt förändras. Fusion av rhoptries före invasion har tidigare visats av TEM av fasta rumstemperatursektioner46, vilket överensstämmer med produktionen av den svampformade funktionen vi observerar i vår merozoit efter invasionen. Staplarna av membran kopplade till denna funktion har inte observerats tidigare och eftersom det inte finns någon indikation på en IMC närvarande i den nyligen invaderade merozoiten, antar vi att membranstaplarna kan vara resterna av IMC-maskineriet kvar efter invasionen är klar, men detta återstår att bekräfta.

Figure 8
Figur 8: Den apikala änden av mogna merozoiter genom kryo-ET av en FIB-malet lamell och TEM av plastsektioner. (A) I genomsnitt 20 centrala skivor från ett 8x binned tomogram (2,74 Å/pixel) från en 230 nm tjock lamell som visar den typiska morfologin hos den apikala änden av en mogen merozoit. Schizonterna behandlades med E64 före nedfrysning, så PV-membranet har spruckit och merozoiterna finns i värdens röda blodkroppar. (B) visar samma som i (A), men med anteckningar för att indikera värdens röda blodkroppsmembran (RCM, rött), merozoitplasmamembranet (grönt), det inre membrankomplexet (IMC, lila), polära ringar (PR, svart), mikronemer (M, gul), rhoptries (R, grå) och kärnhöljet (NE, blå). En närliggande merozoit, som är ur plan i denna region av tomogram, indikeras av en grön triangel. Skalstång, 200 nm. (C) De cellulära egenskaper som observeras av cryoET överensstämmer med de från TEM hos schizonter bevarade i plastsnitt. Liknande cellulära egenskaper indikeras i en mogen merozoit från en schizont som har behandlats med förening 2, som stoppar utgången före PV-membranbrott. Skalstång, 500 nm. (D) En kommenterad schematisk bild av en merozoit som visar cellulära egenskaper i delar (A-C). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tjocklek på det skyddade området mellan de rektangulära fräsmönstren (μm) Nomisk jonstrålström (pA) vid 30 kV
3 300
1.5 100
0.75 50
0.3 30
0,2 - 0,06 (slutlig polering) 30*

Tabell 1: Frässtrategi för att producera tunna lameller. Stegvis fräsning utförs genom att reducera jonstrålströmmen som motsvarar tjockleken på det skyddade området. Detta begränsar provuppvärmningen och förhindrar devitrifiering. *Polering bör utföras parallellt för att jämnt applicera värme på lamellerna från båda sidor, vilket minskar risken för att de böjer sig eller böjer sig när de når sin slutliga tjocklek. Andra steg kan göras sekventiellt, fräsa mönstret ovanför lamellen och sedan under lamellen innan du flyttar till nästa strålström. Kartläggning av nätet för att lokalisera fräspositioner bör utföras vid 1,5 pA strålström för att minimera provuppvärmning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Discussion

Medan kryoFIB-fräsning blir mer rutinmässig har beredning av optimala prover för fräsning inte; därför inträffar de flesta av de kritiska stegen i detta protokoll innan provet når kryoFIB-SEM. Provoptimering genom flera omgångar av cellberedning, doppfrysning och screening med ljus- och elektronmikroskopi krävs för att producera bästa möjliga prov innan fräsning försöks. Att ha bästa möjliga prov ökar inte bara chanserna för framgång utan optimerar också användningen av utrustningen. Av denna anledning kräver de flesta nationella anläggningar bevis för att tillräcklig optimering har utförts innan de beviljar tid på sina maskiner. Väl inne i kryoFIB-SEM är det viktigt att maximera effektiviteten hos den organoplatina beläggningen för att producera jämnt tunna lameller. Slutligen är tålamod och god provhantering en förutsättning för användaren, som kommer att behöva sitta i flera dagar för att producera och sedan överföra galler som innehåller känsliga lameller. Detta kan förändras med införandet av automatiserade frässtrategier47,48, men än så länge är hela malningsprocessen fortfarande till stor del manuell på de flesta anläggningar.

Medan arbetet enbart fokuserade på P. falciparum schizonts, kunde metoden som presenteras här enkelt modifieras för att optimera nätberedning och fräsning för andra celltyper. Viktiga faktorer att tänka på är densiteten hos cellerna som appliceras på gallret, rutnätstypen (koppar är giftigt för vissa celler), storleken och avståndet mellan hål i kolfilmen, blottningstiden och metoden för blotting (enkel/dubbelsidig, manuell eller automatiserad). Dessutom, om cellerna odlas på gallret (vanligtvis guldnät med en hålig kolfilm), kan sammanflödet kontrolleras med ljusmikroskopi före blottning och frysning. Fräsningsstrategin beror på hur cellerna deponeras på gallret. För malariainfekterade röda blodkroppar är gallret i huvudsak belagt av ett obrutet lager av celler, tjockare i vissa områden och tunnare i andra områden. Fräsning utförs på flera punkter i ett område längs denna gradient där istjockleken genererar lameller som är en lämplig storlek för tomografi. Detta tillvägagångssätt fungerar bra för mindre celler eftersom du kan producera lameller som innehåller en skiva genom flera celler. För större celler eller klumpar av celler kan det vara så att en cell eller cellklump kan producera en lamell.

Näthantering och provöverföring är fortfarande en av de största utmaningarna i detta arbetsflöde. Lameller kan gå förlorade på grund av brott eller sprickor, gardinartefakter som döljer biologin, överdriven ytkontaminering samt problem med nätorientering inom TEM, vilket kräver ett extra hanteringssteg för att flytta gallret. Graden av förluster varierar från dag till dag och rutnät till rutnät, men det förbättras genom övning och hanteringserfarenhet över tid. I denna studie fann man att gallren kan omorienteras noggrant i autoladdaren flera gånger utan att förstöra lameller och detta har ibland fördelen att tvätta bort ytis. En annan viktig begränsning av detta arbetsflöde är den tid det tar att producera lameller. Eftersom produktionen är långsam är det viktigt att ha ett korrekt optimerat prov, vilket gör fräsningen så effektiv som möjligt.

Ett antal anpassningar av FIB-fräsning av glaskroppsprover har nyligen införts. En spelväxlare är implementeringen av kryogeniskt kylda lyftverktyg i kryoFIB-SEM-kammaren som gör det möjligt att fräsa större materialblock från högtrycksfrysta prover. Blocken kan fästas på en metallstav eller plockas upp i en gripare och flyttas till en andra provposition, innehållande ett speciellt modifierat EM-rutnät. Blocken kan sedan beläggas med organoplatina och fräsas för att generera lameller. Förmågan att mala lameller från högtrycksfryst material innebär att mycket större celler och vävnader kan bearbetas, specifikt riktade områden genom korrelativ fluorescensmikroskopi12. Andra nya anpassningar av FIB-fräsningsmetoden inkluderar minskning av gardinartefakter genom kilförfräsning av provet16, mikrofluidisk kryofixering49 och fotomikromönstring av elektronmikroskopinät för att förbättra cellfördelningen50. Det har också visats att fräsning av mikroexpansionsgap på vardera sidan av en lamell kan lindra kompressionen av det omgivande provet när det når sin slutliga tunnhet51. Detta kan vara särskilt användbart vid fräsning av kontinuerliga cellskikt, såsom provet i denna studie, där böjning av lameller ibland ses under det sista poleringssteget.

Framtiden för elektronmikroskopi kommer sannolikt att vara bestämning av in situ-molekylära strukturer genom subtomogrammedelvärde och FIB-fräsning är ett viktigt verktyg som underlättar produktionen av glaskroppsbiologiska prover för dessa typer av arbetsflöden. Medan FIB-fräsning fortfarande är i sin linda för biologiska tillämpningar, sker metodutveckling i snabb takt tack vare hårt arbete från forskare, både akademiska och vid nationella anläggningar, plus kommersiella investeringar i att utveckla kryoFIB-SEM-teknik för att stödja forskning.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning finansierades helt eller delvis av Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). För öppen tillgång har författaren tillämpat en CC BY offentlig upphovsrättslicens på alla författaraccepterade manuskriptversioner som härrör från detta bidrag.

Detta projekt för vilket denna metod utvecklades finansierades av ett Medical Research Council-anslag MR/P010288/1 som tilldelades Helen R. Saibil, Roland A. Fleck och Michael J. Blackman. Kulturer av P. falciparum odlades vid The Francis Crick Institute, med stöd av medlemmar i Michael J. Blackmans grupp. Författarna vill tacka Dr. Ser Ying (Michele) Tan för att ha tillhandahållit bilderna av förening 2 och E64-behandlade schizonter i tunna blodutstryk. De flesta lamellerna producerades med stöd från personal på eBIC och vi är tacksamma för tillgång till Scios dubbelstrålande kryoFIB-SEM på forskningsförslag NT21004. Författarna erkänner också stödet från Royal Society Industry Fellowship-systemet (INF\R2\202061) för att fortsätta utvecklingen av FIB-fräsningstekniken inom CUI. Författarna vill också tacka Helen R. Saibil för nyttiga diskussioner i relation till detta metoddokument och handledning av projektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
c-clips Thermo Fisher Scientific 1036171
Clipping station Thermo Fisher Scientific n/a Direct quote from Thermo
Clipping station Sub-angstrom CSA-01
Compound 2 n/a n/a Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc
Cryo-FIB specific autogrid rims Thermo Fisher Scientific 1205101
E64 Sigma E3132
Emitech K100X glow discharge unit Quorum n/a
Gibco RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 12633012 Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements
Giemsa Stain VWR International 350864X
Glass slides Thermo Fisher Scientific 11562203
Grid boxes Sub-angstrom PB For clipped grids
Grid boxes Thermo Fisher Scientific n/a For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific
Grid boxes Agar Scientific AGG3727
Home-made manual plunge freezing rig n/a n/a With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.
Human blood n/a n/a UK National Blood and Transplant service
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system JEOL n/a FIB-SEM
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage Leica n/a sputter coater
Leica EM ACE900 Leica n/a e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.
Linkam cryo-stage for light microscope Linkam Model No. CMS196 Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.
Methanol Sigma 179957
Nikon Eclipse E200 light microscope Nikon n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.
Percoll VWR International 17-0891-01 Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids Quantifoil N1-C17nCuH2-01 100 pack
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids Quantifoil N1-C17nCu20-01 100 pack
Quorum PP3010 prep-chamber Quorum n/a sputter coater
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage. FEI n/a FIB-SEM
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen Viking Direct ND538522
TFS Titan Krios 300 kV TEM Thermo Fisher Scientific n/a TEM equipped with a K2 or K3 camera.
Whatmann grade 1 filter paper Sigma WHA1001150
Zeiss Axio Scope A1 light microscope Zeiss n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumeister, W. From proteomic inventory to architecture. FEBS Letters. 579 (4), 933-937 (2005).
  2. Rigort, A., Villa, E., Bäuerlein, F. J. B., Engel, B. D., Plitzko, J. M. Integrative approaches for cellular cryo-electron tomography: Correlative imaging and focused ion beam micromachining. Methods in Cell Biology. 111, 259-281 (2012).
  3. Oikonomou, C. M., Chang, Y. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14, 205-220 (2016).
  4. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  5. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
  6. Narayan, K., Subramaniam, S. Focused ion beams in biology. Nature Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).
  7. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  8. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  9. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: Focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (5), 771-777 (2013).
  10. Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180 (2), 318-326 (2015).
  11. de Winter, D. A. M., et al. In-situ integrity control of frozen-hydrated, vitreous lamellas prepared by the cryo-focused ion beam-scanning electron microscope. Journal of Structural Biology. 183 (1), 11-18 (2013).
  12. Schaffer, M., et al. A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue. Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).
  13. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  14. Albert, S., et al. Proteasomes tether to two distinct sites at the nuclear pore complex. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 114 (52), 13726-13731 (2017).
  15. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705 (2018).
  16. Schaffer, M., et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).
  17. Szwedziak, P., Wang, Q., Bharat, T. A. M., Tsim, M., Löwe, J. Architecture of the ring formed by the tubulin homologue FtsZ in bacterial cell division. eLife. 3, 04601 (2014).
  18. Carlson, L. A., et al. Cryo electron tomography of native HIV-1 budding sites. PLOS Pathogens. 6 (11), 1001173 (2010).
  19. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nature Communications. 11 (1), 5885 (2020).
  20. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  21. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  22. Murphy, G. E., et al. Correlative 3D imaging of whole mammalian cells with light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 176 (3), 268-278 (2012).
  23. Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2012).
  24. Spehner, D., et al. Cryo-FIB-SEM as a promising tool for localizing proteins in 3D. Journal of Structural Biology. 211 (1), 107528 (2020).
  25. Kamino, T., Yaguchi, T., Ohnishi, T., Ishitani, T., Osumi, M. Application of a FIB-STEM system for 3D observation of a resin-embedded yeast cell. Journal of Electron Microscopy. 53 (5), Tokyo. 563-566 (2004).
  26. Han, H., Zuber, B., Dubochet, J. Compression and crevasses in vitreous sections under different cutting conditions. Journal of Microscopy. 230, Pt 2 167-171 (2008).
  27. Matias, V. R. F., Al-amoudi, A., Dubochet, J., Beveridge, T. J. Cryo-transmission electron microscopy of frozen-hydrated sections of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (20), 6112-6118 (2003).
  28. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150 (1), 109-121 (2005).
  29. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. The EMBO Journal. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  30. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: A new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1-2), 43-51 (2006).
  31. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 172 (2), 180-190 (2010).
  32. Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. -J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryoelectron microscopy of vitrified specimens. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer. Berlin Heidelberg. 114-131 (1987).
  33. Hsieh, C., Schmelzer, T., Kishchenko, G., Wagenknecht, T., Marko, M. Practical workflow for cryo focused-ion-beam milling of tissues and cells for cryo-TEM tomography. Journal of Structural Biology. 185 (1), 32-41 (2014).
  34. Harapin, J., et al. Structural analysis of multicellular organisms with cryo-electron tomography. Nature Methods. 12 (7), 634-636 (2015).
  35. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 180 (3), 572-576 (2012).
  36. Duyvesteyn, H. M. E., et al. Machining protein microcrystals for structure determination by electron diffraction. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 115 (38), 9569-9573 (2018).
  37. Blackman, M. J. Purification of Plasmodium falciparum merozoites for analysis of the processing of merozoite surface protein-1. Microbes as Tools for Cell Biology. 45, Academic Press. London, UK. 213-220 (1995).
  38. Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2 - anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  41. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  42. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  43. Turoňová, B., Schur, F. K. M., Wan, W., Briggs, J. A. G. Efficient 3D-CTF correction for cryo-electron tomography using NovaCTF improves subtomogram averaging resolution to 3.4 Å. Journal of Structural Biology. 199 (3), 187-195 (2017).
  44. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3d correlative microscopy. Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).
  45. Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host & Microbe. 9 (1), 9-20 (2011).
  46. Hanssen, E., et al. Electron tomography of Plasmodium falciparum merozoites reveals core cellular events that underpin erythrocyte invasion. Cellular Microbiology. 15 (9), 1457-1472 (2013).
  47. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  48. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife. 9, 52286 (2020).
  49. Fuest, M., et al. In situ microfluidic cryofixation for cryo focused ion beam milling and cryo electron tomography. Scientific Reports. 9 (1), 19133 (2019).
  50. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  51. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208 (3), 107389 (2019).

Tags

Retraktion utgåva 174 FIB-fräsning kryoFIB-SEM lamell tomografi kryoET kryoEM Plasmodium falciparum

Erratum

Formal Correction: Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography
Posted by JoVE Editors on 09/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. The Authors section was updated from:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

to:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
M. Alejandra Carbajal1
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

Förbereda lameller från glaskroppsbiologiska prover med hjälp av ett dubbelstråleskanningselektronmikroskop för kryoelektrontomografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bisson, C., Hecksel, C. W.,… More

Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Carbajal, M. A., Fleck, R. A. Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (174), e62350, doi:10.3791/62350 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter