Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Forbereder lameller fra glassaktige biologiske prøver ved hjelp av et dual-beam skanning elektronmikroskop for kryo-elektrontomografi

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/62350
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3, 1, 1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London, 2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London, 3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

ERRATUM NOTICE

Summary

Ved hjelp av fokusert ionstrålefresing for å produsere glassaktige lameller på nettet fra stupefrosne biologiske prøver for kryo-elektrontomografi.

Abstract

Presentert her er en protokoll for fremstilling av kryo-lameller fra stupfrosne rister av Plasmodium falciparum-infiserte humane erytrocytter, som lett kan tilpasses for andre biologiske prøver. De grunnleggende prinsippene for fremstilling av prøver, fresing og visning av lameller er felles for alle instrumenter, og protokollen kan følges som en generell veiledning for kryo-lamellforberedelse på nettet for kryo-elektronmikroskopi (kryoEM) og kryo-elektrontomografi (cryoET). Elektronmikroskopigitter som støtter cellene, stupefryses ned i flytende nitrogenkjølt flytende etan ved hjelp av en manuell eller automatisert dykkfryser, og screenes deretter på et lysmikroskop utstyrt med et kryotrinn. Frosne rister overføres til et kryoskanningselektronmikroskop utstyrt med en fokusert ionstråle (cryoFIB-SEM). Rister blir rutinemessig sputter belagt før fresing, noe som hjelper spredning av ladningsoppbygging under fresing. Alternativt kan en e-stråle roterende coater brukes til å påføre et lag karbon-platina til rutenettene, hvis nøyaktige tykkelse kan kontrolleres mer nøyaktig. Inne i kryoFIB-SEM påføres et ekstra belegg av en organoplatinumforbindelse på overflaten av rutenettet via et gassinjeksjonssystem (GIS). Dette laget beskytter lamellens forkant når den er malt, hvis integritet er avgjørende for å oppnå jevnt tynne lameller. Regioner av interesse identifiseres via SEM og fresing utføres trinnvis, noe som reduserer strømmen av ionstrålen når lamellen når elektrongjennomsiktighet for å unngå overdreven varmeutvikling. Et rutenett med flere lameller overføres deretter til et transmisjonselektronmikroskop (TEM) under kryogene forhold for tilt-serieoppkjøp. En robust og forurensningsfri arbeidsflyt for lamellklargjøring er et viktig trinn for nedstrømsteknikker, inkludert cellulær kryoEM, kryoET og gjennomsnitt av sub-tomogram. Utvikling av disse teknikkene, spesielt for løft og fresing av høytrykksfrosne prøver, er høyt prioritert i feltet.

Introduction

Bare det cellulære innholdet i biologiske prøver <500 nm tykt kan avbildes effektivt ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM) ved kryogene temperaturer, og begrenser prøveområdet til virus, prokaryoter, enkle encellede organismer og tynnere områder av større eukaryote celler1. On-grid fokusert ionstråle (FIB)-fresing gjør at tykkere stupfrosne biologiske prøver kan tynnes til elektrontransparente lameller ved kryogene temperaturer (< -150 ° C). De resulterende lamellene overføres deretter til en TEM for visualisering og tomografisk datainnsamling, noe som muliggjør høyoppløselige 3D-rekonstruksjoner av de cellulære og molekylære egenskapene inne i celler (for vurderinger, se Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163, og Wagner et al., 20204).

FIB-fresing dukket opp fra materialvitenskap, hvor prøver rutinemessig tynnes for å forberede dem for nedstrømsanalyse5. Det utføres i et skanningelektronmikroskop (SEM), som har to optiske kolonner: konvensjonell skanningelektronmikroskopoptikk og en andre kolonne som inneholder optikk som kan generere og finstyre en fokusert ionstråle (FIB) - kalt en FIB-SEM. Dette gjør at en bestemt region av prøven kan ableres av ioner generert av en galliumkilde, fjerne overflødig materiale og etterlate en lamell6. Freseprosessen styres av SEM-avbildning av prøvens topografi, som brukes til å lokalisere regioner av interesse og overvåke fresefremgang. For biologiske applikasjoner er det grunnleggende oppsettet stort sett det samme, men fresing utføres ved kryogene temperaturer. Dette har krevd at standard FIB-SEM-er må tilpasses for å ha kryokjølte trinn som opprettholder konstante temperaturer og lave overflateforurensningsrater, samt luftsluser for å lette prøveoverføring uten avvik eller forurensning. Prøveskyttelbussene har også blitt modifisert for å gjøre det mulig å montere en rekke forskjellige bærere inne i kryoFIB-SEM, inkludert TEM-gitter, planchetter og kapillærer. Flere sentrale forskergrupper har vært sentrale i utviklingen av disse metodene og den fortsatte teknologiske utviklingen på dette området 7,8,9,10,11,12. Kommersielle løsninger er nå mer allment tilgjengelige for biologisk FIB-fresing ved kryogen temperatur, og on-grid fresing av lameller blir mer rutinemessig, gitt en optimalisert prøve.

En rekke romtemperatur- og kryoEM-teknikker kan brukes til å visualisere cellulær informasjon på tvers av alle livets skalaer, fra hele flercellede organismer med beskjeden oppløsning til å forstå sammenhengen mellom komplekse prosesser på mobilnivå og i enda større detalj, til bestemmelse av in situ Molekylære strukturer13,14,15,16,17,18,19. Klassiske romtemperaturteknikker inkluderer seksjonering av faste og fargede, harpikspregede celler og vev ved ultramikrotomi for analyse av cellulær morfologi ved TEM (for gjennomgang se Studer et al., 200820). Alternative teknikker har blitt utviklet ved å utnytte sekundær elektronspredning av SEM for å avbilde overflaten av blokker av bevarte celler, før man gradvis fjerner materiale enten med en kniv (seriell blokk ansiktsbilde) eller en fokusert ionstråle21,22,23. Denne teknikken har også blitt implementert ved kryogene temperaturer (referert til som kryovolumavbildning) med en cryoFIB-SEM på glassaktige, ufargede blokker av celler eller vev24. Alternativt kan tykkere lameller (~15 μm tykke) freses og studeres ved STEM-avbildning25. Ved hjelp av disse teknikkene kan hele blokker som inneholder mange celler avbildes for å samle befolkningsinformasjon, eller et helt organ / organisme kan avbildes og rekonstrueres i 3D. For å få tilgang til høyoppløselig molekylær informasjon fra celler, må prøvene imidlertid bevares i en nær-innfødt, frossen-hydrert tilstand og må derfor fremstilles under kryogene forhold. Kryo-elektronmikroskopi av glasslegemesnitt (CEMOVIS) er en teknikk der høytrykksfrosne blokker av biologisk materiale seksjoneres under kryogene forhold med et ultramikrotom. Dette gir bånd av kryoseksjoner (40-100 nm tykke)26, som er koblet til et EM-rutenett og avbildet i TEM. Imidlertid forårsaker den fysiske samspillet mellom kniven og glassprøven sprekker og kompresjonsartefakter som kan forvride cellulær struktur alvorlig27,28,29,30. Tykkere seksjoner er mer utsatt for disse artefaktene, noe som gjør det upraktisk å bruke seksjoner tykkere enn ~ 70 nm26. Denne begrensningen begrenser i stor grad 3D-visningen av den biologiske strukturen i tomogrammet. FIB-fresing ved kryogene temperaturer opplever ikke disse problemene, men har sine egne artefakter forårsaket av differensielle fresehastigheter over deler av prøven, noe som fører til variable tykkelser i en lamell - kalt gardinering. Dette problemet reduseres ved påføring av et organoplatinumbelegg påført via et gassinjeksjonssystem (GIS), som beskytter lamellens forkant under fresing31. Den øvre grensen for prøvetykkelse for FIB-fresing på nettet er definert av evnen til å stupe fryse prøven mens du holder den glassaktig32, men med introduksjonen av kryoutløftingsteknikker og tilpassede prøvebærere for biologiske prøver, kan FIB-fresing også brukes til å behandle høytrykksfrosne prøver31,33,34,35. I tillegg kan stupefrosne prøver ikke være for tynne, da det må være nok biologisk materiale til å generere en lamell av rimelig størrelse som vil gi nok overflateareal til å samle tilt-serier ved ønsket forstørrelse. Dette problemet kan lindres ved å frese klumper av mindre celler, for eksempel bakterier eller gjær. Endelig lamelltykkelse (~ 100-300 nm) dikteres vanligvis av prøveintegriteten og fresestrategien. Tynnere lameller er bedre for høyoppløselig strukturelt arbeid, for eksempel sub-tomogram gjennomsnitt, men tykkere lameller inneholder mye større cellulære volumer enn det som kan oppnås ved CEMOVIS, noe som gir mer cellulær kontekst i en nær til naturlig bevart prøve. FIB-fresing kan også brukes til å tynne stupfrosne proteinkrystaller for elektrondiffraksjonsstudier36.

FIB-fresing av glassceller er verdt tiden og kreftene å utføre hvis det vitenskapelige spørsmålet krever høyoppløselige molekylære detaljer av nærfødte prøver in situ. Med tilgang til flere fasiliteter for rutinemessig produksjon av lameller, er hastighetsbegrensende trinn ofte optimalisering av prøven før fresing, hvor det må tas tid for å sikre at prøven er glassaktig og en passende tykkelse for å produsere robuste og jevnt tynne lameller. Beskrevet her er prøveoptimaliseringen for FIB-fresing av stupefrosne humane røde blodlegemer infisert med Plasmodium falciparum-parasitter , det forårsakende middelet til malaria, men denne tilnærmingen kan tilpasses for en gitt prøve.

Protocol

Humant blod ble hentet fra anonymiserte givere gjennom UK National Blood and Transplant-tjenesten og brukes innen 2 uker etter mottak. Ingen etisk godkjenning er nødvendig for bruk.

1. Forberedelse og dypfrysing av Plasmodium falciparum-infiserte røde blodlegemer

  1. Isoler modne schizonter ved sentrifugering (1 580 x g) over et 70 % (v/v) isotont tetthetsgradientmedium (for standardprosedyrer for dyrkning av aseksuelle blodstadier av 3D7 Plasmodium falciparum i humane erytrocytter, se Blackman M.J., 1995:37).
  2. Fest de lufttørkede tynne blodfilmene på et glassglass med 100 % metanol for å kontrollere schizontenes morfologiske homogenitet før farging med 10 % Giemsa-flekk i 6,7 mM fosfatbuffer, pH 7,1.
    MERK: For å berike preparatet for schizonter som stopper opp på bestemte utgangspunkter, kan schizonter synkroniseres ytterligere med forbindelse 2- og E64-hemmere (se representative resultater og figur 1 for en forklaring på effekten av disse hemmerne).
    FORSIKTIG: Plasmodium falciparum er et patogen hos mennesker og må kun håndteres i et egnet inneslutningsanlegg i henhold til lokale retningslinjer for helse og sikkerhet.
  3. Sentrifuge schizonter forsiktig (240 x g) for å pelletere dem og resuspendere i 2x volum av cellepelleten til RPMI-medier, noe som resulterer i en 50 % hematokritsuspensjon.
  4. På en manuell stupfryserigg, bruk 2,5 μL schizonter på karbonsiden av en glødutladet (Bruk innstillinger for glødeutladningsenhet på 60 s, 30 mA i luft, behandle bare karbonsiden av rutenettet) 200 mesh kobbergitter med en 2/4 holey karbonfilm og blett for ~ 20 s fra baksiden av rutenettet ved hjelp av klasse 1 filterpapir med revet kant. Kast deg ut i flytende nitrogenkjølt flytende etan og overfør ristene til lagring (se materialfortegnelse for utstyr som ble brukt i denne studien).
    MERK: Eksperimentet kan settes på pause her, og rutenett kan lagres under flytende nitrogen på ubestemt tid.
    FORSIKTIG: Flytende nitrogen er et kvelningsmiddel og forårsaker frostskader; Håndteres forsiktig i et egnet miljø med oksygenovervåking.
    FORSIKTIG: Flytende etan forårsaker alvorlige forbrenninger og er brannfarlig; Bruk i en avtrekkshette vekk fra tennkilder.
    MERK: Stupefrosne schizonter er ikke lenger levedyktige. Dette ble bestemt ved å inkubere humant blod med flere gullgitter av lufttinte stupfrosne schizonter og observere ingen parasittvekst etter flere dager, sammenlignet med ikke-frosne kontroller. Frosne rister av schizonter er derfor trygge å håndtere utenfor inneslutningsanlegg ved bruk av normale sikkerhets- og dekontamineringsprosedyrer (hansker, overflate/verktøysterilisering med >70% etanol og deponering av rister i >70% etanol).
  5. Skjerm rutenett ved hjelp av et kryo-stadium for et lysmikroskop, med spesiell oppmerksomhet på gradienten av is over rutenettet. I de tynnere områdene av is, sjekk individuelle rutenett for celledekning.
    MERK: De beste rutene skal være én celletykk i midten av rutenettet (figur 2). Dette sikrer at en lamell kan freses over midten av torget uten å treffe den tykkere isen i kantene mot gitterstengene. Forsøket kan settes på pause her, og nett kan lagres under flytende nitrogen på ubestemt tid. Hvis celler bærer en fluorescerende markør, kan rutenett også screenes av cryoCLEM for å lokalisere X/Y-posisjoner av interesse, som kan korreleres med rutenettplasseringer i kryoFIB-SEM for direkte fresing.

2. On-grid FIB-fresing av stupefrosne celler

  1. Merk forsiden av kryoFIB-spesifikke autogrid-felger med en svart, uutslettelig markørpenn for å indikere midten av den utskårne delen og motsatt side av felgen (figur 3). Sett opp klippestasjonen og klipp rutenett i de merkede ringene med karbonsiden ned.
  2. Legg rister inn i kryoFIB-SEM shuttle (vanligvis 2 rister, avhengig av skyttelbussen) karbonside opp og påfør et platina sputter coat i en argonatmosfære (5 x 10-2 mbar) (5 mA i 60 s - tykkelsen er variabel) eller et karbon / platina e-stråle roterende lag (~ 4 nm tykkelse) til overflaten av cellene.
    MERK: Begge typer belegg hjelper ladningsspredning under SEM-avbildning. Fordelen med e-beam roterende belegg er at den nøyaktige tykkelsen på belegget kan spesifiseres.
  3. Legg romfergen inn i kryoFIB-SEM og vurder cellefordelingen på hvert rutenett med SEM ved 5 kV (13 pA eller 25 pA). Ta en oversikt over lav forstørrelse (~ 100x) for å se på isgradienter over rutenettet. Ta deretter bilder med høyere forstørrelse (~ 5000x) for å se på individuelle rutenettfirkanter og identifisere områdene i rutenettet med synlige cellulære egenskaper og lav overflateforurensning til fres.
  4. Påfør et >2 μm organoplatinumbelegg på overflaten av hvert rutenett ved hjelp av gassinjeksjonssystemet (GIS). For å gjøre dette, stikk GIS-nålen inn i kammeret over rutenettet og varm organoplatinumkilden til en innstilt temperatur i en angitt tid (for eksempel ~ 27 ° C i 3-10 s) for å produsere en strøm av damp.
    MERK: Påføringsvinkelen, temperaturen og tidspunktet for organoplatinumbelegget via GIS-nålen bør optimaliseres for å maksimere et jevnt belegg. Dette vil avhenge av den spesifikke kryoFIB-SEM som brukes (se representative resultater for ytterligere forklaring).
  5. Vipp prøven slik at rutenettets plan er ~ 10 ° fra forekomstvinkelen til ionstrålen og flytt midten av en passende rutenettfirkant som skal ses i både SEM- og FIB-bildene.
  6. Undersøk rutenettet ved hjelp av ionstrålen ved lav strøm (nominelt 1,5 pA, 30 kV) og gå til høy nok forstørrelse (~ 7000x) for å visualisere cellene i sentrum av et rutenett firkant. Ta prøven i fokus ved første fresestrøm (300 pA) og korriger for astigmatisme. Juster lysstyrken og kontrasten, og merk deretter ut to rektangulære mønstre til frese, en over og en under en 3 μm tykk beskyttet region, hvis senter er ønsket plassering av den endelige lamellen.
    MERK: Den valgte bredden på mønstrene vil avhenge av topografien til det omkringliggende cellelaget og cellestørrelsen. 7-20 μm er en passende bredde for schizonter, men bredere lameller tar lengre tid å frese. Den valgte høyden på mønstrene for det første fresetrinnet avhenger av prøvetykkelsen, som starter rundt 6 μm; Dette må kanskje justeres under fresing. Fresing utføres retningsbestemt fra utvendige topp- og bunnkanter av mønstrene mot lamellens ansikt. Dette kan gjøres parallelt, hvor begge mønstrene freses samtidig eller sekvensielt, først fjerner materiale fra over lamellen og deretter fra undersiden.
  7. Begynn å frese ved første strøm; overvåke fremdriften i sanntid i ionstrålevisningen og periodisk med SEM (5 kV, 13 eller 25 pA). Kontroller at ionstrålen har brutt gjennom prøven over og under det beskyttede området. Hvis ikke, øk høyden på de rektangulære mønstrene for å fjerne mer materiale. Stopp når overflaten over og under lamellen er helt glatt i ionstrålevisningen.
    MERK: Ionstrålen har brutt gjennom prøven over og under det beskyttede området når innsiden av de rektangulære mønstrene ikke inneholder noen funksjoner i fokalplanet. Noen funksjoner, for eksempel rutenettstolper, kan være synlige ute av fokus i bakgrunnen.
  8. Bytt til neste fresestrøm (100 pA); Fokuser og juster lysstyrken/kontrasten. Reduser avstanden mellom de to rektangulære mønstrene til 1,5 μm og reduser mønsterhøyden til bare å dekke det ikke-malte materialet. Begynn å frese ved den nye strømmen til overflaten over og under lamellen er helt glatt.
  9. Gjenta denne prosessen trinnvis til en tykkelse på 0,3 μm er nådd, og reduser ionstrålestrømmen hver gang i henhold til freseskjemaet i tabell 1.
  10. Fres flere lameller (mengden er avhengig av prøvens tykkelse og tilgjengelig tid) på ett eller begge rutene til en tykkelse på 0,3 μm, registrer X / Y / Z-posisjonen til hver lamell og reserver ~ 1-2 timer på slutten av økten for å polere lamellene til deres endelige tykkelse (60-200 nm).
  11. Ta en SEM-oversikt med lav forstørrelse over hele rutenettet og planlegg en poleringsrute fra lameller foran i rutenettet (nærmere ionstrålekilden) til lameller på baksiden av rutenettet (lengst unna ionstrålekilden) (figur 5).
    MERK: Dette reduserer redeponering av ablert materiale tilbake på overflaten av polerte lameller.
  12. Reduser avstanden mellom de to rektangulære mønstrene til 100-200 nm og begynn det siste poleringstrinnet ved en ionstrålestrøm på 30 pA. Overvåk fremdriften ved SEM ved 2-3 kV (13 pA, bor = 300 n, 3072 x 2048, ~ 2 s for fullformat) og stopp poleringen når kontrasten går tapt i lamellen ved SEM eller når organoplatinumbelegget til lamellen selv begynner å miste integritet.
  13. Før du fjerner rutenettene, må du skaffe deg et SEM-bilde med lav forstørrelse av hele rutenettet og lagre bilder av hver lamell. Bruk dem til å kryssjekke rutenettet senere i TEM. Pause eksperimentet her og lagre ristene med lameller under flytende nitrogen - håndter med forsiktighet.
    MERK: Rister kan lett sputter belagt ved fjerning fra cryoFIB-SEM, noe som kan bidra til å begrense drift og lading i TEM ved høy forstørrelse, men dette bør gjøres forsiktig da for mye sputterbelegg kan skjule det biologiske innholdet inne i lamellene. Det er mulig å skjerme lameller for fluorescens på dette stadiet; Imidlertid vil det å få nok signal avhenge av overflod av det merkede proteinet i tykkelsen av lamellen. Det må utvises stor forsiktighet ved håndtering av ristene for å begrense skader på lamellene og forhindre overflateforurensning.

3. Tilt-serieoppkjøp og generell oversikt over databehandling

  1. Last rutenettene inn i TEM, og juster freseretningen vinkelrett på hellsaksen på trinnet.
    MERK: Justering av rutenettene gjøres med øyet ved hjelp av merkene på autogridfelgen. En ~ 10 ° feilmargin er akseptabelt, ellers kan veggene i grøften på hver side av lamellen skjule lamellen når rutenettet er vippet.
  2. Skaff deg et kart med lav forstørrelse (~ 150x) av hele rutenettet og finn lamellene; Deretter får du et middels forstørrelseskart (~ 1,500x, avhengig av lamellstørrelse) av hver lamell og finner interesseområdene.
  3. Vipp rutenettet ±10° for å gjøre lamellplanet (ikke rutenettet) vinkelrett på den optiske aksen
    MERK: Retningen på fortilten kan bestemmes av posisjonen til lamellens forkant (ser etter venstre over organoplatinumbelegg) i kartene med lav og middels forstørrelse. For TEM-en som brukes her, krever rutenett en +10° forvipping hvis lamellens forkant peker opp i kartene og krever en -10° forvipping hvis de peker nedover. Hvert rutenett kan være forskjellig på grunn av hvordan de ble plukket opp og satt inn i autoloaderen.
  4. Hent dosesymmetrisk vippeserie38 (for eksempel -54° til +54° med en økning på 3-5°) ved en pikselstørrelse som tillater både synsfeltet og oppløsningen som kreves for interesseområdet. Bruk et område med defokusverdier mellom -2 og -5 μm. Samle filmer med 3-10 bilder i hvert trinn, og juster disse parametrene avhengig av pikselstørrelsen for å akkumulere en total dose på ~ 150 e-/Å2 (for en 300 kV TEM).
    MERK: Sprekker i lamellen bør unngås da disse områdene kan drive. Overflatekontaminering bør også unngås, da det kan skjule interesseområdet eller fokusområdet ved høy tilt.
  5. Bevegelse korrigere filmene ved hjelp av et program som MotionCor239. Bruk et dosevektingsfilter på de korrigerte bildene (akkumulert e-/bilde)40 og estimere ufokuseringen for hvert bilde ved hjelp av et program som CTFFIND441.
  6. Bruk fiducial-less alignment (patch tracking) i et program som etomo (IMOD)42 for å beregne justeringen og vinkelforholdet mellom bildene i vippeserier.
  7. Skriv inn justerings- og rotasjonsinformasjonen, sammen med defokusverdiene i et program som kan bruke tredimensjonal CTF-korreksjon, for eksempel NovaCTF43. Beregn et korrigert tomogram for å få utdatatomogrammer med binningsfaktorer som er relevante for nedstrømsanalyse.
  8. Analyser rekonstruksjonene og forbered deg på eventuell nedstrømsbehandling, for eksempel filtrering, segmentering eller gjennomsnitt av sub-tomogram.

Representative Results

Forbereder P. falciparum schizonts for stup frysing
Forbindelse 2- og E64-hemmere brukes til å stoppe schizonter på forskjellige stadier av utgang, og genererer en beriket populasjon av schizonter for senere studier. Dette er viktig fordi uten en komplementær korrelativ teknikk er fresing av spesifikke subcellulære mål eller celletyper utfordrende, da prosessen i hovedsak er blind. Forbindelse 2 er en proteinkinasehemmer som stopper utgang før vakuolruptur. Schizonter kan synkroniseres på forbindelse 2 i 4 timer, deretter vaskes med sammensatte 2-frie medier for å fjerne inhibitoren, hvorpå schizonter vil modnes og utløses etter ca. 30 min. Alternativt kan forbindelse 2 synkroniserte schizonter vaskes inn i E64, en irreversibel bredspektret cysteinproteasehemmer, og inkuberes i ca. 1 time for å stoppe utgang etter punktet for vakuolbrudd, men før vertscellebrudd. Morfologien og homogeniteten til behandlede schizonter bør kontrolleres med Giemsa-fargede blodutstryk før dypfrysing (figur 1). Schizonter kan stupefryses i en av disse tilstandene ved hjelp av metoden beskrevet i denne publikasjonen.

Figure 1
Figur 1 Morfologien til forbindelse 2 og E64-stoppet P. falciparum schizonts ved Giemsa-fargede blodutstryk. (A) I nærvær av forbindelse 2 er den parasitoforøse vakuolen (PV) tett pakket med merozoitter (lilla sirkler) med en enkelt klynge hemozoinkrystaller (mørk brun sirkel). Grensen mellom PV og det omkringliggende hemoglobinet i vertsens røde blodlegemer (hRBC) (grått bånd) er veldefinert, så vel som hRBC-membranen. (B) I nærvær av E64 brytes PV-membranen og merozoittene spres ut i hRBC. Hver schizont inneholder fortsatt en enkelt klynge av hemozoinkrystaller. Vertscellemembranen er lekk og delvis kollapset, derfor er ingen hemoglobin synlig i celleperiferien, og grensen til hRBC-membranen er ikke lett synlig. Skala bar, 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Optimalisering av stupefrysing
En rekke rister med forskjellige hullstørrelser ble testet under optimalisering av blottingsforhold for P. falciparum-infiserte røde blodlegemer, inkludert 2/2, 3/3, 3.5/1 og 5/2 (kvadratisk) holey karbon på gull og kobber 200 mesh rister. 200 mesh kobber finder rister med 2/4 holey karbonfilm gir et passende tykt lag av celler for å male lange glassaktige lameller. Større eller mindre hull resulterte vanligvis i cellelag som var henholdsvis for tynne eller tykke (figur 2A-C). Med 2/4 holey karbon trekkes schizonter gjennom de 2 μm hullene ved å blotte rutenettet fra baksiden (ikke-karbonsiden), noe som resulterer i celler som stikker ut over og under karbonfilmen. Den 4 μm strekningen av karbon mellom hullene resulterer i en stripe av karbon som går gjennom midten av de fleste av de resulterende lamellene, og gir styrke. Finder-rutenett er best egnet for korrelativ- og screeningformål44, men det må utvises forsiktighet for å sikre at tallene / bokstavene i maskedesignet ikke er for store, da dette vil blokkere områder for fresing.

Blottingstiden på et manuelt stempel er ca. 20 s, men det nøyaktige punktet for å stoppe blotting ble bedømt av øyet når væskedråpen som ble trukket fra rutenettet sluttet å spre seg ut på filterpapiret. En revet kant var nødvendig for å bryte overflatespenningen til dråpen for å starte blottingsprosessen. En automatisert stupefryser ble ikke brukt i denne studien, men et rimelig utgangspunkt for denne prøven ville være å bruke samme volum av celler og gittertype som brukes til et manuelt stempel, og sørge for å fjerne ristene bakfra under forhold med høy luftfuktighet (~ 70%) og omgivelsestemperatur (~ 25 ° C). Blottingstidene og -forholdene må optimaliseres for det bestemte automatiserte systemet som brukes.

Stupefrosne gitter av P. falciparum-schizonter ble screenet av et lysmikroskop utstyrt med et kryostadium i stedet for av TEM, fordi prøven ikke var overførbar til elektroner. For tynnere prøver kan rutenett screenes av TEM (whole grid atlas ved ~ 150x forstørrelse) før prøveoverføring til cryoFIB-SEM, som kan være en forutsetning for å få tilgang til et nasjonalt anlegg. Spesiell oppmerksomhet bør rettes mot gradienten av istykkelse over rutenettet og også innenfor individuelle rutenettruter. Gode rutenett bør være en celle tykk eller treffe karbonfilmen i midten (figur 2C). Dette unngår å frese i den tykkere isen mot gitterstengene rundt kanten av rutenettet og vil sikre at ionstrålen bryter gjennom over og under cellelaget, og produserer en fri lamell i stedet for en kile. Når reproduserbar blotting og stupefrysing er optimalisert, er screening vanligvis ikke lenger nødvendig før FIB-fresing.

Figure 2
Figur 2. Analysere cellefordelingen på rutenett av dypfrosne P. falciparum-schizonter ved kryolysmikroskopi. (A) Et eksempel på at is blir for tykk over et rutenett ved kryolysmikroskopi, som skjuler cellene og karbonfilmen. Skala bar, 10 μm. (B) Et eksempel på at hullstørrelsen (300 mesh kobbergitter med 5/2 kvadrat holey karbonfilm) er for stor for cellene, noe som resulterer i et veldig tynt lag biologisk materiale omgitt av tomme områder uten is. Rister som dette produserer svært korte, ustabile lameller. Skala bar, 10 μm. (C) Et eksempel på god cellefordeling på et 200-mesh kobbergitter med 2/4 holey karbonfilm. Disse schizontene ble behandlet med E64-hemmer. De store cellene (rød boks, ~ 5 μm diameter) med en veldefinert periferi er infiserte røde blodlegemer som fortsatt har en intakt vakuolmembran. Klyngene av små celler (blå boks, ~ 1 μm) er de individuelle merozoittene inneholdt i en delvis kollapset verts røde blodlegemer. Hver schizont har en svart flekk i midten, som indikerer posisjonen til hemozoinkrystallene (se figur 1 for ytterligere detaljer). Forskjellen i cellemorfologi er ikke like lett å se når man først er inne i kryoFIB-SEM; Derfor er forhåndsscreening ved kryolysmikroskopi fordelaktig inntil reproduserbare blottingsbetingelser er nådd. Celledekningen rundt kantene på rutenettfirkanten ved siden av rutenettstolpene (hvitstiplede områder) er for tykk til fresing. Den tynnere regionen i midten av rutenettet (gulstiplet område) er et ideelt sted å frese fra, og strekker lamellen inn i det omkringliggende lag av celler. Skala bar, 6 μm. (D) Bilde av en kryoFIB-spesifikk autogrid-kant med to svarte merker, ett innenfor den avskårne delen (svart brakett) og det andre motsatt, klokken 12 og 6. Den svarte pilen representerer freseretningen. (E) Når ristene lastes inn i autoloaderkassetten, må merkene være like langt på hver side av lastepinsetten, noe som resulterer i at lamellene ligger vinkelrett på vippeaksen på trinnet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Merking av kryoFIB-spesifikke autogridfelger for tomografi
Vanligvis klippes rister inn i autogrid-felger før fresing for å lette håndteringen og gi stivhet, noe som beskytter lamellene mot skade under de påfølgende overføringstrinnene. CryoFIB-spesifikke autogrid-felger er konstruert med en banebrytende funksjon for å gi tilgang til mer av rutenettflaten under fresing. Det er viktig å orientere freseretningen vinkelrett på tilt-aksen til TEM, slik at tilt-serie oppkjøp fortsetter ved å rotere lamellen langs lengden. Dette sikrer at de høye veggene i grøften som omgir lamellen ikke skjuler den biologiske informasjonen når rutenettet er vippet.

Vanligvis er autogrid-felgen merket for å hjelpe med visuell justering i cryoFIB-SEM-skyttelbussen og senere når du laster inn TEM. For disse prøvene ble to merker påført klokken 12 og klokken 6 med en uutslettelig markør (se materialfortegnelse), en innenfor midten av den avskårne delen av klippringen og den andre rett motsatt (figur 2D). Når du laster inn i TEM (se materialfortegnelse), skal begge merkene være synlige på hver side av lastepinsetten og justert 90° til kanten av pinsetten (figur 2E). Det skal bemerkes at produsenten anbefaler å justere rutenett ved hjelp av de graverte prikkene på autogrid-felgene, da visse blekk i nærheten av ionstrålen kan forstyrre fresing.

Klippede rister kan screenes ved lysmikroskopi med en modifisert kassett for et kryotrinn, noe som kan være gunstig for å kontrollere at klippeprosessen ikke har ødelagt karbonfilmen i rutenettet. Avhengig av prøvekassetten kan uklippede rister også freses, men det må utvises stor forsiktighet under overføring fra kryoFIB-SEM til TEM for å begrense enhver bøyning av rutenettet, da dette vil bryte lamellene. Uklippede rister kan lastes inn i TEM ved sideinngangskryoholdere, men det er stor sjanse for at lamellene blir ødelagt hvis klipping utføres etter fresing.

Organoplatinum belegg
Organoplatinumbelegg utføres på en eller begge ristene når de er lastet inn i kryoFIB-SEM. Nålen til gassinjeksjonssystemet (GIS) settes inn i kammeret over prøven for å lede en strøm av organoplatinumdamp over overflaten av rutenettet fra en oppvarmet kilde i en bestemt tid. Dampen kondenserer på kalde overflater og danner et solidt lag (~ 2 μm tykt). Integriteten til denne pelsen er avgjørende for at ensartede tynne lameller skal kunne freses. De optimale påføringsforholdene for organoplatinumbelegget er vanligvis forhåndsbestemt av produsenten av instrumentet, men det kan fortsatt være nødvendig med optimalisering. De fleste systemer justerer enten GIS-nålen nær freseretningen eller vinkelrett på freseretningen, avhengig av geometrien til portene på kammeret og rotasjonsgrensene til trinnet. Ulike innstillinger kan testes ved å belegge rutenettet, frese et lite område, vippe scenen og måle tykkelsen på kappen med SEM.

I tillegg til oppsettet av selve kryoFIB-SEM, kan en rekke andre faktorer påvirke påføringen av organoplatinumbelegget, inkludert 1) prøvens topografi, 2) overflateforurensning på rutenettet og 3) reproduserbarheten av dampstrømmen fra GIS-nålen. Siden GIS-strømmen er retningsbestemt, kan ujevn topografi føre til at regioner i skyggen av celler eller overflateforurensning blir ubelagt eller har et tynnere lag. Dette kan føre til kollaps av organoplatinumlaget under polering (figur 3). Når du velger et område å frese, er det nødvendig å være oppmerksom på den omkringliggende topografien, for eksempel stor overflateforurensning, klumper av celler eller ødelagt karbon som stikker ut fra overflaten av rutenettet så langt som et par rutenett kvadrater unna, kan blokkere dampstrømmen, og skape en skygge av tynnere organoplatinum som kan svekke en lamell. I tillegg bør svært små partikler av overflateforurensning nær lamellens forkant også unngås, da de kan sprette av under fresing, og etterlate en svekket flekk med bar is som kan føre til at det utvikler seg et hull i lamellen under polering. Til slutt, hvis fresingen har startet og organoplatinumpelsen ser ustabil ut, belegg igjen, lenger, eller bytt på et reservegitter.

Figure 3
Figur 3: Et organoplatinumbelegg av god kvalitet er avgjørende for å oppnå tynne, jevnt fresede lameller. (A) En mikrograf av forkanten av en lamell hvor organoplatinumbelegget (OP, gult) har blitt påført for tynt, noe som fører til et hull i lamellens forkant som utviklet seg under polering (grønn sirkel) og ujevn fresing over hele lamellens bredde (striper). Organoplatinumoverflaten har blitt skåret av av ionstrålen, noe som fører til en spray av materiale bak beleggets forkant (gulstiplet linje). (B) Organoplatinumbelegget (OP) har blitt påført tykkere, noe som resulterer i en jevnere tynnet lamell. Pelsens integritet er bevart over hele lamellens bredde, og grensesnittet mellom organoplatinumbelegget og det forglassede biologiske materialet er veldefinert (gulstiplet linje). Karbonlaget kan sees løpe gjennom baksiden av lamellen (oransje). Skala barer, 1 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vurdering av nettkvalitet i kryoFIB-SEM og prosessen med fresing
Når rutene er overført til kryoFIB-SEM, kan karbonfilmens integritet og fordelingen av cellene på rutenettene screenes av SEM (figur 4A-C). Isgradienter, posisjonen til gitterstolper og plassering av rutenettnumre på søkerrutenett kan kontrolleres ved lav forstørrelse SEM ved 30 kV (figur 4B), men spenningen bør reduseres tilbake til 5 kV mens du finner freseposisjoner ved høy forstørrelse og overvåker freseprosessen for å øke kontrasten fra overflatetopografien.

Figure 4
Figur 4: Vurdering av rutenettkvalitet og lokalisering av områder som skal freses i kryoFIB-SEM . (A) Oversikt over lavt forstørrelse av et rutenett ved 5 kV via SEM. Den utskårne delen av autogrid-kanten er synlig nederst i bildet. Skalastang, 0,5 mm. (B) Det samme rutenettet ved 30 kV ved SEM, som viser områder med tykkere is (mørkere rutenett) og tynnere is (lysere rutenett). Innfellingen viser området i boksen, med piler som indikerer nummereringen på finder-rutenettet, som er synlig ved 30 kV. Skalastang, 0,5 mm. (C) En oversikt over middels forstørrelse av to rutenett som vurderer fordelingen av cellene på karbonfilmen og plasseringen av rutestolpene. Skalastang, 50 μm. (D) Arrangementet av fresemønstre for det første kuttet ved høy forstørrelse (ionstrålevisning ved 1,5 pA og 30 kV). Den røde regionen (3 μm tykk) er beskyttet, mens de gule områdene vil bli ablert av ionstrålen. Den hvite stiplede linjen indikerer posisjonen til den endelige lamellen. Skalastang, 10 μm. (E) Et bilde med høy forstørrelse på 3 kV via SEM av en polert 200 nm tykk lamell (10 μm bred x 15 μm lang). Tap av kontrast i lamellen ved 3 kV indikerer at en passende tykkelse er nådd. Den lyse hvite forkanten er det gjenværende organoplatinumlaget som påføres rutenettet via GIS før fresing. Skalastang, 5 μm. (F) Den samme lamellen fra (E) sett ved hjelp av ionstrålen ved 30 kV og 1,5 pA. Den tynne hvite linjen over den svarte firkanten (hvit pil) er den gjenværende organoplatinumpelsen helt på forkanten av lamellen. Skala bar, 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Et område som skal freses, velges ved å legge ut et par rektangulære mønstre på hver side av et beskyttet område ved høy forstørrelse (~ 7000x for schizonter) i ionstrålevisningen (figur 4D). Det er kritisk at ingen partikler av overflateforurensning er festet nær freseområdet, da disse kan ha skjult påføringen av det beskyttende organoplatinumbelegget. Det er også viktig at topografien i regionen er egnet til å støtte sidene av lamellen når den endelige tykkelsen er oppnådd.

For malaria-schizonter (cellestørrelse: ~5 μm diameter x 2 μm tykk, skiveformet) kan lameller mellom 7-20 μm brede freses. Hvis cellelaget er passende tykt, vil lamellene vanligvis ende opp ~ 10-15 μm i lengde, fange flere celler over og under karbonlaget (figur 4E-F). Det kan forventes å frese 5-10 lameller i en 8 timers økt (6-7 timer fresing og 1-2 timer polering). Dette vil variere avhengig av tykkelsen på prøven og bredden på lamellene, med tykkere prøver og bredere lameller som tar lengre tid å male. Selv skadede rister kan freses, da det bare krever en håndfull gode rutenett for å generere et sett med lameller (figur 5A). I tillegg, hvis prøven er tynnere enn forventet, for eksempel på grunn av overblotting eller variasjon i hematokriten i kulturen, kan kortere lameller freses relativt raskt. Imidlertid vil deres kortere lengde begrense området som er tilgjengelig for datainnsamling i TEM (figur 5B).

Figure 5
Figur 5: Bestemme når endelig lamelltykkelse er nådd under fresing. (A) Oversikt over lavt forstørrelse av et rutenett ved SEM ved 5 kV som viser karbonskade under klipping. De uskadede områdene inneholdt svært tynn prøve på grunn av overblotting; Det var imidlertid fortsatt mulig å frese seks lameller på dette rutenettet (området innenfor det hvitstiplede omrisset) i en heldagsøkt på kryoFIBSEM. Skalastang, 0,5 mm. (B) En kort lamell (~10 μm bred x 3 μm lang, ikke inkludert organoplatinumlag) produsert fra dette rutenettet (SEM ved 3 kV), som fortsatt ga to regioner å samle tilt-serier fra. Skalastang, 25 μm. (C) En serie SEM-bilder (3 kV) av en lamell under det siste poleringstrinnet som viser hvordan kontrasten går tapt i lamellen når den tynnes (beveger seg fra venstre mot høyre). Den mørke svarte linjen over midten av lamellen i alle bildene er en stripe karbonfilm fra rutenettet. Celler foran denne regionen ble vitrifisert over karbonfilmen, og celler bak denne regionen ble vitrifisert under karbonfilmen. Fresingen ble stoppet da organoplatinumpelsen på venstre side av lamellens forkant var nær ved å miste strukturell integritet. Dette stoppestedet var før hele lamellen ble brakt til en jevn tykkelse, og derfor er det fortsatt noe materiale med høyere kontrast på baksiden av lamellen. (D) Et eksempel på en poleringsrute basert på lamellene som er malt på rutenettet vist i (A). En poleringsrute bør starte ved lameller nærmere FIB-kilden, og bevege seg bort fra FIB-kilden for å begrense redeponering av frest materiale på overflaten av lamellene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Under polering vil den endelige tykkelsen på en lamell avhenge av strukturen til prøven i regionen som freses, organoplatinumbeleggets integritet og tilgjengelig tid. Ideelt sett bør prøven tynnes til kontrasten går tapt over hele overflaten av lamellen ved SEM ved 3 kV, noe som tyder på at den er jevnt elektrongjennomsiktig og rundt 150-200 nm tykk (figur 5C). Det kan imidlertid være nødvendig å stoppe fresingen før dette punktet hvis organoplatinumlaget utvikler et hull eller lamellen begynner å bøye seg. I dette tilfellet kan lamellen fortsatt være tynn nok på forsiden og forbli nyttig for tomografi. Omvendt er det mulig å tynne forbi tap av kontraststadium hvis lamellen ser stabil ut, noe som gjør den enda tynnere ved å flytte fresemønstrene nærmere hverandre (~ 100 nm eller mindre). Dette vil avhenge av hvilken tykkelse hvis nødvendig for nedstrøms arbeidsflyt. Et SEM-bilde med lav forstørrelse er nødvendig for å planlegge en poleringsrute, som starter nærmere ionstrålekilden og arbeider bort (figur 5D). Poleringsrutens retning er viktig for å hindre redeponering av ablert materiale på lameller som allerede er ferdig.

Innsamling og behandling av data fra tilt-serien
Når den er lastet inn i TEM, vil en full gridmontasje med lav forstørrelse (~ 150x) identifisere lamellens posisjoner, som kan korreleres med SEM-bildet med lav forstørrelse tatt på slutten av fresing. For stupefrosne schizonter er det meste av rutenettet ikke gjennomsiktig for elektroner, så lamellposisjonene vises som hvite hakk på svart bakgrunn (figur 6A). Vinkelen på lamellene i forhold til mikroskopets tiltakse bør noteres, da mer enn ~ 10 ° vekk fra vinkelrett kan gjøre tilt-serie oppkjøp vanskelig. En montasje med middels forstørrelse (~1,500x) på stedet for hver lamell vil gi en oversikt over det biologiske innholdet og sjekke for overføringsskade, krystallinsk is eller overdreven overflateforurensning (figur 6B-D). Dette bør også kontrolleres ved høy tilt for å sikre at ingen overflateforurensning skjuler oppkjøpet eller fokusområdet. Å velge en oppkjøpsregion vil ikke bare avhenge av de biologiske egenskapene, men også isens strukturelle integritet i den omkringliggende regionen, for eksempel å unngå sprekker, da disse områdene vil drive, eller områder med overdreven gardinering, hvor en lamell vil ha variabel tykkelse. Før du anskaffer en tilt-serie, påføres en ±10° fortilt rutenettet for å gjøre lamellplanet (ikke rutenettet) vinkelrett på den optiske aksen. Forvippingens retning kan bestemmes av posisjonen til lamellens forkant (ser etter venstre organoplatinumbelegg) i forstørrelsesmontasjen. For TEM som brukes her (300 kV Titan Krios), hvis forkantene av lamellene pekte opp i kartet, krevde dette en +10° forvipping, og hvis de pekte ned, krevde dette en -10° forvipping. Hvert rutenett kan være forskjellig på grunn av retningen der de ble plukket opp i pinsetten og satt inn i autoloaderen (kuttet seksjon vendt mot venstre eller høyre, gir en 180 ° rotasjon). En siste vurdering er pikselstørrelse. Rutinemessig samles vippeserier rundt 2,5-7 Å/piksel, med tanke på størrelsen på funksjonen av interesse, måloppløsningen til de resulterende tomografiske dataene og lamellens overflateareal, noe som kan begrense størrelsen på innsamlingsområdet. Det er mulig å bruke en mindre pikselstørrelse for å få informasjon med høy oppløsning, og den minste vi har brukt med hell på disse prøvene er 1.4 Å/piksel (data ikke vist). Drift vil være mer tydelig ved en mindre pikselstørrelse og er egentlig bare egnet for tynne (<100 nm) lameller der maksimering av oppløsning er av betydning i studien.

Figure 6
Figur 6: Velge tilgjengelige områder av interesse for å skaffe seg vippeserier (A) Et utsnitt av et TEM-kart med lav forstørrelse som viser et område som inneholder lameller, som vises som seks hvite hakk på svart bakgrunn (røde piler). De hvite firkantene er brutt karbonfilm. (B) Et middels forstørrelseskart over en skadet og avvikende lamell. I forkant av lamellen (FE) har organoplatinumpelsen knekket av (1). Det er en klar flekk med krystallinsk is i midten av lamellen (2). Ionstrålen har ikke klart å bryte gjennom i bakkant av lamellen (BE) fordi isen er for tykk ved siden av gitterstengene. Bare en liten del av lamellen er fri for den omkringliggende isen på BE (3), noe som skaper en kile. Tykkelsen har også ført til at hyller er kuttet over lamellen (4), noe som mest sannsynlig vil blokkere sikten til cellene ved høy tilt i TEM. (C) Middels forstørrelse montasje av en hel lamell sett i TEM. Typiske problemer eller regioner som bør unngås ved innsamling av vippeserier fra lameller er områder: dekket med overflateforurensning (SC), dekket av organoplatinumbelegget (OP, gul), nær sprekker (CR og svarte piler), med gardinering på grunn av tetthetsendringer i biologisk materiale (CU og region innenfor blå parenteser), og områder svekket av brudd i organoplatinumbelegget (grønn sirkel). De eneste regionene som er tilgjengelige for tilt-serie oppkjøp er områdene innenfor de to svartstiplede boksene (merket 1 og 2). Visningen må kontrolleres ved høy helling for å sikre at overflateforurensning ikke skjuler interesseområdet eller fokusområdet. (D) En middels forstørrelsesmontasje av en mye renere lamell, men som fortsatt har sprekker (CR) forårsaket av tynning av organoplatinumbelegget (grønn sirkel) under polering. Her fremheves interesseområdet av celletypen observert i lamellen, som i dette tilfellet er de enkelte merozoittene, plassert bak karbonlaget (oransje) mot baksiden av lamellen (svartstiplet boks). Skala barer, 3 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Innhenting av kryo-ET-data fra FIB-frest lamell. (A) En mikrograf av en region av en lamell som inneholder en rød blodcelle som nylig har blitt invadert av en P. falciparum merozoitt. I (B) er det samme bildet kommentert for å vise grensen til den røde blodcellen (rød), et antall dobbeltveggede intracellulære vesikler (lilla og blå for henholdsvis indre og ytre membraner) og merozoitten (grønn) omgitt av en annen membran avledet fra vertscellen (gul). En svart boks viser området der en vippeserie ble anskaffet. Skala bar, 500 nm. (C) Et gjennomsnitt på 20 sentrale skiver sett i XY-planet fra et 8x binned tomogram (2,4 Å/piksel) ervervet ved den apikale enden av merozoitten og i (D) dens merknad, som viser de to membranene som omgir cellen (grønn og gul) og fire membraner stablet i toppen av merozoitten (blå) som er assosiert med et elektrontett soppformet trekk (lilla). En rød pil indikerer krysset mellom membranstablene i toppunktet og det soppformede trekket (også vist i del F, i). En svart pil indikerer en fusjonshendelse mellom plasmamembranen merozoitt og en av de flerlagsvesiklene i parasitten (også vist i del F, ii). Vertsens røde blodcellemembran vises (rød) og en svartstiplet linje viser posisjonen til et tverrsnitt sett i XZ-planet, vist i (E). Funksjonene i tverrsnittet (E) er farget og merket det samme som i del (D), med fargede piler som peker mot membranene. En svart pil indikerer plasseringen av et sputterbelegg påført lamellen etter fresing og tykkelsen på lamellen i indikert. For deler (C-E), vektstang, 500 nm. (F) En mer detaljert visning av funksjonene indikert av de røde og svarte pilhodene i del (C), som viser definisjonen i lipidbi-lagene av membranstakken i toppen av merozoitten (i) og fusjonshendelsen mellom flerlagsvesikkelen med merozoittplasmamembranen. Skala bar, 75 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Hovedfokuset i arbeidet er å dissekere veien til merozoittutgang i P. falciparum Men gitt at populasjonen av celler som brukes i studien aldri kan være helt homogen, ble det ofte observert andre stadier av celleutvikling i lamellene. Eksemplet vist her (Figur 7) inneholder en rød blodcelle som nylig har blitt invadert av en P. falciparum parasitt (merozoitt). Lamellen som ble brukt var 240 nm tykk og rutenettet hadde blitt lett sputter belagt med platina i en argonatmosfære før innsetting i TEM, noe som resulterte i litt mindre kontrast enn normalt forventet. Den røde blodcellemembranen kunne spores i sin helhet rundt cellen. Innenfor den røde blodcellen var tre lukkede membranbundne strukturer, to vesikler, hver omgitt av en dobbel membran og en lyspæreformet formasjon (1, 2 μm x 0, 9 μm på det bredeste), som er forenlig med at det er en merozoitt (Figur 7A-B). Innholdet i de to vesiklene syntes å være lik i motsetning til innholdet i den røde blodcellen, noe som tyder på at disse vesiklene kan inneholde hemoglobin. Tilstedeværelse av vesikler i vertens røde blodlegemer etter invasjon er observert tidligere45. De antas å oppstå fra sekresjonen av lipider og andre virulensfaktorer fra sekretoriske organeller kalt rhoptries i merozoitten, som slippes ut i vertsens røde blodlegeme under invasjonen. Merozoitten er omgitt av to nært tilknyttede membraner, hvorav den innerste antagelig er den opprinnelige plasmamembranen til merozoitten, der det ikke er synlig overflatebelegg, og den ytterste må stamme fra vertsens røde cellemembran som omslutter merozoitten når den invaderer. Cytoplasmaet til merozoitten inneholder mange flerskiktsvesikler og en elektrontett soppformet funksjon ved siden av en stabel membraner ved toppunktet. En vippeserie ervervet over denne regionen (2,4 Å/piksel) viser at den inneholder en stabel med fire membraner, som ser ut til å være forbundet med den soppformede formasjonen (Figur 7C-E). Påfallende er denne morfologien ganske forskjellig fra det normale arrangementet av organeller og cellulære strukturer i den apikale enden av en moden merozoitt. For å vurdere dette ble det oppnådd en komparativ tiltserie (2,74 Å/piksel) over den apikale enden på en moden merozoitt fra en schizont som hadde blitt behandlet med E64 før stupefrysing og fresing (Figur 8). Dette viser at den apikale enden av en merozoitt inneholder to fremtredende klubbformede sekretoriske organeller kalt rhoptries som ligger i et sett med tre polare ringer på den apikale spissen av cellen og omgitt av en rekke mindre sekretoriske organeller kalt mikronemes. Den innerste polare ringen er festet til en dobbel membranstruktur som ligger til grunn for merozoittplasmamembranen, kalt det indre membrankomplekset, som inneholder motorproteiner som driver invasjon. Det har vist seg at under invasjonen slippes innholdet i sekretoriske organeller ut på merozoittoverflaten og inn i vertsens røde blodlegemer, noe som letter vedlegg av merozoitter til vert røde blodlegemer og initierer motorkomplekset som driver invasjon45. Dataene her viser at merozoitten etter invasjon ikke inneholder observerbare strukturer som ligner rhoptries, micronemes eller polarringer, noe som tyder på at morfologien til den apikale enden av merozoitten endres dramatisk. Fusjon av rhoptrier før invasjon har tidligere blitt vist av TEM av faste, romtemperaturseksjoner46, som er i samsvar med produksjonen av den soppformede funksjonen vi observerer i vår post-invasjonstilstand merozoitt. Stablene av membraner koblet til denne funksjonen har ikke blitt observert tidligere, og siden det ikke er noen indikasjon på en IMC tilstede i den nylig invaderte merozoitten, antar vi at membranstablene kan være restene av IMC-maskineriet som er igjen etter at invasjonen er fullført, men dette gjenstår å bli bekreftet.

Figure 8
Figur 8: Den apikale enden av modne merozoitter ved kryo-ET av en FIB-frest lamell og TEM av plastseksjoner. (A) Et gjennomsnitt på 20 sentrale skiver fra et 8x binned tomogram (2,74 Å/piksel) fra en 230 nm tykk lamell som viser den typiske morfologien til den apikale enden av en moden merozoitt. Schizontene ble behandlet med E64 før stupefrysing, slik at PV-membranen har sprukket og merozoittene er inneholdt i vertsens røde blodlegeme. (B) viser det samme som i (A), men med merknader for å indikere vertsens røde blodcellemembran (RCM, rød), merozoittplasmamembranen (grønn), det indre membrankomplekset (IMC, lilla), polare ringer (PR, svart), mikronemes (M, gul), rhoptries (R, grå) og kjernekonvolutten (NE, blå). En nærliggende merozoitt, som er ute av plan i denne regionen av tomogram, er indikert med en grønn trekant. Skala bar, 200 nm. (C) De cellulære egenskapene observert av cryoET er konsistente med de fra TEM av schizonter bevart i plastseksjoner. Lignende cellulære egenskaper er indikert i en moden merozoitt fra en schizont som har blitt behandlet med forbindelse 2, som stopper utgang før PV-membranbrudd. Skala bar, 500 nm. (D) Et annotert skjema av en merozoitt som viser de cellulære egenskapene i deler (A-C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tykkelsen på beskyttet område mellom de rektangulære fresemønstrene (μm) Nomisk ionstrålestrøm (pA) ved 30 kV
3 300
1.5 100
0.75 50
0.3 30
0,2 - 0,06 (endelig polering) 30*

Tabell 1: Fresestrategi for å produsere tynn lamell. Trinnvis fresing utføres ved å redusere ionstrålestrømmen som tilsvarer tykkelsen på det beskyttede området. Dette begrenser prøveoppvarming, og forhindrer avvik. *Polering bør utføres parallelt for jevnt å påføre varmen på lamellene fra begge sider, noe som reduserer risikoen for at de bøyer seg eller bøyer seg når de når sin endelige tykkelse. Andre trinn kan gjøres sekvensielt, fresing mønsteret over lamellen og deretter under lamellen, før du flytter til neste strålestrøm. Oppmåling av nettet for å finne freseposisjoner bør utføres ved 1,5 pA strålestrøm for å minimere prøveoppvarming. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Mens kryoFIB-fresing blir mer rutinemessig, har ikke klargjøring av optimale prøver for fresing gjort det; Derfor skjer de fleste kritiske trinnene i denne protokollen før prøven når kryoFIB-SEM. Prøveoptimalisering ved flere runder med cellepreparering, stupefrysing og screening ved lys- og elektronmikroskopi er nødvendig for å produsere best mulig prøve før fresing forsøkes. Å ha best mulig prøve øker ikke bare sjansene for suksess, men optimaliserer også bruken av utstyret. Av denne grunn krever de fleste nasjonale anlegg bevis på at tilstrekkelig optimalisering er utført før de gir tid på maskinene sine. Inne i kryoFIB-SEM er det avgjørende å maksimere effektiviteten til organoplatinumbelegget for å produsere jevnt tynne lameller. Til slutt er tålmodighet og god prøvehåndtering en forutsetning fra brukeren, som vil bli pålagt å sitte i flere dager og produsere og deretter overføre rister som inneholder delikate lameller. Dette kan endre seg med introduksjonen av automatiserte fresestrategier47,48, men foreløpig er hele freseprosessen fortsatt stort sett manuell på de fleste anlegg.

Mens arbeidet fokuserte utelukkende på P. falciparum schizonts, kunne metoden som presenteres her enkelt modifiseres for å optimalisere gridforberedelse og fresing for andre celletyper. Viktige faktorer å vurdere er tettheten av cellene som påføres rutenettet, rutenetttypen (kobber er giftig for noen celler), størrelsen og avstanden mellom hull i karbonfilmen, blottingstiden og metoden for blotting (enkelt / dobbeltsidig, manuell eller automatisert). I tillegg, hvis cellene dyrkes på ristene (vanligvis gullgitter med en holey karbonfilm), kan sammenløp kontrolleres ved lysmikroskopi før blotting og frysing. Fresestrategien avhenger av hvordan cellene er avsatt på rutenettet. For malariainfiserte røde blodlegemer, er rutenettet i hovedsak belagt av et ubrutt lag av celler, tykkere i enkelte områder og tynnere i andre områder. Fresing utføres på flere punkter i en region langs denne gradienten hvor istykkelsen genererer lameller som er en passende størrelse for tomografi. Denne tilnærmingen fungerer bra for mindre celler, da du kan produsere lameller som inneholder et stykke gjennom flere celler. For større celler eller klumper av celler, kan det være tilfelle at en celle eller celle klump kan produsere en lamell.

Netthåndtering og prøveoverføring er fortsatt en av hovedutfordringene i denne arbeidsflyten. Lameller kan gå tapt på grunn av brudd eller sprekker, gardinerende gjenstander som skjuler biologien, overdreven overflateforurensning, samt rutenettorienteringsproblemer i TEM, noe som krever et ekstra håndteringstrinn for å flytte rutenettet. Graden av tap varierer fra dag til dag og fra nett til nett, men det forbedres gjennom praksis og håndteringserfaring over tid. I denne studien ble det funnet at ristene kan omorienteres forsiktig i autoloaderen flere ganger uten å ødelegge lameller, og dette har noen ganger fordelen av å vaske av overflateis. En annen hovedbegrensning i denne arbeidsflyten er tiden det tar å produsere lameller. Siden produksjonen er treg, er det avgjørende å ha en riktig optimalisert prøve, noe som gjør fresingen så effektiv som mulig.

En rekke tilpasninger til FIB-fresing av biologiske prøver i glasslegemet er nylig introdusert. En game-changer er implementeringen av kryogenisk avkjølte løfteverktøy i cryoFIB-SEM-kammeret som gjør det mulig å frese større blokker av materiale fra høytrykksfrosne prøver. Blokkene kan festes til en metallstang eller plukkes opp i en griper og flyttes til en annen prøveposisjon, som inneholder et spesielt modifisert EM-rutenett. Blokkene kan deretter belegges med organoplatinum og freses for å generere lameller. Evnen til å male lameller fra høytrykksfrosset materiale betyr at mye større celler og vev kan behandles, spesielt rettet mot områder ved korrelativ fluorescensmikroskopi12. Andre nylige tilpasninger til FIB-fresemetoden inkluderer reduksjon av gardineringsartefakter ved kileprefresing av prøven16, mikrofluidisk kryofiksering49 og fotomikromønster av elektronmikroskopigitter for å forbedre cellefordelingen50. Det har også blitt påvist at fresing av mikroekspansjonsgap på hver side av en lamell kan lindre kompresjonen av den omkringliggende prøven når den når sin endelige tynnhet51. Dette kan være spesielt nyttig ved fresing av kontinuerlige cellelag, slik som prøven i denne studien, hvor bøying av lameller noen ganger ses under det siste poleringstrinnet.

Fremtiden for elektronmikroskopi vil trolig være bestemmelse av in situ molekylære strukturer ved sub-tomogram gjennomsnitt og FIB-fresing er et viktig verktøy som vil lette produksjonen av glassaktige biologiske prøver for disse typer arbeidsflyter. Mens FIB-fresing fortsatt er i sin barndom for biologiske anvendelser, skjer metodeutviklingen i et raskt tempo takket være det harde arbeidet til forskere, både akademiske og ved nasjonale anlegg, pluss kommersielle investeringer i å utvikle cryoFIB-SEM-teknologi for å støtte forskning.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble finansiert helt eller delvis av Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Med henblikk på åpen tilgang har forfatteren anvendt en CC BY offentlig opphavsrettslisens til enhver forfatterakseptert manuskriptversjon som oppstår fra denne innsendingen.

Dette prosjektet som denne metoden ble utviklet for, ble finansiert av et medisinsk forskningsråds stipend MR / P010288 / 1 tildelt Helen R. Saibil, Roland A. Fleck og Michael J. Blackman. Kulturer av P. falciparum ble dyrket ved Francis Crick Institute, med støtte fra medlemmer av Michael J. Blackmans gruppe. Forfatterne vil gjerne takke Dr. Ser Ying (Michele) Tan for å gi bildene av sammensatte 2 og E64-behandlede schizonter i tynne blodutstryk. De fleste lamellene ble produsert med støtte fra ansatte ved eBIC, og vi er takknemlige for tilgang til Scios dual-beam cryoFIB-SEM på forskningsforslag NT21004. Forfatterne anerkjenner også støtten fra Royal Society Industry Fellowship-ordningen (INF\R2\202061) i å fortsette utviklingen av FIB-freseteknikken innen CUI. Forfatterne vil også takke Helen R. Saibil for nyttige diskusjoner i forhold til denne metodeoppgaven og veiledning av prosjektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
c-clips Thermo Fisher Scientific 1036171
Clipping station Thermo Fisher Scientific n/a Direct quote from Thermo
Clipping station Sub-angstrom CSA-01
Compound 2 n/a n/a Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc
Cryo-FIB specific autogrid rims Thermo Fisher Scientific 1205101
E64 Sigma E3132
Emitech K100X glow discharge unit Quorum n/a
Gibco RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 12633012 Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements
Giemsa Stain VWR International 350864X
Glass slides Thermo Fisher Scientific 11562203
Grid boxes Sub-angstrom PB For clipped grids
Grid boxes Thermo Fisher Scientific n/a For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific
Grid boxes Agar Scientific AGG3727
Home-made manual plunge freezing rig n/a n/a With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.
Human blood n/a n/a UK National Blood and Transplant service
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system JEOL n/a FIB-SEM
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage Leica n/a sputter coater
Leica EM ACE900 Leica n/a e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.
Linkam cryo-stage for light microscope Linkam Model No. CMS196 Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.
Methanol Sigma 179957
Nikon Eclipse E200 light microscope Nikon n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.
Percoll VWR International 17-0891-01 Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids Quantifoil N1-C17nCuH2-01 100 pack
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids Quantifoil N1-C17nCu20-01 100 pack
Quorum PP3010 prep-chamber Quorum n/a sputter coater
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage. FEI n/a FIB-SEM
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen Viking Direct ND538522
TFS Titan Krios 300 kV TEM Thermo Fisher Scientific n/a TEM equipped with a K2 or K3 camera.
Whatmann grade 1 filter paper Sigma WHA1001150
Zeiss Axio Scope A1 light microscope Zeiss n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumeister, W. From proteomic inventory to architecture. FEBS Letters. 579 (4), 933-937 (2005).
  2. Rigort, A., Villa, E., Bäuerlein, F. J. B., Engel, B. D., Plitzko, J. M. Integrative approaches for cellular cryo-electron tomography: Correlative imaging and focused ion beam micromachining. Methods in Cell Biology. 111, 259-281 (2012).
  3. Oikonomou, C. M., Chang, Y. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14, 205-220 (2016).
  4. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  5. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
  6. Narayan, K., Subramaniam, S. Focused ion beams in biology. Nature Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).
  7. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  8. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  9. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: Focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (5), 771-777 (2013).
  10. Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180 (2), 318-326 (2015).
  11. de Winter, D. A. M., et al. In-situ integrity control of frozen-hydrated, vitreous lamellas prepared by the cryo-focused ion beam-scanning electron microscope. Journal of Structural Biology. 183 (1), 11-18 (2013).
  12. Schaffer, M., et al. A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue. Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).
  13. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  14. Albert, S., et al. Proteasomes tether to two distinct sites at the nuclear pore complex. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 114 (52), 13726-13731 (2017).
  15. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705 (2018).
  16. Schaffer, M., et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).
  17. Szwedziak, P., Wang, Q., Bharat, T. A. M., Tsim, M., Löwe, J. Architecture of the ring formed by the tubulin homologue FtsZ in bacterial cell division. eLife. 3, 04601 (2014).
  18. Carlson, L. A., et al. Cryo electron tomography of native HIV-1 budding sites. PLOS Pathogens. 6 (11), 1001173 (2010).
  19. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nature Communications. 11 (1), 5885 (2020).
  20. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  21. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  22. Murphy, G. E., et al. Correlative 3D imaging of whole mammalian cells with light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 176 (3), 268-278 (2012).
  23. Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2012).
  24. Spehner, D., et al. Cryo-FIB-SEM as a promising tool for localizing proteins in 3D. Journal of Structural Biology. 211 (1), 107528 (2020).
  25. Kamino, T., Yaguchi, T., Ohnishi, T., Ishitani, T., Osumi, M. Application of a FIB-STEM system for 3D observation of a resin-embedded yeast cell. Journal of Electron Microscopy. 53 (5), Tokyo. 563-566 (2004).
  26. Han, H., Zuber, B., Dubochet, J. Compression and crevasses in vitreous sections under different cutting conditions. Journal of Microscopy. 230, Pt 2 167-171 (2008).
  27. Matias, V. R. F., Al-amoudi, A., Dubochet, J., Beveridge, T. J. Cryo-transmission electron microscopy of frozen-hydrated sections of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (20), 6112-6118 (2003).
  28. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150 (1), 109-121 (2005).
  29. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. The EMBO Journal. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  30. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: A new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1-2), 43-51 (2006).
  31. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 172 (2), 180-190 (2010).
  32. Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. -J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryoelectron microscopy of vitrified specimens. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer. Berlin Heidelberg. 114-131 (1987).
  33. Hsieh, C., Schmelzer, T., Kishchenko, G., Wagenknecht, T., Marko, M. Practical workflow for cryo focused-ion-beam milling of tissues and cells for cryo-TEM tomography. Journal of Structural Biology. 185 (1), 32-41 (2014).
  34. Harapin, J., et al. Structural analysis of multicellular organisms with cryo-electron tomography. Nature Methods. 12 (7), 634-636 (2015).
  35. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 180 (3), 572-576 (2012).
  36. Duyvesteyn, H. M. E., et al. Machining protein microcrystals for structure determination by electron diffraction. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 115 (38), 9569-9573 (2018).
  37. Blackman, M. J. Purification of Plasmodium falciparum merozoites for analysis of the processing of merozoite surface protein-1. Microbes as Tools for Cell Biology. 45, Academic Press. London, UK. 213-220 (1995).
  38. Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2 - anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  41. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  42. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  43. Turoňová, B., Schur, F. K. M., Wan, W., Briggs, J. A. G. Efficient 3D-CTF correction for cryo-electron tomography using NovaCTF improves subtomogram averaging resolution to 3.4 Å. Journal of Structural Biology. 199 (3), 187-195 (2017).
  44. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3d correlative microscopy. Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).
  45. Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host & Microbe. 9 (1), 9-20 (2011).
  46. Hanssen, E., et al. Electron tomography of Plasmodium falciparum merozoites reveals core cellular events that underpin erythrocyte invasion. Cellular Microbiology. 15 (9), 1457-1472 (2013).
  47. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  48. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife. 9, 52286 (2020).
  49. Fuest, M., et al. In situ microfluidic cryofixation for cryo focused ion beam milling and cryo electron tomography. Scientific Reports. 9 (1), 19133 (2019).
  50. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  51. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208 (3), 107389 (2019).

Tags

Retraksjon utgave 174 FIB-fresing cryoFIB-SEM lamell tomografi cryoET cryoEM Plasmodium falciparum

Erratum

Formal Correction: Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography
Posted by JoVE Editors on 09/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. The Authors section was updated from:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

to:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
M. Alejandra Carbajal1
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

Forbereder lameller fra glassaktige biologiske prøver ved hjelp av et dual-beam skanning elektronmikroskop for kryo-elektrontomografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bisson, C., Hecksel, C. W.,… More

Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Carbajal, M. A., Fleck, R. A. Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (174), e62350, doi:10.3791/62350 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter