Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Forberedelse af lameller fra glasagtige biologiske prøver ved hjælp af et dobbeltstrålescanningselektronmikroskop til kryo-elektrontomografi

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/62350
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3, 1, 1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London, 2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London, 3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

ERRATUM NOTICE

Summary

Brug af fokuseret ionstrålefræsning til fremstilling af glasagtige lameller på gitteret fra dybfrosne biologiske prøver til kryo-elektrontomografi.

Abstract

Præsenteret her er en protokol til fremstilling af kryo-lameller fra dykfrosne gitter af Plasmodium falciparum-inficerede humane erythrocytter, som let kunne tilpasses til andre biologiske prøver. De grundlæggende principper for forberedelse af prøver, fræsning og visning af lameller er fælles for alle instrumenter, og protokollen kan følges som en generel vejledning til on-grid kryo-lamellpræparation til kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) og kryo-elektrontomografi (cryoET). Elektronmikroskopigitter, der understøtter cellerne, kastes frosset ned i flydende nitrogenkølet flydende ethan ved hjælp af en manuel eller automatiseret springfryser og screenes derefter på et lysmikroskop udstyret med et kryo-trin. Frosne gitter overføres til et kryo-scanning elektronmikroskop udstyret med en fokuseret ionstråle (cryoFIB-SEM). Gitre er rutinemæssigt sputterbelagt inden fræsning, hvilket hjælper spredning af ladningsopbygning under fræsning. Alternativt kan en e-stråle roterende coater bruges til at påføre et lag kulstof-platin på gitterene, hvis nøjagtige tykkelse kan styres mere præcist. Når den er inde i cryoFIB-SEM, påføres en yderligere belægning af en organoplatinforbindelse på overfladen af gitteret via et gasindsprøjtningssystem (GIS). Dette lag beskytter lamellens forkant, når den fræses, hvis integritet er afgørende for at opnå ensartet tynde lameller. Interesseområder identificeres via SEM, og fræsning udføres trinvist, hvilket reducerer ionstrålens strøm, når lamellen når elektrongennemsigtighed, for at undgå overdreven varmegenerering. Et gitter med flere lameller overføres derefter til et transmissionselektronmikroskop (TEM) under kryogene betingelser for tilt-serie erhvervelse. En robust og kontamineringsfri arbejdsgang til lamelpræparation er et vigtigt skridt for downstream-teknikker, herunder cellulær cryoEM, cryoET og sub-tomogram-gennemsnit. Udvikling af disse teknikker, især til udtagning og fræsning af højtryksfrosne prøver, har høj prioritet i marken.

Introduction

Kun det cellulære indhold af biologiske prøver <500 nm tykke kan afbildes effektivt ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) ved kryogene temperaturer, hvilket begrænser prøveområdet til vira, prokaryoter, simple encellede organismer og tyndere områder af større eukaryote celler1. On-grid fokuseret ionstråle (FIB)-fræsning gør det muligt at tynde tykkere dykfrosne biologiske prøver til elektrongennemsigtige lameller ved kryogene temperaturer (< -150 °C). De resulterende lameller overføres derefter til en TEM til visualisering og tomografisk dataindsamling, hvilket muliggør 3D-rekonstruktioner i høj opløsning af de cellulære og molekylære egenskaber inde i celler (for anmeldelser se Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163, og Wagner et al., 20204).

FIB-fræsning opstod inden for materialevidenskab, hvor prøver rutinemæssigt tyndes for at forberede dem til downstream-analyse5. Det udføres i et scanningelektronmikroskop (SEM), som har to optiske søjler: konventionel scanningelektronmikroskopoptik og en anden kolonne indeholdende optik, der er i stand til at generere og fint styre en fokuseret ionstråle (FIB) - kaldet en FIB-SEM. Dette gør det muligt at ablere et bestemt område af prøven af ioner genereret af en galliumkilde, fjerne overskydende materiale og efterlade en lamel6. Fræseprocessen styres af SEM-billeddannelse af prøvens topografi, som bruges til at lokalisere områder af interesse og overvåge fræsningsfremskridt. Til biologiske applikationer er den grundlæggende opsætning stort set den samme, men fræsning udføres ved kryogene temperaturer. Dette har krævet, at standard FIB-SEM'er er tilpasset til at have kryokølede trin, der opretholder konstante temperaturer og lave overfladekontamineringshastigheder, samt luftsluser for at lette prøveoverførsel uden forvitring eller kontaminering. Prøvetransporter er også blevet modificeret for at gøre det muligt at montere en række forskellige bærere inde i cryoFIB-SEM, herunder TEM-gitre, planchetter og kapillærer. Flere nøglegrupper af forskere har været centrale for udviklingen af disse metoder og de fortsatte teknologiske fremskridt på området 7,8,9,10,11,12. Kommercielle løsninger er nu mere bredt tilgængelige til biologisk FIB-fræsning ved kryogen temperatur, og on-grid fræsning af lameller bliver mere rutine, givet en optimeret prøve.

En række rumtemperatur- og kryoEM-teknikker kan bruges til at visualisere cellulær information på tværs af alle livets skalaer, fra hele flercellede organismer med beskeden opløsning til forståelse af sammenhængen mellem komplekse processer på celleniveau og endnu mere detaljeret til bestemmelse af in situ molekylære strukturer13,14,15,16,17,18,19. Klassiske rumtemperaturteknikker omfatter sektionering af faste og farvede, harpiksindlejrede celler og væv ved ultramikrotomi til analyse af cellulær morfologi ved TEM (for gennemgang se Studer et al., 200820). Der er udviklet alternative teknikker, der udnytter sekundær elektronspredning af SEM til at afbilde overfladen af blokke af bevarede celler, før materiale gradvist fjernes enten med en kniv (seriel blokfladebilleddannelse) eller en fokuseret ionstråle21,22,23. Denne teknik er også blevet implementeret med succes ved kryogene temperaturer (kaldet cryovolumenbilleddannelse) med en cryoFIB-SEM på glasagtige, ufarvede blokke af celler eller væv24. Alternativt kan tykkere lameller (~ 15 μm tykke) fræses og studeres ved STEM-billeddannelse25. Ved hjælp af disse teknikker kan hele blokke, der indeholder mange celler, afbildes for at indsamle befolkningsinformation, eller et helt organ / organisme kan afbildes og rekonstrueres i 3D. For at få adgang til molekylær information med høj opløsning fra celler skal prøver imidlertid bevares i en næsten hjemmehørende, frosset hydratiseret tilstand og skal derfor forberedes under kryogene forhold. Kryo-elektronmikroskopi af glaslegemesektioner (CEMOVIS) er en teknik, hvorved højtryksfrosne blokke af biologisk materiale skæres under kryogene betingelser med et ultramikrotom. Dette producerer bånd af kryo-sektioner (40-100 nm tykke)26, som er knyttet til et EM-gitter og afbildet i TEM. Imidlertid forårsager knivens fysiske interaktion med glaslegemeprøven sprække- og kompressionsartefakter, der alvorligt kan forvrænge cellulær struktur27,28,29,30. Tykkere sektioner er mere tilbøjelige til disse artefakter, hvilket gør det upraktisk at bruge sektioner, der er tykkere end ~ 70 nm26. Denne begrænsning begrænser i høj grad 3D-visningen af den biologiske struktur i tomogrammet. FIB-fræsning ved kryogene temperaturer oplever ikke disse problemer, men har sine egne artefakter forårsaget af differentierede fræsehastigheder på tværs af dele af prøven, hvilket fører til variable tykkelser inden for en lamel - kaldet gardiner. Dette problem afhjælpes ved anvendelse af en organoplatinbelægning, der påføres via et gasindsprøjtningssystem (GIS), som beskytter lamellens forkant under fræsning31. Den øvre grænse for prøvetykkelse for FIB-fræsning på nettet defineres af evnen til at dykke fryse prøven, mens den holdes glasagtig32, selv om FIB-fræsning med indførelsen af cryo-udtagningsteknikker og tilpassede prøvebærere til biologiske prøver også kan anvendes til behandling af højtryksfrosne prøver31,33,34,35. Derudover kan dykfrosne prøver ikke være for tynde, da der skal være nok biologisk materiale til at generere en lamel af rimelig størrelse, der giver nok overfladeareal til at samle vippeserier ved den krævede forstørrelse. Dette problem kan afhjælpes ved at fræse klumper af mindre celler, såsom bakterier eller gær. Endelig lameltykkelse (~ 100-300 nm) dikteres normalt af prøveintegriteten og fræsestrategien. Tyndere lameller er bedre til strukturelt arbejde med høj opløsning, såsom sub-tomogramgennemsnit, men tykkere lameller indeholder meget større cellulære volumener, end CEMOVIS kan opnå, hvilket giver mere cellulær kontekst i en næsten til naturligt bevaret prøve. FIB-fræsning kan også bruges til at tynde dykfrosne proteinkrystaller til elektrondiffraktionsundersøgelser36.

FIB-formaling af glasagtige celler er værd at bruge tid og kræfter på at udføre, hvis det videnskabelige spørgsmål kræver molekylære detaljer med høj opløsning af næsten native prøver in situ. Med adgang til flere faciliteter til rutinemæssig produktion af lameller er det hastighedsbegrænsende trin ofte optimering af prøven inden fræsning, hvor der skal tages tid til at sikre, at prøven er glasagtig og har en passende tykkelse til at producere robuste og ensartet tynde lameller. Beskrevet her er prøveoptimering for FIB-fræsning af dykfrosne humane røde blodlegemer inficeret med Plasmodium falciparum-parasitter , malariaens årsagsmiddel, men denne tilgang kan tilpasses til en given prøve.

Protocol

Humant blod blev opnået fra anonymiserede donorer gennem UK National Blood and Transplant service og bruges inden for 2 uger efter modtagelsen. Der kræves ingen etisk godkendelse til brugen.

1. Forberedelse og nedfrysning af Plasmodium falciparum-inficerede røde blodlegemer

  1. Modne skizonter isoleres ved centrifugering (1.580 x g) over et 70% (v/v) isotonisk densitetsgradientmedium (for standardprocedurer for, hvordan man dyrker aseksuelle blodstadier af 3D7 Plasmodium falciparum i humane erytrocytter, se Blackman, M.J., 1995:37).
  2. Fastgør de lufttørrede tynde blodfilm på et glasglas med 100% methanol for at kontrollere skizonternes morfologiske homogenitet, før de farves med 10% Giemsa-plet i 6,7 mM fosfatbuffer, pH 7,1.
    BEMÆRK: For at berige præparatet til skizonter, der er gået i stå ved bestemte udgangspunkter, kan skizonter synkroniseres yderligere med forbindelse 2- og E64-hæmmere (se repræsentative resultater og figur 1 for en forklaring af virkningen af disse hæmmere).
    FORSIGTIG: Plasmodium falciparum er et humant patogen og må kun håndteres i et egnet indeslutningsanlæg i henhold til lokale sundheds- og sikkerhedsretningslinjer.
  3. Skithajoner centrifugeres forsigtigt (240 x g) for at pelletere dem og resuspenderes i 2x volumen af cellepelleten i RPMI-medier, hvilket resulterer i en 50% hæmatokrit suspension.
  4. På en manuel dykfrysningsrig påføres 2,5 μL skizonts på kulstofsiden af en glødudladet (Brug glødudladningsenhedsindstillinger på 60 s, 30 mA i luft, kun behandling af kulstofsiden af gitteret) 200 mesh kobbergitter med en 2/4 hullet kulstoffilm og blots for ~ 20 s fra bagsiden af gitteret ved hjælp af klasse 1 filterpapir med en revet kant. Dyk ned i flydende nitrogenkølet flydende ethan og overfør gitterene til opbevaring (se materialetabel for udstyr, der anvendes i denne undersøgelse).
    BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause her, og gitre kan opbevares under flydende nitrogen på ubestemt tid.
    FORSIGTIG: Flydende nitrogen er et kvælende middel og forårsager forfrysninger; Håndter forsigtigt i et egnet miljø med iltovervågning.
    FORSIGTIG: Flydende ethan forårsager alvorlige forbrændinger og er brandfarlig; Brug i en damphætte væk fra antændelseskilder.
    BEMÆRK: Dyk frosne schizonts er ikke længere levedygtige. Dette blev bestemt ved at inkubere humant blod med flere guldgitter af luftoptøede dykfrosne skizonter og observere ingen parasitvækst efter flere dage sammenlignet med ikke-frosne kontroller. Frosne riste af skizonter er derfor sikre at håndtere uden for indeslutningsfaciliteter ved hjælp af normale sikkerheds- og dekontamineringsprocedurer (handsker, overflade-/værktøjssterilisering med >70% ethanol og bortskaffelse af riste i >70% ethanol).
  5. Screene gitre ved hjælp af et kryo-trin til et lysmikroskop, idet der lægges særlig vægt på isgradienten over gitteret. I de tyndere isområder skal du kontrollere individuelle gitterfirkanter for celledækning.
    BEMÆRK: De bedste firkanter skal være en celle tyk i midten af gitterkvadratet (figur 2). Dette sikrer, at en lamel kan fræses hen over midten af firkanten uden at ramme den tykkere is i kanterne mod gitterstængerne. Forsøget kan sættes på pause her, og gitre kan opbevares under flydende nitrogen på ubestemt tid. Hvis celler bærer en fluorescerende markør, kan gitre også screenes af cryoCLEM for at lokalisere X/Y-positioner af interesse, som kan korreleres med gitterplaceringer i cryoFIB-SEM til direkte fræsning.

2. On-grid FIB-fræsning af dykfrosne celler

  1. Marker fronten af cryoFIB-specifikke autogridfælge med en sort uudslettelig markeringspen for at angive midten af cutaway-sektionen og den modsatte side af fælgen (figur 3). Opsæt fritlægningsstationen og klipgitre i de markerede ringe med kulstofsiden nedad.
  2. Læg gitre i cryoFIB-SEM-shuttlen (typisk 2 gitre, afhængigt af rumfærgen) kulstofsiden opad og påfør en platinsputterbelægning i argonatmosfære (5 x 10-2 mbar) (5 mA i 60 s - tykkelsen er variabel) eller en kulstof/platin e-stråle roterende belægning (~4 nm tykkelse) på overfladen af cellerne.
    BEMÆRK: Begge typer belægninger hjælper ladningsspredning under SEM-billeddannelse. Fordelen ved e-beam roterende coater er, at den nøjagtige tykkelse af belægningen kan specificeres.
  3. Læg rumfærgen i cryoFIB-SEM, og vurder cellefordelingen på hvert net ved hjælp af SEM ved 5 kV (13 pA eller 25 pA). Tag en oversigt over lav forstørrelse (~100x) for at se på isgradienter på tværs af gitteret. Tag derefter billeder med højere forstørrelse (~5.000x) for at se på individuelle gitterkvadrater og identificere de områder af gitteret, der har synlige cellulære egenskaber og lav overfladeforurening til fræsning.
  4. Påfør en >2 μm organoplatinbelægning på overfladen af hvert gitter ved hjælp af gasindsprøjtningssystemet (GIS). For at gøre dette skal du indsætte GIS-nålen i kammeret over gitteret og opvarme organoplatinkilden til en indstillet temperatur i et bestemt tidsrum (for eksempel ~ 27 ° C i 3-10 s) for at producere en dampstrøm.
    BEMÆRK: Påføringsvinklen, temperaturen og timingen af organoplatinbelægningen via GIS-nålen skal optimeres for at maksimere en jævn belægning. Dette afhænger af den specifikke anvendte cryoFIB-SEM (se Repræsentative resultater for yderligere forklaring).
  5. Vip prøven, så gitterplanet er ~10° fra ionstrålens indfaldsvinkel, og flyt midten af et passende gitterkvadrat, der kan ses på både SEM- og FIB-billederne.
  6. Undersøg gitteret ved hjælp af ionstrålen ved lav strøm (nominelt 1,5 pA, 30 kV) og gå til høj nok forstørrelse (~ 7.000x) til at visualisere cellerne i midten af et gitterkvadrat. Bring prøven i fokus ved den første fræsestrøm (300 pA) og korriger for bygningsfejl. Juster lysstyrken og kontrasten, og markér derefter to rektangulære mønstre til fræsning, et over og et under et 3 μm tykt beskyttet område, hvis centrum er den ønskede placering af den endelige lamell.
    BEMÆRK: Den valgte bredde af mønstrene afhænger af topografien af det omgivende cellelag og cellestørrelsen. 7-20 μm er en passende bredde til schizonts, men bredere lameller tager længere tid at fræse. Den valgte højde af mønstrene til det første fræsetrin afhænger af prøvetykkelsen, der starter omkring 6 μm; Dette skal muligvis justeres under fræsning. Fræsning udføres retningsbestemt fra ydersiden, top- og bundkanterne af mønstrene mod lamellens overflade. Dette kan gøres parallelt, hvor begge mønstre fræses samtidigt eller sekventielt, først fjernes materiale ovenfra lamellen og derefter nedefra.
  7. Start fræsning ved første strøm; overvåge live-fremskridtene i ionstrålevisningen og periodisk med SEM (5 kV, 13 eller 25 pA). Kontroller, at ionstrålen er brudt igennem prøven over og under det beskyttede område. Hvis ikke, skal du øge højden på de rektangulære mønstre for at fjerne mere materiale. Stop, når overfladen over og under lamellen er helt glat i ionstrålevisningen.
    BEMÆRK: Ionstrålen er brudt igennem prøven over og under det beskyttede område, når indersiden af de rektangulære mønstre ikke indeholder nogen funktioner i brændplanet. Nogle funktioner, f.eks. gitterbjælker, kan være synlige ude af fokus i baggrunden.
  8. Skift til den næste fræsestrøm (100 pA); Fokuser og juster lysstyrken/kontrasten. Formindsk afstanden mellem de to rektangulære mønstre til 1,5 μm, og reducer mønsterhøjden til kun at dække det ikke-fræsede materiale. Begynd fræsning ved den nye strøm, indtil overfladen over og under lamellen er helt glat.
  9. Gentag denne proces trinvis, indtil en tykkelse på 0,3 μm er nået, hvilket reducerer ionstrålestrømmen hver gang i henhold til fræseskemaet i tabel 1.
  10. Fræs flere lameller (mængden afhænger af prøvens tykkelse og den tid, der er til rådighed) på et eller begge gitter til en tykkelse på 0,3 μm, registrer X/Y/Z-positionen for hver lamel og reserver ~1-2 timer ved sessionens afslutning for at polere lamellerne til deres endelige tykkelse (60-200 nm).
  11. Tag en SEM-oversigt med lav forstørrelse over hele gitteret, og planlæg en poleringsrute, der starter fra lameller foran på gitteret (tættere på ionstrålekilden) til lameller bag på gitteret (længst væk fra ionstrålekilden) (figur 5).
    BEMÆRK: Dette reducerer gendeponering af ableret materiale tilbage på overfladen af polerede lameller.
  12. Reducer mellemrummet mellem de to rektangulære mønstre til 100-200 nm, og start det endelige poleringstrin ved en ionstrålestrøm på 30 pA. Overvåg fremskridtene med SEM ved 2-3 kV (13 pA, dvæle = 300 n, 3072 x 2048, ~ 2 s for en fuld ramme) og stop poleringen, når kontrasten går tabt i lamellen ved SEM, eller når selve lamellens organoplatinbelægning begynder at miste integriteten.
  13. Før du fjerner gitterene, skal du erhverve et SEM-billede med lav forstørrelse af hele gitteret og gemme billeder af hver lamel. Brug dem til at krydstjekke gitteret senere i TEM. Sæt eksperimentet på pause her og opbevar gitterene med lameller under flydende nitrogen - håndter forsigtigt.
    BEMÆRK: Gitre kan være let sputtercoatede ved fjernelse fra cryoFIB-SEM, hvilket kan hjælpe med at begrænse afdrift og opladning i TEM ved høj forstørrelse, men dette bør gøres forsigtigt, da for meget sputterbelægning kan skjule det biologiske indhold inde i lamellerne. Det er muligt at screene lameller for fluorescens på dette stadium; Imidlertid vil opnåelse af nok signal afhænge af overflod af det mærkede protein inden for lamellens tykkelse. Der skal udvises stor omhu ved håndtering af gitterene for at begrænse skader på lamellerne og forhindre overfladeforurening.

3. Tilt-serie erhvervelse og generelt overblik over databehandling

  1. Indlæs ristene i TEM, og juster fræseretningen vinkelret på trinnets hældningsakse.
    BEMÆRK: Justering af gitterene udføres med øjet ved hjælp af mærkerne på autogrid-fælgen. En ~ 10 ° fejlmargin er acceptabel, ellers kan grøftens vægge på hver side af lamellen skjule lamellen, når gitteret vippes.
  2. Få et kort med lav forstørrelse (~ 150x) over hele gitteret, og find lamellerne; Derefter skal du få et mellemstort kort (~ 1.500x, afhængigt af lamelstørrelse) af hver lamel og finde interesseområderne.
  3. Gitteret vippes med ±10° for at gøre lamellens plan (ikke gitteret) vinkelret på den optiske akse
    BEMÆRK: Forhældningsretningen kan bestemmes af placeringen af lamellernes forkant (idet der ses efter den resterende organiske platinpels) på kortene med lav og medium forstørrelse. For TEM, der anvendes her, kræver gitre en +10° forhældning, hvis lamellernes forkanter peger opad på kortene, og kræver en -10° forhældning, hvis de peger nedad. Hvert gitter kan være forskelligt på grund af, hvordan de blev hentet og indsat i autoloaderen.
  4. Få dosissymmetrisk hældningsserie38 (f.eks. -54° til +54° med en stigning på 3-5°) ved en pixelstørrelse, der tillader både synsfelt og opløsning, der kræves for det relevante område. Brug et interval af defokuseringsværdier mellem -2 og -5 μm. Saml film med 3-10 billeder ved hvert trin, og juster disse parametre afhængigt af pixelstørrelsen for at akkumulere en samlet dosis på ~ 150 e / Å2 (for en 300 kV TEM).
    BEMÆRK: Revner i lamellen bør undgås, da disse områder kan drive. Overfladekontaminering bør også undgås, da det kan skjule interesseområdet eller fokusområdet ved høj hældning.
  5. Bevægelseskorriger filmene ved hjælp af et program som MotionCor239. Anvend et dosisvægtningsfilter på de korrigerede billeder (akkumuleret e-/billede)40 , og estimer defokuseringen af hvert billede ved hjælp af et program som CTFFIND441.
  6. Brug fiducial-less alignment (patch tracking) i et program som på etomo (IMOD)42 til at beregne justeringen og vinkelforholdet mellem billederne i tilt-serien.
  7. Indtast justerings- og rotationsoplysningerne sammen med defokuseringsværdierne i et program, der kan anvende tredimensionel CTF-korrektion, for eksempel NovaCTF43. Beregn et korrigeret tomogram for at få outputtomogrammer med binningfaktorer, der er relevante for downstream-analyse.
  8. Analyser rekonstruktionerne, og forbered dig på eventuel downstream-behandling, f.eks. filtrering, segmentering eller subtomogramgennemsnit.

Representative Results

Forberedelse af P. falciparum schizonts til frysning
Compound 2 og E64 hæmmere anvendes til at standse skizonts på forskellige stadier af udgang, hvilket genererer en beriget population af schizonts til efterfølgende undersøgelse. Dette er vigtigt, fordi uden en komplementær korrelativ teknik er fræsning af specifikke subcellulære mål eller celletyper udfordrende, da processen i det væsentlige er blind. Forbindelse 2 er en proteinkinasehæmmer, der standser udgang før vakuolbrud. Schizonts kan synkroniseres på forbindelse 2 i 4 timer og vaskes derefter med sammensatte 2-frie medier for at fjerne inhibitoren, hvorefter schizonts modnes og går ud efter ca. 30 minutter. Alternativt kan sammensatte 2-synkroniserede skizonter vaskes i E64, en irreversibel bredspektret cysteinproteasehæmmer, og inkuberes i ca. 1 time for at standse udgang efter punktet for vakuolbrud, men før værtscellebrud. Morfologien og homogeniteten af behandlede skizonter bør kontrolleres ved Giemsa-farvede blodudstrygninger inden frysning (figur 1). Schizonts kan springfryses i en af disse stater ved hjælp af metoden beskrevet i denne publikation.

Figure 1
Figur 1: Morfologien af forbindelse 2 og E64-stallede P. falciparum schizonts ved Giemsa-farvede blodudstrygninger. (A) I nærvær af forbindelse 2 er den parasitoforiske vakuol (PV) tæt pakket med merozoitter (lilla cirkler) med en enkelt klynge af hæmozoinkrystaller (mørkebrun cirkel). Grænsen mellem PV og det omgivende hæmoglobin i værtsrøde blodlegemer (hRBC) (gråbånd) er veldefineret, såvel som hRBC-membranen. (B) I nærvær af E64 bristes PV-membranen, og merozoitterne spredes ud i hRBC. Hver schizont indeholder stadig en enkelt klynge af hæmozoinkrystaller. Værtscellemembranen er utæt og delvist kollapset, derfor er der ikke noget hæmoglobin synligt inden for celleperiferien, og grænsen for hRBC-membranen er ikke let synlig. Vægtstang, 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Optimering af dykfrysning
En række gitter med forskellige hulstørrelser blev afprøvet under optimering af blottingbetingelser for P. falciparum-inficerede røde blodlegemer, herunder 2/2, 3/3, 3,5/1 og 5/2 (kvadratisk) huldelt kulstof på guld og kobber 200 maskegitter. 200 mesh kobberfindergitter med 2/4 hullet kulstoffilm giver et passende tykt lag af celler til at fræse lange glasagtige lameller. Større eller mindre huller resulterede generelt i cellelag, der var henholdsvis for tynde eller tykke (figur 2A-C). Med 2/4 hullet kulstof trækkes skizonter gennem de 2 μm huller ved at blotte gitteret bagfra (ikke-kulstofside), hvilket resulterer i, at celler stikker ud over og under kulstoffilmen. Den 4 μm lange kulstofstrækning mellem hullerne resulterer i en stribe kulstof, der løber gennem midten af de fleste af de resulterende lameller, hvilket tilføjer styrke. Finder gitre er bedst egnede til korrelerings- og screeningsformål44, men man skal sørge for, at tallene/bogstaverne i maskedesignet ikke er for store, da dette vil blokere områder til fræsning.

Blottingtiden på et manuelt stempel er ca. 20 sek., men det nøjagtige punkt, hvor man skulle stoppe blotting, blev bedømt med øjet, da væskedråben, der blev trukket ud af gitteret, stoppede med at sprede sig ud på filterpapiret. En revet kant var nødvendig for at bryde dråbens overfladespænding for at starte blottingprocessen. En automatiseret dykfryser blev ikke brugt i denne undersøgelse, men et rimeligt udgangspunkt for denne prøve ville være at bruge den samme mængde celler og gittertype som brugt til et manuelt stempel, og sørg for at blotte gitterene bagfra under forhold med høj luftfugtighed (~ 70%) og omgivelsestemperatur (~ 25 ° C). Blottingtiderne og betingelserne skal optimeres til det bestemte automatiserede system, der anvendes.

Dykfrosne gitter af P. falciparum schizonts blev screenet af et lysmikroskop udstyret med et kryo-trin snarere end af TEM, fordi prøven ikke kunne overføres til elektroner. For tyndere prøver kan gitre screenes af TEM (hele gitteratlas ved ~150x forstørrelse) inden prøveoverførsel til cryoFIB-SEM, hvilket kan være en forudsætning for at få adgang til en national facilitet. Der skal lægges særlig vægt på gradienten af istykkelse over gitteret og også inden for individuelle gitterkvadrater. Gode gitterfirkanter skal være en celle tykke eller ramme kulstoffilmen i midten (figur 2C). På den måde undgår man fræsning i den tykkere is mod gitterstængerne rundt om kanten af gitterkvadratet og sikrer, at ionstrålen bryder igennem over og under cellelaget, hvilket giver en fri lamel i stedet for en kile. Når reproducerbare blotting og dykfrysningsforhold er optimeret, er screening normalt ikke længere nødvendig før FIB-fræsning.

Figure 2
Figur 2. Analyse af cellefordelingen på gitter af dybfrosne P. falciparum schizonts ved kryo-lys mikroskopi. (A) Et eksempel på, at is er for tyk over et gitterkvadrat ved kryo-lysmikroskopi, der skjuler cellerne og kulstoffilmen. Skalabjælke, 10 μm. (B) Et eksempel på, at hulstørrelsen (300 mesh kobbergitter med 5/2 kvadratisk hullet kulstoffilm) er for stor til cellerne, hvilket resulterer i et meget tyndt lag biologisk materiale omgivet af tomme områder uden is. Gitre som dette producerer meget korte, ustabile lameller. Skalastang, 10 μm. (C) Et eksempel på god cellefordeling på et 200-mesh kobbergitter med 2/4 hullet kulstoffilm. Disse skizonter blev behandlet med E64-hæmmer. De store celler (rød boks, ~ 5 μm diameter) med en veldefineret periferi er inficerede røde blodlegemer, der stadig har en intakt vakuolmembran. Klyngerne af små celler (blå boks, ~ 1 μm) er de individuelle merozoitter indeholdt i en delvist kollapset vært røde blodlegemer. Hver schizont har en sort plet i midten, der angiver placeringen af hæmozoinkrystallerne (se figur 1 for yderligere detaljer). Forskellen i cellemorfologi er ikke så let at se en gang inde i cryoFIB-SEM; Derfor er præscreening med kryo-lysmikroskopi gavnlig, indtil reproducerbare blottingbetingelser er nået. Celledækningen omkring kanterne af gitterkvadratet ved siden af gittersøjlerne (hvidstiplede områder) er for tyk til fræsning. Det tyndere område i midten af gitterkvadratet (gul-stiplede område) er et ideelt sted at fræse fra og udvide lamellen ind i det omgivende lag af celler. Skalabjælke, 6 μm. (D) Billede af en kryoFIB-specifik autogridfælg med to sorte mærker, det ene inden for cutaway-sektionen (sort beslag) og det andet modsat, kl. 12 og kl. 6. Den sorte pil repræsenterer fræseretningen. (E) Når gitterene lægges i autoloaderkassetten, skal mærkerne være lige langt fra hver side af læssepincetten, hvilket resulterer i, at lamellerne ligger vinkelret på trinnets hældningsakse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Mærkning af kryoFIB-specifikke autogridfælge til tomografi
Typisk klippes gitter i autogrid-fælge inden fræsning for at lette håndteringen og give stivhed, som beskytter lamellerne mod skader under de efterfølgende overførselstrin. CryoFIB-specifikke autogridfælge er udviklet med en cutaway-funktion, der hjælper med at få adgang til mere af gitterfladen under fræsning. Det er vigtigt at orientere fræseretningen vinkelret på TEM's hældningsakse, således at tiltserieerhvervelsen fortsætter ved at dreje lamellen langs dens længde. Dette sikrer, at de høje vægge i grøften omkring lamellen ikke skjuler den biologiske information, når gitteret vippes.

Autogridfælgen er typisk markeret for at hjælpe med visuel justering inden for cryoFIB-SEM-shuttlen og senere, når TEM læsses. For disse prøver blev der påført to mærker klokken 12 og 6 med en uudslettelig markør (se materialetabel), en inden for midten af klipringens afskårne sektion og den anden direkte modsat (figur 2D). Ved ilægning i TEM (se materialetabellen) skal begge mærker være synlige på hver side af læssepincetten og justeret 90° i forhold til pincettens kant (figur 2E). Det skal bemærkes, at producenten anbefaler at justere gitter ved hjælp af de indgraverede prikker på autogrid-fælgene, da visse blæk i nærheden af ionstrålen kan forstyrre fræsning.

Afklippede gitre kan screenes ved lysmikroskopi med en modificeret kassette til et kryo-trin, hvilket kan være en fordel for at kontrollere, at klippeprocessen ikke har ødelagt gitterets kulstoffilm. Afhængigt af prøvekassetten kan der også fræses uklippede gitre, men der skal udvises stor omhu under overførsel fra cryoFIB-SEM til TEM for at begrænse enhver bøjning af gitteret, da dette vil bryde lamellerne. Uklippede gitre kan indlæses i TEM ved hjælp af kryoholdere med sideindgang, men der er stor chance for, at lamellerne går i stykker, hvis der udføres klipning efter fræsning.

Organoplatinbelægning
Organoplatinbelægning udføres på et eller begge gitter, når de er blevet indlæst i cryoFIB-SEM. Nålen i gasindsprøjtningssystemet (GIS) indsættes i kammeret over prøven for at lede en strøm af organoplatindamp over gitterets overflade fra en opvarmet kilde i et bestemt tidsrum. Dampen kondenserer på kolde overflader og danner et fast lag (~ 2 μm tykt). Integriteten af denne pels er afgørende for, at ensartede tynde lameller kan fræses. De optimale anvendelsesbetingelser for organoplatinbelægningen er normalt forudbestemt af producenten af instrumentet, men en vis optimering kan stadig være påkrævet. De fleste systemer justerer enten GIS-nålen tæt på fræseretningen eller vinkelret på fræseretningen, afhængigt af portenes geometri på kammeret og trinets rotationsgrænser. Forskellige indstillinger kan afprøves ved at belægge gitteret, fræse et lille område, vippe scenen og måle tykkelsen af belægningen med SEM.

Ud over opsætningen af selve cryoFIB-SEM kan en række andre faktorer påvirke anvendelsen af organoplatinbelægningen, herunder 1) prøvens topografi, 2) overfladeforurening på gitteret og 3) reproducerbarheden af dampstrømmen fra GIS-nålen. Da GIS-flowet er retningsbestemt, kan ujævn topografi medføre, at områder i skyggen af celler eller overfladeforurening ikke belægges eller har et tyndere lag. Dette kan føre til sammenbrud af organoplatinlaget under polering (figur 3). Når du vælger et område, der skal fræses, er det nødvendigt at være opmærksom på den omgivende topografi, for eksempel stor overfladeforurening, klumper af celler eller brudt kulstof, der rager ud fra gitterets overflade så langt som et par gitterfirkanter væk, kan blokere dampstrømmen og skabe en skygge af tyndere organoplatin, der kan svække en lamell. Derudover bør meget små partikler af overfladeforurening nær lamellens forkant også undgås, da de kan poppe af under fræsning og efterlade en svækket plet af bar is, der kan resultere i, at der opstår et hul i lamellen under polering. Endelig, hvis fræsningen er startet, og organoplatinbelægningen ser ustabil ud, skal du belægge igen i længere tid eller skifte til et backupgitter.

Figure 3
Figur 3: En organoplatinbelægning af god kvalitet er afgørende for at opnå tynde, jævnt malede lameller. (A) En mikrografi af forkanten af en lamel, hvor organoplatinbelægningen (OP, gul) er blevet påført for tyndt, hvilket fører til et hul i lamellens forkant, der udviklede sig under polering (grøn cirkel) og ujævn fræsning over hele lamellens bredde (striber). Den organoplatinske overflade er blevet skåret af ionstrålen, hvilket fører til en spray af materiale bag belægningens forkant (gul-stiplede linje). (B) Organoplatinbelægningen (OP) er blevet påført tykkere, hvilket resulterer i en mere jævnt fortyndet lamel. Pelsens integritet bevares i hele lamellens bredde, og grænsefladen mellem organoplatinpelsen og det forglasede biologiske materiale er veldefineret (gulstiplede linje). Kulstoflaget kan ses løbe gennem bagsiden af lamellen (orange). Vægtstænger, 1 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Vurdering af netkvalitet i cryoFIB-SEM og fræsningsprocessen
Når gitre er overført til cryoFIB-SEM, kan kulstoffilmens integritet og fordelingen af cellerne på nettene screenes af SEM (figur 4A-C). Isgradienter, gitterstængernes positioner og placeringen af gitternumre på findergitter kan kontrolleres ved SEM med lav forstørrelse ved 30 kV (figur 4B), men spændingen skal reduceres tilbage til 5 kV, mens fræsepositioner lokaliseres ved høj forstørrelse og overvågning af fræseprocessen for at øge kontrasten fra overfladetopografien.

Figure 4
Figur 4: Vurdering af netkvalitet og lokalisering af områder, hvor der skal fræses i cryoFIB-SEM . (A) En oversigt over lav forstørrelse af et net ved 5 kV via SEM. Den afskårne del af autogrid-fælgen er synlig nederst i billedet. Skalabjælke, 0,5 mm. (B) Det samme gitter ved 30 kV ved SEM, der viser områder med tykkere is (mørkere gitterfirkanter) og tyndere is (lysere gitterfirkanter). Indsatsen viser området i boksen med pile, der angiver nummereringen på findergitteret, som er synligt ved 30 kV. Skalabjælke, 0,5 mm. (C) En mellemstor oversigt over to gitterkvadrater, der vurderer fordelingen af cellerne på kulstoffilmen og placeringen af gitterstængerne. Skalastang, 50 μm. (D) Arrangementet af fræsemønstre til det første snit ved høj forstørrelse (ionstrålebillede ved 1,5 pA og 30 kV). Det røde område (3 μm tykt) er beskyttet, mens de gule områder vil blive ableret af ionstrålen. Den hvidstiplede linje angiver placeringen af den endelige lamell. Skalabjælke, 10 μm. (E) En høj forstørrelsesvisning ved 3 kV via SEM af en poleret 200 nm tyk lamel (10 μm bred x 15 μm lang). Tabet af kontrast i lamellen ved 3 kV indikerer, at der er opnået en passende tykkelse. Den lyse hvide forkant er det resterende organoplatinlag, der påføres gitteret via GIS inden fræsning. Skalastang, 5 μm. (F) Den samme lamel fra (E) set med ionstrålen ved 30 kV og 1,5 pA. Den tynde hvide linje over den sorte firkant (hvid pil) er den resterende organoplatinfrakke på selve forkanten af lamellen. Vægtstang, 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Et område, der skal fræses, vælges ved at lægge et par rektangulære mønstre på hver side af et beskyttet område ved høj forstørrelse (~ 7.000x for skizonter) i ionstrålevisningen (figur 4D). Det er afgørende, at der ikke fastgøres overfladepartikler i nærheden af fræseområdet, da disse kan have sløret påføringen af den beskyttende organoplatinbelægning. Det er også vigtigt, at regionens topografi er egnet til at understøtte lamellens sider, når dens endelige tykkelse er opnået.

For malariale schizonts (cellestørrelse: ~ 5 μm diameter x 2 μm tyk, skiveform) kan lameller mellem 7-20 μm brede fræses. Hvis cellelaget er passende tykt, vil lamellerne normalt ende ~ 10-15 μm i længden og fange flere celler over og under kulstoflaget (figur 4E-F). Det kan forventes at fræse 5-10 lameller i en 8 timers session (6-7 timers fræsning og 1-2 timers polering). Dette vil variere afhængigt af prøvens tykkelse og lamellernes bredde, hvor tykkere prøver og bredere lameller tager længere tid at formale. Selv beskadigede gitter kan fræses, da det kun kræver en håndfuld gode gitterfirkanter at generere et sæt lameller (figur 5A). Hvis prøven desuden er tyndere end forventet, f.eks. på grund af overblotting eller variation i kulturens hæmatokrit, kan kortere lameller formales relativt hurtigt; Deres kortere længde vil imidlertid begrænse det areal, der er til rådighed for dataindsamling i TEM (figur 5B).

Figure 5
Figur 5: Bestemmelse af, hvornår den endelige lameltykkelse er nået under fræsningen. (A) Oversigt over lav forstørrelse af et gitter ved SEM ved 5 kV, der viser kulstofskader under klipning. De ubeskadigede områder indeholdt meget tynd prøve på grund af over-blotting; Det var dog stadig muligt at fræse seks lameller på dette gitter (regionen inden for den hvide stiplede kontur) i en hel dags session på cryoFIBSEM. Skalastang, 0,5 mm. (B) En kort lamel (~10 μm bred x 3 μm lang, ikke inklusive organoplatinlag) fremstillet af dette gitter (SEM ved 3 kV), som stadig gav to regioner til indsamling af vippeserier. Skalabjælke, 25 μm. (C) En række SEM-billeder (3 kV) af en lamel under det sidste poleringstrin, der viser, hvordan kontrasten går tabt i lamellen, når den tyndes (bevæger sig fra venstre mod højre). Den mørkesorte linje over midten af lamellen i alle billeder er en stribe kulstoffilm fra gitteret. Celler foran denne region blev forglasset over kulstoffilmen, og celler bag denne region blev forglasset under kulstoffilmen. Fræsningen blev stoppet, da organoplatinbelægningen på venstre side af lamellens forkant var tæt på at miste strukturel integritet. Dette stoppunkt var før hele lamellen blev bragt til en jævn tykkelse, hvorfor der stadig er noget højere kontrastmateriale bag på lamellen. D) Et eksempel på en poleringsvej baseret på lamellerne fræset på gitteret vist i punkt A. En poleringsrute bør starte ved lameller nærmere FIB-kilden og bevæge sig væk fra FIB-kilden for at begrænse omlejring af fræset materiale på lamellernes overflade. Klik her for at se en større version af denne figur.

Under polering afhænger den endelige tykkelse af en lamel af strukturen af prøven i det område, der formales, organoplatinlagets integritet og den tilgængelige tid. Ideelt set bør prøven tyndes, indtil kontrasten går tabt over hele lamellens overflade ved SEM ved 3 kV, hvilket tyder på, at den er jævnt elektrongennemsigtig og omkring 150-200 nm tyk (figur 5C). Det kan dog være nødvendigt at stoppe fræsningen før dette punkt, hvis organoplatinlaget udvikler et hul, eller lamellen begynder at bøje. I dette tilfælde kan lamellen stadig være tynd nok foran og forblive nyttig til tomografi. Omvendt er det muligt at tynde forbi tabet af kontrasttrin, hvis lamellen ser stabil ud, hvilket gør den endnu tyndere ved at flytte fræsemønstrene tættere på hinanden (~ 100 nm eller mindre). Dette afhænger af hvilken tykkelse, hvis det kræves til downstream-arbejdsgangen. Et SEM-billede med lav forstørrelse er påkrævet for at planlægge en poleringsrute, der starter tættere på ionstrålekilden og arbejder væk (figur 5D). Poleringsretningen er vigtig for at forhindre omlejring af ableret materiale på lameller, der allerede er færdige.

Indsamling og behandling af tilt-series-data
Når den er indlæst i TEM, vil en montage med lav forstørrelse i fuldt gitter (~150x) identificere lamellernes positioner, som kan korreleres med SEM-billedet med lav forstørrelse, der er taget i slutningen af fræsningen. For springfrosne schizonts er det meste af gitteret ikke gennemsigtigt for elektroner, så lamelpositionerne vises som hvide hak på en sort baggrund (figur 6A). Lamellernes vinkel i forhold til mikroskopets hældningsakse skal bemærkes, da mere end ~ 10 ° væk fra vinkelret kan gøre tilt-serie erhvervelse vanskelig. En mellemstor montage (~1.500x) på stedet for hver lamel vil give et overblik over det biologiske indhold og kontrollere for overførselsskader, krystallinsk is eller overdreven overfladeforurening (figur 6B-D). Dette bør også kontrolleres ved høj hældning for at sikre, at ingen overfladeforurening skjuler erhvervelsen eller fokusområdet. Valg af en erhvervelsesregion afhænger ikke kun af de biologiske egenskaber, men også isens strukturelle integritet i det omkringliggende område, for eksempel at undgå revner, da disse regioner vil drive eller områder med overdreven gardinering, hvor en lamel vil have variabel tykkelse. Før der erhverves en vippeserie, påføres en ±10° forhældning på gitteret for at gøre lamellernes plan (ikke gitteret) vinkelret på den optiske akse. Forhældningens retning kan bestemmes af placeringen af lamellernes forkant (på udkig efter den resterende organiske platinfrakke) i montagen med mellemforstørrelse. For TEM, der anvendes her (300 kV Titan Krios), hvis lamellernes forkanter pegede op på kortet, krævede dette en +10° forhældning, og hvis de pegede nedad, krævede dette en -10° forhældning. Hvert gitter kan være forskelligt på grund af den retning, hvori de blev hentet i pincetten og indsat i autoloaderen (cutaway sektion vender mod venstre eller højre, giver en 180 ° rotation). En sidste overvejelse er pixelstørrelse. Rutinemæssigt indsamles tilt-serier omkring 2,5-7 Å / pixel under hensyntagen til størrelsen af den pågældende funktion, målopløsningen af de resulterende tomografiske data og lamellens overfladeareal, hvilket kan begrænse størrelsen af erhvervelsesområdet. Det er muligt at bruge en mindre pixelstørrelse til at få information i høj opløsning, og den mindste, vi har brugt med succes på disse prøver, er 1,4 Å / pixel (data vises ikke). Drift vil være mere tydelig ved en mindre pixelstørrelse og er kun rigtig velegnet til tynde (<100 nm) lameller, hvor maksimering af opløsning er af betydning i undersøgelsen.

Figure 6
Figur 6: Valg af tilgængelige områder af interesse, hvorfra man kan erhverve hældningsserier (A) Et afsnit af et TEM-kort med lav forstørrelse, der viser et område, der indeholder lameller, der vises som seks hvide hak på en sort baggrund (røde pile). De hvide firkanter er brudt kulstoffilm. (B) Et mellemstort kort over en beskadiget og afviget lamell. Ved forkanten af lamellen (FE) er organoplatinpelsen knækket af (1). Der er en klar plet af krystallinsk is i midten af lamellen (2). Ionstrålen har ikke kunnet bryde igennem ved bagkanten af lamellen (BE), fordi isen er for tyk ved siden af gitterstængerne. Kun en lille del af lamellen er fri for den omgivende is ved BE (3), hvilket skaber en kile. Tykkelsen har også medført, at hylder er skåret over lamellen (4), hvilket sandsynligvis vil blokere udsynet til cellerne ved høj hældning i TEM. C) Montage med mellemstor størrelse af en hel lamel set i TEM. Typiske problemer eller områder, der skal undgås ved indsamling af vippeserier fra lameller, er områder: dækket af overfladekontaminering (SC), dækket af organoplatinbelægningen (OP, gul), nær revner (CR og sorte pile), med gardiner på grund af densitetsændringer i biologisk materiale (CU og region inden for blå parenteser) og områder svækket af brud i organoplatinpelsen (grøn cirkel). De eneste områder, der er tilgængelige for erhvervelse af vippeserier, er områderne inden for de to sortstiplede bokse (mærket 1 og 2). Visningen skal kontrolleres ved høj hældning for at sikre, at overfladeforurening ikke skjuler interesseområdet eller fokusområdet. (D) En mellemstor montage af en meget renere lamel, men som stadig har revner (CR) forårsaget af udtynding af organoplatinbelægningen (grøn cirkel) under polering. Her fremhæves interesseområdet af celletypen observeret inden for lamellen, som i dette tilfælde er de enkelte merozoitter, placeret bag kulstoflaget (orange) mod bagsiden af lamellen (sort-stiplede boks). Vægtstænger, 3 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Indhentning af kryo-ET-data fra FIB-fræset lameller. (A) En mikrografi af et område af en lamel indeholdende en rød blodlegeme, der for nylig er blevet invaderet af en P. falciparum merozoite. I (B) er det samme billede kommenteret for at vise grænsen for de røde blodlegemer (rød), et antal dobbeltvæggede intracellulære vesikler (lilla og blå for henholdsvis de indre og ydre membraner) og merozoitten (grøn) omgivet af en anden membran afledt af værtscellen (gul). En sort boks viser det område, hvor en vippeserie blev erhvervet. Skalastang, 500 nm. (C) Et gennemsnit på 20 centrale skiver set i XY-planet fra et 8x binned tomogram (2,4 Å / pixel) erhvervet i den apikale ende af merozoitten og i (D) dens annotation, der viser de to membraner, der omgiver cellen (grøn og gul) og fire membraner stablet i toppen af merozoitten (blå), der er forbundet med en elektrontæt svampeformet funktion (lilla). En rød pil angiver krydset mellem membranstablerne i toppen og den svampeformede funktion (også vist i del F, i). En sort pil indikerer en fusionsbegivenhed mellem merozoitplasmamembranen og en af de flerlagede vesikler i parasitten (også vist i del F, ii). Værtens røde blodcellemembran vises (rød), og en sort-stiplede linje viser placeringen af et tværsnit set i XZ-planet, vist i (E). Funktionerne i tværsnittet (E) er farvet og mærket det samme som i del (D), med farvede pile, der peger på membranerne. En sort pil angiver placeringen af en sputtercoat, der påføres lamellen efter fræsning, og tykkelsen af lamellen i angivet. For dele (C-E), skalastang, 500 nm. (F) En mere detaljeret visning af de træk, der er angivet med de røde og sorte pilespidser i del (C), der viser definitionen i lipid-dobbeltlagene af membranstakken i toppen af merozoitten (i) og fusionsbegivenheden mellem flerlagsvesiklen med merozoitplasmamembranen. Skalastang, 75 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Arbejdets primære fokus er at dissekere vejen for merozoitudgang i P. falciparum Men da populationen af celler, der blev anvendt i undersøgelsen, aldrig kan være fuldt homogen, blev der ofte observeret andre stadier af celleudvikling inden for lamellerne. Eksemplet vist her (Figur 7) indeholder en rød blodlegeme, der for nylig er blevet invaderet af en P. falciparum parasit (merozoit). Den anvendte lamel var 240 nm tyk, og gitteret var blevet let sputter belagt med platin i en argonatmosfære før indsættelse i TEM, hvilket resulterede i lidt mindre kontrast end normalt forventet. Den røde blodcellemembran kunne spores i sin helhed omkring cellen. Inden i de røde blodlegemer var tre lukkede membranbundne strukturer, to vesikler, hver omgivet af en dobbelt membran og et lyspæreformet træk (1,2 μm x 0,9 μm på sine bredeste dele), hvilket er i overensstemmelse med, at det er en merozoit (Figur 7A-B). Indholdet af de to vesikler syntes at være ens i modsætning til indholdet af de røde blodlegemer, hvilket tyder på, at disse vesikler kan indeholde hæmoglobin. Tilstedeværelsen af vesikler i værtsrøde blodlegemer efter invasion er tidligere observeret45. De menes at stamme fra udskillelsen af lipider og andre virulensfaktorer fra sekretoriske organeller kaldet rhoptries i merozoitten, som udledes i værtsrødlegemet under invasionen. Merozoitten er omgivet af to nært forbundne membraner, hvoraf den inderste formodentlig er merozoittens oprindelige plasmamembran, hvor der ikke er nogen synlig overfladebelægning, og den yderste skal stamme fra værtsmembranen for røde blodlegemer, der omslutter merozoitten, når den invaderer. Merozoittens cytoplasma indeholder mange flerlags vesikler og en elektrontæt svampeformet funktion ved siden af en stak membraner ved toppen. En vippeserie erhvervet over dette område (2,4 Å/pixel) viser, at den indeholder en stak af fire membraner, som ser ud til at være forbundet med det svampeformede træk (Figur 7C-E). Påfaldende nok er denne morfologi helt anderledes end det normale arrangement af organeller og cellulære strukturer i den apikale ende af en moden merozoit. For at vurdere dette blev der opnået en sammenlignende hældningsserie (2,74 Å/pixel) over den apikale ende på en moden merozoit fra en skizont, der var blevet behandlet med E64 før nedfrysning og fræsning (Figur 8). Dette viser, at den apikale ende af en merozoit indeholder to fremtrædende klubformede sekretoriske organeller kaldet rhoptries beliggende inden for et sæt af tre polære ringe ved den apikale spids af cellen og omgivet af et antal mindre sekretoriske organeller kaldet mikronemer. Den inderste polære ring er fastgjort til en dobbelt membranstruktur, der ligger til grund for merozoitplasmamembranen, kaldet det indre membrankompleks, som indeholder motorproteiner, der driver invasion. Det har vist sig, at indholdet af sekretoriske organeller under invasionen udledes på merozoitoverfladen og ind i værtsrøde blodlegemer, hvilket letter fastgørelse af merozoitter til at være vært for røde blodlegemer og initierer det motoriske kompleks, der driver invasion45. Dataene her viser, at merozoitten efter invasion ikke indeholder observerbare strukturer, der ligner roptrier, mikronemer eller polære ringe, hvilket tyder på, at morfologien af den apikale ende af merozoitten dramatisk ændres. Fusion af rhoptries før invasion er tidligere blevet vist af TEM af faste, stuetemperatur sektioner46, hvilket er i overensstemmelse med produktionen af den svampeformede funktion, vi observerer i vores merozoit efter invasionen. Stablerne af membraner, der er forbundet med denne funktion, er ikke blevet observeret tidligere, og da der ikke er nogen indikation af en IMC til stede i den nyligt invaderede merozoit, antager vi, at membranstablerne kan være resterne af IMC-maskineriet, der er tilbage efter invasionen er afsluttet, men dette er stadig ikke bekræftet.

Figure 8
Figur 8: Den apikale ende af modne merozoitter ved kryo-ET af en FIB-fræset lamel og TEM af plastprofiler. (A) Et gennemsnit på 20 centrale skiver fra et 8x binned tomogram (2,74 Å/pixel) fra en 230 nm tyk lamel, der viser den typiske morfologi for den apikale ende af en moden merozoit. Schizonterne blev behandlet med E64 inden frysning, således at PV-membranen er bristet, og merozoitterne er indeholdt i værtsrødlegemet. (B) viser det samme som i (A), men med anmærkninger for at angive værtsmembranen for røde blodlegemer (RCM, rød), merozoitplasmamembranen (grøn), det indre membrankompleks (IMC, lilla), polære ringe (PR, sort), mikronemer (M, gul), rhoptries (R, grå) og den nukleare kappe (NE, blå). En nærliggende merozoit, som er ude af plan i denne region af tomogram, er angivet med en grøn trekant. Skalabjælke, 200 nm. (C) De cellulære egenskaber, der observeres af cryoET, er i overensstemmelse med dem fra TEM af skizonter konserveret i plastiske sektioner. Lignende cellulære egenskaber er indikeret i en moden merozoit fra en skizont, der er blevet behandlet med forbindelse 2, standsning af udgang før PV-membranbrud. Skalastang, 500 nm. (D) Et kommenteret skema over en merozoit, der viser de cellulære egenskaber i dele (A-C). Klik her for at se en større version af denne figur.

Tykkelsen af det beskyttede område mellem de rektangulære fræsemønstre (μm) nomisk ionstrålestrøm (pA) ved 30 kV
3 300
1.5 100
0.75 50
0.3 30
0,2 - 0,06 (endelig polering) 30*

Tabel 1: Fræsningsstrategi til fremstilling af tynde lameller. Trinvis fræsning udføres ved at reducere ionstrålestrømmen svarende til tykkelsen af det beskyttede område. Dette begrænser prøveopvarmningen og forhindrer forvitrificering. *Polering skal udføres parallelt for jævnt at påføre lamellerne varme fra begge sider, hvilket reducerer risikoen for, at de bøjer eller bukker, når de når deres endelige tykkelse. Andre trin kan udføres sekventielt, fræsning af mønsteret over lamellen og derefter under lamellen, inden du flytter til næste strålestrøm. Opmåling af nettet for at lokalisere fræsepositioner skal udføres ved 1,5 pA strålestrøm for at minimere prøveopvarmning. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Mens kryoFIB-fræsning bliver mere rutinemæssig, har forberedelse af optimale prøver til fræsning ikke; derfor forekommer de fleste af de kritiske trin i denne protokol, før prøven når cryoFIB-SEM. Prøveoptimering ved flere runder af celleforberedelse, dykfrysning og screening ved lys- og elektronmikroskopi er påkrævet for at producere den bedst mulige prøve, før fræsning forsøges. At have den bedst mulige prøve øger ikke kun chancerne for succes, men optimerer også brugen af udstyret. Af denne grund kræver de fleste nationale faciliteter bevis for, at der er udført tilstrækkelig optimering, før de giver tid på deres maskiner. Når du er inde i cryoFIB-SEM, er det afgørende at maksimere effektiviteten af organoplatinbelægningen for at producere ensartet tynde lameller. Endelig er tålmodighed og god prøvehåndtering en forudsætning for brugeren, som skal sidde i flere dage og producere og derefter overføre gitre indeholdende sarte lameller. Dette kan ændre sig med introduktionen af automatiserede fræsestrategier47,48, men endnu er hele fræseprocessen stadig stort set manuel på de fleste faciliteter.

Mens arbejdet udelukkende fokuserede på P. falciparum schizonts, kunne metoden, der præsenteres her, let ændres for at optimere gitterforberedelse og fræsning til andre celletyper. Vigtige faktorer, der skal overvejes, er tætheden af de celler, der påføres gitteret, gittertypen (kobber er giftigt for nogle celler), størrelsen og afstanden mellem huller i kulstoffilmen, blottingtiden og metoden til blotting (enkelt / dobbeltsidet, manuel eller automatiseret). Derudover, hvis cellerne dyrkes på gitterene (normalt guldgitter med en hullet kulstoffilm), kan sammenløbet kontrolleres ved lysmikroskopi, før de blottes og fryses. Fræsestrategien afhænger af, hvordan cellerne deponeres på nettet. For malariainficerede røde blodlegemer er gitteret i det væsentlige belagt med et ubrudt lag af celler, tykkere i nogle områder og tyndere i andre områder. Fræsning udføres på flere punkter i et område langs denne gradient, hvor istykkelsen genererer lameller, der er en passende størrelse til tomografi. Denne fremgangsmåde fungerer godt for mindre celler, da du kan producere lameller, der indeholder en skive gennem flere celler. For større celler eller klumper af celler kan det være tilfældet, at en celle eller celleklump kan producere en lameller.

Nethåndtering og prøveoverførsel er fortsat en af de største udfordringer i denne arbejdsgang. Lameller kan gå tabt på grund af brud eller revner, gardinartefakter, der skjuler biologien, overdreven overfladeforurening samt netorienteringsproblemer inden for TEM, hvilket kræver et ekstra håndteringstrin for at omplacere gitteret. Graden af tab varierer fra dag til dag og grid-to-grid, men det forbedres gennem praksis og håndteringserfaring over tid. I denne undersøgelse blev det konstateret, at gitterene omhyggeligt kan omorienteres i autoloaderen flere gange uden at ødelægge lameller, og dette har undertiden fordelen ved at vaske overfladeis af. En anden hovedbegrænsning ved denne arbejdsgang er den tid, det tager at producere lameller. Da produktionen er langsom, er det afgørende at have en korrekt optimeret prøve, hvilket gør fræsningen så effektiv som muligt.

Der er for nylig indført en række tilpasninger til FIB-formaling af glasagtige biologiske prøver. En game-changer er implementeringen af kryogenkølede løfteværktøjer i cryoFIB-SEM-kammeret, der gør det muligt at fræse større blokke af materiale fra højtryksfrosne prøver. Blokkene kan fastgøres til en metalstang eller samles op i en griber og flyttes til en anden prøveposition, der indeholder et specielt modificeret EM-gitter. Blokkene kan derefter overtrækkes med organoplatinum og fræses for at generere lameller. Evnen til at fræse lameller fra højtryksfrosset materiale betyder, at meget større celler og væv kan behandles, specifikt målrettet områder ved korrelativ fluorescensmikroskopi12. Andre nylige tilpasninger af FIB-fræsningsmetoden omfatter reduktion af gardinartefakter ved kileforfræsning af prøven16, mikrofluidisk kryofiksering49 og fotomikromønster af elektronmikroskopigitter for at forbedre cellefordeling50. Det er også blevet påvist, at fræsning af mikroekspansionshuller på hver side af en lamel kan lindre kompression af den omgivende prøve, når den når sin endelige tyndhed51. Dette kan især være nyttigt ved fræsning af kontinuerlige cellelag, såsom prøven i denne undersøgelse, hvor bøjning af lameller undertiden ses under det sidste poleringstrin.

Fremtiden for elektronmikroskopi vil sandsynligvis være bestemmelse af in situ molekylære strukturer ved sub-tomogram gennemsnit, og FIB-fræsning er et vigtigt værktøj, der vil lette produktionen af glasagtige biologiske prøver til denne type arbejdsgange. Mens FIB-fræsning stadig er i sin barndom for biologiske anvendelser, sker metodeudviklingen i et hurtigt tempo takket være hårdt arbejde fra forskere, både akademiske og nationale faciliteter, plus kommercielle investeringer i udvikling af kryoFIB-SEM-teknologi til støtte for forskning.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev finansieret helt eller delvist af Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Med henblik på fri adgang har forfatteren anvendt en CC BY offentlig ophavsretslicens på enhver forfatteraccepteret manuskriptversion, der opstår som følge af denne indsendelse.

Dette projekt, som denne metode blev udviklet til, blev finansieret af et Medical Research Council-tilskud MR / P010288 / 1 tildelt Helen R. Saibil, Roland A. Fleck og Michael J. Blackman. Kulturer af P. falciparum blev dyrket på The Francis Crick Institute med støtte fra medlemmer af Michael J. Blackmans gruppe. Forfatterne vil gerne takke Dr. Ser Ying (Michele) Tan for at give billederne af forbindelse 2 og E64-behandlede skizonts i tynde blodudstrygninger. De fleste lameller blev produceret med støtte fra personale på eBIC, og vi er taknemmelige for adgang til Scios dual-beam cryoFIB-SEM på forskningsforslag NT21004. Forfatterne anerkender også støtten fra Royal Society Industry Fellowship-ordningen (INF\R2\202061) til at fortsætte udviklingen af FIB-fræseteknikken inden for CUI. Forfatterne vil også gerne takke Helen R. Saibil for nyttige diskussioner i forhold til dette metodepapir og tilsyn med projektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
c-clips Thermo Fisher Scientific 1036171
Clipping station Thermo Fisher Scientific n/a Direct quote from Thermo
Clipping station Sub-angstrom CSA-01
Compound 2 n/a n/a Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc
Cryo-FIB specific autogrid rims Thermo Fisher Scientific 1205101
E64 Sigma E3132
Emitech K100X glow discharge unit Quorum n/a
Gibco RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 12633012 Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements
Giemsa Stain VWR International 350864X
Glass slides Thermo Fisher Scientific 11562203
Grid boxes Sub-angstrom PB For clipped grids
Grid boxes Thermo Fisher Scientific n/a For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific
Grid boxes Agar Scientific AGG3727
Home-made manual plunge freezing rig n/a n/a With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.
Human blood n/a n/a UK National Blood and Transplant service
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system JEOL n/a FIB-SEM
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage Leica n/a sputter coater
Leica EM ACE900 Leica n/a e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.
Linkam cryo-stage for light microscope Linkam Model No. CMS196 Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.
Methanol Sigma 179957
Nikon Eclipse E200 light microscope Nikon n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.
Percoll VWR International 17-0891-01 Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids Quantifoil N1-C17nCuH2-01 100 pack
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids Quantifoil N1-C17nCu20-01 100 pack
Quorum PP3010 prep-chamber Quorum n/a sputter coater
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage. FEI n/a FIB-SEM
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen Viking Direct ND538522
TFS Titan Krios 300 kV TEM Thermo Fisher Scientific n/a TEM equipped with a K2 or K3 camera.
Whatmann grade 1 filter paper Sigma WHA1001150
Zeiss Axio Scope A1 light microscope Zeiss n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumeister, W. From proteomic inventory to architecture. FEBS Letters. 579 (4), 933-937 (2005).
  2. Rigort, A., Villa, E., Bäuerlein, F. J. B., Engel, B. D., Plitzko, J. M. Integrative approaches for cellular cryo-electron tomography: Correlative imaging and focused ion beam micromachining. Methods in Cell Biology. 111, 259-281 (2012).
  3. Oikonomou, C. M., Chang, Y. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14, 205-220 (2016).
  4. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  5. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
  6. Narayan, K., Subramaniam, S. Focused ion beams in biology. Nature Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).
  7. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  8. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  9. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: Focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (5), 771-777 (2013).
  10. Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180 (2), 318-326 (2015).
  11. de Winter, D. A. M., et al. In-situ integrity control of frozen-hydrated, vitreous lamellas prepared by the cryo-focused ion beam-scanning electron microscope. Journal of Structural Biology. 183 (1), 11-18 (2013).
  12. Schaffer, M., et al. A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue. Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).
  13. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  14. Albert, S., et al. Proteasomes tether to two distinct sites at the nuclear pore complex. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 114 (52), 13726-13731 (2017).
  15. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705 (2018).
  16. Schaffer, M., et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).
  17. Szwedziak, P., Wang, Q., Bharat, T. A. M., Tsim, M., Löwe, J. Architecture of the ring formed by the tubulin homologue FtsZ in bacterial cell division. eLife. 3, 04601 (2014).
  18. Carlson, L. A., et al. Cryo electron tomography of native HIV-1 budding sites. PLOS Pathogens. 6 (11), 1001173 (2010).
  19. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nature Communications. 11 (1), 5885 (2020).
  20. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  21. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  22. Murphy, G. E., et al. Correlative 3D imaging of whole mammalian cells with light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 176 (3), 268-278 (2012).
  23. Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2012).
  24. Spehner, D., et al. Cryo-FIB-SEM as a promising tool for localizing proteins in 3D. Journal of Structural Biology. 211 (1), 107528 (2020).
  25. Kamino, T., Yaguchi, T., Ohnishi, T., Ishitani, T., Osumi, M. Application of a FIB-STEM system for 3D observation of a resin-embedded yeast cell. Journal of Electron Microscopy. 53 (5), Tokyo. 563-566 (2004).
  26. Han, H., Zuber, B., Dubochet, J. Compression and crevasses in vitreous sections under different cutting conditions. Journal of Microscopy. 230, Pt 2 167-171 (2008).
  27. Matias, V. R. F., Al-amoudi, A., Dubochet, J., Beveridge, T. J. Cryo-transmission electron microscopy of frozen-hydrated sections of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (20), 6112-6118 (2003).
  28. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150 (1), 109-121 (2005).
  29. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. The EMBO Journal. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  30. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: A new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1-2), 43-51 (2006).
  31. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 172 (2), 180-190 (2010).
  32. Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. -J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryoelectron microscopy of vitrified specimens. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer. Berlin Heidelberg. 114-131 (1987).
  33. Hsieh, C., Schmelzer, T., Kishchenko, G., Wagenknecht, T., Marko, M. Practical workflow for cryo focused-ion-beam milling of tissues and cells for cryo-TEM tomography. Journal of Structural Biology. 185 (1), 32-41 (2014).
  34. Harapin, J., et al. Structural analysis of multicellular organisms with cryo-electron tomography. Nature Methods. 12 (7), 634-636 (2015).
  35. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 180 (3), 572-576 (2012).
  36. Duyvesteyn, H. M. E., et al. Machining protein microcrystals for structure determination by electron diffraction. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 115 (38), 9569-9573 (2018).
  37. Blackman, M. J. Purification of Plasmodium falciparum merozoites for analysis of the processing of merozoite surface protein-1. Microbes as Tools for Cell Biology. 45, Academic Press. London, UK. 213-220 (1995).
  38. Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2 - anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  41. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  42. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  43. Turoňová, B., Schur, F. K. M., Wan, W., Briggs, J. A. G. Efficient 3D-CTF correction for cryo-electron tomography using NovaCTF improves subtomogram averaging resolution to 3.4 Å. Journal of Structural Biology. 199 (3), 187-195 (2017).
  44. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3d correlative microscopy. Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).
  45. Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host & Microbe. 9 (1), 9-20 (2011).
  46. Hanssen, E., et al. Electron tomography of Plasmodium falciparum merozoites reveals core cellular events that underpin erythrocyte invasion. Cellular Microbiology. 15 (9), 1457-1472 (2013).
  47. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  48. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife. 9, 52286 (2020).
  49. Fuest, M., et al. In situ microfluidic cryofixation for cryo focused ion beam milling and cryo electron tomography. Scientific Reports. 9 (1), 19133 (2019).
  50. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  51. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208 (3), 107389 (2019).

Tags

Tilbagetrækning udgave 174 FIB-fræsning cryoFIB-SEM lameller tomografi cryoET cryoEM Plasmodium falciparum

Erratum

Formal Correction: Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography
Posted by JoVE Editors on 09/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. The Authors section was updated from:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

to:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
M. Alejandra Carbajal1
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

Forberedelse af lameller fra glasagtige biologiske prøver ved hjælp af et dobbeltstrålescanningselektronmikroskop til kryo-elektrontomografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bisson, C., Hecksel, C. W.,… More

Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Carbajal, M. A., Fleck, R. A. Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (174), e62350, doi:10.3791/62350 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter