Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Получение ламелей из биологических образцов стекловидного тела с помощью двухлучевого сканирующего электронного микроскопа для криоэлектронной томографии

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/62350
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3, 1, 1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London, 2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London, 3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

ERRATUM NOTICE

Summary

Использование сфокусированного ионно-лучевого фрезерования для получения стекловидных пластинок на сетке из замороженных биологических образцов для криоэлектронной томографии.

Abstract

Здесь представлен протокол приготовления криоламелей из замороженных сеток инфицированных Plasmodium falciparum эритроцитов человека, который может быть легко адаптирован для других биологических образцов. Основные принципы подготовки образцов, фрезерования и просмотра ламелей являются общими для всех приборов, и протокол может быть использован в качестве общего руководства по подготовке криоламелей на сетке для криоэлектронной микроскопии (криоЭМ) и криоэлектронной томографии (криоЭТ). Сетки электронной микроскопии, поддерживающие клетки, погружаются в жидкий этан с охлаждением жидким азотом с помощью ручной или автоматической морозильной камеры, а затем экранируются на световом микроскопе, оснащенном криоступентом. Замороженные сетки переносятся в криосканирующий электронный микроскоп, оснащенный сфокусированным ионным пучком (cryoFIB-SEM). Перед фрезерованием решетки обычно наносятся напылением, что способствует рассеиванию накопления шихты во время фрезерования. В качестве альтернативы можно использовать ротационную машину для нанесения на решетки слоя углерода-платины, точную толщину которого можно более точно контролировать. Попав внутрь криоFIB-SEM, на поверхность решетки с помощью системы впрыска газа (ГИС) наносится дополнительное покрытие из платинового органического соединения. Этот слой защищает передний край ламели при фрезеровании, целостность которого имеет решающее значение для получения равномерно тонких ламелей. Области интереса идентифицируются с помощью SEM, и фрезерование выполняется поэтапно, уменьшая ток ионного пучка по мере того, как ламель достигает электронной прозрачности, чтобы избежать чрезмерного выделения тепла. Затем сетка с несколькими ламелями переносится в просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) в криогенных условиях для получения наклонных рядов. Надежный и свободный от загрязнений рабочий процесс подготовки ламелей является важным этапом для последующих методов, включая клеточную криоЭМ, криоЭТ и усреднение субтомограммы. Разработка этих методов, особенно для подъема и измельчения замороженных образцов под высоким давлением, имеет первостепенное значение в полевых условиях.

Introduction

Только клеточное содержимое биологических образцов толщиной <500 нм может быть эффективно визуализировано с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) при криогенных температурах, ограничивая диапазон образцов вирусами, прокариотами, простыми одноклеточными организмами и более тонкими областями более крупных эукариотических клеток1. Фрезерование сфокусированным ионным пучком (FIB) на сетке позволяет разбавлять более толстые замороженные биологические образцы до электронно-прозрачных ламелей при криогенных температурах (< -150 °C). Полученные ламели затем переносятся в ПЭМ для визуализации и сбора томографических данных, что позволяет проводить 3D-реконструкции клеточных и молекулярных особенностей внутри клеток с высоким разрешением (обзоры см. Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163 и Wagner et al., 20204).

FIB-фрезерование возникло в области материаловедения, где образцы обычно разбавляются, чтобы подготовить их к последующему анализу5. Он выполняется в сканирующем электронном микроскопе (SEM), который имеет две оптические колонки: обычную оптику сканирующего электронного микроскопа и вторую колонку, содержащую оптику, способную генерировать и точно контролировать сфокусированный ионный пучок (FIB), называемый FIB-SEM. Это позволяет удалить определенную область образца ионами, генерируемыми источником галлия, удаляя лишний материал и оставляя после себя ламель6. Процесс фрезерования управляется СЭМ-визуализацией топографии образца, которая используется для определения интересующих областей и мониторинга хода фрезерования. Для биологических применений базовая установка в основном такая же, но измельчение осуществляется при криогенных температурах. Это потребовало адаптации стандартных FIB-SEM к криоохлаждаемым ступеням, которые поддерживают постоянную температуру и низкий уровень поверхностного загрязнения, а также воздушные шлюзы для облегчения переноса образцов без девитрификации или загрязнения. Челноки для образцов также были модифицированы, чтобы позволить устанавливать ряд различных носителей внутри криоFIB-SEM, включая сетки TEM, планшеты и капилляры. Несколько ключевых групп исследователей сыграли центральную роль в разработке этих методов и продолжающихся технологических достижениях в этой области 7,8,9,10,11,12. В настоящее время более широко доступны коммерческие решения для биологического FIB-фрезерования при криогенной температуре, а сетевое измельчение ламелей становится все более рутинным при получении оптимизированного образца.

Ряд методов комнатной температуры и криоЭМ может быть использован для визуализации клеточной информации на всех уровнях жизни, от целых многоклеточных организмов при скромном разрешении до понимания контекста сложных процессов на клеточном уровне и еще более подробно, до определения in situ Молекулярные структуры13,14,15,16,17,18,19. Классические методы комнатной температуры включают секционирование фиксированных и окрашенных, погруженных в смолу клеток и тканей с помощью ультрамикротомии для анализа клеточной морфологии с помощью ПЭМ (обзор см. в Studer et al., 200820). Были разработаны альтернативные методы, использующие вторичное рассеяние электронов с помощью SEM для визуализации поверхности блоков сохраненных ячеек, прежде чем постепенно удалять материал либо ножом (серийная визуализация лица блока), либо сфокусированным ионным пучком21,22,23. Этот метод также был успешно реализован при криогенных температурах (называемых криообъемной визуализацией) с помощью криоFIB-SEM на стекловидных, неокрашенных блоках клеток или тканей24. В качестве альтернативы, более толстые ламели (толщиной ~ 15 мкм) могут быть фрезерованы и изучены с помощью STEM-визуализации25. Используя эти методы, можно визуализировать целые блоки, содержащие множество клеток, для сбора информации о популяции или весь орган / организм может быть изображен и реконструирован в 3D. Однако для доступа к молекулярной информации с высоким разрешением из клеток образцы должны быть сохранены в почти нативном, замороженно-гидратированном состоянии и, следовательно, должны быть подготовлены в криогенных условиях. Криоэлектронная микроскопия срезов стекловидного тела (CEMOVIS) - это метод, при котором замороженные блоки биологического материала под высоким давлением разрезаются в криогенных условиях с помощью ультрамикротома. При этом получаются ленты криосекций (толщиной 40-100 нм)26, которые прикреплены к ЭМ-сетке и отображены в ПЭМ. Однако физическое взаимодействие ножа с образцом стекловидного тела вызывает трещины и артефакты сжатия, которые могут сильно исказить клеточную структуру27,28,29,30. Более толстые участки более подвержены этим артефактам, что делает непрактичным использование участков толще ~ 70 нм26. Это ограничение сильно ограничивает 3D-вид биологической структуры на томограмме. FIB-фрезерование при криогенных температурах не испытывает этих проблем, но имеет свои собственные артефакты, вызванные разницей в скорости фрезерования по частям образца, что приводит к переменной толщине внутри ламели - так называемой завесе. Эта проблема смягчается нанесением органоплатинового покрытия, наносимого с помощью системы впрыска газа (GIS), которая защищает переднюю кромку ламели во время фрезерования31. Верхний предел толщины образца для FIB-фрезерования на сетке определяется возможностью погружения, замораживания образца с сохранением его стекловидного тела32, хотя, с внедрением методов криолифтинга и адаптированных носителей образцов для биологических образцов, FIB-фрезерование также может быть использовано для обработки замороженных образцов под высоким давлением31,33,34,35. Кроме того, замороженные образцы не могут быть слишком тонкими, так как должно быть достаточно биологического материала для создания ламели разумного размера, которая обеспечит достаточную площадь поверхности для сбора наклонных серий при требуемом увеличении. Эту проблему можно смягчить, измельчив скопления более мелких клеток, таких как бактерии или дрожжи. Конечная толщина ламели (~100-300 нм) обычно определяется целостностью образца и стратегией фрезерования. Более тонкие ламели лучше подходят для структурных работ с высоким разрешением, таких как усреднение субтомограммы, но более толстые ламели содержат гораздо большие клеточные объемы, чем могут быть достигнуты с помощью CEMOVIS, обеспечивая более клеточный контекст в почти естественно сохранившемся образце. FIB-фрезерование также может быть использовано для разжижения кристаллов белка с погружной заморозкой для исследований дифракции электронов36.

FIB-фрезерование стекловидных клеток стоит потраченного времени и усилий, если научный вопрос требует высокоразрешающей молекулярной детализации околонативных образцов in situ. Имея доступ к большему количеству мощностей для рутинного производства ламелей, этапом, ограничивающим скорость, часто является оптимизация образца перед фрезерованием, где необходимо время, чтобы убедиться, что образец является стекловидным и имеет соответствующую толщину для получения прочных и равномерно тонких ламелей. Здесь описана оптимизация образца для FIB-фрезерования погруженно-замороженных эритроцитов человека, инфицированных паразитами Plasmodium falciparum , возбудителем малярии, но этот подход может быть адаптирован для любого данного образца.

Protocol

Человеческая кровь была получена от анонимных доноров через Национальную службу крови и трансплантации Великобритании и используется в течение 2 недель с момента получения. Для его использования не требуется никакого этического одобрения.

1. Подготовка и замораживание эритроцитов, инфицированных Plasmodium falciparum

  1. Изолируют зрелые шизонты центрифугированием (1,580 x g) в среде изотонического градиента плотности 70% (v/v) (стандартные процедуры культивирования бесполых стадий крови 3D7 Plasmodium falciparum в эритроцитах человека см. Blackman M.J., 1995,37).
  2. Зафиксируйте высушенные на воздухе тонкие пленки крови на предметном стекле со 100% метанолом, чтобы проверить морфологическую однородность шизонтов перед окрашиванием 10% красителем Гимзы в 6,7 мМ фосфатном буфере, рН 7,1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обогатить препарат для шизонтов, остановленных в определенных точках выхода, шизонты могут быть дополнительно синхронизированы с ингибиторами соединения 2 и Е64 (см. Репрезентативные результаты и рисунок 1 для объяснения эффекта этих ингибиторов).
    ВНИМАНИЕ: Plasmodium falciparum является патогеном человека и должен обрабатываться только в подходящем помещении для содержания в соответствии с местными правилами охраны труда и техники безопасности.
  3. Осторожно центрифужируют шизонты (240 x г), чтобы гранулировать их и ресуспендировать в 2-кратном объеме клеточной гранулы среды RPMI, в результате чего получается 50% суспензия гематокрита.
  4. На ручной установке для погружной заморозки нанесите 2,5 мкл шизонтов на углеродную сторону тлеющего разряда (используйте настройки блока тлеющего разряда 60 с, 30 мА на воздухе, обрабатывая только углеродную сторону сетки) медную сетку 200 меш с 2/4 отверстия углеродной пленки и промокните в течение ~ 20 с с обратной стороны сетки, используя фильтровальную бумагу класса 1 с разорванным краем. Погрузите жидкий этан с жидким азотом и перенесите решетки в хранилище (см. Таблицу материалов для оборудования, используемого в этом исследовании).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперимент можно приостановить, а сетки можно хранить под жидким азотом неограниченное время.
    ВНИМАНИЕ: Жидкий азот является удушающим и вызывает обморожение; Обращайтесь с осторожностью в подходящей среде с контролем кислорода.
    ВНИМАНИЕ: Жидкий этан вызывает сильные ожоги и легко воспламеняется; Используйте в вытяжном шкафу вдали от источников возгорания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Погруженные замороженные шизонты больше не жизнеспособны. Это было определено путем инкубации человеческой крови с несколькими золотыми сетками размороженных на воздухе схизонтов и наблюдения за отсутствием роста паразитов через несколько дней по сравнению с незамороженными контрольными группами. Таким образом, замороженные решетки шизонтов безопасны для обращения за пределами защитных сооружений с использованием обычных процедур безопасности и обеззараживания (перчатки, стерилизация поверхностей / инструментов >70% этанола и утилизация решеток в >70% этаноле).
  5. Экранные сетки используют крио-столик для светового микроскопа, уделяя особое внимание градиенту льда через сетку. На более тонких участках льда проверьте отдельные квадраты сетки на покрытие ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лучшие квадраты должны быть толщиной в одну ячейку в центре квадрата сетки (рис. 2). Это гарантирует, что ламель может быть фрезерована по центру квадрата, не ударяясь о более толстый лед по краям о решетчатые стержни. Здесь эксперимент можно поставить на паузу, а сетки можно хранить под жидким азотом неограниченное время. Если клетки несут флуоресцентный маркер, сетки также могут быть экранированы криоCLEM для определения интересующих позиций X/Y, которые могут быть соотнесены с расположением сеток в криоFIB-SEM для прямого фрезерования.

2. Сетевое FIB-фрезерование погружных замороженных ячеек

  1. Отметьте переднюю часть автосетчатых дисков CryoFIB черным несмываемым маркером, чтобы обозначить центр вырезанной секции и противоположную сторону обода (рис. 3). Установите клипсаторную станцию и прикрепите сетки к отмеченным кольцам карбоновой стороной вниз.
  2. Загрузите решетки в шаттл cryoFIB-SEM (обычно 2 сетки, в зависимости от челнока) карбоновой стороной вверх и нанесите платиновое покрытие для распыления в атмосфере аргона (5 x 10-2 мбар) (5 мА в течение 60 с - толщина изменяется) или углеродно-платиновый поворотный слой электронного луча (толщина ~ 4 нм) на поверхность ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оба типа покрытий способствуют рассеиванию заряда во время СЭМ-визуализации. Преимущество ротационной машины для нанесения покрытий с электронным лучом заключается в том, что можно указать точную толщину покрытия.
  3. Загрузите шаттл в криоFIB-SEM и оцените распределение ячеек в каждой сети с помощью SEM при напряжении 5 кВ (13 пА или 25 пА). Сделайте обзор с малым увеличением (~ 100x), чтобы посмотреть на градиенты льда по всей сетке. Затем сделайте снимки с большим увеличением (~ 5,000x), чтобы посмотреть на отдельные квадраты сетки и определить области сетки с видимыми ячеистыми особенностями и низким загрязнением поверхности для фрезерования.
  4. Нанесите органоплатиновое покрытие размером >2 мкм на поверхность каждой сетки с помощью системы впрыска газа (GIS). Для этого вставьте иглу ГИС в камеру над решеткой и нагрейте источник органоплатины до заданной температуры в течение заданного времени (например, ~27 °C в течение 3-10 с) для получения потока пара.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Угол нанесения, температура и время нанесения органоплатинового покрытия через иглу ГИС должны быть оптимизированы для обеспечения максимальной равномерности покрытия. Это будет зависеть от конкретного используемого криоFIB-SEM (см. Репрезентативные результаты для дальнейшего объяснения).
  5. Наклоните образец так, чтобы плоскость сетки составляла ~ 10 ° от угла падения ионного пучка, и переместите центр подходящего квадрата сетки, который будет виден как на изображениях SEM, так и на изображениях FIB.
  6. Исследуйте сетку с помощью ионного пучка при низком токе (номинально 1,5 пА, 30 кВ) и перейдите к достаточно высокому увеличению (~ 7000x), чтобы визуализировать ячейки в центре квадрата сетки. Сфокусируйте образец при первом фрезерном токе (300 пА) и скорректируйте астигматизм. Отрегулируйте яркость и контрастность, затем разметьте два прямоугольных узора для фрезерования, один над и один под защищенной областью толщиной 3 мкм, центр которой является желаемым местом окончательной ламели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранная ширина узоров будет зависеть от топографии окружающего слоя клеток и размера ячейки. 7-20 мкм - подходящая ширина для шизонтов, но более широкие ламели требуют больше времени для фрезерования. Выбранная высота шаблонов для первого этапа фрезерования зависит от толщины образца и составляет около 6 мкм; Возможно, потребуется отрегулировать это во время фрезерования. Фрезеровка осуществляется направленно от наружных верхних и нижних краев узоров к поверхности ламели. Это можно сделать параллельно, когда оба рисунка фрезеруются одновременно или последовательно, сначала удаляя материал сверху ламели, а затем снизу.
  7. Начните фрезерование с первым током; следить за ходом движения в реальном времени в виде ионного пучка и периодически с помощью SEM (5 кВ, 13 или 25 пА). Убедитесь, что ионный пучок пробил образец выше и ниже защищенной области. Если нет, увеличьте высоту прямоугольных узоров, чтобы удалить больше материала. Остановитесь, когда поверхность над и под ламелью станет полностью гладкой в виде ионного пучка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ионный пучок пробил образец выше и ниже защищенной области, когда внутренняя часть прямоугольных узоров не содержит признаков в фокальной плоскости. Некоторые функции, такие как полосы сетки, могут быть видны не в фокусе на заднем плане.
  8. Переключение на следующий ток фрезерования (100 пА); Сфокусируйтесь и отрегулируйте яркость/контрастность. Уменьшите расстояние между двумя прямоугольными узорами до 1,5 мкм и уменьшите высоту шаблона, чтобы покрыть только нефрезерованный материал. Начинайте фрезерование на новом токе до тех пор, пока поверхность над и под ламелью не станет полностью гладкой.
  9. Повторяйте этот процесс поэтапно до тех пор, пока не будет достигнута толщина 0,3 мкм, каждый раз уменьшая ток ионного пучка в соответствии со схемой фрезерования в таблице 1.
  10. Фрезеруйте несколько ламелей (количество зависит от толщины образца и доступного времени) на одной или обеих сетках до толщины 0,3 мкм, запишите положение каждой ламели по X/Y/Z и оставьте ~1-2 часа в конце сеанса для полировки ламелей до их окончательной толщины (60-200 нм).
  11. Сделайте обзор всей сетки с помощью СЭМ с малым увеличением и спланируйте маршрут полировки, начиная с ламелей в передней части сетки (ближе к источнику ионного пучка) до ламелей в задней части сетки (наиболее удаленной от источника ионного пучка) (рис. 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это уменьшает повторное осаждение абляционного материала обратно на поверхность полированных ламелей.
  12. Уменьшите расстояние между двумя прямоугольными узорами до 100-200 нм и начните заключительный этап полировки при токе ионного пучка 30 пА. Следите за ходом СЭМ при 2-3 кВ (13 пА, выдержка = 300 н, 3072 x 2048, ~2 с для полного кадра) и прекращайте полировку, когда контраст теряется в ламелях с помощью СЭМ или когда платиновоорганическое покрытие самой ламели начинает терять целостность.
  13. Перед удалением сеток получите SEM-изображение всей сетки с малым увеличением и сохраните изображения каждой ламели. Используйте их для перекрестной проверки сетки позже в TEM. Поставьте здесь эксперимент на паузу и храните сетки с ламелями под жидким азотом – обращайтесь с ними осторожно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сетки могут быть слегка покрыты распылением при снятии с криоFIB-SEM, что может помочь ограничить дрейф и зарядку в ПЭМ при большом увеличении, но это следует делать осторожно, так как слишком большое покрытие распыления может скрыть биологическое содержимое внутри ламелей. На этом этапе можно провести скрининг ламелей на флуоресценцию; Однако получение достаточного сигнала будет зависеть от содержания меченого белка в толщине пластинки. Необходимо соблюдать большую осторожность при обращении с решетками, чтобы ограничить повреждение ламелей и предотвратить загрязнение поверхности.

3. Сбор данных с помощью серии Tilt и общий обзор обработки данных

  1. Загрузите решетки в ПЭМ, выровняв направление фрезерования перпендикулярно оси наклона ступени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выравнивание сеток выполняется на глаз с помощью меток на ободе автосетки. Допустима погрешность ~ 10 °, в противном случае стенки траншеи по обе стороны от ламели могут затенять ламель при наклоне сетки.
  2. Получите карту с малым увеличением (~ 150x) всей сетки и найдите ламели; Затем приобретите карту среднего увеличения (~ 1,500x, в зависимости от размера ламели) каждой ламели и найдите интересующие области.
  3. Предварительно наклоните сетку на ±10°, чтобы плоскость ламели (не сетки) была перпендикулярна оптической оси
    ПРИМЕЧАНИЕ: Направление предварительного наклона можно определить по положению переднего края ламелей (в поисках оставшегося органоплатинового слоя) на картах с малым и средним увеличением. Для ПЭМ, используемого здесь, сетки требуют предварительного наклона +10°, если передние края ламелей направлены вверх на картах, и требуют предварительного наклона -10°, если они направлены вниз. Каждая сетка может отличаться из-за того, как они были подобраны и вставлены в автозагрузчик.
  4. Получите дозосимметричную сериюнаклона 38 (например, от -54° до +54° с шагом 3-5°) с размером пикселя, который обеспечивает как поле зрения, так и разрешение, необходимые для интересующей области. Используйте диапазон значений размытия от -2 до -5 мкм. Соберите ролики с 3-10 кадрами с каждым шагом и для этого отрегулируйте эти параметры в зависимости от размера пикселя, чтобы накопить суммарную дозу ~150 e-/Å2(для ПЭМ 300 кВ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать трещин в ламелях, так как эти области могут дрейфовать. Также следует избегать поверхностного загрязнения, так как оно может затенять интересующую область или зону фокусировки при высоком наклоне.
  5. Коррекция движения фильмов с помощью такой программы, как MotionCor239. Примените фильтр взвешивания дозы к скорректированным изображениям (накопленным e-/image)40 и оцените расфокусировку каждого изображения с помощью такой программы, как CTFFIND441.
  6. Используйте безфидуциальное выравнивание (отслеживание патчей) в такой программе, как etomo (IMOD)42 , для расчета выравнивания и угловых отношений изображений в наклонных сериях.
  7. Введите информацию о выравнивании и вращении вместе со значениями расфокусировки в программу, которая может применить трехмерную коррекцию CTF, например, NovaCTF43. Рассчитайте скорректированную томограмму, чтобы получить выходные томограммы с коэффициентами биннинга, относящимися к последующему анализу.
  8. Проанализируйте реконструкции и подготовьтесь к любой последующей обработке, например, фильтрации, сегментации или усреднению субтомограммы.

Representative Results

Подготовка P. falciparum schizonts к погруженному замораживанию
Ингибиторы соединения 2 и Е64 используются для остановки шизонтов на разных стадиях выхода, генерируя обогащенную популяцию шизонтов для последующего изучения. Это важно, потому что без дополнительной корреляционной техники измельчение конкретных субклеточных мишеней или типов клеток является сложной задачей, поскольку процесс по существу слепой. Соединение 2 представляет собой ингибитор протеинкиназы, который останавливает выход до разрыва вакуоли. Шизонты могут быть синхронизированы с соединением 2 в течение 4 часов, затем промыты средой, свободной от соединения 2, для удаления ингибитора, после чего шизонты созревают и выходят примерно через 30 минут. В качестве альтернативы, синхронизированные шизонты соединения 2 могут быть промыты в Е64, необратимый ингибитор цистеиновой протеазы широкого спектра действия, и инкубированы в течение примерно 1 часа, чтобы остановить выход после точки разрыва вакуоли, но до разрыва клетки-хозяина. Морфология и однородность обработанных шизонтов должны быть проверены мазками крови, окрашенными по Гимзе, перед погружением в замораживание (рис. 1). Шизонты могут быть заморожены в любом из этих состояний с помощью метода, описанного в этой публикации.

Figure 1
Рисунок 1: Морфология соединения 2 и E64-остановленных шизонтов P. falciparum по мазкам крови, окрашенным в Гимсу. (A) В присутствии соединения 2 паразитофорная вакуоль (PV) плотно упакована мерозоитами (пурпурными кругами) с одним кластером кристаллов гемозоина (темно-коричневый круг). Граница между PV и окружающим гемоглобином в эритроците хозяина (hRBC) (серая полоса) четко определена, как и мембрана hRBC. (B) В присутствии E64 PV-мембрана разрывается, и мерозоиты распространяются внутри hRBC. Каждый шизонт по-прежнему содержит один кластер кристаллов гемозоина. Мембрана клетки-хозяина протекает и частично разрушена, поэтому гемоглобин не виден на периферии клетки, а граница мембраны hRBC не так легко видна. Масштабная линейка, 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Оптимизация погруженного замораживания
Ряд сеток с различными размерами отверстий был опробован во время оптимизации условий блоттинга для эритроцитов, инфицированных P. falciparum, включая 2/2, 3/3, 3,5/1 и 5/2 (квадрат) дырявый углерод на золотых и медных сетках 200 меш. Медные решетки с 200 мешами и 2/4 дырявой углеродной пленки обеспечивают достаточно толстый слой ячеек для фрезерования длинных стекловидных ламелей. Большие или меньшие отверстия обычно приводили к тому, что слои клеток были слишком тонкими или толстыми соответственно (рис. 2A-C). С 2/4 дырявого углерода шизонты протягиваются через отверстия размером 2 мкм путем промокания сетки сзади (неуглеродная сторона), в результате чего клетки выпирают выше и ниже углеродной пленки. Растяжение углерода 4 мкм между отверстиями приводит к тому, что полоса углерода проходит через середину большинства полученных ламелей, добавляя прочности. Сетки поиска наиболее подходят для корреляционных и экранирующих целей44, но необходимо следить за тем, чтобы цифры/буквы в конструкции сетки не были слишком большими, так как это заблокирует области для фрезерования.

Время промокания на ручном поршне составляет примерно 20 с, но точная точка, в которой можно прекратить промокание, определялась на глаз, когда капля жидкости, вытягиваемая из сетки, переставала растекаться по фильтровальной бумаге. Рваный край требовался, чтобы сломать поверхностное натяжение капли, чтобы начать процесс промокания. Автоматическая погружная морозильная камера в этом исследовании не использовалась, но разумной отправной точкой для этого образца было бы использование того же объема ячеек и типа решетки, что и для ручного плунжера, при условии промокания решеток сзади в условиях высокой влажности (~ 70%) и температуры окружающей среды (~ 25 ° C). Время и условия блоттинга должны быть оптимизированы для конкретной используемой автоматизированной системы.

Погруженные замороженные сетки шизонтов P. falciparum были экранированы световым микроскопом, оснащенным криостадией, а не ПЭМ, поскольку образец не передавался электронам. Для более тонких образцов сетки могут быть проверены с помощью TEM (атлас всей сетки при ~150-кратном увеличении) перед передачей образца в криоFIB-SEM, что может быть предварительным условием для доступа к национальному объекту. Особое внимание следует обратить на градиент толщины льда по всей сетке, а также внутри отдельных квадратов сетки. Хорошие квадраты сетки должны быть толщиной в одну ячейку или попадать в углеродную пленку в центре (рис. 2C). Это позволяет избежать фрезерования более толстого льда о стержни сетки по краю квадрата сетки и гарантирует, что ионный пучок пробьется выше и ниже слоя ячейки, образуя свободную ламель, а не клин. После того, как воспроизводимые условия блоттинга и погружения были оптимизированы, просеивание, как правило, больше не требуется перед FIB-фрезерованием.

Figure 2
Рисунок 2. Анализ распределения клеток на сетках погруженных замороженных шизонтов P. falciparum методом крио-световой микроскопии. (A) Пример слишком толстого льда на квадрате сетки с помощью крио-световой микроскопии, скрывающего клетки и углеродную пленку. Масштабная линейка, 10 мкм. (B) Пример размера отверстия (медная сетка 300 меш с 5/2 квадратной дырявой углеродной пленки) слишком велик для клеток, в результате чего получается очень тонкий слой биологического материала, окруженный пустыми областями без льда. Из таких сеток получаются очень короткие, неустойчивые ламели. Масштабная линейка, 10 мкм. (C) Пример хорошего распределения ячеек на медной сетке 200 меш с 2/4 дырявой углеродной пленкой. Эти шизонты лечили ингибитором Е64. Крупные клетки (красная коробка, диаметр ~ 5 мкм) с четко выраженной периферией представляют собой инфицированные эритроциты, которые все еще имеют неповрежденную мембрану вакуоли. Скопления мелких клеток (синяя коробка, ~ 1 мкм) представляют собой отдельные мерозоиты, содержащиеся в частично разрушенных эритроцитах хозяина. Каждый шизонт имеет черное пятно в центре, указывающее на положение кристаллов гемозоина (см. Рисунок 1 для получения дополнительной информации). Разницу в морфологии клеток не так легко увидеть, оказавшись внутри криоFIB-SEM; Таким образом, предварительный скрининг с помощью крио-световой микроскопии полезен до тех пор, пока не будут достигнуты воспроизводимые условия блоттинга. Покрытие ячеек по краям квадрата сетки рядом с полосами сетки (белыми пунктирными областями) слишком толстое для фрезерования. Более тонкая область в центре квадрата сетки (область с желтыми пунктирами) является идеальным местом для фрезерования, расширяя ламель в окружающий слой ячеек. Масштабная линейка, 6 мкм. (D) Изображение обода автосетки, специфичного для криоFIB, с двумя черными метками, одна из которых находится в разрезе (черная скобка), а другая напротив, в положении «12 часов» и «6 часов». Черная стрелка обозначает направление фрезерования. (E) Когда решетки загружаются в кассету автомата заряжания, метки должны быть равноудалены по обе стороны от загрузочного пинцета, в результате чего ламели должны лежать перпендикулярно оси наклона ступени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Маркировка автосетчатых дисков для томографии
Как правило, решетки обрезаются в автосетчатые диски перед фрезерованием, чтобы облегчить обращение и обеспечить жесткость, которая защищает ламели от повреждений на последующих этапах передачи. Диски с автоматической решеткой CryoFIB были разработаны с функцией вырезания, чтобы облегчить доступ к большей части поверхности решетки во время фрезерования. Важно ориентировать направление фрезерования перпендикулярно оси наклона ПЭМ таким образом, чтобы последовательное получение наклона происходило путем вращения ламели по всей ее длине. Это гарантирует, что высокие стенки траншеи, окружающие ламели, не заслоняют биологическую информацию при наклоне сетки.

Как правило, обод авторешетки помечен, чтобы помочь с визуальным выравниванием внутри шаттла cryoFIB-SEM и позже при загрузке TEM. Для этих образцов были нанесены две метки в положении «12 часов» и «6 часов» несмываемым маркером (см. Таблицу материалов), одна в центре вырезанной части зажимного кольца, а вторая прямо напротив (рис. 2D). При загрузке в ПЭМ (см. Таблицу материалов) обе метки должны быть видны по обе стороны от загружающего пинцета и выровнены под углом 90° к краю пинцета (рис. 2Е). Следует отметить, что производитель рекомендует выравнивать сетки с помощью выгравированных точек на ободах автосетки, так как определенные чернила в непосредственной близости от ионного пучка могут мешать фрезерованию.

Обрезанные сетки могут быть экранированы с помощью световой микроскопии с модифицированной кассетой для криостадии, что может быть полезно для проверки того, что процесс клипирования не разрушил углеродную пленку сетки. В зависимости от кассеты с образцом необрезанные сетки также могут быть фрезерованы, но при переносе с криоFIB-SEM на ПЭМ необходимо соблюдать большую осторожность, чтобы ограничить любой изгиб сетки, так как это приведет к разрушению ламелей. Необрезанные решетки могут быть загружены в ПЭМ криодержателями с боковым входом, но существует высокая вероятность того, что ламели сломаются, если обрезка выполняется после фрезерования.

Органоплатиновое покрытие
Органоплатиновое покрытие наносится на одну или обе решетки после того, как они были загружены в криоFIB-SEM. Игла системы впрыска газа (ГИС) вводится в камеру над образцом для направления потока пароорганических паров по поверхности решетки от нагретого источника в течение заданного времени. Пар конденсируется на холодных поверхностях и образует сплошной слой (толщиной ~2 мкм). Целостность этого слоя имеет решающее значение для фрезерования равномерно тонких ламелей. Оптимальные условия нанесения платинового органического покрытия обычно заранее определяются производителем прибора, но некоторая оптимизация все же может потребоваться. Большинство систем либо выравнивают иглу ГИС близко к направлению фрезерования, либо перпендикулярно направлению фрезерования, в зависимости от геометрии портов в камере и пределов вращения столика. Различные настройки можно опробовать, нанеся покрытие на сетку, фрезеровав небольшую область, наклонив сцену и измерив толщину слоя с помощью SEM.

Помимо настройки самого криоFIB-SEM, на нанесение платиноворганического покрытия может влиять ряд других факторов, включая 1) топографию образца, 2) поверхностное загрязнение сетки и 3) воспроизводимость потока пара от иглы ГИС. Поскольку поток ГИС является направленным, неровная топография может привести к тому, что области, находящиеся в тени клеток или поверхностных загрязнений, будут непокрыты или будут иметь более тонкую оболочку. Это может привести к разрушению платинорганического слоя во время полировки (рис. 3). При выборе участка для фрезерования необходимо помнить об окружающей топографии, например, о большом поверхностном загрязнении, скоплениях ячеек или разрушенном углероде, которые выступают с поверхности сетки на расстояние до пары квадратов сетки, могут блокировать поток пара, создавая тень более тонкой органоплатины, которая может ослабить ламель. Кроме того, следует избегать очень мелких частиц поверхностного загрязнения вблизи переднего края ламели, так как они могут выскочить во время фрезерования, оставляя ослабленный участок голого льда, что может привести к образованию отверстия в ламели во время полировки. Наконец, если фрезерование началось, и платиновоорганическое покрытие выглядит нестабильным, нанесите покрытие еще раз, дольше, или переключите его на резервную сетку.

Figure 3
Рисунок 3: Платиновоорганическое покрытие хорошего качества имеет решающее значение для получения тонких, равномерно фрезерованных ламелей. (A) Микрофотография переднего края ламели, на которую платинорганическое покрытие (OP, желтый) было нанесено слишком тонко, что привело к отверстию в передней кромке ламели, которая образовалась во время полировки (зеленый круг) и неравномерному фрезерованию по всей ширине ламели (полосы). Платинорганическая поверхность была срезана ионным пучком, что привело к распылению материала за передним краем покрытия (желтая пунктирная линия). (B) Платиновоорганическое покрытие (OP) было нанесено более густо, что привело к более равномерному истончению ламели. Целостность оболочки сохраняется по всей ширине ламели, а граница раздела между платиновоорганическим покрытием и остеклованным биологическим материалом четко очерчена (желто-пунктирная линия). Слой углерода проходит через заднюю часть ламели (оранжевый). Масштабные линейки, 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Оценка качества сетки в криоФИБ-СЭМ и процесс фрезерования
После того, как решетки были перенесены в криоFIB-SEM, целостность углеродной пленки и распределение ячеек на решетках могут быть проверены SEM (рис. 4A-C). Градиенты льда, положение решеток и расположение номеров сетки на сетках искателя можно проверить с помощью СЭМ с малым увеличением на 30 кВ (рис. 4B), но напряжение должно быть уменьшено до 5 кВ при обнаружении позиций фрезерования при большом увеличении и мониторинге процесса фрезерования для увеличения контраста с топографией поверхности.

Figure 4
Рисунок 4: Оценка качества сети и определение местоположения участков для фрезерования в криоFIB-SEM . (A) Обзор сетки с малым увеличением на 5 кВ через SEM. Вырезанная часть обода автосетки видна в нижней части изображения. Масштабная линейка, 0,5 мм. (B) Та же сетка на 30 кВ с помощью SEM, показывающая области более толстого льда (более темные квадраты сетки) и более тонкого льда (более светлые квадраты сетки). На врезке показан регион в рамке со стрелками, указывающими нумерацию на сетке искателя, которая видна на 30 кВ. Масштабная линейка, 0,5 мм. (C) Обзор двух квадратов сетки со средним увеличением, оценивающий распределение ячеек на углеродной пленке и расположение стержней сетки. Масштабная линейка, 50 мкм. (D) Расположение схем фрезерования для первого реза при большом увеличении (вид ионного пучка при 1,5 пА и 30 кВ). Красная область (толщиной 3 мкм) защищена, в то время как желтые области будут удалены ионным пучком. Белая пунктирная линия указывает на положение конечной ламели. Масштабная линейка, 10 мкм. (E) Изображение с большим увеличением при напряжении 3 кВ с помощью СЭМ полированной ламели толщиной 200 нм (ширина 10 мкм и длина 15 мкм). Потеря контраста внутри ламели при напряжении 3 кВ указывает на то, что была достигнута подходящая толщина. Ярко-белый передний край - это оставшийся слой органоплатины, который наносится на сетку через ГИС перед фрезерованием. Масштабная линейка, 5 мкм. (F) Та же ламель из (E), просматриваемая с помощью ионного пучка на 30 кВ и 1,5 пА. Тонкая белая линия, проходящая через черный квадрат (белая стрелка), является оставшимся органоплатиновым слоем на самом переднем крае ламели. Масштабная линейка, 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Область, подлежащая фрезерованию, выбирается путем размещения пары прямоугольных узоров по обе стороны от защищаемой области при большом увеличении (~ 7000x для шизонтов) в виде ионного пучка (рис. 4D). Крайне важно, чтобы частицы поверхностного загрязнения не прикреплялись к области измельчения, так как они могли затемнить нанесение защитного органоплатинового покрытия. Также важно, чтобы топография региона подходила для поддержки сторон ламели после достижения ее окончательной толщины.

Для малярийных шизонтов (размер клеток: ~ 5 мкм в диаметре и 2 мкм в толщину, в форме диска) можно фрезеровать ламели шириной от 7 до 20 мкм. Если слой клетки достаточно толстый, ламели обычно имеют длину ~ 10-15 мкм, захватывая несколько клеток выше и ниже слоя углерода (рис. 4E-F). Можно ожидать фрезерования 5-10 ламелей за 8 часов сеанса (6-7 часов фрезерования и 1-2 часа полировки). Это будет варьироваться в зависимости от толщины образца и ширины ламелей, при этом более толстые образцы и более широкие ламели требуют больше времени для фрезерования. Даже поврежденные сетки можно фрезеровать, так как для создания набора ламелей требуется всего несколько хороших квадратов сетки (рис. 5A). Кроме того, если образец тоньше, чем ожидалось, например, из-за чрезмерного блоттинга или изменения гематокрита культуры, более короткие ламели могут быть измельчены относительно быстро; однако их меньшая протяженность ограничит площадь, доступную для сбора данных в ТЕА (рис. 5В).

Figure 5
Рисунок 5: Определение того, когда была достигнута окончательная толщина ламели во время фрезерования. (A) Обзор сетки с малым увеличением с помощью SEM на 5 кВ, показывающий повреждение углерода во время отсечения. Неповрежденные участки содержали очень тонкий образец из-за чрезмерного блоттинга; тем не менее, все еще можно было фрезеровать шесть ламелей на этой сетке (область внутри контура с белым пунктиром) за целый день сеанса на криоFIBSEM. Масштабная линейка, 0,5 мм. (B) Короткая ламель (~ 10 мкм в ширину и 3 мкм в длину, не включая органоплатиновый слой), изготовленная из этой сетки (СЭМ при 3 кВ), которая по-прежнему обеспечивала две области для сбора наклонных рядов. Масштабная линейка, 25 мкм. (C) Серия СЭМ-изображений (3 кВ) ламели на заключительном этапе полировки, показывающая, как теряется контраст в ламели при ее истончении (движение слева направо). Темно-черная линия посередине ламели на всех изображениях представляет собой полоску углеродной пленки от сетки. Клетки перед этой областью были остеклованы над углеродной пленкой, а клетки позади этой области были остеклованы ниже углеродной пленки. Фрезерование было остановлено, когда органоплатиновое покрытие на левой стороне переднего края ламели было близко к потере структурной целостности. Эта точка остановки была до того, как вся ламель была доведена до равномерной толщины, поэтому в задней части ламели все еще есть более контрастное вещество. (D) Пример пути полировки на основе ламелей, фрезерованных на сетке, показанной в подпункте (А). Маршрут полировки должен начинаться с ламелей, расположенных ближе к источнику FIB, удаляясь от источника FIB, чтобы ограничить повторное осаждение измельченного материала на поверхность ламелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Во время полировки окончательная толщина ламели будет зависеть от структуры образца в фрезеруемой области, целостности платинового органического покрытия и доступного времени. В идеале образец следует разбавлять до тех пор, пока контраст не будет потерян по всей поверхности ламели с помощью SEM при 3 кВ, что позволяет предположить, что он равномерно прозрачен электронами и имеет толщину около 150-200 нм (рис. 5C). Однако до этого момента может потребоваться прекратить фрезерование, если в платиновом органическом слое образуется отверстие или ламель начинает изгибаться. В этом случае ламель все еще может быть достаточно тонкой спереди и оставаться полезной для томографии. И наоборот, можно проредить потерю контрастной ступени, если ламель выглядит стабильной, сделав ее еще тоньше, переместив фрезерные узоры ближе друг к другу (~ 100 нм или меньше). Это будет зависеть от того, какая толщина требуется для последующего рабочего процесса. Для планирования маршрута полировки требуется СЭМ-изображение с малым увеличением, начиная ближе к источнику ионного пучка и удаляясь (рис. 5D). Направление маршрута полировки важно для предотвращения повторного осаждения абляционного материала на уже готовые ламели.

Сбор и обработка данных наклонных рядов
После загрузки в ПЭМ монтаж полной сетки с малым увеличением (~ 150x) определит положение ламелей, которое можно соотнести с изображением SEM с малым увеличением, полученным в конце фрезерования. Для погруженных замороженных шизонтов большая часть сетки не прозрачна для электронов, поэтому положения ламелей выглядят как белые зазубрины на черном фоне (рис. 6А). Следует отметить угол наклона ламелей по отношению к оси наклона микроскопа, так как удаление более ~ 10 ° от перпендикуляра может затруднить получение последовательности наклона. Монтаж со средним увеличением (~ 1,500x) в месте расположения каждой ламели даст обзор биологического содержимого и проверит наличие повреждений при переносе, кристаллического льда или чрезмерного загрязнения поверхности (рис. 6B-D). Это также следует проверять при высоком наклоне, чтобы убедиться, что загрязнение поверхности не заслоняет область захвата или фокусировки. Выбор региона приобретения будет зависеть не только от биологических особенностей, но и от структурной целостности льда в окружающем регионе, например, избегая трещин, так как эти области будут дрейфовать, или участков с чрезмерной завесой, где ламель будет иметь переменную толщину. Перед получением наклонной серии к сетке применяется предварительный наклон на ±10°, чтобы плоскость ламелей (не сетка) была перпендикулярна оптической оси. Направление предварительного наклона можно определить по положению переднего края ламелей (в поисках оставшегося органоплатинового слоя) в монтаже со средним увеличением. Для используемого здесь ПЭМ (300 кВ Titan Krios), если передние края ламелей направлены вверх на карте, это требовало предварительного наклона +10°, а если они были направлены вниз, то для этого требовался предварительный наклон -10°. Каждая сетка может отличаться из-за ориентации, в которой они были подобраны пинцетом и вставлены в автомат заряжания (разрезная секция, обращенная влево или вправо, производит вращение на 180 °). Последнее соображение - размер пикселя. Обычно наклонные серии собираются около 2,5-7 Å / пиксель, принимая во внимание размер интересующего объекта, целевое разрешение результирующих томографических данных и площадь поверхности ламели, что может ограничивать размер области захвата. Для получения информации с высоким разрешением можно использовать меньший размер пикселя, и самый маленький размер, который мы успешно использовали на этих образцах, составляет 1,4 Å / пиксель (данные не показаны). Дрейф будет более заметен при меньшем размере пикселя и действительно подходит только для тонких (<100 нм) ламелей, где максимальное разрешение имеет важное значение в исследовании.

Figure 6
Рисунок 6: Выбор доступных областей интереса, из которых можно получить наклонную серию (А) Участок карты ТЕА с малым увеличением, показывающий область, содержащую ламели, в виде шести белых выемок на черном фоне (красные стрелки). Белые квадраты представляют собой сломанную углеродную пленку. (B) Карта со средним увеличением поврежденной и девитрифицированной ламели. По переднему краю ламели (FE) откололся органоплатиновый слой (1). В центре ламели имеется прозрачное пятно кристаллического льда (2). Ионный пучок не смог пробиться через задний край ламели (BE), потому что лед слишком толстый рядом с решетчатыми стержнями. Только небольшая часть ламели свободна от окружающего льда на БЭ (3), создавая клин. Толщина также привела к тому, что полки были вырезаны над ламелью (4), что, скорее всего, закроет обзор ячеек при высоком наклоне в ПЭМ. С) Монтаж целой ламели со средним увеличением, рассматриваемый в ТЕА. Типичными проблемами или областями, которых следует избегать при сборе наклонных рядов из ламелей, являются области: покрытые поверхностным загрязнением (SC), покрытые органоплатиновым слоем (OP, желтый), вблизи трещин (CR и черные стрелки), с занавеской из-за изменений плотности биологического материала (CU и область в синих скобках) и области, ослабленные разрывами органоплатинового слоя (зеленый круг). Единственными областями, доступными для захвата серии наклона, являются области внутри двух черных пунктирных прямоугольников (помеченных 1 и 2). Обзор должен быть проверен при высоком наклоне, чтобы убедиться, что загрязнение поверхности не заслоняет интересующую область или область фокусировки. (D) Монтаж гораздо более чистой ламели со средним увеличением, но на которой все еще есть трещины (CR), вызванные истончением органоплатинового слоя (зеленый круг) во время полировки. Здесь интересующая область выделена типом клеток, наблюдаемым внутри ламелей, которые в данном случае представляют собой отдельные мерозоиты, расположенные за слоем углерода (оранжевый) по направлению к задней части ламели (черная пунктирная рамка). Масштабные линейки, 3 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Получение данных крио-ET из ламелей, фрезерованных FIB. (A) Микрофотография области ламели, содержащей эритроцит, которая недавно была захвачена мерозоитом P. falciparum. В (B) то же изображение аннотировано, чтобы показать границу эритроцита (красный), ряд внутриклеточных пузырьков с двойными стенками (фиолетовый и синий для внутренней и внешней мембран соответственно) и мерозоит (зеленый), окруженный второй мембраной, полученной из клетки-хозяина (желтый). Черным прямоугольником показана область, в которой была получена наклонная серия. Масштабная линейка, 500 нм. (C) В среднем 20 центральных срезов, просматриваемых в плоскости XY из 8-кратной томограммы (2,4 Å / пиксель), полученной на апикальном конце мерозоита, и в (D) его аннотации, показывающей две мембраны, окружающие клетку (зеленую и желтую), и четыре мембраны, сложенные в вершине мерозоита (синий), которые связаны с электронно-плотным грибовидным элементом (фиолетовый). Красная стрелка указывает на соединение мембранных стопок в верхушке и грибовидную особенность (также показано в частях F, i). Черная стрелка указывает на событие слияния между плазматической мембраной мерозоита и одной из многослойных везикул внутри паразита (также показано в части F, ii). Мембрана эритроцитов хозяина показана (красным), а черной пунктирной линией показано положение поперечного сечения, рассматриваемого в плоскости XZ, показанной на (E). Элементы поперечного сечения (E) окрашены и помечены так же, как и в части (D), с цветными стрелками, указывающими на мембраны. Черная стрелка указывает на положение слоя напыления, нанесенного на ламель после фрезерования, и на толщину ламели. Для деталей (C-E), масштабная линейка, 500 нм. (F) Более подробное представление об особенностях, обозначенных красными и черными стрелками в части (C), показывающее определение в липидных бислоях мембранного стека на вершине мерозоита (i) и событие слияния между многослойной везикулой с плазматической мембраной мерозоита. Масштабная линейка, 75 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Основное внимание в работе уделяется анализу пути выхода мерозоита в P. falciparum Но учитывая, что популяция клеток, использованных в исследовании, никогда не может быть полностью однородной, часто наблюдались другие стадии развития клеток внутри ламелей. Пример, показанный здесь (Рисунок 7) содержит эритроциты, которые недавно подверглись вторжению P. falciparum паразит (мерозоит). Используемая ламель имела толщину 240 нм, а сетка была слегка распылена платиной в атмосфере аргона перед введением в ПЭМ, что привело к несколько меньшему контрасту, чем обычно можно было бы ожидать. Мембрану эритроцитов можно проследить во всей ее полноте, окружающей клетку. Внутри эритроцита находились три замкнутые мембраносвязанные структуры, две везикулы, каждая из которых окружена двойной мембраной, и особенность в форме лампочки (1,2 мкм х 0,9 мкм в самых широких частях), что согласуется с тем, что это мерозоит (Рисунок 7А-B). Содержимое двух везикул, по-видимому, было сходным в отличие от содержимого эритроцита, что позволяет предположить, что эти везикулы могут содержать гемоглобин. Наличие везикул в эритроците хозяина после инвазии наблюдалось ранее45. Считается, что они возникают из-за секреции липидов и других факторов вирулентности из секреторных органелл, называемых роптриями в мерозоите, которые выделяются в эритроциты хозяина во время инвазии. Мерозоит окружен двумя тесно связанными мембранами, самая внутренняя из которых, по-видимому, является нативной плазматической мембраной мерозоита, на которой нет видимого поверхностного покрытия, а самая внешняя должна происходить из мембраны эритроцитов хозяина, которая обволакивает мерозоит при его вторжении. Цитоплазма мерозоита содержит множество многослойных везикул и электронно-плотную грибовидную особенность, примыкающую к стопке мембран на вершине. Наклонная серия, полученная над этой областью (2,4 Å / пиксель), показывает, что она содержит стопку из четырех мембран, которые, по-видимому, связаны с грибовидным признаком (Рисунок 7C-E). Поразительно, что эта морфология сильно отличается от нормального расположения органелл и клеточных структур в апикальном конце зрелого мерозоита. Чтобы оценить это, сравнительная серия наклона (2,74 Å / пиксель) над апикальным концом на зрелом мерозоите была получена из шизонта, который был обработан E64 перед погружением, замораживанием и измельчением (Рисунок 8). Это показывает, что апикальный конец мерозоита содержит две заметные булавовидные секреторные органеллы, называемые ростриями, расположенные в наборе из трех полярных колец на апикальном конце клетки и окруженные рядом более мелких секреторных органелл, называемых микронемами. Самое внутреннее полярное кольцо присоединено к двойной мембранной структуре, которая лежит в основе плазматической мембраны мерозоита, называемой внутренним мембранным комплексом, который содержит моторные белки, которые управляют вторжением. Было показано, что во время инвазии содержимое секреторных органелл выбрасывается на поверхность мерозоита и в эритроцит хозяина, облегчая прикрепление мерозоитов к эритроцитам хозяина и инициируя двигательный комплекс, который управляет инвазией45. Приведенные здесь данные показывают, что после вторжения мерозоит не содержит наблюдаемых структур, напоминающих роптрии, микронемы или полярные кольца, что позволяет предположить, что морфология апикального конца мерозоита резко меняется. Слияние ротрий до вторжения было показано ранее с помощью ПЭМ срезов с фиксированной комнатной температурой46, что согласуется с получением грибовидной особенности, которую мы наблюдаем в нашем состоянии после вторжения мерозоита. Стопки мембран, связанных с этой особенностью, ранее не наблюдались, и, поскольку нет никаких указаний на присутствие IMC во вновь захваченном мерозоите, мы предполагаем, что мембранные стеки могут быть остатками оборудования IMC, оставшимися после завершения вторжения, но это еще предстоит подтвердить.

Figure 8
Рисунок 8: Апикальный конец зрелых мерозоитов методом крио-ЭТ ламели FIB-фрезерования и ПЭМ пластических срезов. (A) В среднем 20 центральных срезов из 8-кратной томограммы (2,74 Å / пиксель) из ламели толщиной 230 нм, показывающие типичную морфологию апикального конца зрелого мерозоита. Шизонты обрабатывали Е64 перед замораживанием, таким образом, PV-мембрана разорвалась, и мерозоиты содержались в эритроците хозяина. (B) показывает то же самое, что и в (A), но с аннотациями, указывающими мембрану эритроцитов хозяина (RCM, красный), плазматическую мембрану мерозоита (зеленый), внутренний мембранный комплекс (IMC, фиолетовый), полярные кольца (PR, черный), микронемы (M, желтый), роптры (R, серый) и ядерную оболочку (NE, синий). Соседний мерозоит, находящийся вне плоскости в этой области томограммы, обозначен зеленым треугольником. Масштабная линейка, 200 нм. (C) Клеточные особенности, наблюдаемые с помощью cryoET, согласуются с таковыми из ПЭМ шизонтов, сохранившихся в пластиковых срезах. Аналогичные клеточные особенности проявляются в зрелом мерозоите из шизонта, который был обработан соединением 2, останавливая выход до разрыва PV-мембраны. Масштабная линейка, 500 нм. (D) Аннотированная схема мерозоита, показывающая ячеистые особенности в частях (A-C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Толщина защищаемой области между прямоугольными фрезерными схемами (мкм) Номинальный ионный пучок тока (пА) при 30 кВ
3 300
1.5 100
0.75 50
0.3 30
0,2 - 0,06 (окончательная полировка) 30*

Таблица 1: Стратегия фрезерования для получения тонких ламелей. Ступенчатое фрезерование осуществляется за счет уменьшения тока ионного пучка, соответствующего толщине защищаемой области. Это ограничивает нагрев образца, предотвращая девитрификацию. * Полировка должна выполняться параллельно, чтобы равномерно нагреть ламели с обеих сторон, что снижает риск их изгиба или изгиба по мере достижения окончательной толщины. Другие шаги можно выполнять последовательно, фрезеруя узор над ламелью, а затем под ламелью, прежде чем переходить к следующему току луча. Обследование сетки для определения местоположения фрезерных позиций следует проводить при токе пучка 1,5 пА, чтобы свести к минимуму нагрев образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Discussion

В то время как криоFIB-фрезерование становится все более рутинным, подготовка оптимальных образцов для измельчения не имеет; поэтому большинство критических шагов в этом протоколе происходят до того, как образец достигнет криоFIB-SEM. Оптимизация образца с помощью нескольких раундов подготовки клеток, погружного замораживания и скрининга с помощью световой и электронной микроскопии необходимы для получения наилучшего образца перед попыткой измельчения. Наличие наилучшего образца не только увеличивает шансы на успех, но и оптимизирует использование оборудования. По этой причине большинство национальных предприятий требуют доказательств того, что была проведена достаточная оптимизация, прежде чем предоставлять время на их машины. Попав внутрь cryoFIB-SEM, максимизация эффективности платинорганического покрытия имеет решающее значение для получения равномерно тонких ламелей. Наконец, терпение и хорошее обращение с образцами являются обязательным навыком пользователя, который должен будет сидеть в течение нескольких дней, производя, а затем передавая сетки, содержащие тонкие ламели. Это может измениться с внедрением автоматизированных стратегий фрезерования47,48, но пока весь процесс фрезерования по-прежнему в основном выполняется вручную на большинстве предприятий.

В то время как работа была сосредоточена исключительно на P. falciparum schizonts, представленный здесь метод может быть легко модифицирован для оптимизации подготовки сетки и измельчения для других типов клеток. Важными факторами, которые следует учитывать, являются плотность ячеек, наносимых на сетку, тип сетки (медь токсична для некоторых ячеек), размер и расстояние между отверстиями в углеродной пленке, время блоттинга и метод блоттинга (односторонний/двухсторонний, ручной или автоматический). Кроме того, если клетки выращиваются на сетках (обычно золотых сетках с дырявой углеродной пленкой), слияние можно проверить с помощью световой микроскопии перед промоканием и замораживанием. Стратегия фрезерования зависит от того, как ячейки осаждаются на сетке. Для эритроцитов, инфицированных малярией, сетка по существу покрыта непрерывным слоем клеток, более толстым в одних областях и более тонким в других областях. Фрезерование выполняется в нескольких точках в одной области вдоль этого градиента, где толщина льда создает ламели, подходящие по размеру для томографии. Этот подход хорошо работает для небольших клеток, так как вы можете производить ламели, содержащие срез через несколько клеток. Для более крупных клеток или скоплений клеток может случиться так, что одна клетка или клеточный сгусток может продуцировать одну ламель.

Обработка сетки и перенос образцов остаются одной из основных проблем этого рабочего процесса. Ламели могут быть потеряны из-за поломок или трещин, занавесных артефактов, скрывающих биологию, чрезмерного загрязнения поверхности, а также проблем с ориентацией сетки в ПЭМ, что требует дополнительного шага обработки для изменения положения сетки. Степень потерь варьируется изо дня в день и от сети к сети, но со временем она улучшается благодаря практике и опыту обработки. В этом исследовании было обнаружено, что решетки могут быть тщательно переориентированы в автомате заряжания несколько раз, не разрушая ламели, и это иногда имеет преимущество смывания поверхностного льда. Еще одним основным ограничением этого рабочего процесса является время, необходимое для производства ламелей. Поскольку производство идет медленно, очень важно иметь правильно оптимизированный образец, чтобы сделать фрезерование максимально эффективным.

В последнее время был внедрен ряд приспособлений к FIB-фрезерованию биологических образцов стекловидного тела. Переломным моментом является внедрение криогенных охлаждаемых подъемных инструментов в камеру cryoFIB-SEM, которые позволяют измельчать более крупные блоки материала из замороженных образцов под высоким давлением. Блоки могут быть прикреплены к металлическому стержню или взяты в захват и перемещены во второе положение образца, содержащее специально модифицированную ЭМ-сетку. Затем блоки могут быть покрыты платиновой органикой и измельчены для получения ламелей. Способность фрезеровать ламели из замороженного материала под высоким давлением означает, что можно обрабатывать гораздо более крупные клетки и ткани, в частности, нацеливаясь на области с помощью корреляционной флуоресцентной микроскопии12. Другие недавние адаптации к методу FIB-фрезерования включают уменьшение артефактов занавески путем предварительного фрезерования образца16 клином, микрофлюидную криофиксацию49 и фотомикроструктурирование сеток электронной микроскопии для улучшения распределения клеток50. Кроме того, было продемонстрировано, что фрезерование зазоров микрорасширения по обе стороны ламели может облегчить сжатие окружающим образцом, когда он достигает своей окончательной тонкости51. Это может быть особенно полезно при фрезеровании непрерывных слоев ячеек, таких как образец в этом исследовании, где изгиб ламелей иногда наблюдается на заключительном этапе полировки.

Будущее электронной микроскопии, вероятно, будет заключаться в определении молекулярных структур in situ путем субтомограммного усреднения, а FIB-фрезерование является важным инструментом, который облегчит производство биологических образцов стекловидного тела для этих типов рабочих процессов. В то время как FIB-фрезерование все еще находится в зачаточном состоянии для биологических применений, разработка методов происходит быстрыми темпами благодаря напряженной работе исследователей, как академических, так и на национальных объектах, а также коммерческим инвестициям в разработку технологии криоFIB-SEM для поддержки исследований.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Это исследование полностью или частично финансировалось Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). В целях открытого доступа автор применил публичную лицензию CC BY об авторском праве к любой версии рукописи, принятой автором, вытекающей из этого представления.

Этот проект, для которого был разработан этот метод, финансировался за счет гранта Совета по медицинским исследованиям MR / P010288 / 1, присужденного Хелен Р. Сайбил, Роланду А. Флеку и Майклу Дж. Культуры P. falciparum были выращены в Институте Фрэнсиса Крика при поддержке членов группы Майкла Блэкмана. Авторы хотели бы поблагодарить доктора Сер Ин (Мишель) Тан за предоставление изображений шизонтов, обработанных соединением 2 и E64, в тонких мазках крови. Большинство ламелей были изготовлены при поддержке сотрудников eBIC, и мы благодарны за доступ к двухлучевому криоFIB-SEM Scios по исследовательскому предложению NT21004. Авторы также выражают признательность за поддержку Программы отраслевых стипендий Королевского общества (INF\R2\202061) в продолжении разработки технологии FIB-фрезерования в рамках CUI. Авторы также хотели бы поблагодарить Хелен Р. Сайбил за полезные дискуссии в связи с этим документом о методах и руководство проектом.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
c-clips Thermo Fisher Scientific 1036171
Clipping station Thermo Fisher Scientific n/a Direct quote from Thermo
Clipping station Sub-angstrom CSA-01
Compound 2 n/a n/a Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc
Cryo-FIB specific autogrid rims Thermo Fisher Scientific 1205101
E64 Sigma E3132
Emitech K100X glow discharge unit Quorum n/a
Gibco RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 12633012 Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements
Giemsa Stain VWR International 350864X
Glass slides Thermo Fisher Scientific 11562203
Grid boxes Sub-angstrom PB For clipped grids
Grid boxes Thermo Fisher Scientific n/a For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific
Grid boxes Agar Scientific AGG3727
Home-made manual plunge freezing rig n/a n/a With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.
Human blood n/a n/a UK National Blood and Transplant service
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system JEOL n/a FIB-SEM
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage Leica n/a sputter coater
Leica EM ACE900 Leica n/a e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.
Linkam cryo-stage for light microscope Linkam Model No. CMS196 Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.
Methanol Sigma 179957
Nikon Eclipse E200 light microscope Nikon n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.
Percoll VWR International 17-0891-01 Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids Quantifoil N1-C17nCuH2-01 100 pack
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids Quantifoil N1-C17nCu20-01 100 pack
Quorum PP3010 prep-chamber Quorum n/a sputter coater
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage. FEI n/a FIB-SEM
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen Viking Direct ND538522
TFS Titan Krios 300 kV TEM Thermo Fisher Scientific n/a TEM equipped with a K2 or K3 camera.
Whatmann grade 1 filter paper Sigma WHA1001150
Zeiss Axio Scope A1 light microscope Zeiss n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumeister, W. From proteomic inventory to architecture. FEBS Letters. 579 (4), 933-937 (2005).
  2. Rigort, A., Villa, E., Bäuerlein, F. J. B., Engel, B. D., Plitzko, J. M. Integrative approaches for cellular cryo-electron tomography: Correlative imaging and focused ion beam micromachining. Methods in Cell Biology. 111, 259-281 (2012).
  3. Oikonomou, C. M., Chang, Y. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14, 205-220 (2016).
  4. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  5. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
  6. Narayan, K., Subramaniam, S. Focused ion beams in biology. Nature Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).
  7. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  8. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  9. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: Focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (5), 771-777 (2013).
  10. Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180 (2), 318-326 (2015).
  11. de Winter, D. A. M., et al. In-situ integrity control of frozen-hydrated, vitreous lamellas prepared by the cryo-focused ion beam-scanning electron microscope. Journal of Structural Biology. 183 (1), 11-18 (2013).
  12. Schaffer, M., et al. A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue. Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).
  13. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  14. Albert, S., et al. Proteasomes tether to two distinct sites at the nuclear pore complex. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 114 (52), 13726-13731 (2017).
  15. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705 (2018).
  16. Schaffer, M., et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).
  17. Szwedziak, P., Wang, Q., Bharat, T. A. M., Tsim, M., Löwe, J. Architecture of the ring formed by the tubulin homologue FtsZ in bacterial cell division. eLife. 3, 04601 (2014).
  18. Carlson, L. A., et al. Cryo electron tomography of native HIV-1 budding sites. PLOS Pathogens. 6 (11), 1001173 (2010).
  19. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nature Communications. 11 (1), 5885 (2020).
  20. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  21. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  22. Murphy, G. E., et al. Correlative 3D imaging of whole mammalian cells with light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 176 (3), 268-278 (2012).
  23. Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2012).
  24. Spehner, D., et al. Cryo-FIB-SEM as a promising tool for localizing proteins in 3D. Journal of Structural Biology. 211 (1), 107528 (2020).
  25. Kamino, T., Yaguchi, T., Ohnishi, T., Ishitani, T., Osumi, M. Application of a FIB-STEM system for 3D observation of a resin-embedded yeast cell. Journal of Electron Microscopy. 53 (5), Tokyo. 563-566 (2004).
  26. Han, H., Zuber, B., Dubochet, J. Compression and crevasses in vitreous sections under different cutting conditions. Journal of Microscopy. 230, Pt 2 167-171 (2008).
  27. Matias, V. R. F., Al-amoudi, A., Dubochet, J., Beveridge, T. J. Cryo-transmission electron microscopy of frozen-hydrated sections of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (20), 6112-6118 (2003).
  28. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150 (1), 109-121 (2005).
  29. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. The EMBO Journal. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  30. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: A new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1-2), 43-51 (2006).
  31. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 172 (2), 180-190 (2010).
  32. Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. -J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryoelectron microscopy of vitrified specimens. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer. Berlin Heidelberg. 114-131 (1987).
  33. Hsieh, C., Schmelzer, T., Kishchenko, G., Wagenknecht, T., Marko, M. Practical workflow for cryo focused-ion-beam milling of tissues and cells for cryo-TEM tomography. Journal of Structural Biology. 185 (1), 32-41 (2014).
  34. Harapin, J., et al. Structural analysis of multicellular organisms with cryo-electron tomography. Nature Methods. 12 (7), 634-636 (2015).
  35. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 180 (3), 572-576 (2012).
  36. Duyvesteyn, H. M. E., et al. Machining protein microcrystals for structure determination by electron diffraction. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 115 (38), 9569-9573 (2018).
  37. Blackman, M. J. Purification of Plasmodium falciparum merozoites for analysis of the processing of merozoite surface protein-1. Microbes as Tools for Cell Biology. 45, Academic Press. London, UK. 213-220 (1995).
  38. Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2 - anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  41. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  42. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  43. Turoňová, B., Schur, F. K. M., Wan, W., Briggs, J. A. G. Efficient 3D-CTF correction for cryo-electron tomography using NovaCTF improves subtomogram averaging resolution to 3.4 Å. Journal of Structural Biology. 199 (3), 187-195 (2017).
  44. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3d correlative microscopy. Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).
  45. Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host & Microbe. 9 (1), 9-20 (2011).
  46. Hanssen, E., et al. Electron tomography of Plasmodium falciparum merozoites reveals core cellular events that underpin erythrocyte invasion. Cellular Microbiology. 15 (9), 1457-1472 (2013).
  47. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  48. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife. 9, 52286 (2020).
  49. Fuest, M., et al. In situ microfluidic cryofixation for cryo focused ion beam milling and cryo electron tomography. Scientific Reports. 9 (1), 19133 (2019).
  50. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  51. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208 (3), 107389 (2019).

Tags

Ретракция выпуск 174 FIB-фрезерование криоFIB-SEM ламели томография криоЭТ криоЭМ Plasmodium falciparum

Erratum

Formal Correction: Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography
Posted by JoVE Editors on 09/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. The Authors section was updated from:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

to:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
M. Alejandra Carbajal1
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

Получение ламелей из биологических образцов стекловидного тела с помощью двухлучевого сканирующего электронного микроскопа для криоэлектронной томографии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bisson, C., Hecksel, C. W.,… More

Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Carbajal, M. A., Fleck, R. A. Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (174), e62350, doi:10.3791/62350 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter