Summary
在这里，我们提出了一个协议，使用微加工微流体平台生成三维简化和无差别皮肤模型。平行流动方法允许真皮隔室 的原位 沉积，以便在顶部接种上皮细胞，所有这些都由注射器泵控制。
Abstract
这项工作提出了一种新的，具有成本效益的，可靠的微流体平台，具有产生复杂多层组织的潜力。作为概念证明，已经对包含真皮（基质）和表皮（上皮）隔室的简化和无差别的人体皮肤进行了建模。为了实现这一目标，已经开发了一种多功能且坚固耐用的乙烯基器件，分为两个腔室，克服了基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流体器件在生物医学应用中存在的一些缺点，例如使用昂贵和专用的设备或吸收小的疏水分子和蛋白质。此外，还开发了一种基于平行流动的新方法，使真皮和表皮隔室 的原位 沉积成为可能。皮肤结构由含有人原代成纤维细胞的纤维蛋白基质和播种在上面的永生化角质形成细胞的单层组成，随后在动态培养条件下维持。这种新的微流体平台开辟了模拟人类皮肤病并推断产生其他复杂组织的方法的可能性。
Introduction
最近，在开发和生产用于分析化妆品和药品毒性的体外人体皮肤模型方面取得了进展1。制药和护肤行业的研究人员一直在使用动物，小鼠是最常见的，来测试他们的产品2，3，4，5。然而，在动物身上测试产品并不总是预测人类的反应，这经常导致药物失败或对人类的不良反应，从而导致经济损失5，6。英国是1998年第一个禁止使用动物进行美容测试的国家。后来，在2013年，欧盟禁止在动物身上测试和批准化妆品（欧盟化妆品法规第1223/2009号）7。
其他国家也在考虑这一禁令，例如美国的"人道化妆品法案"8。除了道德问题之外，动物和人类皮肤之间的解剖学差异使得动物试验耗时，昂贵且通常无效。此外，到2025年，全球 体外 毒理学检测市场规模预计将达到269.8亿美元9。由于这些原因，需要为这些 体外 研究开发新的方法和替代方案，例如生物工程人体皮肤模型，以便在不使用动物的情况下测试化妆品和药物的安全性和毒性作用。
市售有两种不同的体外，人体皮肤模型。第一种类型由分层的表皮当量组成，这些表皮当量含有多层分化的角质形成细胞，这些细胞接种在不同的材料上。其中一些已获得经济合作与发展组织（OECD）的批准，并得到（欧洲替代方法验证中心（ECVAM））的验证，用于皮肤腐蚀和刺激测试，例如EpiDerm或SkinEthic10，11，12。第二种类型是全皮肤等效物，具有一层分化的人类角质形成细胞，这些角质形成细胞接种在含有成纤维细胞的三维（3D）支架上，例如T-Skin和EpiDerm-FT。然而，这些模型是在静态条件下培养的，这使得它们无法准确表示人体生理条件。
最近的兴趣集中在以动态灌注13，14，15，16，17，18，19的细胞插入（CCI）格式生成体外3D皮肤模型。然而，根据它们在该领域的经典定义，这些系统不能严格意义上被视为微流体的芯片皮肤。Ingber对芯片上器官的定义指出，器官必须放置在微流体通道内，这是只有少数设备满足20，21的条件。到目前为止，芯片上的皮肤已经将大部分简单的上皮模拟为由多孔膜隔开的单细胞层和/或真皮细胞层22，23。虽然在微流体系统中对皮肤建模有一些进展16，24，但目前没有文献显示一个符合Ingber定义的芯片器官系统，能够在原位产生多层皮肤，包括上皮和基质成分。
在这项工作中，提出了一种新的，经济高效，强大的，基于乙烯基的微流体平台，用于芯片皮肤应用。该平台通过微加工生产，这为制造过程提供了更多的简单性，并在设备布局中增加了灵活性和多功能性，克服了PDMS25的一些局限性 。还设计了一种通过注射泵控制的平行流量引入简化的皮肤结构的方法。平行流动允许两种粘度非常不同的流体（在这种情况下是缓冲液和纤维蛋白预凝胶）通过通道灌注而不相互混合。作为概念证明，在装置中引入了含有嵌入在模仿真皮的纤维蛋白基质中的成纤维细胞的真皮表皮构建体，在其上加载单层角质形成细胞以模拟未分化的表皮。真皮隔室高度可以通过改变流速来调节。与之前描述的模型22，26，27，28，29相比，这项工作的主要新颖之处在于通过微流体在微室内开发3D结构。虽然本文提出了一种简化的未分化皮肤，但长期目标是生成和表征完全分化的皮肤结构，以证明其在药物和化妆品测试目的中的可行性和功能。
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Protocol
1. 芯片设计及微加工参数
- 使用FreeCAD开源设计软件设计微流控芯片层;有关通道的尺寸，请参阅 表1。 在设计中包括四个直径为 2.54 mm 的孔，以使用定制的对准器实现正确的层叠加。
| 长度（微米） | 宽度（微米） | |
| 下腔室 | 28,400 | 800 |
| 上腔室 | 31,000 | 800 |
表1：设备的上下通道尺寸。
- 将 95 μm 厚的粘合透明乙烯基片切割成 30 cm x 30 cm 的正方形，以正确放入绘图仪中。
- 使用Brother CanvasWorkspace软件创建一个30厘米x 30厘米的工作空间，并用芯片不同层的设计图案填充它（图1A）。将其存储在.svg文件中。
- 用边缘绘图仪切割30厘米x 30厘米的乙烯基片（图1B-D）。
- 将乙烯基板粘在低粘性粘合剂垫上，并在必要时消除所有气泡。
- 将.svg文件上传到绘图仪，并设置切割参数：切割刀片：3级;切割压力：0级;切割速度：1级。将带有乙烯基的粘合垫放入绘图仪中，然后开始切割过程。
- 按照前面的步骤，在 12 μm 厚的双面胶带乙烯基上切割顶部通道图案。
图1：芯片设计和微加工工艺（A）软件布局显示了为芯片设计的顶部和底部图案的工作空间。（B）切割过程中的边缘绘图仪;图中显示了切割刀片、整张乙烯基片材和粘合垫。（C） 图案乙烯基从切割的薄片上分离。（D） 采用顶部通道设计图案的粘性乙烯基层的样品。请点击此处查看此图的放大版本。
2. PDMS层制造
- 以10：1（v / v）的比例混合PDMS和固化剂，并将混合物置于真空下15分钟以除去气泡。将55mL混合物倒入55cm2 方形培养皿中，以获得2mm厚的层。用针头去除气泡。
- 将混合物（步骤2.1）在80°C的烘箱中固化1小时。 拆下PDMS的模具，并将其切割成具有芯片尺寸的矩形。用18 G注射器针头为管子打孔。
3. 芯片组装
注意：为了更好地理解，请参阅 图 2。
- 使用对准器组装整个设备，以正确调整通道、入口和出口。堆起四个乙烯基层（带有相应的底部微图案）用于组装下部通道，保持底层的盖带，以避免粘在对准器上。
- 将聚碳酸酯（PC）多孔膜切割并放置在下通道的顶部，以将其与上通道分开。注意不要覆盖下部通道的入口。
- 添加十个乙烯基层与上腔室设计。粘贴双面胶带乙烯基层，顶部有顶部通道图案。从对准器中取出芯片，然后将其粘贴在载玻片上。
- 将 2 mm 厚的 PDMS 板放在双面胶带乙烯基层的顶部，为管道提供适当的锚固并避免泄漏。在芯片顶部留下一个重量过夜，以确保芯片完全防水。通过冲洗70%v / v乙醇5分钟对芯片进行灭菌，然后用蒸馏的H2O洗涤。
图2：微流控芯片组件。 （一）设备组装的一般方案。下腔室和上腔室分别由四张和十一张叠加的乙烯基板组成。（B）微流控芯片的顶部和侧面视图。顶部和底部通道分别以粉红色和蓝色表示。（C） 使用定制对准器的芯片组件的图像。（D） 完成组装后的芯片映像。 请点击此处查看此图的放大版本。
4. 泵连接
注：泵连接的图形表示 如图3所示。
- 将泵 1 连接到上腔室入口 1 （UCi1）。
- 将泵 2 连接到上腔室入口 2 （UCi2）。
- 将泵 3 连接到下腔室入口 （LCi）。
- 将上腔室出口 （UCo） 和下腔出口 （LCo） 连接到废气管。
- 使用聚四氟乙烯 （PTFE） 管和 18 G 不锈钢连接器将注射器连接到每个入口。
图3：泵的连接和入口/出口位置。 （A） 图显示了三个不同泵与各自入口的连接。出口连接到废物容器。（B） 带有标签的入口和出口的芯片图像。缩写： LCi = 下腔室入口;LCo = 下腔出口;UCi1 = 上腔室入口 1;UCi2 = 上腔入口 2;UCo = 上腔室出口。 请点击此处查看此图的放大版本。
5. 细胞培养
注意：HaCaT细胞系具有商业来源。人类原发性成纤维细胞来自健康的供体，是从"卡洛斯三世健康研究所国家生物研究机构"登记的人类来源生物样本中获取的。
- 在细胞培养罩中工作，事先在紫外线下灭菌并用乙醇擦拭。
- 在37°C下解冻H2B-GFP-HaCaT细胞（人永生化皮肤角质形成细胞，hKCs）和GFP-人原代成纤维细胞（hFBs），加入2mL培养基，并在20°C下以250×g离心7分钟。
注意：H2B-GFP-HaCaT细胞是人类永生化的角质形成细胞，经过修饰以表达杂交组蛋白H2B-绿色荧光蛋白（GFP），为其细胞核提供绿色荧光。GFP-hFB是用载体pLZRS-IRES-EGFP转化的人原发性成纤维细胞，以表达细胞质绿色荧光。这些细胞按照先前公布的协议30，31进行了修改 - 在补充10%胎牛血清和1%抗生素/抗真菌剂溶液的1x DMEM中培养hKCs和hFBs。使用前将培养基预热至37°C。
- 通过用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，加入2mL胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）并在37°C下孵育10分钟来分离细胞。
- 灭活胰蛋白酶，加入4mL培养基。重悬细胞，并将其转移到15 mL管中。除去10μL以在Neubauer室中计数细胞并确定适当的浓度。
- 将15 mL管在20°C下以250×g离心7分钟。 除去上清液，并以所需浓度重悬沉沉淀：hFB为50，000个细胞/ mL，hKCs为5·×106个细胞/ mL。
6. 纤维蛋白原凝胶前制剂
- 通过将1mL CaCl2（NaCl 中的1%w / v）添加到小瓶中来激活凝血酶。
- 加入以下组分，以终浓度为3.5mg / mL的纤维蛋白获得1mL纤维蛋白水凝胶：59μL活化凝血酶（10 NIH单位/ mL），59μL氨甲环酸（材料表，100mg / mL），764μL含有50，000 hFBs / mL的培养基，118μL纤维蛋白原（20mg / mL NaCl（0.9%w / v））。
注意：必须在最后一刻添加纤维蛋白原。
7. 并行流协议
- 在整个过程中，泵 3 通过 LCi 以 50 μL/min 的速度泵送 1x PBS。
- 泵 2 泵以 100 μL/min 的速度通过 UCi2 泵牺牲液 （1x PBS）。
- 用预凝胶加载注射器，迅速将其放入泵1中，并以200μL / min的速度运行（图4A）。
- 一旦预凝胶离开UCo，停止泵1和2。
- 在37°C下离开芯片而不取出管子至少10分钟以允许凝胶化。
- 用泵3至UCi2以50μL / h泵泵培养基过夜。
- 用盖子块 UCi1。
8. hKCs单层播种
- 在显微镜下检查hFBs在真皮室生成后24小时是否扩散。
- 用泵2至UCi2以5×·106个细胞/mL以40μL/min的速度引入hKCs，持续1分钟（图4B）。
- 将芯片在37°C下在湿度饱和的培养箱中过夜，以便附着细胞。
- 用泵3仅通过LCi以50μL / min泵泵送新鲜培养基（图4C）。
图4：用于生成真皮 - 表皮结构的微流体方案（A）横向横截面显示了产生真皮隔室的平行流动过程。（B） 角质形成细胞单层在真皮室生成后24小时播种。（C）细胞培养维持在微流体装置内。（D）芯片内部皮肤的横截面再现。请点击此处查看此图的放大版本。
9. 细胞活力测定
注意：活/死试剂盒根据细胞的活或死状态用绿色或红色荧光染色细胞。为了进行适当的活力分化，必须在该步骤中使用非荧光hKCs和hFBs。该过程中的所有步骤都是通过UCi2与泵2一起执行的。
- 用1x PBS以50μL / min洗涤顶部通道5分钟以除去培养基。
- 泵送空气以50 μL/min的速度除去1x PBS。
- 按照制造商的说明准备钙黄素AM/锭同源二聚体-1试剂盒（活/死）溶液。
- 以50μL/分钟泵送活/死溶液2分钟。
- 在37°C的黑暗中孵育30分钟。
- 通过以50μL / min泵送1x PBS 2分钟以除去任何剩余的试剂来洗涤顶部通道。
- 在共聚焦显微镜下观察样品。对于活细胞和死细胞，分别使用495/590 nm的激发波长和519/617 nm的发射波长。
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Representative Results
设计的芯片由两个流体室组成，由一个5μm孔径的PC膜隔开，该膜允许细胞通过允许促进生长的分子从下腔室通过。上腔室容纳组织构建体，在这种情况下，在含有hFBs的纤维蛋白水凝胶上放置单层hKCs。
通道的高度由添加到每个通道的粘合片数量决定。下腔室由4层（380μm）和10个单面胶带层和双面带层（962μm）组成。芯片的尺寸为4 cm x 2 cm，这增强了其操作性。粘性乙烯基板为设备的目视检查提供水密性和透明度。PDMS层对于ll管的正确锚固非常有用，以避免从固定管子的孔中泄漏。
根据已发表的文献，迄今为止尚未报道使用注射泵将含细胞的水凝胶注射到微流体室中。因此，必须评估纤维蛋白预凝胶的注射性。我们观察到，在50μL / min的流量下，注射器被阻塞。然而，高于200μL/min的流速可能会损害细胞。进行流变学研究以测试纤维蛋白预凝胶的剪切变稀行为，在选定的流速范围（50-200μL / min）内获得10至50 cP的粘度。这些结果有助于建立该系统的工作条件。
在这项工作中，基于两个叠加层流的产生，开发了一种平行流动方法，其中下层是预凝胶，而上层是牺牲液（PBS）。通过数值求解纳维-斯托克斯方程并施加适当的边界条件，我们发现有多种可能的解可以获得所需的高度。考虑到先前建立的剪切速率限制，为了实现约500μm高度的水凝胶，牺牲PBS和预凝胶的流速分别为104和222μL / min。在实践中，为了简单起见，使用100和200μL/min的微流量。当在模型中重新引入时，发现这些值导致凝胶高度为576μm，与预期值非常相似（图5B）。为了通过实验检查所提出方法的功能，测量了沿上腔的水凝胶高度。观察到的平均高度为550μm（图5A），与我们的数学模型的预测非常相似。
图5：平行流动数学解，以选择适当的前凝胶和牺牲流体流动，以获得所需的真皮高度。 （A）将hKCs的共聚焦图像前视图接种在纤维蛋白凝胶顶部以评估其高度。（B） 根据预凝胶和PBS流速的不同高度的数学解。缩写：hKCs =人类永生化皮肤角质形成细胞;PBS = 磷酸盐缓冲盐水。 请点击此处查看此图的放大版本。
在开始时建立方案时，PBS没有通过下通道冲洗，导致凝胶的理论高度与测量高度之间的差异。与估计的高度差异相比，这种高度差异约为40%（图6）。一旦方案得到优化并且PBS泵送通过下腔室，这种高度损失就解决了（图5）。
图6：接种在水凝胶顶部的hKCs的共聚焦视图，以测量PBS未泵送下腔室时其高度。 缩写：hKCs =人类永生化皮肤角质形成细胞;PBS = 磷酸盐缓冲盐水。 请点击此处查看此图的放大版本。
图7A 显示了含有纤维蛋白水凝胶的上腔室的荧光俯视图图像，并嵌入GFP-hFBs，表明上样后24小时，细胞沿腔室均匀分布并扩散良好。 图7B 显示了接种在水凝胶顶部的汇合GFP-hKCs。
图7：上通道的荧光图像，显示设备中接种的不同细胞（ A）平行流动实验后24小时上腔室的俯视图，显示嵌入纤维蛋白凝胶中的hFB。（B） 在水凝胶生成后24小时接种在水凝胶顶部的汇合GFP-hKCS。红色虚线表示通道壁。比例尺：400 μm。缩写：hFBs =人类原发性成纤维细胞;GFP-hKCs = 绿色荧光蛋白表达人类永生化皮肤角质形成细胞。 请点击此处查看此图的放大版本。
重要的是要保持系统关闭过夜，直到hKCs沉淀并附着在水凝胶表面。当在电池附着之前移除管子时，气泡进入通道并取代电池，导致不均匀的汇合单层，如图 8所示。
图8：在hKCs播种后立即去除管道时水凝胶表面的俯视图。红色虚线表示通道壁。比例尺：400 μm。缩写：hKCs =人类永生的皮肤角质形成细胞。请点击此处查看此图的放大版本。
使用平行流动方法在加载后24小时对嵌入水凝胶中的hFBs进行细胞活力测试，显示细胞活力为〜95%。在将hKCs细胞接种在纤维蛋白水凝胶上24小时后对它们进行的相同测试显示出类似的结果。下一步是生成真皮表皮结构，并在24小时后使用共聚焦显微镜研究其结构（图9）。
图9：微流控芯片中未分化皮肤模型的重建3D共聚焦图像。 黄色虚线表示将hKCs（顶部）与嵌入凝胶中的hFB（底部）分离的水凝胶表面。缩写：hFBs =人类原发性成纤维细胞;hKCs = 人类永生化皮肤角质形成细胞。 请点击此处查看此图的放大版本。
在纤维蛋白原凝胶的剪切变薄行为与其凝胶化时间之间找到平衡至关重要：如果建立平行流动的时间太长，它会凝结并阻塞系统;如果凝胶化过程太慢，水凝胶中的hFBs将沉淀， 如图10所示。这种瞬态的行为可以通过改变凝血酶浓度来调节。
图10：由于纤维蛋白胶凝时间缓慢，纤维蛋白水凝胶的共聚焦图像显示沉淀的hFBs（红色）。hKCs单层（蓝色）显示在凝胶顶部。缩写：hFBs =人类原发性成纤维细胞;hKCs = 人类永生化皮肤角质形成细胞。 请点击此处查看此图的放大版本。
在装置平面化和后验实践期间，出现了一些并发症，必须解决这些并发症才能获得最佳功能的装置和结构良好的组织。这些问题如 表2所示，以及故障排除的解决方案。
| 问题 | 解决 方案 |
| 在上腔室中引入3D水凝胶，在真皮生成后在上面留出自由空间以在顶部播种角质形成细胞 | 应用两种具有不同粘度的流体（PBS和预凝胶）的平行流动，以创建具有受控高度的真皮隔室。 |
| 乙烯基板堆叠过程中的通道不对中 | 使用定制的对准器将所有纸张堆积在正确的位置 |
| 在纤维蛋白凝胶顶部实现汇合角质形成细胞单层，以模拟表皮 | 在从芯片中取出管子之前，允许细胞附着在凝胶上，防止气泡进入通道并置换细胞。 |
| 在通过多孔膜的平行流动方案期间，由于预凝胶泄漏到下通道，沿通道的水凝胶高度损失。 | 在并联流量建立期间，通过下部通道泵送 PBS。 |
| 凝胶内的成纤维细胞沉淀 | 凝血酶浓度略微增加以加速纤维蛋白凝胶化 |
表2：在开发当前工作期间发现的问题和所应用的解决方案。
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Discussion
开发这种方法的动机是希望在高通量平台中模拟皮肤病并研究新的创新疗法的效果。迄今为止，该实验室通过手动或借助3D生物打印技术将纤维蛋白凝胶与成纤维细胞一起投射到细胞培养插入板中并在其上接种角质形成细胞来生产这些真皮表皮等效物。一旦角质形成细胞达到汇合，3D培养物暴露于气液界面，其诱导角质形成细胞分化，产生分层的表皮，从而完全发育出圆周间人皮肤32，33，34。然而，这些3D培养物尽管在临床上非常相关，但价格昂贵，耗时且不模拟生理条件。
组织芯片技术提供了一个平台来模拟细胞培养中的生理条件，从而能够更好地了解候选药物13，14，15，16，17，18，19，35的毒性，功效和递送。大多数以微流控"经典"芯片为模型的组织由单层细胞组成，主要是上皮细胞22、26、42、27、28、36、37、38、39、40、41.由于难以生成均匀和叠加的组织层，更复杂，多层组织的建模受到阻碍。
与以前的设备22，43相比，这项工作的主要新颖之处在于开发了一种通过微流体产生未分化和简化的皮肤结构的方法。此外，相对于其他已发表的技术44的另一项重要创新是设计了一种相对简单，具有成本效益，易于使用的一次性芯片系统，该系统由生物相容性乙烯基片制成，允许临时制造。该系统避免了使用PDMS25所需的硅晶圆和复杂的等离子体键合程序。基于这种材料的芯片需要为每个不同的芯片设计生成特定的晶圆，这提高了原型制作工艺的价格。所有这些都使得当前的"经典"技术昂贵，复杂且不是很灵活。
为了克服这些限制，使用皮肤作为组织模型，我们提出了一个非常灵活，廉价和强大的基于乙烯基层的微流体平台，由微加工生产。我们还提出了一种基于层流液平行流动的新方法，该方法允许 原位 生成双层皮肤结构，其下真皮隔室含有hFBs，上表皮隔室由单层hKCs组成。该芯片由两个由多孔PC膜隔开的腔室组成。上通道包含皮肤结构，并留下自由空间，以允许hKC分化和分层和/或将来培养基，空气甚至药物的灌注。下腔室连续灌注培养基以促进细胞生长。由于泵送力，使用多孔膜可能导致一部分预凝胶从上腔室损失到下腔室。在下腔室中引入PBS流量可补偿此压差并避免此泄漏。
hKCs在水凝胶表面的分布是生成皮肤模型时的一个重要方面。当它们没有均匀分布时，均匀单层的产生，因此，表皮分化可能会受到阻碍。同样，hFBs必须在水凝胶内均匀分布，以类似于它们在真实皮肤中的自然位置。为避免细胞沉淀或管道堵塞，必须仔细研究水凝胶成分（特别是凝血酶浓度）以控制凝胶时间和剪切变稀行为。
尽管有这些令人鼓舞的发现，但未来的工作需要证明该系统的长期功能，该系统是促进hKC单层的正确增殖和分化所必需的，以形成包括角质层在内的良好分化的人体皮肤。除皮肤外，该系统还允许产生其他复杂的多层组织结构。
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Disclosures
作者声明他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们衷心感谢哈维尔·罗德里格斯博士、玛丽亚·路易莎·洛佩斯博士、卡洛斯·马特兰和胡安·弗朗西斯科·罗德里格斯提供的非常有用的建议、讨论和/或初步数据。我们也衷心感谢Sergio Férnandez，Pedro Herreros和Lara Stolzenburg对这个项目的贡献。特别感谢Marta García博士获得GFP标签的hFBs和hKCS。最后，我们承认吉列尔莫·比斯凯诺和安吉利卡·科拉尔的出色技术援助。这项工作得到了"马德里社区投资集团活动计划"，项目S2018/BAA-4480，Biopieltec-CM的支持。这项工作也得到了"Excela de excelencia"项目EPUC3M03，CAM的支持。CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
| Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Culture plates | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
| Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
| Glass slide | Thermo Scientific | ||
| GFP-Human dermal fibroblasts | - | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
| H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
| Live/dead kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Syringes | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
| Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |
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