Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att generera en tredimensionell förenklad och odifferentierad hudmodell med hjälp av en mikromaskin mikrofluidisk plattform. En parallell flödesmetod gör det möjligt att in situ deponera ett hudfack för sådd av epitelceller ovanpå, allt styrt av sprutpumpar.
Abstract
Detta arbete presenterar en ny, kostnadseffektiv och pålitlig mikrofluidisk plattform med potential att generera komplexa flerskiktsvävnader. Som ett konceptbevis har en förenklad och odifferentierad mänsklig hud som innehåller en dermal (stromal) och ett epidermalt (epitelial) fack modellerats. För att uppnå detta har en mångsidig och robust, vinylbaserad enhet uppdelad i två kammare utvecklats, övervinna några av nackdelarna som finns i mikrofluidiska enheter baserade på polydimethylsiloxan (PDMS) för biomedicinska tillämpningar, såsom användning av dyr och specialiserad utrustning eller absorption av små, hydrofoba molekyler och proteiner. Dessutom utvecklades en ny metod baserad på parallella flöden, vilket möjliggör in situ-deponering av både dermala och epidermal avdelningar. Hudkonstruktionen består av en fibrinmatris som innehåller mänskliga primära fibroblaster och ett monoskikt av odödliga keratinocyter sådda ovanpå, som därefter upprätthålls under dynamiska odlingsförhållanden. Denna nya mikrofluidiska plattform öppnar möjligheten att modellera mänskliga hudsjukdomar och extrapolera metoden för att generera andra komplexa vävnader.
Introduction
Nyligen har framsteg gjorts mot utveckling och produktion av in vitro mänskliga hudmodeller för analys av toxiciteten hos kosmetiska och farmaceutiska produkter1. Forskare inom läkemedels- och hudvårdsindustrin har använt djur, möss är de vanligaste, för att testa sina produkter2,3,4,5. Testprodukter på djur är dock inte alltid förutsägande av svaret hos människor, vilket ofta leder till läkemedelssvikt eller negativa effekter hos människor och följaktligen till ekonomiska förluster5,6. Förenade kungariket var det första land som förbjöd användning av djur för kosmetisk testning 1998. Senare, 2013, förbjöd EU testning och approbation av kosmetika hos djur (EU:s kosmetikalagstiftning nr 1223/2009)7.
Detta förbud övervägs också av andra länder, t.ex. Förutom etiska problem gör de anatomiska skillnaderna mellan djur- och mänsklig hud djurförsök tidskrävande, dyra och ofta ineffektiva. Dessutom förväntas den globala marknaden för in vitro-toxikologitestning uppgå till 26,98 miljarder US-dollar år 20259. Av dessa skäl finns det ett behov av att utveckla nya metoder och alternativ för in vitro-studier, såsom bioengineered humana hudmodeller, som möjliggör testning av säkerhet och toxiska effekter av kosmetika och läkemedel utan användning av djur.
Det finns två olika typer av kommersiellt tillgängliga, in vitro, mänskliga hudmodeller. Den första typen består av stratifierade epidermala ekvivalenter som innehåller flera lager av differentierande keratinocyter som är sådda på olika material. Några av dem har godkänts av Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD) och godkänts av (Europeiska centrumet för validering av alternativa metoder (ECVAM) för hudkorrosion och irritationstestning, såsom EpiDerm eller SkinEthic10,11,12. Den andra typen är fullhudsekvivalenter med ett lager av differentierande mänskliga keratinocyter sådda på en tredimensionell (3D) byggnadsställning som innehåller fibroblaster, såsom T-Skin och EpiDerm-FT. Dessa modeller odlas dock under statiska förhållanden, vilket gör att de inte kan representera mänskliga fysiologiska förhållanden korrekt.
Det senaste intresset har fokuserat på att generera in vitro 3D-hudmodeller i cellodlingsinsatsformat (CCI) med dynamisk perfusion13,14,15,16,17,18,19. Dessa system kan dock inte betraktas som stricto sensu som mikrofluidiska skin-on-chips enligt deras klassiska definition på fältet. Ingbers definition för organ på ett chip anger att organet måste placeras inuti de mikrofluidiska kanalerna, vilket är ett villkor att endast ett fåtal enheter uppfyller20,21. Skin-on-chips har hittills modellerat mestadels enkel epitel som encelliga lager och/eller hudcelllager åtskilda av ett poröst membran22,23. Även om det har gjorts några framsteg modellering av huden i mikrofluidiska system16,24, finns det för närvarande ingen litteratur som visar ett organ-på-ett-chip-system som passar Ingbers definition, som kan producera en flerskiktad hud på plats och inklusive både epitelala och stromala komponenter.
I detta arbete presenteras en ny, kostnadseffektiv, robust, vinylbaserad mikrofluidisk plattform för hud-på-ett-chip-applikationer. Denna plattform producerades genom mikrobearbetning, vilket ger mer enkelhet i tillverkningsprocessen, liksom ökad flexibilitet och mångsidighet i enhetens layout, övervinna några av begränsningarna i PDMS25. Ett sätt att införa en förenklad hudkonstruktion genom ett parallellt flöde som styrs med sprutpumpar utformades också. Parallellt flöde gör att två vätskor med mycket olika viskositeter (en buffert och fibrin pre-gel i detta fall) kan perfuseras genom en kanal utan att blandas med varandra. Som ett bevis på koncept introducerades en dermo-epidermal konstruktion som innehåller fibroblaster inbäddade i en fibrin matris som härma dermis i enheten, ovanpå vilken en monolayer av keratinocyter laddades för att efterlikna odifferentierade epidermis. Dermal kupéhöjden kan moduleras genom att ändra flödeshastigheterna. Huvudförfattaren i detta arbete, jämfört med tidigare beskrivna modeller22,26,27,28,29, är utvecklingen av en 3D-konstruktion inuti en mikrokammare med hjälp av mikrofluidik. Även om denna artikel presenterar en förenklad odifferentierad hud, är det långsiktiga målet att generera och karakterisera en helt differentierad hudkonstruktion för att visa dess livskraft och funktionalitet för läkemedels- och kosmetiska teständamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Parametrar för spåndesign och mikrotillverkning
- Designa de mikrofluidiska spånskikten med FreeCAD öppen källkodsdesignprogramvara; se tabell 1 för kanalernas dimensioner. Inkludera fyra hål med diametern 2,54 mm i designen för att använda en skräddarsydd aligner för en korrekt lager superposition.
| Längd (μm) | Bredd (μm) | |
| Nedre kammaren | 28,400 | 800 |
| Övre kammare | 31,000 | 800 |
Tabell 1: Mått på enhetens övre och nedre kanaler.
- Skär 95 μm tjocka, självhäftande, genomskinliga vinylskivor i 30 cm x 30 cm rutor för att passa ordentligt i plottern.
- Använd Brother CanvasWorkspace-programvaran för att skapa en arbetsyta på 30 cm x 30 cm och fylla den med de utformade mönstren för chipets olika lager(bild 1A). Lagra den i en .svg fil.
- Skär 30 cm x 30 cm vinylskivor med kantplottern (figur 1B-D).
- Stick vinylplåten på en lågstiftig limmatta och eliminera alla luftbubblor om det behövs.
- Ladda upp .svg fil till plottern och ställ in skärparametrarna: skärblad: nivå 3; skärtryck: nivå 0; skärhastighet: nivå 1. Placera den självhäftande mattan med vinylen i plottern och starta skärprocessen.
- Klipp det övre kanalmönstret på 12 μm tjock dubbelsidig tejp vinyl genom att följa föregående steg.
Bild 1: Spåndesign och mikromachiningprocess. (A) Programvarulayout som visar arbetsutrymmet fyllt med både de övre och nedre mönstren avsedda för chipet. b)Kantplotter under styckningsprocessen. skärblad, hela vinylplåt och limmatta visas. c)Mönstrad vinyl lossnar från det skurna arket. (D) Prov av ett självhäftande vinylskikt mönstrat med den övre kanaldesignen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
2. TILLVERKNING AV PDMS-lager
- Blanda PDMS och härdningsmedlet i ett förhållande av 10:1 (v/v) och placera blandningen under vakuum i 15 minuter för att avlägsna luftbubblor. Häll 55 ml av blandningen i en 55 cm2 kvadratisk odlingsfat för att få ett 2 mm tjockt lager. Ta bort bubblor med en nål.
- Härda blandningen (steg 2.1) i en ugn i 1 h vid 80 °C. Lossa PDMS och skär det i rektanglar med chipdimensionerna. Gör hål för slangen med en 18 G sprutnål.
3. Spånmontering
OBS: För bättre förståelse, se figur 2.
- Montera hela enheten med en aligner för att justera kanaler, inlopp och uttag ordentligt. Stapla upp fyra vinylskikt (med motsvarande nedre mikromönster) för montering av den nedre kanalen, håll täcktejpen på det nedre lagret för att undvika att hålla fast vid justeringen.
- Skär och placera polykarbonatet (PC) poröst membran ovanpå den nedre kanalen för att separera det från det övre. Var försiktig så att du inte täcker inloppen på den nedre kanalen.
- Tillsätt tio vinylskikt med den övre kammardesignen. Stick ett dubbelsidigt tejp vinyllager med toppkanalmönstret ovanpå. Ta bort spånan från justeringsjustern och sätt den på glasglasglaset.
- Placera ett 2 mm tjockt PDMS-ark ovanpå det dubbelsidiga tejp vinylskiktet för att ge lämplig förankring för slangen och för att undvika läckage. Lämna en vikt ovanpå chipet över natten för att säkerställa att chipet är helt vattentätt. Sterilisera spånet genom att spola 70% v/v etanol i 5 min och tvätta sedan med destillerad H2O.
Bild 2: Mikrofluidisk spånenhet. a)Allmänt schema för enhetens montering. Nedre och övre kammare består av fyra respektive elva ovanpålagda vinylark. (B) Topp- och sidovyer av det mikrofluidiska chipet. Topp- och bottenkanaler representeras i rosa respektive blått. (C) Bild av spånenheten med hjälp av en skräddarsydd aligner. (D)Chipbild efter fullständig montering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
4. Pumpanslutningar
OBS: Den grafiska representationen av pumpanslutningar visas i bild 3.
- Anslut pump 1 till övre kammarens inlopp 1 (UCi1).
- Anslut pump 2 till övre kammaren Inlopp 2 (UCi2).
- Anslut pump 3 till nedre kammarens inlopp (LCi).
- Anslut övre kammarutloppet (UCo) och nedre kammarens uttag (LCo) till ett avfallsrör.
- Anslut sprutorna till varje inlopp med hjälp av polytetrafluoretylenrör (PTFE) och 18 G rostfria kontakter.
Bild 3: Pumpanslutningar och inlopps-/utloppsställe. (A) Diagram som visar anslutningen av de tre olika pumparna till deras respektive inlopp. Uttag ansluts till en avfallsbehållare. (B)Chipbild med märkta inlopp och uttag. Förkortningar: LCi = inlopp i nedre kammaren; LCo = utlopp i nedre kammaren; UCi1 = övre kammarens inlopp 1; UCi2 = övre kammarens inlopp 2; UCo = övre kammarutlopp. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
5. Cellkultur
OBS: HaCaT-cellinjen har ett kommersiellt ursprung. Mänskliga primära fibroblaster kommer från friska donatorer och erhölls från insamling av biologiska prover av mänskligt ursprung registrerade i "Registro Nacional de Biobancos para Investigación Biomédica del Instituto de Salud Carlos III".
- Arbeta i en cellodlingshuv, tidigare steriliserad under ultraviolett ljus och torkad med etanol.
- Tina H2B-GFP-HaCaT-celler (humana odödliga hud keratinocyter, hKCs) och GFP-mänskliga primära fibroblaster (hFBs) vid 37 °C, tillsätt 2 ml odlingsmedium och centrifugera i 7 min vid 20 °C vid 250 × g.
OBS: H2B-GFP-HaCaT celler är mänskliga odödliga keratinocyter modifierade för att uttrycka en hybrid histon H2B-grön fluorescerande protein (GFP), vilket ger deras kärnor med grön fluorescens. GFP-hFBs är mänskliga primära fibroblaster omvandlas med vektor pLZRS-IRES-EGFP för att uttrycka cytoplasmic grön fluorescens. Dessa celler ändrades efter tidigare publicerade protokoll30,31 - Odla både hKCs och hFBs i 1x DMEM kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum och 1% av antibiotiska/antimykotiska lösning. Förvärm odlingsmediet vid 37 °C före användning.
- Lossa cellerna genom att tvätta dem med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), tillsätt 2 ml trypsin/etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och inkubera dem i 10 min vid 37 °C.
- Inaktivera trypsin lägga till 4 ml kulturmedium. Återanvänd cellerna och överför dem till ett 15 ml-rör. Ta bort 10 μL för att räkna celler på en Neubauer-kammare och bestämma lämplig koncentration.
- Centrifugera 15 ml-röret i 7 min vid 20 °C vid 250 × g. Ta bort supernatanten och återanvänd pelletsen vid önskad koncentration: hFBs vid 50 000 celler/ml och hKCs vid 5·× 106 celler/ml.
6. Fibrinogen pre-gel beredning
- Aktivera trombin genom att lägga till 1 mL CaCl2 (1% w/v i NaCl) till injektionsflaskan.
- Tillsätt följande komponenter för att erhålla 1 ml fibrinhydrogel vid en slutlig koncentration av fibrin på 3,5 mg/ml: 59 μL aktiverat trombin (10 NIH-enheter/ml), 59 μL tranexamsyra(tabell över material,100 mg/ml), 764 μL odlingsmedium innehållande 50 000 hFB/mL.
OBS: Fibrinogen måste tillsättas i sista stund.
7. Protokoll för parallella flöden
- Pump 1x PBS med pump 3 genom LCi vid 50 μL/min under hela processen.
- Pumpuppoffringsvätska (1x PBS) med pump 2 genom UCi2 vid 100 μL/min.
- Ladda sprutan med förgelen, placera den snabbt i pump 1 och kör den vid 200 μL/min (figur 4A).
- Stopppumparna 1 och 2 när förgelen har lämnat UCo.
- Lämna spånet utan att ta bort slangen vid 37 °C i minst 10 minuter för att tillåta gelering.
- Pumpkulturmedium vid 50 μL/h med pump 3 till UCi2 över natten.
- Blockera UCi1 med ett lock.
8. hKCs monolayer sådd
- Kontrollera under mikroskopet att hFBs sprids 24 h efter generering av hudfacket.
- För in hKCs med pump 2 till UCi2 vid 5 ×·106 celler/ml vid 40 μL/min i 1 min (figur 4B).
- Lämna chipet över natten vid 37 °C i en fuktmättad inkubator för cellfäste.
- Pumpa färskt odlingsmedium med pump 3 endast genom LCi vid 50 μL/min (figur 4C).
Figur 4: Mikrofluidiskt protokoll för generering av dermo-epidermal konstruktion. (A) Tvärgående tvärsnitt som visar den parallella flödesprocessen för att generera hudutrymmet. b)Keratinocytmonolayer sådd 24 h efter rövfacksgenerering. c)Cellodlingsunderhåll inuti den mikrofluidiska enheten. (D) Tvärsnittsrekreation av huden inuti chipet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
9. Analys av cellviabilitet
OBS: Live/Dead kit fläckar celler med grön eller röd fluorescens beroende på deras levande eller döda tillstånd. För korrekt differentiering av lönsamheten måste icke-fluorescerande hKCs och hFBs användas i detta steg. Alla steg i proceduren utförs via UCi2 med pump 2.
- Tvätta toppkanalen med 1x PBS i 5 min vid 50 μL/min för att ta bort odlingsmediet.
- Pumpa luft för att ta bort 1x PBS vid 50 μL/min.
- Förbered Calcein AM/Ethidium homodimer-1 Kit (Live/Dead) lösning genom att följa tillverkarens instruktioner.
- Pump Live/Dead-lösning vid 50 μL/min i 2 min.
- Inkubera 30 min vid 37 °C i mörker.
- Tvätta toppkanalen genom att pumpa 1x PBS vid 50 μL/min i 2 minuter för att avlägsna eventuellt återstående reagens.
- Observera provet under det konfokala mikroskopet. Använd en excitationsvåglängd på 495/590 nm respektive en emissionsvåglängd på 519/617 nm för levande respektive döda celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det designade chipet består av två fluida kammare åtskilda av ett 5 μm porstorlek PC-membran som möjliggör tillväxten av cellen genom att tillåta passage av tillväxtfrämjande molekyler från den nedre kammaren. Den övre kammaren håller vävnad konstruktion, i detta fall, en monolayer av hKCs på en fibrin hydrogel som innehåller hFBs.
Kanalernas höjd bestäms av antalet självhäftande ark som läggs till varje kanal. Den nedre kammaren består av 4 lager (380 μm) och det övre av 10 ensidiga tejplager och ett dubbelsidigt (962 μm). Chipets dimensioner är 4 cm x 2 cm, vilket förbättrar dess manipulering. De självhäftande vinylskivorna ger vattentäthet och transparens för visuell inspektion av enheten. PDMS-skiktet var användbart för korrekt förankring av llthe slangar för att undvika läckage från hålen där rören var fixerade.
Enligt publicerad litteratur har injicerbara cellinnehållande hydrogeler i mikrofluidiska kammare med hjälp av sprutpumpar hittills inte rapporterats. Av denna anledning måste injicerbarheten hos fibrin pregelen bedömas. Vi observerade att under ett flöde av 50 μL/min blockerades sprutan. Flödeshastigheter som är högre än 200 μL/min kan dock skada cellerna. Rheologiska studier utfördes för att testa skjuvförtunnande beteende hos fibrin pre-gel, erhålla viskositeter från 10 till 50 cP inom det valda flödeshastighetsområdet (50-200 μL/min). Dessa resultat bidrog till att fastställa arbetsvillkoren för detta system.
I detta arbete har en parallell flödesmetod utvecklats baserat på generering av två överlagrade laminära flöden den nedre är pre-gel, medan den övre var offervätska (PBS). Numeriskt lösa Navier-Stokes ekvationer och införa lämpliga gränsförhållanden, fann vi att det fanns flera möjliga lösningar för att få önskad höjd. Med tanke på de skjuvhastighetsgränser som fastställts tidigare, för att uppnå en hydrogel på cirka 500 μm höjd, var flödeshastigheterna 104 respektive 222 μL/min för offer PBS respektive pre-gel. I praktiken användes mikroflöden på 100 och 200 μL/min för enkelhetens skull. När dessa värden återinfördes i modellen konstaterades de resultera i en gelhöjd på 576 μm, mycket lik de förväntade värdena (figur 5B). För att experimentellt kontrollera den föreslagna metodens funktion mättes höjden på hydrogelen längs den övre kammaren. En genomsnittlig höjd på 550 μm observerades (figur 5A), ungefär som förutsägelsen av vår matematiska modell.
Figur 5: Matematiska lösningar för parallella flöden för att välja lämpliga pregel- och offervätskaflöden för att erhålla önskad hudhöjd. (A) Framifrån av den konfokala bilden av hKCs sådd ovanpå fibringelen för att bedöma dess höjd. (B) Matematisk lösning för olika höjder beroende på förgel- och PBS-flödeshastigheter. Förkortningar: hKCs = humana odödliggjorda hud keratinocyter; PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Vid upprättandet av protokollet i början spolades PBS inte genom den nedre kanalen, vilket ledde till skillnader mellan gelens teoretiska höjd och den uppmätta. Denna höjdskillnad var ~40% jämfört med den uppskattade (figur 6). När protokollet optimerades och PBS pumpades genom den nedre kammaren löstes denna höjdförlust (figur 5).
Figur 6: Konfokal vy av hKCs sådda ovanpå hydrogelen för att mäta dess höjd när PBS inte pumpades genom den nedre kammaren. Förkortningar: hKCs = humana odödliggjorda hud keratinocyter; PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7A visar en fluorescerande bild av den övre kammaren som innehåller en fibrinhydrogel med inbäddade GFP-hFBs, som visar att 24 h efter lastning är cellerna jämnt fördelade längs kammaren och väl spridda. Figur 7B visar sammanflöde GFP-hKCs sådda ovanpå hydrogelen.
Bild 7: Fluorescensbilder av den övre kanalen som visar olika celler sådda i enheten. b)Sammanflöde GFP-hKCs sådda ovanpå hydrogelen 24 h efter hydrogelgenerering. Streckad röd linje indikerar kanalväggar. Skalstänger: 400 μm. Förkortningar: hFBs = humana primära fibroblaster; GFP-hKCs = gröna fluorescerande protein-uttrycka mänskliga odödliga huden keratinocyter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Det är viktigt att hålla systemet stängt över natten tills hKCs sediment och fästa på hydrogelytan. När slangen tas bort före cellfästet kommer luftbubblor in i kanalen och förskjuter celler, vilket leder till ett ickeuniformt konflödesmonolayer, som visas i figur 8.
Bild 8: Ovanifrån hydrogelytan när du tar bort slangar omedelbart efter hKCs-sådd. Streckad röd linje indikerar kanalväggar. Skalstång: 400 μm. Förkortningar: hKCs = humana odödliggjorda hud keratinocyter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Cellviabilitetstestet som utfördes på hFBs inbäddade i hydrogelen utfördes 24 h efter lastning med parallellflödesmetoden, vilket visar en cellviabilitet på ~ 95%. Samma test som utfördes på hKCs celler 24 h efter sådd av dem på fibrin hydrogel visade liknande resultat. Nästa steg var att generera en dermo-epidermal konstruktion och studera dess struktur med hjälp av konfokal mikroskopi efter 24 h (figur 9).
Figur 9: Rekonstruerad 3D-konfokal bild av den odifferentierade hudmodellen i det mikrofluidiska chipet. Gul streckad linje anger ytan på hydrogelen som separerar hKCs (överst) från hFBs inbäddade i gelén (botten). Förkortningar: hFBs = humana primära fibroblaster; hKCs = humana odödliga hud keratinocyter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Det är viktigt att hitta en jämvikt mellan skjuvförtunnande beteende hos fibrinogengelen och dess geleringstid: om det tar för lång tid att etablera det parallella flödet koagulerar det och blockerar systemet; Om geleringsprocessen är för långsam kommer hFBs i hydrogelen att sedimentera enligt figur 10. Beteendet hos detta övergående tillstånd kan regleras genom att variera trombinkoncentrationen.
Figur 10: Konfokal bild av en fibrinhydrogel som visar sedimenterade hFBs (i rött) på grund av en långsam fibringeleringstid. En hKCs monolayer (i blått) visas ovanpå gelén. Förkortningar: hFBs = humana primära fibroblaster; hKCs = humana odödliga hud keratinocyter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Under enheten planifiering och bakre experimentella metoder uppstod vissa komplikationer som måste lösas för att få en optimalt fungerande enhet och välstrukturerad vävnad. Dessa problem visas i tabell 2, tillsammans med lösningarna för felsökning.
| Problem | Lösningar |
| Vi introducerar en 3D-hydrogel i den övre kammaren, vilket lämnar ledigt utrymme ovanför att så keratinocyter ovanpå efter hudgenerering | Applicera ett parallellt flöde av två vätskor (PBS och pre-gel) med olika viskositeter för att skapa ett dermalt fack med kontrollerad höjd. |
| Feljustering av kanalen under vinylplåtstapling | Använd en skräddarsydd aligner för att stapla alla ark på rätt plats |
| Uppnå ett sammanflöde keratinocytmonolayer ovanpå fibringelen för att simulera epidermis | Låt cellfästet på gelén innan du tar bort rören från chipet, förhindra att luftbubblor kommer in i kanalen och förskjuter cellerna. |
| Hydrogel höjdförlust längs kanalen på grund av att pre-gel läcker till den nedre kanalen under parallellflödesprotokoll genom det porösa membranet. | Pumpa PBS genom den nedre kanalen under parallellflödesetablering. |
| Fibroblast sedimentering inuti gelén | Trombinkoncentrationen ökade något för att påskynda fibringelering |
Tabell 2: Problem som konstaterats under utvecklingen av det nuvarande arbetet och de lösningar som tillämpas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Motivationen att utveckla denna metod var viljan att modellera hudsjukdomar och studera effekterna av nya och innovativa terapier i en plattform med hög genomströmning. Hittills producerar detta laboratorium dessa dermo-epidermal motsvarigheter genom gjutning-antingen manuellt eller med hjälp av 3D bioprinting teknik-fibrin gel med fibroblaster i en cell kultur infoga tallrik och så keratinocyter ovanpå den. När keratinocyterna når sammanflöde utsätts 3D-kulturen för luft-vätskegränssnittet, vilket inducerar keratinocytdifferentiering, vilket genererar en stratifierad epidermis och följaktligen en fullt utvecklad interfolliculär mänsklig hud32,33,34. Dessa 3D-kulturer, om än mycket relevanta kliniskt, är dock dyra, tidskrävande och efterliknar inte fysiologiska förhållanden.
Vävnad-på-ett-chip-teknik ger en plattform för att efterlikna fysiologiska förhållanden i cellkulturen, vilket möjliggör en bättre förståelse för toxicitet, effekt och leverans av läkemedelskandidater13,14,15,16,17,18,19,35. De flesta vävnader som modelleras på mikrofluidiska "klassiska" chips består av enstaka lager av celler, mestadels epitelceller22,26,42,27,28,36,37,38,39,40,41 . Modellering av mer komplexa, flerskiktade vävnader har hämmats av svårigheten att generera homogena och överlagrade vävnadslager.
Huvudförfattaren i detta arbete, jämfört med tidigare enheter22,43, är utvecklingen av en metod för att generera en odifferentierad och förenklad hudkonstruktion med hjälp av mikrofluidik. En annan viktig nyhet när det gäller annan offentliggjord teknik44 är dessutom utformningen av ett relativt enkelt, kostnadseffektivt och lättanvänt engångschipsystem av biokompatibla vinylskivor som möjliggör ad hoc-tillverkning. Detta system undviker användning av kiselplattor och komplicerade plasmabindningsförfaranden som behövs med PDMS25. Chips baserade på detta material kräver generering av wafers som är specifika för varje chipdesign, vilket höjer priset på prototypprocessen. Allt detta gör den nuvarande "klassiska" tekniken dyr, komplex och inte särskilt flexibel.
För att övervinna dessa begränsningar, med hud som en vävnadsmodell, presenterar vi en mycket flexibel, billig och robust mikrofluidisk plattform baserad på vinyllager, producerad av mikromachining. Vi presenterar också en ny metodik baserad på det parallella flödet av laminar vätskor som gör det möjligt in situ generering av en bilayer hud konstruktion med en lägre dermal fack innehåller hFBs och en övre epidermal fack bestående av en monolayer av hKCs. Chipet består av två kammare åtskilda av ett poröst PC-membran. Den övre kanalen innehåller hudkonstruktionen och lämnar ledigt utrymme för att tillåta hKC-differentiering och stratifiering och/ eller perfusion av odlingsmedium, luft eller till och med droger i framtiden. Den nedre kammaren är kontinuerligt perfunderad med odlingsmedium för att främja celltillväxt. Användning av ett poröst membran kan leda till förlust av en del av förgelen från den övre kammaren till den nedre när den utsätts för högt tryck på grund av pumpkraft. Införandet av ett PBS-flöde i den nedre kammaren kompenserar denna tryckskillnad och undviker detta läckage.
Fördelningen av hKCs på hydrogelytan är en viktig aspekt när man genererar en hudmodell. När de inte är homogent spridda kan genereringen av ett enhetligt monoskikt och därför epidermal differentiering hämmas. På samma sätt måste hFBs fördelas lika inom hydrogelen för att likna deras naturliga plats där de finns i verklig hud. För att undvika cellsedimentation eller slangblockering måste hydrogelsammansättningen (särskilt trombinkoncentrationen) noggrant studeras för att kontrollera geleringstider och skjuvningsförtunnande beteende.
Trots dessa uppmuntrande resultat krävs framtida arbete för att visa att systemet fungerar på lång sikt för att främja korrekt spridning och differentiering av hKC-monolagret för att bilda en väl differentierad mänsklig hud inklusive ett hornhinne. Förutom hud skulle detta system tillåta generering av andra komplexa, flerskiktade vävnadskonstruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar verkligen Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán och Juan Francisco Rodríguez för mycket användbara förslag, diskussioner och / eller preliminära data. Vi tackar också Sergio Férnandez, Pedro Herreros och Lara Stolzenburgs bidrag till detta projekt. Särskilt tack till Dr. Marta García för GFP-märkta hFBs och hKCs. Slutligen erkänner vi guillermo Vizcaínos och Angélica Corrals utmärkta tekniska hjälp. Detta arbete stöddes av "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Detta arbete stöddes också av "Programa de excelencia", Project EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
| Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Culture plates | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
| Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
| Glass slide | Thermo Scientific | ||
| GFP-Human dermal fibroblasts | - | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
| H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
| Live/dead kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Syringes | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
| Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |
References
- McNamee, P., et al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
- Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).
- Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
- Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
- Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A.
- H.R.2858 - Humane Cosmetics Act. 114th Congress. , Available from: https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858 (2016).
- Global in-vitro toxicology testing market report: size, share & trends analysis 2014-2015. , Available from: https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html (2018).
- Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B.
- OECD. In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431. OECD Guideline for Testing of Chemicals. , (2019).
- Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients. International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).
- vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).
- Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
- Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents. Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).
- Wu, R., et al. Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function. Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).
- Materne, E. -M., et al. The multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526 (2015).
- Schimek, K., et al. Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications. Bioengineering. 5 (2), 43 (2018).
- Alberti, M., et al. Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing. Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E.
- Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).
- Wufuer, M., et al. Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment. Scientific Reports. 6, 37471 (2016).
- Ramadana, Q., Ting, F. C. W. In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin. Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).
- Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898 (2020).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Huh, D. A human disease model of drug toxicity - induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice. Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).
- Beckwitt, C. H., et al. Liver ' organ on a chip '. Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).
- Poceviciute, R., Ismagilov, R. F.
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
- Escámez, M. J., et al. Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement. Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).
- Llames, S. G., et al. Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin. Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).
- Llames, S., et al. Clinical results of an autologous engineered skin. Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).
- Cubo, N., Garcia, M., del Cañizo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. 3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis. Biofabrication. 9 (1), 015006 (2016).
- Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip. Biomaterials. 116, 48-56 (2017).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535 (2016).
- Marx, U., et al. Human-on-a-chip' developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man. Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation. Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture. Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).
- Ren, K., Chen, Y., Wu, H. New materials for microfluidics in biology. Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).
