Summary
여기서는 마이크로머신 마이크로유체 플랫폼을 사용하여 3차원 단순화 및 미분화 피부 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 병렬 흐름 접근법은 주사기 펌프에 의해 제어되는 상피 세포의 파종을 위해 진피 구획의 시상 증착을 허용합니다.
Abstract
이 작품은 복잡한 다층 조직을 생성 할 수있는 잠재력을 가진 새롭고 비용 효율적이며 신뢰할 수있는 미세 유체 플랫폼을 제공합니다. 개념의 증거로, 진피 (기질)와 표피 (상피) 구획을 포함하는 단순화되고 미분화되지 않은 인간 피부를 모델링했습니다. 이를 위해, 2개의 챔버로 나뉘어진 다목적이고 견고한 비닐 계열 장치가 개발되어 고가의 특수 장비의 사용 또는 소형 소수성 분자 및 단백질의 흡수와 같은 생물 의학 응용을 위한 다디메틸실록산(PDMS)을 기반으로 한 미세 유체 장치에 존재하는 몇 가지 단점을 극복했습니다. 더욱이, 병렬 흐름을 기반으로 하는 새로운 방법이 개발되어 진피 및 표피 구획모두의 시상증을 가능하게 하였다. 피부 구조는 인간 1 차 섬유아세포와 위에 시드된 불멸의 각질 세포의 단층이 포함된 피브린 매트릭스로 이루어져 있으며, 이는 이후 동적 배양 조건하에서 유지됩니다. 이 새로운 미세 유체 플랫폼은 인간의 피부 질환을 모델링하고 다른 복잡한 조직을 생성하는 방법을 추정 할 수있는 가능성을 엽니 다.
Introduction
최근에는 화장품 및 의약품의 독성 분석을 위한 체외 인체 피부 모델의 개발 및 생산을 향한 발전이 이루어지고있다. 제약 및 스킨 케어 산업의 연구원은 동물을 사용하고있다, 마우스가 가장 일반적인되고, 자신의 제품을 테스트하기 위해2,3,4,5. 그러나, 동물에 대한 제품을 테스트하는 것은 인간에서 항상 반응을 예측하는 것은 아니며, 이는 종종 인간에서 약물 실패 또는 부작용으로 이어지며 결과적으로 경제적 손실5,6. 영국은 1998년에 화장품 검사를 위해 동물을 사용하는 것을 금지한 최초의 국가였습니다. 이후 2013년 EU는 동물 화장품 의 검사 및 승인을 금지했다(EU 화장품 규정 제1223호/2009)7.
이 금지는 미국8의'휴먼 화장품 법'과 같은 다른 국가에서도 고려되고 있습니다. 윤리적 관심사 외에도 동물과 인간의 피부 사이의 해부학적 차이는 동물 실험을 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들고 종종 비효율적입니다. 또한, 2025년9년까지전 세계 체외 독성 검사 시장 규모는 2698억 달러에 이를 것으로 예상됩니다. 이러한 이유로, 동물을 사용하지 않고 화장품과 약물의 안전성과 독성 효과에 대한 테스트를 가능하게 하는 생체 공학 인간 피부 모델과 같은 체외 연구를 위한 새로운 방법과 대안을 개발할 필요가 있습니다.
시험관, 인간 피부 모델에서 두 가지 종류의 시판이 가능합니다. 첫 번째 유형은 서로 다른 재료에 시드되는 각질 세포의 여러 층을 포함하는 계층화된 표피 등가물로 구성됩니다. 이들 중 일부는 경제협력개발기구(OECD)의 승인을 받았으며, EpiDerm 또는 SkinEthic10,11,12와같은 피부 부식 및 자극 테스트를 위한 대안방법 검증을 위한 유럽 센터(ECVAM)에 의해 검증되었다. 두 번째 유형은 T-Skin 및 EpiDerm-FT와 같은 섬유아세포가 함유된 3차원(3D) 비계에 시드된 인간 각질 세포를 분화하는 층이 있는 전체 피부 등가물입니다. 그러나, 이 모형은 정확하게 인간적인 생리적인 조건을 나타낼 수 없는 정적인 조건하에서 배양됩니다.
최근 관심은 동적 관류13,14,15,16,17,18,19를가진 세포 배양 삽입 (CCI) 형식으로 체외 3D 피부 모델을 생성하는 데 초점을 맞추고있다. 그러나 이러한 시스템은 현장에서의 고전적인 정의에 따라 미세 유체 피부 온 칩으로 엄격하다고 간주 할 수 없습니다. 장기에 칩에 대한 Ingber의 정의는 장기가 미세 유체 채널 내부에 배치되어야한다고 명시, 이는 단지 몇 장치가20을충족하는 조건입니다20,21. 스킨 온 칩은 지금까지 다공성 멤브레인22,23로분리된 단세포 층 및/또는 진피 세포 층으로서 대부분 간단한 상피를 모델링하였다. 미세 유체 시스템16,24에서피부를 모델링하는 몇 가지 발전이 있었지만, 현재 잉버의 정의에 맞는 장기 온 - 어 칩 시스템을 보여주는 문헌이 없다, 장소에서 다층 피부를 생성 할 수 및 상피 및 기질 구성 요소를 모두 포함.
이 작품에서는 스킨 온-어칩 애플리케이션을 위한 새롭고 비용 효율적이고 견고한 비닐 기반 의 미세 유체 플랫폼이 제공됩니다. 이 플랫폼은 PDMS25의일부 한계를 극복하면서 제조 공정에서 보다 단순하고 장치 레이아웃의 유연성과 다기능성을 높이는 마이크로 가공에 의해 생산되었습니다. 주사기 펌프로 제어되는 병렬 흐름을 통해 단순화된 피부 구조를 도입하는 방법도 설계되었습니다. 병렬 흐름은 매우 다른 점도 (이 경우 버퍼 및 피브린 프리 젤)를 가진 두 유체가 서로 혼합하지 않고 채널을 통해 침투 할 수 있게합니다. 개념의 증거로서, 진피를 모방한 피브린 매트릭스에 내장된 섬유아세포를 함유한 진피 분체 구조가 장치에 도입되었으며, 그 위에 각질 세포의 단층이 장화되어 미분화 표피를 모방하였다. 진피 구획 높이는 유량을 수정하여 변조될 수 있다. 이 작품의 주요 참신함은, 이전에 설명된모델(22,26,27,28,29)에비해 미세유체제를 통해 마이크로챔버 내부의 3D 구조의 개발이다. 이 문서는 단순화 된 미분화 피부를 제공하지만, 장기적인 목표는 생성하고 약물 및 화장품 테스트 목적으로 의 생존력과 기능을 보여주기 위해 완전히 차별화 된 피부 구조를 특성화하는 것입니다.
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Protocol
1. 칩 설계 및 마이크로 머시닝 매개 변수
- FreeCAD 오픈 소스 설계 소프트웨어로 미세 유체 칩 레이어를 설계합니다. 채널의 치수에 대한 표 1을 참조하십시오. 올바른 레이어 중첩을 위해 사용자 정의 제작 된 정렬기를 사용하는 설계에 직경 4개의 구멍을 포함합니다.
| 길이(μm) | 너비(μm) | |
| 하부 챔버 | 28,400 | 800 |
| 상부 챔버 | 31,000 | 800 |
표 1: 장치의 상부 및 하부 채널의 치수입니다.
- 95 μm 두께의 접착제, 투명한 비닐 시트를 30cm x 30cm 사각형으로 잘라 플로터에 제대로 맞춥니다.
- 브라더스 CanvasWorkspace 소프트웨어를 사용하여 30cm x 30cm 작업 공간을 만들고 칩의 다양한 레이어에 대한 디자인 된 패턴으로 채웁니다(그림 1A). .svg 파일에 저장합니다.
- 가장자리 플로터(그림 1B-D)와30cm x 30cm 비닐 시트를 잘라.
- 비닐 시트를 낮은 압정 접착제 매트에 붙이고 필요한 경우 모든 기포를 제거하십시오.
- 플로터에 .svg 파일을 업로드하고 절단 매개 변수를 설정합니다: 절단 블레이드: 레벨 3; 절삭 압력: 레벨 0; 절삭 속도 : 레벨 1. 접착제 매트에 비닐을 플로터에 넣고 절단 과정을 시작합니다.
- 12 μm 두께의 양면 테이프 비닐에 상단 채널 패턴을 이전 단계에 따라 잘라냅니다.
그림 1: 칩 설계 및 마이크로 머시닝 프로세스. (A)칩을 위해 설계된 상단 및 하단 패턴으로 채워진 작업 공간을 보여주는 소프트웨어 레이아웃. (B)절단 공정 중 에지 플로터; 절단 블레이드, 전체 비닐 시트 및 접착제 매트가 표시됩니다. (C)컷 시트에서 분리되는 패턴 비닐. (D)상단 채널 디자인패턴 접착제 비닐 레이어의 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. PDMS 층 제작
- PDMS 및 경화제를 10:1(v/v)의 비율로 혼합하고 혼합물을 15분 동안 진공 아래에 놓고 기포를 제거합니다. 혼합물 55mL을 55cm2 제곱 배양 접시에 붓고 2mm 두께층을 얻습니다. 바늘로 거품을 제거합니다.
- 80°C에서 1시간 동안 오븐에서 혼합물(2.1단계)을 치료한다. PDMS의 성형을 풀고 칩 치수로 사각형으로 잘라냅니다. 18 G 주사기 바늘로 튜브를 위한 구멍을 만드십시오.
3. 칩 조립
참고: 더 잘 이해하면 그림 2를참조하십시오.
- 채널, 입구 및 콘센트를 적절하게 조정하기 위해 정렬기를 사용하여 전체 장치를 조립합니다. 하부 채널을 조립하기 위해 4개의 비닐 레이어(해당 하부 마이크로패턴 포함)를 쌓아, 하단 레이어의 커버 테이프를 유지하여 정렬기를 고집하지 않도록 합니다.
- 폴리카보네이트(PC) 다공성 멤브레인을 하부 채널 위에 놓아 상부에서 분리한다. 하부 채널의 입구를 커버하지 않도록 주의하십시오.
- 상부 챔버 디자인으로 10개의 비닐 레이어를 추가합니다. 상단 채널 패턴이 있는 양면 테이프 비닐 레이어를 붙입니다. 리정렬기에서 칩을 제거하고 유리 슬라이드에 붙입니다.
- 2mm 두께의 PDMS 시트를 양면 테이프 비닐 레이어 위에 놓고 튜브에 적합한 고정을 제공하고 누출을 방지합니다. 칩이 완전히 방수되었는지 확인하기 위해 밤새 칩 위에 무게를 둡니다. 70% v/v 에탄올을 5분 동안 세척한 다음 증류된 H2O로 세척하여 칩을 멸균합니다.
그림 2: 미세 유체 칩 조립. (A)장치의 조립의 일반적인 방식. 하부 및 상부 챔버는 각각 4 개 및 11 개의 중첩 된 비닐 시트로 구성됩니다. (B)미세 유체 칩의 상단 및 측면 보기. 상단 및 하단 채널은 각각 분홍색과 파란색으로 표시됩니다. (C)맞춤형 리정렬기를 사용하여 칩 어셈블리의 이미지. (D)완전한 조립 후 칩 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 펌프 연결
참고: 펌프 연결의 그래픽 표현은 그림 3에표시됩니다.
- 상부 챔버 입구 1 (UCi1)에 펌프 1을 연결합니다.
- 펌프 2를 상부 챔버 입구 2(UCi2)에 연결합니다.
- 펌프 3을 하부 챔버 입구(LCi)에 연결합니다.
- 상부 챔버 콘센트 (UCo) 및 하부 챔버 콘센트 (LCo)를 폐기물 튜브에 연결합니다.
- 폴리테트라플루오로틸렌(PTFE) 튜브와 18G 스테인리스 스틸 커넥터를 사용하여 각 입구에 주사기를 연결합니다.
그림 3: 펌프 연결 및 입구/콘센트 위치. (A)각각의 입구에 세 개의 서로 다른 펌프의 연결을 보여주는 다이어그램. 콘센트는 폐기물 용기에 연결됩니다. (B)라벨이 부착된 입구와 콘센트가 있는 칩 이미지. 약어: LCi = 하부 챔버 입구; LCo = 하부 챔버 콘센트; UCi1 = 상부 챔버 입구 1; UCi2 = 상부 챔버 입구 2; UCo = 상부 챔버 콘센트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 세포 배양
참고: HaCaT 세포주에는 상업적 기원이 있습니다. 인간 1차 섬유아세포는 건강한 기증자로부터 나왔으며 "레지스토 나시오날 드 바이오방코스 파라 Investigación Biomédica 델 인스티투토 데 살루드 카를로스 III"에 등록된 인간 기원의 생물학적 샘플의 수집에서 얻어졌다.
- 세포 배양 후드에서 작업, 이전에 자외선아래 살균 및 에탄올로 닦아.
- 37°C에서 H2B-GFP-HaCaT 세포(인간 불멸피부 각질세포, hKC) 및 GFP-인간 1차 섬유아세포(hFBs)를 37°C에서, 배양 배지 2mL, 원심분리기는 250°C에서 250°C에서7분 동안 × 첨가한다.
참고: H2B-GFP-HaCaT 세포는 하이브리드 히스톤 H2B-녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하도록 변형된 인간 불멸의 각질 세포로, 핵을 녹색 형광으로 제공한다. GFP-hFB는 세포질 녹색 형광을 발현하기 위해 벡터 pLZRS-IRES-EGFP로 변형된 인간 1차 섬유아세포이다. 이들 세포는 이전에 발표된프로토콜(30) 30,31에 따라 수정되었습니다. - 1x DMEM의 hKC와 hFB를 10% 태아 소 혈청과 항생제/항마이코틱 용액의 1%로 보충한 배양. 사용하기 전에 37°C에서 배양 배지를 미리 데우기 전에 미리 데워보실 수 있습니다.
- 1x 인산염 완충식식염(PBS)으로 세포를 분리하고, 트립신/에틸렌디아민 테트라아세산(EDTA)의 2mL을 추가하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 비활성화 된 트립신은 배양 배지의 4 mL을 추가합니다. 세포를 다시 중단하고 15mL 튜브로 옮기십시오. 10 μL을 제거하여 노이바우어 챔버의 세포를 계산하고 적절한 농도를 결정합니다.
- 원심분리기는 250× g에서20°C에서 7분 동안 15mL 튜브를 원심분리한다. 상체를 제거하고 원하는 농도로 펠릿을 재보페: 50,000세포/mL및 hKC에서 5·×106 세포/mL에서 hFC를 재보선다.
6. 피브리노겐 프리젤 제제
- 유리병에 CaCl2의 1mL (NaCl에서 1 % w / v)를 추가하여 혈전을 활성화합니다.
- 다음 성분을 추가하여 3.5 mg/mL의 피브린 의 최종 농도에서 피브린 하이드로겔 1mL을 얻으려면 다음 성분을 추가하십시오: 활성화 된 트롬빈 59 μL (10 NIH 단위 / mL), 59 μL의 탄examic 산(재료 표,100 mg /mL), 배양 배지의 764 μL 50,000 hF를 함유하고 있습니다. 118 μL 의 피브리노겐 (NaCl에서 20 mg / mL (0.9 % w / v)).
참고: 피브리노겐은 마지막 순간에 추가해야 합니다.
7. 병렬 흐름 프로토콜
- 전체 공정 동안 50 μL/min에서 LCi를 통해 펌프 3로 1배 PBS를 펌프합니다.
- 100 μL/min에서 UCi2를 통해 2를 통해 펌프2를 펌프하는 희생 유체(1x PBS)를 펌프합니다.
- 프리 젤로 주사기를 적재하고 펌프 1에 빠르게 배치하고 200 μL/min(그림4A)에서실행합니다.
- 프리젤이 UCo를 빠져나가면 펌프 1과 2를 중지합니다.
- 겔화를 허용하기 위해 37 °C에서 튜브를 제거하지 않고 칩을 10 분 이상 방치하십시오.
- 펌프 3에서 UCi2까지 하룻밤 동안 50 μL/h에서 배양 배지를 펌핑합니다.
- 캡으로 UCi1을 차단합니다.
8. hKCs 모노 레이어 시드
- hFB가 진피 구획의 생성 후 24 시간 확산되는 현미경하에서 확인하십시오.
- 5×~UCi2까지 펌프 2를 가진 hKC를 40 μL/min에서 1분(그림4B)에서5×,106셀/mL로 소개합니다.
- 칩을 37°C에서 세포 부착을 위해 습도 포화 인큐베이터에 하룻밤 을 둡니다.
- 펌프 3로 신선한 배양 배지를 LCi를 통해서만 50 μL/min(그림4C)으로펌프합니다.
도 4: 진피 구획생성을 위한 미세유체 프로토콜. (A)횡단단면은 진피 구획을 생성하는 병렬 유동 공정을 나타낸다. (B)진피 구획 생성 후 24시간 종자 다층 파종. (C)미세 유체 장치 내부의 세포 배양 유지. (D)칩 내부의 피부의 단면 레크리에이션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
9. 셀 생존 가능성 분석
참고: 라이브/데드 키트는 생후 또는 죽은 상태에 따라 녹색 또는 빨간색 형광으로 세포를 얼룩지게 합니다. 적절한 생존 가능성 분화를 위해 비형성 hKC 및 hFB를 이 단계에서 사용해야 합니다. 절차의 모든 단계는 펌프 2와 UCi2를 통해 수행됩니다.
- 50 μL/분에서 5분 동안 1x PBS로 상단 채널을 세척하여 배양 배지를 제거합니다.
- 공기를 펌프하여 50 μL/분에서 1x PBS를 제거합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 칼신 AM/에티듐 호모디머-1 키트(Live/Dead) 솔루션을 준비하십시오.
- 50 μL/분에서 2분 동안 라이브/데드 용액을 펌프합니다.
- 어둠 속에서 37 °C에서 30 분 배양하십시오.
- 1x PBS를 50 μL/분에서 2분 동안 펌핑하여 상단 채널을 세척하여 남은 시약을 제거합니다.
- 공초점 현미경의 밑에 견본을 관찰합니다. 495/590 nm의 난동파장과 519/617 nm의 방출 파장을 라이브 및 죽은 세포에 각각 사용하십시오.
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Representative Results
설계 된 칩은 하부 챔버에서 성장 촉진 분자의 통과를 허용하여 세포의 성장을 허용하여 세포의 성장을 허용하는 5 μm 모공 크기의 PC 멤브레인에 의해 분리 된 두 개의 유체 챔버로 구성되어 있습니다. 상부 챔버는 조직 구조를 보유하고, 이 경우, hFB를 포함하는 피브린 하이드로 겔에 hKC의 단층.
채널의 높이는 각 채널에 추가된 접착제 시트 수에 따라 결정됩니다. 하부 챔버는 4층(380 μm)과 10개의 일방적 테이프 층 중 상부 1층및 양면 테이프 층(962 μm)으로 구성된다. 칩의 치수는 4cm x 2cm로 조작을 향상시킵니다. 접착제 비닐 시트는 장치의 육안 검사를 위한 수분 미디움과 투명성을 제공합니다. PDMS 층은 튜브가 고정된 구멍에서 누출되는 것을 피하기 위해 llthe 튜브의 적절한 고정에 유용했습니다.
출판 된 문헌에 따르면, 주사기 펌프를 사용하여 미세 유체 챔버로 세포 함유 하이드로겔의 주사용성은 현재까지보고되지 않았습니다. 이러한 이유로, 피브린 프리 젤의 주사용 평가 했다. 우리는 50 μL /min의 흐름에서 주사기가 차단된 것을 관찰했습니다. 그러나 200 μL/min보다 높은 유량은 세포를 손상시킬 수 있습니다. 유변학 연구는 피브린 프리젤의 전단 숱이 거동을 시험하여 선택된 유속 범위 내에서 10 내지 50 cP의 점도(50-200 μL/min)를 획득하였다. 이러한 결과는 이 시스템의 작업 조건을 설정하는 데 도움이 되었습니다.
이 작품에서, 상류체가 희생유체(PBS)인 하부리겔인 2개의 중첩라미나 흐름의 생성에 기초하여 병렬 유동 방법이 개발되었다. 수치적으로 Navier-Stokes 방정식을 해결하고 적절한 경계 조건을 부과하면서 원하는 높이를 얻기 위해 여러 가지 가능한 솔루션이 있음을 발견했습니다. 앞서 확립된 전단 속도 제한을 고려하여 약 500μm 높이의 하이드로겔을 달성하기 위해, 유량은 희생 PBS 및 프리겔에 대해 각각 104 및 222 μL/min이었다. 실제로 100 μL/min의 마이크로 유량은 단순성으로 사용되었습니다. 모델에서 다시 도입했을 때, 이러한 값은 576 μm의 겔 높이를 초래하는 것으로 나타났으며, 이는 예상값(도5B)과매우 유사하다. 제안된 방법의 기능을 실험적으로 확인하기 위해 상체 챔버를 따라 하이드로겔의 높이를 측정하였다. 550 μm의 평균 높이가 관찰되었다(그림 5A),우리의 수학 모델의 예측과 매우 유사.
도 5: 병렬 흐름 수학적 솔루션은 원하는 진피 높이를 얻기 위해 적절한 사전 겔 및 희생 유체 흐름을 선택하는 것입니다. (A)그 높이를 평가하기 위해 피브린 젤 위에 시드hKC의 공초점 이미지의 전면 보기. (B)사전 겔 및 PBS 유량에 따라 다른 높이에 대한 수학적 용액. 약어 : hKCs = 인간의 불멸의 피부 각질 세포; PBS = 인산염 완충식식염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
처음에 프로토콜을 확립할 때, PBS는 낮은 채널을 통해 플러시되지 않았고, 겔의 이론적 높이와 측정된 것 사이의 불일치로 이어졌다. 높이의 차이는 추정된 것과 비교하여 ~40%였다(도6). 프로토콜이 최적화되고 PBS가 하부 챔버를 통해 펌핑되면 높이손실이 해결되었습니다(그림5).
그림 6: PBS가 하부 챔버를 통해 펌핑되지 않았을 때 높이를 측정하기 위해 하이드로겔 위에 시드된 hKCs의 공초점 보기. 약어 : hKCs = 인간의 불멸의 피부 각질 세포; PBS = 인산염 완충식식염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7A는 임베디드 GFP-hFB를 함유한 피브린 하이드로겔을 함유하는 상부 챔버의 형광 상부 뷰 영상을 나타내며, 24h로 적재 후, 세포가 챔버를 따라 균일하게 분포되고 잘 퍼지는 것을 보여준다. 도 7B는 하이드로겔 위에 시드된 컨클레이브 GFP-hKCs를 나타낸다.
도 7: 상부 채널의 형광 이미지는 장치에 시드된 상체 세포를 나타내는 것이다. (A)피브린 젤에 내장된 hFB를 나타내는 병렬 유동 프로토콜 후 상부 챔버 24h의 상부 챔버의 상주도. (B)하이드로겔 생성 후 하이드로겔 24h 위에 시드된 코클레이크 GFP-hKCs. 대시 된 빨간색 선은 채널 벽을 나타냅니다. 스케일 바: 400 μm. 약어: hFBs = 인간 1 차 섬유아세포; GFP-hKC = 녹색 형광 단백질 표현 인간의 불멸피부 각질 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
hKC 퇴적물까지 밤새 시스템을 닫고 하이드로겔 표면에 부착하는 것이 중요합니다. 튜브가 세포 부착 전에 제거되면 기포가 채널에 들어가 세포를 변위시켜 도 8에나와 같이 부균일한 컨실릭 단층으로 이어집니다.
그림 8: hKC 시드 직후 튜브를 제거할 때 하이드로겔 표면의 상단 보기. 대시 된 빨간색 선은 채널 벽을 나타냅니다. 스케일 바: 400 μm. 약어 : hKCs = 인간의 불멸의 피부 각질 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
하이드로겔에 내장된 hFBs에서 수행된 세포 생존성 시험은 병렬 유동 방법을 이용하여 적재 후 24시간 수행되었으며, ~95%의 세포 생존가능성을 나타낸다. 피브린 하이드로겔에 시드후 24h hKCs 세포에서 수행된 동일한 시험은 유사한 결과를 보였다. 다음 단계는 24h(도9)이후공초점 현미경검사를 이용하여 진피 계피 구조를 생성하고 그 구조를 연구하는 것이었다.
그림 9: 미세 유체 칩에서 미분화 된 피부 모델의 3D 공초점 이미지를 재구성합니다. 노란색 파선은 젤(bottom)에 내장된 hFB로부터 hKC(위)를 분리하는 하이드로겔의 표면을 나타낸다. 약어: hFBs = 인간 1 차 섬유아세포; hKC = 인간 불멸의 피부 각질 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
피브리노겐 젤의 전단 숱이 거동과 겔화 시간 사이의 평형을 찾는 것이 중요합니다: 병렬 흐름을 확립하는 데 너무 오래 걸리면 시스템을 응고하고 차단합니다. 겔화 과정이 너무 느리면 하이드로겔내hFB가 도 10에도시된 바와 같이 퇴적물을 한다. 이 일시적인 상태의 동작은 혈전 농도를 변화시킴으로써 조절될 수 있다.
도 10: 느린 피브린 겔화 시간으로 인해 퇴적hFBs (빨간색)를 보여주는 피브린 하이드로 겔의 공초점 이미지. hKCs 단층층(파란색)이 젤 위에 표시됩니다. 약어: hFBs = 인간 1 차 섬유아세포; hKC = 인간 불멸의 피부 각질 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
장치 계획화 및 후방 실험 관행 동안, 최적의 기능 장치와 잘 구조화 된 조직을 얻기 위해 해결해야하는 몇 가지 합병증이 발생했습니다. 이러한 문제는 문제 해결솔루션과 함께 표 2에표시됩니다.
| 문제 | 솔루션 |
| 상부 챔버에 3D 하이드로겔을 도입하여 진피 생성 후 위에 각질 세포를 종자하기 위해 위의 여유 공간을 남겨 둡시 | 서로 다른 점도와 함께 두 유체(PBS 및 프리 젤)의 병렬 흐름을 적용하여 제어된 높이가 있는 진피 구획을 만듭니다. |
| 비닐 시트 스태킹 중 채널 정렬 불량 | 올바른 장소에 있는 모든 시트를 쌓기 위해 맞춤 제작 된 정렬기를 사용 |
| 피브린 젤 위에 컨리치 케나티노사이클 단층을 획득하여 표피를 시뮬레이션합니다. | 칩에서 튜브를 제거하기 전에 젤에 세포 부착을 허용하여 기포가 채널에 유입되는 것을 방지하고 세포를 대체합니다. |
| 다공성 멤브레인을 통해 병렬 유동 프로토콜 동안 하부 채널로 누출되는 프리젤로 인해 채널을 따라 하이드로겔 높이 손실이 발생한다. | 병렬 흐름 설치 시 낮은 채널을 통해 PBS를 펌프합니다. |
| 젤 내부의 섬유아세포 퇴적물 | 혈소판 농도는 피브린 겔화를 가속화하기 위해 약간 증가했습니다. |
표 2: 적용된 현재 작업 및 솔루션 개발 중에 발견된 문제.
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Discussion
이 방법을 개발하는 동기는 피부 질환을 모델링하고 높은 처리량 플랫폼에서 새롭고 혁신적인 치료법의 효과를 연구하려는 욕구였습니다. 현재까지 이 실험실은 수동적으로 또는 3D 바이오 프린팅 기술의 도움으로 이러한 진모 표피 등가물을 생성합니다- 섬유아세포가 있는 피브린 젤은 세포 배양 삽입 플레이트에 삽입하고 그 위에 각질 세포를 파종합니다. 각질 세포가 합류하면 3D 배양은 각질 세포 분화를 유도하는 공기 액체 인터페이스에 노출되어 계층화된 표피를 생성하고 결과적으로 완전히 발달된 간 간 인간피부(32,33,34)를생성한다. 그러나, 이러한 3D 배양, 임상적으로 매우 관련이 있지만, 비싼, 시간이 많이 소요, 생리적 조건을 모방하지 않습니다.
조직-온-칩 기술은 세포 배양에서 생리적 상태를 에뮬레이트하는 플랫폼을 제공하여 약물 후보13,14,16,17,18,19,35의독성, 효능 및 전달에 대한 더 나은 이해를 가능하게 한다. 미세유체 "고전" 칩을 모델로 한 대부분의 조직은 세포의 단일 층으로 구성되며, 대부분 상피세포(22,26,42,27,28,36,37,38,39,40, 41)로구성됩니다. . 더 복잡하고 다층 조직의 모델링은 균질하고 중첩 된 조직 층을 생성하는 어려움에 의해 방해되었습니다.
이 작품의 주요 참신함은, 이전장치(22,43)와비교하여, 미세유체에 의한 미분화되고 단순화된 피부 구조를 생성하는 방법의 개발이다. 또한, 다른 공표 기술에 관한 또 다른 중요한혁신(44)은 비교적 간단하고 비용 효율적이며 사용하기 쉬운 일회용 칩 시스템을 생체 호환 비닐 시트로 제작하여 임시 제작을 가능하게 하는 것입니다. 이 시스템은 PDMS25에필요한 실리콘 웨이퍼및 복잡한 플라즈마 본딩 절차의 사용을 방지합니다. 이 소재를 기반으로 하는 칩은 각 칩 설계에 특정한 웨이퍼생성이 필요하며, 이는 프로토타이핑 공정의 가격을 높입니다. 이 모든 것은 현재의 "고전적" 기술을 비싸고 복잡하며 매우 유연하지 않습니다.
이러한 한계를 극복하기 위해 피부를 조직 모델로 사용하여 마이크로 머시닝에 의해 생성된 비닐 층을 기반으로 매우 유연하고 저렴하며 견고한 미세 유체 플랫폼을 제공합니다. 또한 hFB를 함유한 하부 진피 구획과 hKC의 단층으로 구성된 상피 구획을 함유한 이중층 피부 구조의 시상 생성을 허용하는 라미나르 유체의 병렬 흐름을 기반으로 하는 새로운 방법론을 제시합니다. 칩은 다공성 PC 멤브레인으로 구분된 두 개의 챔버로 구성됩니다. 상부 채널은 피부 구조를 포함하고 hKC 분화 및 계층화 및 / 또는 미래의 배양 매체, 공기, 또는 약물의 관류를 허용할 수있는 여유 공간을 떠난다. 하부 챔버는 지속적으로 세포 성장을 촉진하기 위해 배양 배지와 침투한다. 다공성 멤브레인의 사용은 펌핑 력으로 인한 고압을 받게 될 때 상부 챔버에서 하부 챔버로 프리 겔의 일부를 손실로 이어질 수 있다. 하부 챔버에 PBS 흐름을 도입하면 이러한 압력 차이를 보정하고 이 누출을 방지합니다.
하이드로겔 표면에 hKC의 분포는 피부 모델을 생성할 때 중요한 측면이다. 균일하게 퍼지지 않을 때, 균일하게 단층의 생성이 그러므로 표피 분화가 방해될 수 있습니다. 같은 방법으로, hFBs는 실제 피부에서 발견되는 그들의 자연적인 위치를 닮은 하이드로겔 안에 동등하게 분배되어야 합니다. 세포 침전 또는 튜브 차단을 피하기 위해 하이드로겔 조성물(특히 혈전 농도)은 겔화 시간과 전단 숱이 거동을 조절하기 위해 신중하게 연구되어야 합니다.
이러한 고무적인 연구 결과에도 불구하고, 계층 각질을 포함하여 잘 차별화된 인간 피부를 형성하기 위해 hKC 단층의 올바른 증식 및 분화를 촉진하는 데 필요한 시스템의 장기적인 기능을 입증하기 위해 미래의 작업이 필요합니다. 피부 외에, 이 시스템은 다른 복잡한, 다층 조직 구조의 생성을 허용할 것입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
하비에르 로드리게스 박사, 마리아 루이사 로페즈 박사, 카를로스 마텔란, 후안 프란시스코 로드리게스에게 매우 유용한 제안, 토론 및/또는 예비 데이터에 진심으로 감사드립니다. 또한 세르지오 페른란데스, 페드로 헤레로스, 라라 스톨젠부르크의 공헌에 감사드립니다. GFP 라벨hF와 hKC에 대한 박사 마르타 가르시아에 특별한 감사. 마지막으로, 기예르모 비즈카이노와 앙겔리카 코랄의 뛰어난 기술 적 지원을 인정합니다. 이 작품은 "Programa de Actividades de I+D 엔트레 그루포스 드 Investigación de la Comunidad de Madrid", Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 또한 "Programa de excelencia", 프로젝트 EPUC3M03, CAM에 의해 지원되었습니다. 콘세예리아 드 EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
| Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Culture plates | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
| Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
| Glass slide | Thermo Scientific | ||
| GFP-Human dermal fibroblasts | - | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
| H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
| Live/dead kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Syringes | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
| Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |
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