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Bioengineering

माइक्रोमशीन्ड माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में एक सरलीकृत त्रि-आयामी त्वचा-ऑन-ए-चिप मॉडल का उत्पादन

Published: May 17, 2021 doi: 10.3791/62353
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1,4
1Department of Bioengineering and Aerospace Engineering, Universidad Carlos III de Madrid (UC3M), 2Group of Optics, Photonics and Biophotonics (GOFB). Center for Biomedical Technology, Universidad Politécnica de Madrid, 3Division of Epithelial Biomedicine, CIEMAT, 4Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón

Summary

यहां, हम माइक्रोमशीन्ड माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का उपयोग करके त्रि-आयामी सरलीकृत और अविभेदित त्वचा मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एक समानांतर प्रवाह दृष्टिकोण शीर्ष पर एपिथेलियल कोशिकाओं के बोने के लिए एक डर्मल डिब्बे के सीटू जमाव की अनुमति देता है, सभी सिरिंज पंपों द्वारा नियंत्रित होते हैं।

Abstract

यह काम जटिल बहुस्तरीय ऊतकों को उत्पन्न करने की क्षमता के साथ एक नया, लागत प्रभावी और विश्वसनीय माइक्रोफ्लुइडिक मंच प्रस्तुत करता है। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, एक सरलीकृत और अविभेदित मानव त्वचा जिसमें एक डर्मल (स्ट्रोमल) और एक एपिडर्मल (एपिथेलियल) डिब्बे को मॉडलिंग किया गया है। इसे पूरा करने के लिए, दो कक्षों में विभाजित एक बहुमुखी और मजबूत, विनाइल आधारित उपकरण विकसित किया गया है, बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) के आधार पर माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में मौजूद कुछ कमियों पर काबू पाने, जैसे महंगे और विशेष उपकरणों का उपयोग या छोटे, हाइड्रोफोबिक अणुओं और प्रोटीन का अवशोषण। इसके अलावा, समानांतर प्रवाह पर आधारित एक नई विधि विकसित की गई थी, जिससे डर्मल और एपिडर्मल दोनों डिब्बों के सीटू जमाव में सक्षम हो गया था। त्वचा के निर्माण में एक फाइब्रिन मैट्रिक्स होता है जिसमें मानव प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट होता है और शीर्ष पर वरीयता प्राप्त अमर केराटिनोसाइट्स का एक मोनोलेयर होता है, जिसे बाद में गतिशील संस्कृति स्थितियों के तहत बनाए रखा जाता है। यह नया माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म मानव त्वचा रोगों को मॉडल करने और अन्य जटिल ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए विधि को एक्सट्रपलेशन करने की संभावना को खोलता है।

Introduction

हाल ही में, कॉस्मेटिक और दवा उत्पादों की विषाक्तता के विश्लेषण के लिए इन विट्रो मानव त्वचा मॉडल के विकास और उत्पादन की ओर प्रगति की गई है1। दवा और त्वचा देखभाल उद्योगों के शोधकर्ता अपने उत्पादों2,3,4,5का परीक्षण करने के लिए जानवरों, चूहों का सबसे आम होने के नाते उपयोग कर रहे हैं। हालांकि, जानवरों पर परीक्षण उत्पाद हमेशा मनुष्यों में प्रतिक्रिया का पूर्वानुमान नहीं होता है, जो अक्सर मनुष्यों में दवा विफलता या प्रतिकूल प्रभाव की ओर जाता है और परिणामस्वरूप आर्थिक नुकसान5,6 होताहै। ब्रिटेन पहला देश था जिसने १९९८ में कॉस्मेटिक परीक्षण के लिए जानवरों के इस्तेमाल पर रोक लगा दी थी । बाद में, २०१३ में, यूरोपीय संघ के परीक्षण और जानवरों में सौंदर्य प्रसाधन के अनुमोदन पर प्रतिबंध लगा दिया (यूरोपीय संघ सौंदर्य प्रसाधन विनियमन नंबर 1223/2009)7।

इस निषेध पर अन्य देशों द्वारा भी विचार किया जा रहा है जैसे कि संयुक्त राज्य अमेरिकामें' द ह्यूमेर कॉस्मेटिक्स एक्ट ' । नैतिक चिंताओं के अलावा, पशु और मानव त्वचा के बीच शारीरिक मतभेद पशु परीक्षण समय लेने वाली, महंगी, और अक्सर अप्रभावी बनाते हैं । इसके अलावा, वैश्विक इन विट्रो विष विज्ञान परीक्षण बाजार का आकार 2025 9तक 26.98 अरब डॉलर तक पहुंचने की उम्मीद है। इन कारणों से, बायोइंजीनियर्ड मानव त्वचा मॉडल जैसे इन विट्रो अध्ययनों के लिए नए तरीकों और विकल्पों को विकसित करने की आवश्यकता है, जो जानवरों के उपयोग के बिना सौंदर्य प्रसाधनों और दवाओं की सुरक्षा और विषाक्त प्रभावों के लिए परीक्षण को सक्षम करते हैं।

दो अलग-अलग प्रकार के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, इन विट्रो, मानव त्वचा मॉडल। पहले प्रकार में स्तरीकृत एपिडर्मल समकक्ष होते हैं जिनमें विभिन्न सामग्रियों पर वरीयता प्राप्त केराटिनोसाइट्स को अलग करने की कई परतें होती हैं। उनमें से कुछ को आर्थिक सहयोग और विकास संगठन (ओईसीडी) द्वारा अनुमोदित किया गया है और त्वचा जंग और जलन परीक्षण के लिए (वैकल्पिक विधियों के सत्यापन के लिए यूरोपीय केंद्र (ईसीवीएएम) द्वारा मान्य किया गया है, जैसे एपिडर्म या स्किनएथिक10,11,12। दूसरा प्रकार पूर्ण त्वचा समकक्ष हैं, जिनमें तीन आयामी (3 डी) पाड़ पर वरीयता प्राप्त मानव केराटिनोसाइट्स को अलग करने की एक परत होती है जिसमें फाइब्रोब्लास्ट होते हैं, जैसे टी-स्किन और एपिडर्म-एफटी। हालांकि, इन मॉडलों को स्थिर परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया जाता है, जो उन्हें मानव शारीरिक स्थितियों का सही प्रतिनिधित्व करने में असमर्थ बनाता है।

हाल ही में रुचि ने गतिशीलपरफ्यूजन13, 14, 15, 16, 17, 18, 19के साथ सेल कल्चर-डालने (सीसीआई) प्रारूपोंमें इन विट्रो 3डीत्वचा मॉडल पैदा करने पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, इन प्रणालियों को क्षेत्र में उनकी शास्त्रीय परिभाषा के अनुसार माइक्रोफ्लुइडिक स्किन-ऑन-चिप्स के रूप में सख्त नहीं माना जा सकता है। अंगों के लिए है Ingber परिभाषा पर एक चिप राज्यों है कि अंग microfluidic चैनलों के अंदर रखा जाना चाहिए, जो एक शर्त है कि केवल कुछ उपकरणों को पूरा20,21। स्किन-ऑन-चिप्स ने अब तक ज्यादातर सरल एपिथेलिया को एकल-कोशिका परतों और/या डर्मल सेल परतों के रूप में मॉडलिंग की हैजोएक असुरक्षित झिल्ली22,23से अलग हैं । यद्यपि माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम16,24में त्वचा को मॉडलिंग करने में कुछ प्रगति हुई है, वर्तमान में कोई साहित्य नहीं है जो इंगबर की परिभाषा को फिट बैठता है, जो सीटू में एक बहुस्तरीय त्वचा का उत्पादन करने में सक्षम है और दोनों एपिथेलियल और स्ट्रॉमल घटकों को शामिल करता है।

इस काम में स्किन-ऑन-ए-चिप एप्लीकेशंस के लिए एक नया, कॉस्ट-प्रभावी, दमदार, विनाइल बेस्ड माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म पेश किया जाता है । इस मंच को माइक्रो-मशीनिंग द्वारा उत्पादित किया गया था, जो निर्माण प्रक्रिया में अधिक सादगी प्रदान करता है, साथ ही डिवाइस के लेआउट में लचीलापन और बहुमुखी प्रतिभा में वृद्धि, पीडीएमएस25की कुछ सीमाओं पर काबू पा रहा था। सिरिंज पंपों के साथ नियंत्रित समानांतर प्रवाह के माध्यम से एक सरलीकृत त्वचा निर्माण शुरू करने का एक तरीका भी डिजाइन किया गया था। समानांतर प्रवाह बहुत अलग चिपचिपाहट के साथ दो तरल पदार्थ (इस मामले में एक बफर और फाइब्रिन प्री-जेल) को एक दूसरे के साथ मिश्रण किए बिना एक चैनल के माध्यम से छिद्रित होने की अनुमति देता है। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, एक डर्मो-एपिडर्मल निर्माण जिसमें फाइब्रिन मैट्रिक्स में एम्बेडेड फाइब्रोब्लास्ट होते हैं, जो डर्मिस की नकल करते हैं, डिवाइस में पेश किया गया था, जिसके शीर्ष पर केराटिनोसाइट्स का एक मोनोलेयर अविभेदित एपिडर्मिस का अनुकरण करने के लिए लोड किया गया था। डर्मल डिब्बे की ऊंचाई को प्रवाह दरों को संशोधित करके संग्राहक किया जा सकता है। इस काम की मुख्य नवीनता, पहले वर्णित मॉडल22,26, 27,28,29की तुलना में, माइक्रोफ्लुइडिक्स के माध्यम से माइक्रोचैम्बर के अंदर 3 डी निर्माण का विकास है। यद्यपि यह लेख एक सरलीकृत अविभेदित त्वचा प्रस्तुत करता है, दीर्घकालिक लक्ष्य दवा और कॉस्मेटिक परीक्षण उद्देश्यों के लिए अपनी व्यवहार्यता और कार्यक्षमता प्रदर्शित करने के लिए पूरी तरह से विभेदित त्वचा निर्माण उत्पन्न और विशेषता है।

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Protocol

1. चिप डिजाइन और माइक्रोमशीनिंग पैरामीटर

  1. फ्रीकैड ओपन-सोर्स डिजाइन सॉफ्टवेयर के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चिप परतों को डिजाइन करें; चैनलों के आयामों के लिए तालिका 1 को देखें। एक सही परत सुपरपोजिशन के लिए कस्टम-निर्मित एलाइनर का उपयोग करने के लिए डिजाइन में चार 2.54 मिमी व्यास छेद शामिल करें।
लंबाई (माइक्रोन) चौड़ाई (माइक्रोन)
लोअर चैंबर 28,400 800
ऊपरी कक्ष 31,000 800

तालिका 1:डिवाइस के ऊपरी और निचले चैनलों के आयाम।

  1. प्लॉटर में ठीक से फिट करने के लिए 95 माइक्रोन-मोटी, चिपकने वाला, पारदर्शी विनाइल शीट को 30 सेमी x 30 सेमी वर्गों में काटें।
  2. 30 सेमी x 30 सेमी कार्यक्षेत्र बनाने के लिए भाई कैनवासवर्कस्पेस सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, और इसे चिप(चित्रा 1A)की विभिन्न परतों के लिए डिजाइन किए गए पैटर्न से भरें। इसे .svg फाइल में स्टोर करें।
  3. 30 सेमी x 30 सेमी विनाइल शीट्स को एज प्लॉटर(चित्रा 1B-D)के साथ काटें ।
    1. विनाइल शीट को कम टैक चिपकने वाली चटाई पर चिपकाएं, और यदि आवश्यक हो तो सभी हवा के बुलबुले को खत्म करें।
    2. .svg फ़ाइल को प्लॉटर पर अपलोड करें, और काटने के मापदंड निर्धारित करें: ब्लेड काटना: स्तर 3; दबाव में कटौती: स्तर 0; गति में कटौती: स्तर 1। विनाइल के साथ चिपकने वाली चटाई को प्लॉटर में रखें, और काटने की प्रक्रिया शुरू करें।
  4. पिछले चरणों का पालन करके 12 माइक्रोन-मोटी डबल-तरफा टेप विनाइल पर शीर्ष चैनल पैटर्न को काटें।

Figure 1
चित्रा 1:चिप डिजाइन और माइक्रोमशीनिंग प्रक्रिया। (A)सॉफ्टवेयर लेआउट में चिप के लिए डिजाइन किए गए टॉप और बॉटम दोनों पैटर्न से भरा वर्किंग स्पेस दिखाया गया है । (ख)काटने की प्रक्रिया के दौरान एज प्लॉटर; काटने ब्लेड, पूरे विनाइल शीट, और चिपकने वाली चटाई दिखाया गया है। (ग)पैटर्न विनाइल कट शीट से अलग किया जा रहा है । (घ)शीर्ष चैनल डिजाइन के साथ पैटर्न वाली चिपकने वाली विनाइल लेयर का नमूना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. पीडीएमएस लेयर निर्माण

  1. पीडीएमएस और इलाज एजेंट को 10:1 (v/v) के अनुपात में मिलाएं, और मिश्रण को हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए वैक्यूम के नीचे रखें। 2 मिमी मोटी परत प्राप्त करने के लिए मिश्रण के 55 एमएल को55 सेमी 2 वर्ग संस्कृति पकवान में डालें। एक सुई के साथ बुलबुले निकालें।
  2. 80 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक ओवन में मिश्रण (चरण 2.1) का इलाज करें। पीडीएमएस को अनमोल्ड करें और चिप आयामों के साथ आयतों में कटौती करें। एक 18 जी सिरिंज सुई के साथ टयूबिंग के लिए छेद करें।

3. चिप विधानसभा

नोट: बेहतर समझ के लिए, चित्रा 2देखें ।

  1. चैनलों, इनलेट्स और आउटलेट्स को ठीक से समायोजित करने के लिए एक एलाइनर का उपयोग करके पूरे डिवाइस को इकट्ठा करें। निचले चैनल को इकट्ठा करने के लिए चार विनाइल परतों (इसी नीचे माइक्रोपैटर्न के साथ) को ढेर करें, जो एलाइनर से चिपके रहने से बचने के लिए नीचे की परत के कवर टेप को रखते हैं।
  2. इसे ऊपरी चैनल से अलग करने के लिए पॉली कार्बोनेट (पीसी) असुरक्षित झिल्ली को काटें और रखें। सावधान रहें कि निचले चैनल के इनलेट्स को कवर न करें।
  3. ऊपरी कक्ष डिजाइन के साथ दस विनाइल परतें जोड़ें। शीर्ष पर शीर्ष चैनल पैटर्न के साथ एक डबल तरफा टेप विनाइल परत छड़ी। चिप को एलाइनर से निकालकर ग्लास स्लाइड पर चिपका दें।
  4. टयूबिंग के लिए उपयुक्त प्रस्तोता प्रदान करने और रिसाव से बचने के लिए डबल-तरफा टेप विनाइल परत के शीर्ष पर 2-मिमी मोटी पीडीएमएस शीट रखें। चिप पूरी तरह से निर्विवाद है सुनिश्चित करने के लिए रात भर चिप के शीर्ष पर एक वजन छोड़ दें । 5 मिनट के लिए 70% v/v इथेनॉल फ्लश करके चिप को स्टरलाइज करें, और फिर आसुत एच2ओ से धोएं।

Figure 2
चित्रा 2:माइक्रोफ्लुइडिक चिप असेंबली। (डिवाइसकी असेंबली की सामान्य योजना। निचले और ऊपरी कक्ष क्रमशः चार और ग्यारह अतिरंजित विनाइल शीट से बने होते हैं। (ख)माइक्रोफ्लुइडिक चिप के शीर्ष और पार्श्व विचार । ऊपर और नीचे चैनलों क्रमशः गुलाबी और नीले रंग में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । (ग)कस्टम-निर्मित एलाइनर का उपयोग करके चिप असेंबली की छवि। (घ)पूरी असेंबली के बाद चिप छवि । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

4. पंप कनेक्शन

नोट: पंप कनेक्शन का चित्रमय प्रतिनिधित्व चित्र 3में दिखाया गया है ।

  1. ऊपरी चैंबर इनलेट 1 (UCi1) के लिए पंप 1 कनेक्ट करें।
  2. ऊपरी चैंबर इनलेट 2 (UCi2) के लिए पंप 2 कनेक्ट करें।
  3. पंप 3 को लोअर चैंबर इनलेट (एलसीआई) से कनेक्ट करें।
  4. ऊपरी चैंबर आउटलेट (यूको) और लोअर चैंबर आउटलेट (LCo) एक बेकार ट्यूब के लिए कनेक्ट करें ।
  5. पॉलीटट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) ट्यूब और 18 जी स्टेनलेस स्टील कनेक्टर का उपयोग करके सीरिंज को प्रत्येक इनलेट से कनेक्ट करें।

Figure 3
चित्र 3-पंप कनेक्शन और इनलेट्स/आउटलेट्स स्थान। (A)आरेख अपने-अपने इनलेट्स के लिए तीन अलग-अलग पंपों का कनेक्शन दिखाता है। आउटलेट एक अपशिष्ट कंटेनर से कनेक्ट होते हैं। (ख)लेबल वाले इनलेट्स और आउटलेट्स के साथ चिप इमेज । संक्षिप्त: एलसीआई = लोअर चैंबर इनलेट; LCo = लोअर चैंबर आउटलेट; UCi1 = ऊपरी कक्ष इनलेट 1; UCi2 = ऊपरी कक्ष इनलेट 2; यूको = ऊपरी चैंबर आउटलेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

5. सेल संस्कृति

नोट: HaCaT सेल लाइन एक वाणिज्यिक मूल है । मानव प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट स्वस्थ दानदाताओं से आते हैं और "रजिस्ट्रो नैसिनल डी बायोबांकोस पैरा इन्वेस्टिगेसिओन बायोमेडिका डेल इंस्टीटोटो डी सालुद कार्लोस III" में पंजीकृत मानव मूल के जैविक नमूनों के संग्रह से प्राप्त किए गए थे।

  1. सेल कल्चर हुड में काम करें, पहले पराबैंगनी प्रकाश के तहत निष्फल और इथेनॉल के साथ मिटा दिया जाता है।
  2. गल एच 2बी-जीएफपी-हाकैट कोशिकाएं (मानव अमर त्वचा केराटिनोसाइट्स, एचकेसीएस) और जीएफपी-ह्यूमन प्राइमरी फाइब्रोब्लास्ट (एचएफबी) 37 डिग्री सेल्सियस पर, संस्कृति माध्यम के 2 एमएल जोड़ें, और 250 × जीपर 20 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें।
    नोट: H2B-GFP-HaCaT कोशिकाओं मानव अमर keratinocytes एक संकर histone H2B-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करने के लिए संशोधित कर रहे हैं, हरी फ्लोरेसेंस के साथ अपने नाभिक प्रदान करते हैं । जीएफपी-एचएफबी मानव प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट हैं जो साइटोप्लाज्मिक ग्रीन फ्लोरेसेंस व्यक्त करने के लिए वेक्टर पीएलजेडआरएस-आईआरएस-ईजीएफपी के साथ परिवर्तित होते हैं। इन कोशिकाओं को पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल30,31 के बाद संशोधित किया गया था
  3. संस्कृति दोनों HKCs और 1x DMEM में hFBs 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटीबायोटिक के 1% के साथ पूरक/ उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति माध्यम को पहले से गर्म करें।
  4. कोशिकाओं को 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) से धोकर अलग करें, ट्राइपसिन/एथिलेंडाइमाइन टेट्राएसेटिक एसिड (EDTA) के 2 मिलील जोड़कर और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग करें ।
  5. निष्क्रिय ट्राइप्सिन संस्कृति माध्यम के 4 एमएल जोड़ने। कोशिकाओं को फिर से रीसुस्ल करें, और उन्हें 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक Neubauer कक्ष पर कोशिकाओं की गिनती और उचित एकाग्रता निर्धारित करने के लिए 10 μL निकालें ।
  6. सेंट्रलाइज 7 मिनट के लिए 15 एमएल ट्यूब 20 डिग्री सेल्सियस पर 250 × जीपर । सुपरनैंट निकालें, और वांछित एकाग्रता पर छर्रों को फिर से खर्च करें: 50,000 कोशिकाओं/एमएल और एचकेसीएस पर 50 × 106 कोशिकाओं/एमएल पर एचएफसी।

6. फिब्रिनोजेन प्री-जेल तैयारी

  1. सीएसीएल2 (एनएसीएल में 1% w/v) के 1mL को शीशी में जोड़कर थ्रोम्बिन को सक्रिय करें।
  2. 3.5 मिलीग्राम/एमएल के फाइब्रिन की अंतिम एकाग्रता पर एक फाइब्रिन हाइड्रोगेल के 1 एमएल प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित घटकों को जोड़ें: सक्रिय थ्रोम्बिन के 59 माइक्रोन (10 एनआईएच इकाइयां/ एल), 59 माइक्रोनएक्सेमिक एसिड(सामग्री की तालिका,100 मिलीग्राम/एमएल), 50,000 एचबी/एमएल युक्त संस्कृति माध्यम का 764 माइक्रोन, 118 μL का फाइब्रिनोजेन (20 मिलीग्राम/एमएल नैसीएल में (0.9% w/v)) ।
    नोट: फिब्रिनोजेन को अंतिम समय में जोड़ा जाना चाहिए।

7. समानांतर प्रवाह प्रोटोकॉल

  1. पूरी प्रक्रिया के दौरान 50 माइक्रोन/
  2. पंप बलि तरल पदार्थ (1x PBS) 100 μL/
  3. प्री-जेल के साथ सिरिंज लोड करें, इसे तेजी से पंप 1 में रखें, और इसे 200 μL/min(चित्रा 4A) पर चलाएं।
  4. एक बार प्री-जेल यूको से बाहर निकलने के बाद पंप 1 और 2 बंद करें।
  5. जेलेशन की अनुमति देने के लिए कम से कम 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबिंग को हटाने के बिना चिप छोड़ दें।
  6. पंप संस्कृति माध्यम ५० μL/h पर UCi2 के माध्यम से पंप 3 रातोंरात ।
  7. एक टोपी के साथ UCi1 ब्लॉक।

8. एचकेसीएस मोनोलेयर सीडिंग

  1. माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें कि डर्मल डिब्बे की पीढ़ी के बाद एचबी 24 घंटे फैलते हैं।
  2. 5 ×10 6 कोशिकाओं/एमएल पर UCi2 के माध्यम से पंप2 के साथ hKCs परिचय 1 मिनट के लिए ४० μL/min(चित्रा 4B)।
  3. सेल अटैचमेंट के लिए आर्द्रता-संतृप्त इनक्यूबेटर में चिप को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दें।
  4. पंप 3 के साथ ताजा संस्कृति माध्यम केवल ५० μL/मिनट(चित्रा 4C)पर LCi के माध्यम से ।

Figure 4
चित्र 4:डर्मो-एपिडर्मल निर्माण की पीढ़ी के लिए माइक्रोफ्लुइडिक प्रोटोकॉल। (ए)ट्रांसवर्स क्रॉस-सेक्शन जो डर्मल डिब्बे को उत्पन्न करने के लिए समानांतर प्रवाह प्रक्रिया दिखाता है। (ख)केराटिनोसिटे मोनोलेयर सीडिंग 24 घंटे डर्मल कंपार्टमेंट जनरेशन के बाद । (ग)माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के अंदर सेल कल्चर मेंटेनेंस । (घ)चिप के अंदर त्वचा का क्रॉस-सेक्शनल मनोरंजन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

9. सेल व्यवहार्यता परख

नोट: लाइव/मृत किट उनके जीवित या मृत राज्य के आधार पर हरे या लाल फ्लोरेसेंस के साथ कोशिकाओं दाग । उचित व्यवहार्यता भेदभाव के लिए, इस चरण में गैर-फ्लोरोसेंट एचकेसी और एचएफबी का उपयोग किया जाना चाहिए। प्रक्रिया में सभी कदम पंप 2 के साथ UCi2 के माध्यम से किए जाते हैं।

  1. संस्कृति माध्यम को हटाने के लिए 50 माइक्रोन/मिनट पर 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ शीर्ष चैनल धोएं ।
  2. पंप हवा 50 μL/
  3. निर्माता के निर्देशों का पालन करके कैल्सीइन एएम/एथिडियम होमडिमर-1 किट (लाइव/डेड) समाधान तैयार करें ।
  4. 2 मिनट के लिए ५० μL/min पर लाइव/डेड सॉल्यूशन पंप करें ।
  5. अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट इनक्यूबेट करें।
  6. किसी भी शेष अभिवात को हटाने के लिए 2 मिनट के लिए 50 μL/min पर 1x PBS पंप करके शीर्ष चैनल धोएं।
  7. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत नमूने का निरीक्षण करें। 495/590 एनएम की एक उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और जीवित और मृत कोशिकाओं के लिए क्रमशः 519/617 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें ।

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Representative Results

डिजाइन की गई चिप 5 माइक्रोन पोर आकार पीसी झिल्ली से अलग दो तरल कक्षों से बना है जो निचले कक्ष से विकास को बढ़ावा देने वाले अणुओं के पारित होने की अनुमति देकर कोशिका के विकास की अनुमति देता है। ऊपरी कक्ष ऊतक निर्माण रखता है, इस मामले में, एचएफबी युक्त फाइब्रिन हाइड्रोगेल पर एचकेसी का एक मोनोलेयर।

चैनलों की ऊंचाई प्रत्येक चैनल में जोड़े गए चिपकने वाली चादरों की संख्या से निर्धारित होती है। निचला कक्ष 4 परतों (380 माइक्रोन) और 10 एक तरफा टेप परतों में से ऊपरी और एक दो तरफा एक (962 माइक्रोन) से बना है। चिप के आयाम 4 सेमी x 2 सेमी हैं, जो इसके हेरफेर को बढ़ाता है। चिपकने वाली विनाइल शीट डिवाइस के दृश्य निरीक्षण के लिए पानी की जकड़न और पारदर्शिता प्रदान करती है। पीडीएमएस परत उन छेदों से किसी भी रिसाव से बचने के लिए लैल्थ ट्यूबिंग के उचित प्रस्तोता के लिए उपयोगी थी जहां ट्यूब तय किए गए थे।

प्रकाशित साहित्य के अनुसार, सिरिंज पंपों का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में सेल युक्त हाइड्रोगेल्स की इंजेक्टेबिलिटी की आज तक रिपोर्ट नहीं की गई है । इस कारण, फाइब्रिन प्री-जेल की इंजेक्शन की क्षमता का आकलन करना पड़ा। हमने देखा कि ५० μL/min के प्रवाह के तहत, सिरिंज अवरुद्ध किया गया था । हालांकि, २०० μL/min से अधिक प्रवाह दरों कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है । रियोलॉजिकल अध्ययन फाइब्रिन प्री-जेल के कतरनी पतले व्यवहार का परीक्षण करने के लिए किए गए थे, चयनित प्रवाह दर सीमा (50-200 μL/min) के भीतर 10 से 50 सीओपी तक चिपचिपाहट प्राप्त करते थे। इन परिणामों ने इस प्रणाली की कार्य दशाओं को स्थापित करने में मदद की ।

इस कार्य में, दो अतिरंजित लेमिनार की पीढ़ी के आधार पर एक समानांतर प्रवाह विधि विकसित की गई है, जो पूर्व-जेल होने के नाते निचले हिस्से का प्रवाह करती है, जबकि ऊपरी एक बलि द्रव (पीबीएस) था। संख्यात्मक रूप से Navier-स्टोक्स समीकरणों को सुलझाने और उचित सीमा शर्तों को लागू करने, हमने पाया कि वांछित ऊंचाई प्राप्त करने के लिए कई संभव समाधान थे । पहले स्थापित कतरनी दर सीमा को ध्यान में रखते हुए, लगभग 500 माइक्रोन ऊंचाई के हाइड्रोजेल को प्राप्त करने के लिए, प्रवाह दर क्रमशः बलि पीबीएस और प्री-जेल के लिए 104 और 222 माइक्रोन/मिनट थे। व्यवहार में, सादगी के लिए 100 और 200 माइक्रोल/मिनट की माइक्रोफ्लो दरों का उपयोग किया जाता था। जब मॉडल में फिर से पेश किया गया, तो इन मूल्यों को 576 माइक्रोन की जेल ऊंचाई में पाया गया, जो अपेक्षित मूल्यों(चित्रा 5B)के समान था। प्रस्तावित विधि के कामकाज की प्रायोगिक रूप से जांच करने के लिए, ऊपरी कक्ष के साथ हाइड्रोगेल की ऊंचाई मापी गई थी। 550 माइक्रोन की औसत ऊंचाई(चित्रा 5A)देखी गई, जो हमारे गणितीय मॉडल की भविष्यवाणी के समान है।

Figure 5
चित्र 5:वांछित डर्मल ऊंचाई प्राप्त करने के लिए उपयुक्त पूर्व-जेल और बलि द्रव प्रवाह का चयन करने के लिए समानांतर प्रवाह गणितीय समाधान। (इसकीऊंचाई का आकलन करने के लिए फाइब्रिन जेल के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त एचकेसीएस की कॉन्फोकल छवि का एक) फ्रंट व्यू। (ख)प्री-जेल और पीबीएस प्रवाह दरों के आधार पर विभिन्न ऊंचाइयों के लिए गणितीय समाधान। संक्षिप्त रूप: एचकेसी = मानव अमर त्वचा केराटिनोसाइट्स; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

शुरुआत में प्रोटोकॉल स्थापित करते समय, पीबीएस को निचले चैनल के माध्यम से फ्लश नहीं किया गया था, जिससे जेल की सैद्धांतिक ऊंचाई और एक मापा गया था। ऊंचाई में यह अंतर अनुमानित एक(चित्र 6)की तुलना में ~ 40% था। एक बार प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था और पीबीएस को निचले कक्ष के माध्यम से पंप किया गया था, ऊंचाई में इस नुकसान को हल किया गया था(चित्र 5)।

Figure 6
चित्रा 6:हाइड्रोजेल के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त एचकेसी का कॉन्फोकल दृश्य जब पीबीएस को निचले कक्ष के माध्यम से पंप नहीं किया गया था। संक्षिप्त रूप: एचकेसी = मानव अमर त्वचा केराटिनोसाइट्स; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 7A ऊपरी कक्ष की एक फ्लोरोसेंट टॉप व्यू छवि दिखाता है जिसमें एम्बेडेड जीएफपी-एचएफबी के साथ एक फाइब्रिन हाइड्रोगेल होता है, यह प्रदर्शित करता है कि लोड होने के बाद 24 घंटे, कोशिकाओं को समान रूप से कक्ष के साथ वितरित किया जाता है और अच्छी तरह से फैलता है। चित्रा 7B हाइड्रोगेल के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त GFP-hKCs दिखाता है ।

Figure 7
चित्र 7:ऊपरी चैनल की फ्लोरेसेंस छवियां जो डिवाइस में वरीयता प्राप्त विभिन्न कोशिकाओं को दिखाती हैं। (ए)समानांतर प्रवाह प्रोटोकॉल के बाद ऊपरी कक्ष 24 घंटे का शीर्ष दृश्य फाइब्रिन जेल में एम्बेडेड एचएफबी दिखाता है। (ख)हाइड्रोजेल उत्पादन के बाद हाइड्रोगेल 24 एच के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त ग्लेंट जीएफपी-एचकेसीएस । धराशायी लाल रेखा चैनल की दीवारों को इंगित करती है। स्केल बार: 400 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: एचएफबी = मानव प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट; जीएफपी-एचकेसी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त करने वाली मानव अमर त्वचा केराटिनोसाइट्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एचकेसी तलछट तक सिस्टम को रात भर बंद रखना और हाइड्रोजेल सतह से जोड़ना महत्वपूर्ण है। जब सेल अटैचमेंट से पहले ट्यूबिंग को हटा दिया जाता है, तो हवा के बुलबुले चैनल में प्रवेश करते हैं और कोशिकाओं को विस्थापित करते हैं, जिससे एक गैर-वर्दी वाला मोनोलेयर होता है,जैसा कि चित्र 8 में दिखाया गया है।

Figure 8
चित्र 8:एचकेसी सीडिंग के तुरंत बाद ट्यूबिंग को हटाते समय हाइड्रोगेल सतह का शीर्ष दृश्य। धराशायी लाल रेखा चैनल की दीवारों को इंगित करती है। स्केल बार: 400 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: एचकेसी = मानव अमर त्वचा केराटिनोसाइट्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

हाइड्रोगेल में एम्बेडेड एचएफबी पर किए गए सेल व्यवहार्यता परीक्षण समानांतर प्रवाह विधि का उपयोग करके लोड करने के बाद 24 घंटे किया गया था, जिसमें ~ 95% की सेल व्यवहार्यता दिखाई गई थी। फाइब्रिन हाइड्रोगेल पर सीडिंग के बाद एचकेसीएस कोशिकाओं 24 एच पर किए गए इसी परीक्षण ने इसी तरह के परिणाम दिखाए । अगला कदम 24 एच(चित्रा 9)के बाद कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इसकी संरचना का निर्माण और अध्ययन करना था।

Figure 9
चित्रा 9:माइक्रोफ्लुइडिक चिप में अविभेदित त्वचा मॉडल की 3डी कॉन्फोकल छवि को खंगाला गया। पीला धराशायी रेखा जेल (नीचे) में एम्बेडेड एचएफबी से एचकेसी (ऊपर) को अलग करने वाले हाइड्रोगेल की सतह को इंगित करती है। संक्षिप्त रूप: एचएफबी = मानव प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट; hKCs = मानव अमर त्वचा keratinocytes। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फाइब्रिनोजेन जेल के कतरनी पतले व्यवहार और इसके जेलेशन समय के बीच संतुलन खोजना महत्वपूर्ण है: यदि समानांतर प्रवाह स्थापित करने में बहुत अधिक समय लगता है, तो यह सिस्टम को इकट्ठा करता है और अवरुद्ध करता है; यदि जेलेशन प्रक्रिया बहुत धीमी है, तो हाइड्रोगेल में एचएफबी तलछट होगा जैसा कि चित्र 10में दिखाया गया है । इस क्षणिक राज्य के व्यवहार को थ्रोम्बिन एकाग्रता को अलग करके विनियमित किया जा सकता है।

Figure 10
चित्रा 10:धीमी फाइब्रिन गेलिंग समय के कारण तलछट एचएफबी (लाल रंग में) दिखाने वाले फाइब्रिन हाइड्रोगेल की कॉन्फोकल छवि। जेल के शीर्ष पर एक एचकेसीएस मोनोलेयर (नीले रंग में) दिखाया गया है। संक्षिप्त रूप: एचएफबी = मानव प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट; hKCs = मानव अमर त्वचा keratinocytes। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

डिवाइस योजनाकरण और पीछे के प्रयोगात्मक प्रथाओं के दौरान, कुछ जटिलताओं को उत्पन्न किया गया था जिन्हें एक इष्टतम कार्य उपकरण और अच्छी तरह से संरचित ऊतक प्राप्त करने के लिए हल किया जाना था। ये समस्याएं समस्या निवारण के समाधान के साथ-साथ तालिका 2में दिखाई जाती हैं।

समस्याएं समाधान
ऊपरी कक्ष में एक 3 डी हाइड्रोजेल का परिचय, डर्मल पीढ़ी के बाद शीर्ष पर बीज केराटिनोसाइट्स के ऊपर मुक्त स्थान छोड़ने एक नियंत्रित ऊंचाई के साथ एक डर्मल डिब्बे बनाने के लिए विभिन्न चिपचिपाहट के साथ दो तरल पदार्थ (पीबीएस और प्री-जेल) का समानांतर प्रवाह लागू करें।
विनाइल शीट स्टैकिंग के दौरान चैनल गलत संरेखण सही जगह पर सभी चादरों को ढेर करने के लिए कस्टम-निर्मित संरेखण का उपयोग
एपिडर्मिस का अनुकरण करने के लिए फाइब्रिन जेल के शीर्ष पर एक कॉन्फ्लोटेंट केराटिनोसिटे मोनोलेयर प्राप्त करें चिप से ट्यूबों को हटाने से पहले जेल के लिए सेल लगाव की अनुमति दें, चैनल में प्रवेश करने और कोशिकाओं को विस्थापित करने से हवा के बुलबुले को रोकने ।
असुरक्षित झिल्ली के माध्यम से समानांतर प्रवाह प्रोटोकॉल के दौरान निचले चैनल को प्री-जेल लीक होने के कारण चैनल के साथ हाइड्रोजेल ऊंचाई हानि। समानांतर प्रवाह स्थापना के दौरान निचले चैनल के माध्यम से पीबीएस पंप।
जेल के अंदर फाइब्रोब्लास्ट तलछट फाइब्रिन जेलेशन में तेजी लाने के लिए थ्रोम्बिन एकाग्रता थोड़ी बढ़ गई थी

तालिका 2:वर्तमान कार्य और समाधानों के विकास के दौरान पाए गए मुद्दे।

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Discussion

इस विधि को विकसित करने की प्रेरणा त्वचा रोगों को मॉडल करने और एक उच्च थ्रूपुट मंच में नए और अभिनव उपचारों के प्रभावों का अध्ययन करने की इच्छा थी। आज तक, यह प्रयोगशाला कास्टिंग द्वारा इन डर्मो-एपिडर्मल समकक्ष का उत्पादन करती है- या तो मैन्युअल रूप से या 3 डी बायोप्रिंटिंग तकनीक की मदद से - फाइब्रोब्लास्ट के साथ फाइब्रिन जेल एक सेल कल्चर डालने प्लेट डालें और इसके ऊपर केराटिनोसाइट्स को सीडिंग करें। एक बार जब केराटिनोसाइट्स संगम पहुंच जाते हैं, तो 3 डी संस्कृति हवा-तरल इंटरफ़ेस के संपर्क में आती है, जो केराटिनोसिट भेदभाव को प्रेरित करती है, एक स्तरीकृत एपिडर्मिस पैदा करती है और नतीजतन, एक पूरी तरह से विकसित इंटरफोलिकुलर मानव त्वचा32,33,34। हालांकि, ये 3 डी संस्कृतियां, हालांकि चिकित्सकीय रूप से बहुत प्रासंगिक हैं, महंगी, समय लेने वाली हैं, और शारीरिक स्थितियों की नकल नहीं करती हैं।

टिश्यू-ऑन-ए-चिप तकनीक कोशिका संस्कृति में शारीरिक स्थितियों का अनुकरण करने के लिए एक मंच प्रदान करती है, जिससे दवा उम्मीदवारों13, 14, 15,16,17, 18,19,35कीविषाक्तता,प्रभावकारिता और वितरण की बेहतर समझ हो सकती है। माइक्रोफ्लुइडिक "शास्त्रीय" चिप्स पर मॉडलिंग किए गए अधिकांश ऊतक कोशिकाओं की एकल परतों से बने होते हैं, जिनमें ज्यादातर एपिथेलियल कोशिकाएं22,26,42,27,28,36,37,38,39,40,41 . अधिक जटिल, बहुस्तरीय ऊतकों की मॉडलिंग सजातीय और अतिरंजित ऊतक परतों को उत्पन्न करने की कठिनाई से बाधित हुई है ।

पिछले उपकरणों की तुलना में इस काम की मुख्यनवीनता, 22,43,माइक्रोफ्लुइडिक्स के माध्यम से एक अविभेदित और सरलीकृत त्वचा का निर्माण उत्पन्न करने के लिए एक विधि का विकास है। इसके अलावा, अन्य प्रकाशित प्रौद्योगिकियों44 के संबंध में एक और महत्वपूर्ण नवाचार तदर्थ निर्माण की अनुमति देने वाली बायो संगत विनाइल शीट से बने अपेक्षाकृत सरल, लागत प्रभावी, आसानी से उपयोग करने वाली डिस्पोजेबल चिप प्रणाली का डिजाइन है। यह प्रणाली पीडीएमएस25के साथ आवश्यक सिलिकॉन वेफर्स और जटिल प्लाज्मा बॉन्डिंग प्रक्रियाओं के उपयोग से बचती है । इस सामग्री के आधार पर चिप्स प्रत्येक अलग चिप डिजाइन के लिए विशिष्ट वेफर्स की पीढ़ी की आवश्यकता होती है, जो प्रोटोटाइप प्रक्रिया की कीमत उठाती है। यह सब वर्तमान "शास्त्रीय" तकनीक को महंगा, जटिल और बहुत लचीला नहीं बनाता है।

इन सीमाओं को दूर करने के लिए, एक ऊतक मॉडल के रूप में त्वचा का उपयोग करके, हम माइक्रोमशीनिंग द्वारा उत्पादित विनाइल परतों के आधार पर एक बहुत ही लचीला, सस्ता और मजबूत माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म पेश करते हैं। हम लेमिनार तरल पदार्थों के समानांतर प्रवाह के आधार पर एक नई पद्धति भी प्रस्तुत करते हैं जो बाइलेयर त्वचा की सीटू पीढ़ी में एक निचले डर्मल डिब्बे के साथ निर्माण की अनुमति देता है जिसमें एचएफबी और एचकेसी के मोनोलेयर से बना एक ऊपरी एपिडर्मल डिब्बा होता है। चिप एक असुरक्षित पीसी झिल्ली से अलग दो कक्षों के होते हैं । ऊपरी चैनल में त्वचा का निर्माण होता है और भविष्य में एचकेसी भेदभाव और स्तरीकरण और/या यहां तक कि दवाओं के परफ्यूजन की अनुमति देने के लिए खाली जगह छोड़ देता है । सेल ग्रोथ को बढ़ावा देने के लिए लोअर चैंबर लगातार कल्चर मीडियम के साथ है । एक छिद्रपूर्ण झिल्ली का उपयोग पंपिंग बल के कारण उच्च दबाव के अधीन होने पर ऊपरी कक्ष से निचले हिस्से में प्री-जेल के एक हिस्से का नुकसान हो सकता है। निचले कक्ष में एक पीबीएस प्रवाह का परिचय इस दबाव अंतर की भरपाई करता है और इस रिसाव से बचा जाता है।

एक त्वचा मॉडल पैदा करते समय हाइड्रोगेल सतह पर एचकेसी का वितरण एक महत्वपूर्ण पहलू है। जब वे सजातीय रूप से नहीं फैलते हैं, तो एक समान मोनोलेयर की पीढ़ी और इसलिए, एपिडर्मल भेदभाव बाधित हो सकता है। इसी तरह, एचएफबी को हाइड्रोगेल के भीतर समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए ताकि वे वास्तविक त्वचा में पाए जाते हैं। सेल तलछट या टयूबिंग रुकावट से बचने के लिए, हाइड्रोजेल संरचना (विशेष रूप से थ्रोम्बिन एकाग्रता) को जेलेशन समय और कतरनी पतले व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए सावधानीपूर्वक अध्ययन किया जाना चाहिए।

इन उत्साहजनक निष्कर्षों के बावजूद, एक स्ट्रैटम कॉर्नियम सहित एक अच्छी तरह से विभेदित मानव त्वचा बनाने के लिए एचकेसी मोनोलेयर के सही प्रसार और भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक प्रणाली के दीर्घकालिक कामकाज को प्रदर्शित करने के लिए भविष्य के काम की जरूरत है । त्वचा के अलावा, यह प्रणाली अन्य जटिल, बहुस्तरीय ऊतक निर्माणों की पीढ़ी की अनुमति देगी।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम ईमानदारी से डॉ जेवियर Rodríguez, डॉ मारिया लुइसा लोपेज़, कार्लोस Matellán, और जुआन फ्रांसिस्को Rodríguez बहुत उपयोगी सुझावों, चर्चाओं, और/या प्रारंभिक डेटा के लिए शुक्रिया अदा करते हैं । हम इस परियोजना के लिए सर्जियो फेर्नडेज़, पेड्रो हेरेरोस और लारा स्टोल्ज़ेनबर्ग के योगदान का भी धन्यवाद करते हैं। विशेष धन्यवाद जीएफपी-लेबल एचएफबी और एचकेसीएस के लिए डॉ मार्टा गार्सिया के पास जाएं। अंत में, हम गिलर्मो विज्कानो और एंजेलिका कोरल की उत्कृष्ट तकनीकी सहायता को पहचानते हैं। इस काम को "प्रोग्रामा डी एक्टिविडेस डी आई + डी एंट्रे ग्रुपोस डी इन्वेस्टिगासिओन डी ला कोमुनिडाड डी मैड्रिड", प्रोजेक्ट S2018/BAA-4480, बायोपिएलटेक-सीएम द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को "प्रोग्रामा डी एक्सेलेंसिया", प्रोजेक्ट EPUC3M03, CAM द्वारा भी समर्थित किया गया था। CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN ई INVESTIGACIÓN।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amchafibrin Rottafarm Tranexamic acid
Antibiotic/antimycotic Thermo Scientific HyClone
Calcium chloride Sigma Aldrich
Culture plates Fisher
DMEM Invitrogen Life Technologies
Double-sided tape vynil ATP Adhesive Systems GM 107CC, 12 µm thick
Edge plotter Brother Scanncut CM900
FBS Thermo Scientific HyClone
Fibrinogen Sigma Aldrich Extracted from human plasma
Glass slide Thermo Scientific
GFP-Human dermal fibroblasts - Primary. Gift from Dr. Marta García
H2B-GFP-HaCaT cell line ATCC Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García
Live/dead kit Invitrogen
PBS Sigma Aldrich
Polycarbonate membrane Merk TM 5 µm pore size
Polydimethylsiloxane Dow Corning Sylgard 184
Sodium chloride Sigma Aldrich
Syringes Terumo 5 mL
Thrombin Sigma Aldrich 10 NIH/vial
Transparent adhesive vinyl Mactac JT 8500 CG-RT, 95 µm thick
Trypsin/EDTA Sigma Aldrich
Tubing IDEX Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID

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References

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माइक्रोमशीन्ड माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में एक सरलीकृत त्रि-आयामी त्वचा-ऑन-ए-चिप मॉडल का उत्पादन
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Risueño, I., Valencia, L., Holgado, M., Jorcano, J. L., Velasco, D. Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (171), e62353, doi:10.3791/62353 (2021).

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