Summary
Her præsenterer vi en protokol til at generere en tredimensionel forenklet og udifferentieret hudmodel ved hjælp af en mikromaskineret mikrofluidisk platform. En parallel flow tilgang gør det muligt in situ deposition af et dermalt rum til såning af epitelceller på toppen, alle styres af sprøjte pumper.
Abstract
Dette arbejde præsenterer en ny, omkostningseffektiv og pålidelig mikrofluidisk platform med potentiale til at generere komplekse flerlagsvæv. Som et proof of concept er en forenklet og udifferentieret menneskelig hud, der indeholder et dermalt (stromalt) og et epidermalt (epitel) rum, blevet modelleret. For at opnå dette er der udviklet en alsidig og robust, vinylbaseret enhed opdelt i to kamre, der overvinder nogle af de ulemper, der er til stede i mikrofluidiske enheder baseret på polydimethylsiloxan (PDMS) til biomedicinske applikationer, såsom brug af dyrt og specialiseret udstyr eller absorption af små hydrofobiske molekyler og proteiner. Desuden blev der udviklet en ny metode baseret på parallelstrømning, der gjorde det muligt at placere både dermale og epidermale rum. Hudkonstruktionen består af en fibrinmatrix, der indeholder menneskelige primære fibroblaster og en monolag af udødeliggjorte keratinocytter sået på toppen, som efterfølgende opretholdes under dynamiske kulturforhold. Denne nye mikrofluidiske platform åbner mulighed for at modellere menneskelige hudsygdomme og ekstrapolere metoden til at generere andre komplekse væv.
Introduction
For nylig er der gjort fremskridt i retning af udvikling og produktion af in vitro menneskelige hudmodeller til analyse af toksiciteten af kosmetiske og farmaceutiske produkter1. Forskere i farmaceutiske og hudpleje industrier har brugt dyr, mus er den mest almindelige, at teste deres produkter2,3,4,5. Forsøgsprodukter på dyr er imidlertid ikke altid forudsigende for reaktionen hos mennesker, hvilket ofte fører til lægemiddelsvigt eller bivirkninger hos mennesker og dermed til økonomiske tab5,6. Det Forenede Kongerige var det første land, der forbød brugen af dyr til kosmetiske forsøg i 1998. Senere, i 2013, forbød EU testning og anvendelse af kosmetik hos dyr (EU's kosmetikforordning nr. 1223/2009)7.
Dette forbud behandles også af andre lande, f.eks. Ud over etiske bekymringer gør de anatomiske forskelle mellem dyre- og menneskehud dyreforsøg tidskrævende, dyre og ofte ineffektive. Desuden forventes den globale in vitro-toksikologiske markedsstørrelse at nå OP PÅ USD 26,98 mia. Af disse grunde er der behov for at udvikle nye metoder og alternativer til disse in vitro-undersøgelser, såsom bioengineered human hud modeller, der gør det muligt at teste for sikkerhed og toksiske virkninger af kosmetik og lægemidler uden brug af dyr.
Der er to forskellige former for kommercielt tilgængelige, in vitro, menneskelige hudmodeller. Den første type består af stratificerede epidermale ækvivalenter, der indeholder flere lag af differentiere keratinocytter, der er seedet på forskellige materialer. Nogle af dem er godkendt af Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling (OECD) og godkendt af (Det Europæiske Center for Validering af Alternative Metoder (ECVAM) til hudkorrosions- og irritationstest, såsom EpiDerm eller SkinEthic10,11,12. Den anden type er fuld hud ækvivalenter med et lag af differentiere menneskelige keratinocytter seedet på en tre-dimensionel (3D) stillads, der indeholder fibroblaster, såsom T-Skin og EpiDerm-FT. Disse modeller dyrkes dog under statiske forhold, hvilket gør dem ude af stand til præcist at repræsentere menneskelige fysiologiske forhold.
Den seneste interesse har fokuseret på at generere in vitro 3D-hudmodeller i cellekultur-insert (CCI) formater med dynamisk perfusion13,14,15,16,17,18,19. Disse systemer kan dog ikke betragtes som stricto sensu som mikrofluidiske skin-on-chips i henhold til deres klassiske definition på området. Ingbers definition for organer-on-a-chip siger, at organet skal placeres inde i de mikrofluidiske kanaler, hvilket er en betingelse, at kun få enheder opfylder20,21. Skin-on-chips har hidtil modelleret det meste simple epithelia som encellede lag og / eller dermal cellelag adskilt af en porøsmembran 22,23. Selv om der har været nogle fremskridt modellering hud i mikrofluidiske systemer16,24, der er i øjeblikket ingen litteratur, der viser et organ-on-a-chip system, der passer Ingber definition, i stand til at producere en flerlags hud in situ og herunder både epitel og stromale komponenter.
I dette arbejde præsenteres en ny, omkostningseffektiv, robust, vinylbaseret mikrofluidisk platform til hud-på-en-chip-applikationer. Denne platform blev produceret af mikro-bearbejdning, som giver mere enkelhed i fremstillingsprocessen, samt øget fleksibilitet og alsidighed i layoutet af enheden, overvinde nogle af begrænsningerne i PDMS25. En måde at indføre en forenklet hudkonstruktion gennem en parallel strømning kontrolleret med sprøjtepumper blev også designet. Parallel flow tillader to væsker med meget forskellige viskositeter (en buffer og fibrin pre-gel i dette tilfælde) at blive perfused gennem en kanal uden at blande sig med hinanden. Som et bevis på konceptet blev en dermo-epidermal konstruktion, der indeholder fibroblaster indlejret i en fibrin matrix, der efterligner dermis, introduceret i enheden, oven på hvilken en monolag af keratinocytter blev indlæst for at efterligne de udifferentierede epidermis. Dermalrumshøjden kan moduleres ved at ændre flowhastighederne. Den vigtigste nyhed i dette arbejde, sammenlignet med tidligere beskrevne modeller22,26,27,28,29, er udviklingen af en 3D-konstruktion inde i et mikrokammer ved hjælp af mikrofluidics. Selv om denne artikel præsenterer en forenklet udifferentieret hud, det langsigtede mål er at generere og karakterisere en fuldt differentieret hud konstruere til at demonstrere sin levedygtighed og funktionalitet til narkotika og kosmetiske testformål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chip design og micromachining parametre
- Design de mikrofluidiske spånlag med FreeCAD open source-designsoftware; se tabel 1 for kanalernes dimensioner. Medtag fire huller med en diameter på 2,54 mm i designet for at bruge en skræddersyet aligner til en korrekt lag superposition.
| Længde (μm) | Bredde (μm) | |
| Nederste kammer | 28,400 | 800 |
| Øverste kammer | 31,000 | 800 |
Tabel 1: Enhedens øvre og nedre kanalers dimensioner.
- Skær 95 μm-tykke, klæbende, gennemsigtige vinylplader i 30 cm x 30 cm firkanter for at passe ordentligt ind i plotteren.
- Brug Brother CanvasWorkspace-software til at oprette et arbejdsområde på 30 cm x 30 cm, og fyld den med de designede mønstre for de forskellige lag af chippen (Figur 1A). Gem den i en .svg fil.
- Skær de 30 cm x 30 cm vinylplader med kantplotteren (Figur 1B-D).
- Stick vinyl ark til en lav tack klæbemåtte, og fjerne alle de luftbobler, hvis det er nødvendigt.
- Overfør .svg-filen til plotteren, og angiv skæreparametrene: skæreklinge: niveau 3; skæretryk: niveau 0; skærehastighed: niveau 1. Placer den klæbende måtte med vinylen i plotteren, og start skæreprocessen.
- Skær den øverste kanal mønster på 12 μm-tyk dobbeltsidet tape vinyl ved at følge de foregående trin.
Figur 1: Chipdesign og mikromaskineringsproces. (A) Softwarelayout, der viser arbejdsområdet fyldt med både de øverste og nederste mønstre, der er designet til chippen. (B) Kantplotter under opskæringsprocessen; skærekniv, hele vinylplader og klæbemåtte er vist. (C) Mønstret vinyl, der løsnes fra det afskårne ark. (D) Prøve af et klæbende vinyllag mønstret med det øverste kanaldesign. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. PDMS lag fabrikation
- Bland PDMS og hærdningsmiddel i et forhold på 10:1 (v/v), og anbring blandingen under vakuum i 15 minutter for at fjerne luftbobler. Hæld 55 mL af blandingen i en 55 cm2 kvadratisk kultur skål for at opnå et 2 mm tykt lag. Fjern bobler med en nål.
- Blandingen (trin 2.1) hærdes i en ovn i 1 time ved 80 °C. Unmold PDMS og skære det i rektangler med chip dimensioner. Lav huller til slangen med en 18 G sprøjtenål.
3. Spånmontering
BEMÆRK: Du kan finde en bedre forståelse under Figur 2.
- Saml hele enheden ved hjælp af en aligner for at justere kanaler, indløb og stikkontakter korrekt. Hober fire vinyllag (med den tilsvarende nederste mikropattern) til montering af den nederste kanal, holde dækbåndet af det nederste lag for at undgå at holde sig til aligner.
- Skær og placer polycarbonat (PC) porøs membran på toppen af den nederste kanal for at adskille den fra den øverste. Pas på ikke at dække indløbene på den nederste kanal.
- Tilsæt ti vinyllag med det øverste kammerdesign. Stick en dobbeltsidet tape vinyl lag med den øverste kanal mønster på toppen. Fjern chippen fra aligneren, og sæt den på glasrutsjebanen.
- Placer et 2 mm tykt PDMS-ark oven på det dobbeltsidede tape vinyllag for at give passende forankring til slangen og for at undgå lækage. Efterlad en vægt på toppen af chippen natten over for at sikre, at chippen er helt vandtæt. Steriliseres chippen ved at skylle 70% v/v ethanol i 5 min, og vask derefter med destilleret H2O.
Figur 2: Mikrofluidisk spånsamling. (A) Generel ordning for samlingen af anordningen. Nederste og øvre kamre består af henholdsvis fire og elleve overlejrede vinylplader. (B) Top- og sidevisninger af mikrofluidisk chip. Top- og bundkanaler er repræsenteret i henholdsvis pink og blå. (C) Billede af chipsamlingen ved hjælp af en specialfremstillet aligner. (D) Chipbillede efter komplet samling. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Pumpeforbindelser
BEMÆRK: Den grafiske repræsentation af pumperforbindelser er vist i figur 3.
- Tilslut pumpe 1 til det øverste kammerindløb 1 (UCi1).
- Tilslut pumpe 2 til det øverste kammerindløb 2 (UCi2).
- Tilslut pumpe 3 til underkammerets indløb (LCi).
- Tilslut Upper Chamber Outlet (UCo) og Lower Chamber Outlet (LCo) til et affaldsrør.
- Tilslut sprøjterne til hver indløb ved hjælp af polytetrafluoroethylen (PTFE) rør og 18 G rustfrit stål stik.
Figur 3: Pumpetilslutninger og indløb/udløbsplacering. (A) Diagram, der viser de tre forskellige pumpers forbindelse til deres respektive indløb. Udløb opretter forbindelse til en affaldsbeholder. (B) Chipbillede med mærkede indløb og udløb. Forkortelser: LCi = nedre kammerindløb; LCo = lavere kammerudtag; UCi1 = øvre kammer indløb 1; UCi2 = øvre kammer indløb 2; UCo = øvre kammerudtag. Klik her for at se en større version af dette tal.
5. Cellekultur
BEMÆRK: HaCaT-cellelinjen har en kommerciel oprindelse. Humane primære fibroblaster kommer fra raske donorer og blev fremstillet ved indsamling af biologiske prøver af menneskelig oprindelse registreret i "Registro Nacional de Biobancos para Investigación Biomédica del Instituto de Salud Carlos III".
- Arbejde i en celle kultur hætte, tidligere steriliseret under ultraviolet lys og tørres med ethanol.
- Optø H2B-GFP-HaCaT-celler (human udødeliggjorte hud keratinocytter, hKCs) og GFP-humane primære fibroblaster (hFBs) ved 37 °C, tilsæt 2 ml kulturmedium og centrifuge i 7 min ved 20 °C ved 250 × g.
BEMÆRK: H2B-GFP-HaCaT celler er human udødeliggjort keratinocytter modificeret til at udtrykke en hybrid histone H2B-grøn fluorescerende protein (GFP), giver deres kerner med grøn fluorescens. GFP-hFBs er menneskelige primære fibroblaster forvandlet med vektor pLZRS-IRES-EGFP at udtrykke cytoplasmisk grøn fluorescens. Disse celler blev ændret efter tidligere offentliggjorte protokoller30,31 - Kultur både hDC'er og hFB'er i 1x DMEM suppleret med 10% fosterkvægsserum og 1% af antibiotika/antimykotisk opløsning. Forvarm kulturmediet ved 37 °C før brug.
- Fjern cellerne ved at vaske dem med 1x fosfatbufferet saltvand (PBS), tilsæt 2 mL trypsin/ethylenediamin tetraacethansyre (EDTA) og inkubation af dem i 10 min ved 37 °C.
- Inaktivere trypsin tilføjer 4 mL af kulturmedium. Resuspend cellerne, og overføre dem til en 15 ML rør. Fjern 10 μL for at tælle celler på et Neubauer-kammer og bestemme den passende koncentration.
- Centrifugere 15 mL rør i 7 min ved 20 °C ved 250 × g. Supernatanten fjernes, og pillerne genbruges i den ønskede koncentration: hB'er ved 50.000 celler/mL og hKCs ved 5,× 106 celler/mL.
6. Fibrinogen pre-gel forberedelse
- Aktiver thrombin ved at tilføje 1mL cacl2 (1% w/v i NaCl) til hætteglasset.
- Der tilsættes følgende komponenter for at opnå 1 ml aktiveret trombin (10 NIH-enheder/ml), 59 μL tranexamsyre (Materialetabel, 100 mg/ml), 764 μL kulturmedium indeholdende 50.000 hFBs/ml, 118 μL fibrinogen (20 mg/ml i NaCl (0,9% w/v)).
BEMÆRK: Fibrinogen skal tilføjes i sidste øjeblik.
7. Parallel flow protokol
- Pump 1x PBS med pumpe 3 gennem LCi ved 50 μL/min under hele processen.
- Pumpe offervæske (1x PBS) med pumpe 2 gennem UCi2 ved 100 μL/min.
- Lad sprøjten med prægelen, læg den hurtigt i pumpe 1, og kør den ved 200 μL/min (Figur 4A).
- Stop pumper 1 og 2, når pre-gelen forlader UCo.
- Lad chippen stå uden at fjerne slangen ved 37 °C i mindst 10 min for at tillade gelering.
- Pumpekulturmedium ved 50 μL/h med pumpe 3 til UCi2 natten over.
- Bloker UCi1 med en kasket.
8. hKCs monolagssåning
- Kontroller under mikroskopet, at hFB'er spredes 24 timer efter generering af dermalrummet.
- HDC'erne indføres med pumpe 2 til UCi2 ved 5 ×,106 celler/mL ved 40 μL/min i 1 min (figur 4B).
- Lad spånen natten over være ved 37 °C i en fugtmættet inkubator til celletilbehør.
- Pump frisk kulturmedium med pumpe 3 kun gennem LCi ved 50 μL/min (Figur 4C).
Figur 4: Mikrofluidisk protokol til generering af dermo-epidermal konstruktion. (A) Tværgående tværsnit, der viser parallelstrømsprocessen til generering af det dermale rum. (B) Keratinocyte monolayer såning 24 timer efter dermal rum generation. (C) Vedligeholdelse af cellekultur inde i den mikrofluidiske anordning. (D) Tværsnits genskabelse af huden inde i chippen. Klik her for at se en større version af dette tal.
9. Analyse af celle levedygtighed
BEMÆRK: Live / Dead kit pletter celler med grøn eller rød fluorescens afhængigt af deres levende eller døde tilstand. For at sikre en korrekt differentiering af levedygtigheden skal der anvendes ikke-fluorescerende hDC'er og hFB'er i dette trin. Alle trin i proceduren udføres gennem UCi2 med pumpe 2.
- Vask den øverste kanal med 1x PBS i 5 min ved 50 μL/min for at fjerne kulturmediet.
- Pump luft for at fjerne 1x PBS ved 50 μL/min.
- Forbered Calcein AM/Ethidium homodimer-1 Kit (Live/Dead) løsning ved at følge producentens anvisninger.
- Pump Live/Dead opløsning ved 50 μL/min i 2 min.
- Inkuberes 30 min ved 37 °C i mørke.
- Vask topkanalen ved at pumpe 1x PBS ved 50 μL/min i 2 min for at fjerne eventuelle resterende reagens.
- Overhold prøven under det konfokale mikroskop. Brug en excitation bølgelængde på 495/590 nm og en emission bølgelængde på 519/617 nm for levende og døde celler, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den designede chip består af to fluidiske kamre adskilt af en 5 μm pore størrelse PC membran, der tillader vækst af cellen ved at tillade passage af vækstfremmende molekyler fra det nederste kammer. Det øverste kammer holder vævskonstruktionen, i dette tilfælde en monolag af hKCs på en fibrin hydrogel indeholdende hFBs.
Kanalernes højde bestemmes af antallet af klæbeark, der tilsættes hver kanal. Det nederste kammer består af 4 lag (380 μm) og det øverste af 10 ensidige tapelag og et dobbeltsidet (962 μm). Chippens dimensioner er 4 cm x 2 cm, hvilket forbedrer dens manipulation. De klæbende vinylplader giver vandtæthed og gennemsigtighed til visuel inspektion af enheden. PDMS-laget var nyttigt til korrekt forankring af slangen for at undgå lækage fra hullerne, hvor rørene blev fastgjort.
Ifølge offentliggjort litteratur er injicerbarheden af celleholdige hydrogeler i mikrofluidiske kamre ved hjælp af sprøjtepumper ikke blevet rapporteret til dato. Af denne grund måtte injicerbarheden af fibrin pre-gel vurderes. Vi observerede, at sprøjten blev blokeret under en strøm på 50 μL/min. Flowhastigheder på over 200 μL/min kan dog beskadige cellerne. Rheologiske undersøgelser blev udført for at teste fibrin-prægelens forskydningsadfærd og opnå viskositeter fra 10 til 50 cP inden for det valgte flowhastighedsområde (50-200 μL/min). Disse resultater bidrog til at skabe arbejdsvilkårene for dette system.
I dette arbejde er der udviklet en parallel flowmetode baseret på dannelsen af to overlejrede laminar, jo lavere der er prægelen, mens den øverste var offervæske (PBS). Numerisk løse Navier-Stokes ligninger og pålægge de relevante grænse betingelser, fandt vi, at der var flere mulige løsninger for at opnå den ønskede højde. I betragtning af de tidligere fastsatte grænseværdier for forskydningshastighed for at opnå en hydrogel på ca. 500 μm højde var strømningshastigheden henholdsvis 104 og 222 μL/min for den offermæssige PBS og prægelen. I praksis blev mikroflowhastigheder på 100 og 200 μL/min anvendt til enkelhed. Ved genindført i modellen viste det sig, at disse værdier resulterede i en gelhøjde på 576 μm, meget lig de forventede værdier (Figur 5B). For eksperimentelt at kontrollere funktionen af den foreslåede metode blev højden af hydrogel langs det øverste kammer målt. En gennemsnitlig højde på 550 μm blev observeret (Figur 5A), meget lig forudsigelsen af vores matematiske model.
Figur 5: Matematiske parallelle flowløsninger til at vælge de relevante prægel- og offervæskestrømme for at opnå den ønskede dermale højde. (A) Forsidebillede af det konfokale billede af hCC'er, der er seedet oven på fibringelen for at vurdere dens højde. (B) Matematisk opløsning til forskellige højder afhængigt af præ-gel og PBS flowhastigheder. Forkortelser: hKCs = human udødeliggjort hud keratinocytter; PBS = fosfat-buffered saltvand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Ved fastlæggelsen af protokollen i begyndelsen blev PBS ikke skyllet gennem den nederste kanal, hvilket førte til uoverensstemmelser mellem gelens teoretiske højde og den målte. Denne højdeforskel var ~40 % sammenlignet med den anslåede (figur 6). Når protokollen blev optimeret og PBS pumpet gennem det nederste kammer, blev dette tab i højden løst (Figur 5).
Figur 6: Confocal visning af hKCs seedet oven på hydrogel til at måle sin højde, når PBS ikke blev pumpet gennem det nederste kammer. Forkortelser: hKCs = human udødeliggjort hud keratinocytter; PBS = fosfat-buffered saltvand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7A viser et fluorescerende topbillede af det øverste kammer, der indeholder en fibrin hydrogel med indlejrede GFP-hFBs, hvilket viser, at 24 timer efter belastning, celler er jævnt fordelt langs kammeret og godt spredt. Figur 7B viser sammenflydende GFP-hKCs sået oven på hydrogel.
Figur 7: Fluorescensbilleder af den øvre kanal, der viser forskellige celler, der er seedet i enheden. (A) Topvisning af det øverste kammer 24 timer efter parallel flowprotokol, der viser hFB'erne, der er indlejret i fibringelen. (B) Sammenflydende GFP-hKCs sået oven på hydrogel 24 timer efter hydrogel generation. Stiplet rød linje angiver kanalvægge. Skalastænger: 400 μm. Forkortelser: hFBs = humane primære fibroblaster; GFP-hKCs = grøn fluorescerende protein-udtrykke menneskelige udødeliggjort hud keratinocytter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Det er vigtigt at holde systemet lukket natten over, indtil hKCs sediment og vedhæfte til hydrogel overflade. Når slangen fjernes før celletilbehør, kommer luftbobler ind i kanalen og forskyder celler, hvilket fører til et ikke-sammenhængende sammenløbsmonolag, som vist i figur 8.
Figur 8: Topvisning af hydrogeloverfladen, når slangen fjernes umiddelbart efter hKCs såning. Stiplet rød linje angiver kanalvægge. Skalastang: 400 μm. Forkortelser: hKCs = human udødeliggjort hud keratinocytter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Celle levedygtighedstesten udført på hFBs indlejret i hydrogel blev udført 24 timer efter belastning ved hjælp af parallel flow metode, der viser en celle levedygtighed på ~ 95%. Den samme test udført på hKCs celler 24 timer efter såning dem på fibrin hydrogel viste lignende resultater. Det næste skridt var at generere en dermo-epidermal konstruktion og studere dens struktur ved hjælp af konfokal mikroskopi efter 24 timer (Figur 9).
Figur 9: Rekonstrueret 3D-sammenfødt billede af den udifferentierede hudmodel i den mikrofluidiske chip. Gul stiplet linje angiver overfladen af hydrogel adskille hKCs (top) fra hFBs indlejret i gelen (nederst). Forkortelser: hFBs = humane primære fibroblaster; hKCs = human udødeliggjort hud keratinocytter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Det er afgørende at finde en balance mellem fibrinogengelens forskydningsfunktion og dens geleringstid: Hvis det tager for lang tid at etablere det parallelle flow, koagulerer og blokerer det systemet; hvis geleringsprocessen er for langsom, vil hFB'er i hydrogelen sediment som vist i figur 10. Adfærden af denne forbigående tilstand kan reguleres ved at variere trombinkoncentrationen.
Figur 10: Confocal billede af en fibrin hydrogel viser sedimenterede hFBs (i rødt) på grund af en langsom fibrin gelering tid. En hKCs monolayer (i blå) vises oven på gelen. Forkortelser: hFBs = humane primære fibroblaster; hKCs = human udødeliggjort hud keratinocytter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Under enhedens planificering og bageste eksperimentelle praksis opstod der nogle komplikationer, der skulle løses for at opnå en optimalt fungerende enhed og velstruktureret væv. Disse problemer vises i tabel 2sammen med løsningerne til fejlfinding.
| Problemer | Løsninger |
| Indførelse af en 3D hydrogel i det øverste kammer, forlader fri plads ovenfor til frø keratinocytter på toppen efter dermal generation | Påfør en parallel strøm af to væsker (PBS og pre-gel) med forskellige viskositeter for at skabe et dermalt rum med en kontrolleret højde. |
| Kanal forskydning under vinyl ark stabling | Brug af en skræddersyet aligner til at stable alle arkene på det rigtige sted |
| Opnå en sammenflyttet keratinocyt monolayer på toppen af fibrin gel til at simulere epidermis | Lad celletilbehør til gelen, før du fjerner rørene fra chippen, forhindrer luftbobler i at komme ind i kanalen og fortrænge cellerne. |
| Hydrogel højde tab langs kanalen på grund af pre-gel lækker til den nederste kanal under parallel flow protokol gennem porøse membran. | Pump PBS gennem den nederste kanal under parallel flow etablering. |
| Fibroblast sedimentering inde i gelen | Trombinkoncentrationen blev lidt forøget for at fremskynde fibringelation |
Tabel 2: Problemer, der er konstateret i forbindelse med udviklingen af det igangværende arbejde og de anvendte løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Motivationen til at udvikle denne metode var ønsket om at modellere hudsygdomme og studere virkningerne af nye og innovative behandlinger i en platform med høj kapacitet. Til dato producerer dette laboratorium disse dermo-epidermale ækvivalenter ved støbning-enten manuelt eller ved hjælp af 3D bioprinting teknologi-fibrin gel med fibroblaster i en celle kultur indsætte plade og såning keratinocytterne på toppen af det. Når keratinocytterne når sammenløb, er 3D-kulturen udsat for den luft-flydende grænseflade, som fremkalder keratinocyt differentiering, der genererer en stratificeret epidermis og dermed en fuldt udviklet interfollicular menneskelig hud32,33,34. Men disse 3D-kulturer, omend meget relevante klinisk, er dyre, tidskrævende og efterligner ikke fysiologiske forhold.
Tissue-on-a-chip-teknologi giver en platform til at efterligne fysiologiske forhold i cellekultur, hvilket muliggør en bedre forståelse af toksicitet, effekt og levering aflægemiddelkandidater 13,14,15,16,17,18,19,35. De fleste af væv modelleret på mikrofluidiske "klassiske" chips består af enkelte lag af celler, for det meste epitelceller22,26,42,27,28,36,37,38,39,40,41 . Modellering af mere komplekse, flerlagsvæv er blevet hæmmet af vanskeligheden ved at generere homogene og overlejrede vævslag.
Den vigtigste nyhed i dette arbejde, sammenlignet med tidligere enheder22,43, er udviklingen af en metode til at generere en udifferentieret og forenklet hudkonstruktion ved hjælp af mikrofluidics. Desuden er en anden vigtig nyskabelse med hensyn til andre offentliggjorte teknologier44 udformningen af et relativt enkelt, omkostningseffektivt engangschipsystem, der er fremstillet af biokompatiible vinylplader, der muliggør ad hoc-fabrikation. Dette system undgår brugen af silicium wafers og komplicerede plasmabindingsprocedurer, der er nødvendige med PDMS25. Chips baseret på dette materiale kræver generering af wafers, der er specifikke for hvert andet chipdesign, hvilket hæver prisen på prototypeprocessen. Alt dette gør den nuværende "klassiske" teknologi dyr, kompleks og ikke særlig fleksibel.
For at overvinde disse begrænsninger, ved hjælp af huden som vævsmodel, præsenterer vi en meget fleksibel, billig og robust mikrofluidisk platform baseret på vinyllag, produceret af mikromaskiner. Vi præsenterer også en ny metode baseret på den parallelle strøm af laminarvæsker, der gør det muligt for in situ-generering af en bilayer hudkonstruktion med et lavere dermalt rum, der indeholder hFB'er og et øvre epidermalt rum bestående af en monolag af hKCs. Chippen består af to kamre adskilt af en porøs pc-membran. Den øverste kanal indeholder huden konstruere og efterlader fri plads til at tillade hKC differentiering og lagdeling og / eller perfusion af kultur medium, luft, eller endda narkotika i fremtiden. Det nederste kammer er løbende gennemsyret af kulturmedium for at fremme cellevækst. Brugen af en porøs membran kan føre til tab af en del af præ-gelen fra det øverste kammer til det nederste, når den udsættes for højt tryk på grund af pumpekraft. Indførelsen af en PBS-strøm i det nederste kammer kompenserer for denne trykforskel og undgår denne lækage.
Fordelingen af hKCs på hydrogeloverfladen er et vigtigt aspekt, når der genereres en hudmodel. Når de ikke er homogent spredt, kan dannelsen af en ensartet monolag og derfor den epidermale differentiering hæmmes. På samme måde skal hFB'er fordeles ligeligt inden for hydrogelen, så de ligner deres naturlige placering, hvor de findes i ægte hud. For at undgå celle sedimentering eller slange blokering, hydrogel sammensætning (især trombin koncentration) skal omhyggeligt undersøges for at kontrollere gelering gange og forskydning udtynding adfærd.
På trods af disse opmuntrende resultater er der behov for et fremtidigt arbejde for at påvise, at det system, der er nødvendigt for at fremme korrekt spredning og differentiering af hKC-monolagsfunktion, fungerer på lang sigt for at fremme den korrekte spredning og differentiering af hKC-monolag for at danne en veldifferentieret menneskelig hud, herunder et stratum corneum. Udover hud, ville dette system tillade generering af andre komplekse, flerlags væv konstruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker oprigtigt Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán og Juan Francisco Rodríguez for meget nyttige forslag, diskussioner og / eller foreløbige data. Vi takker også venligst bidrag fra Sergio Férnandez, Pedro Herreros og Lara Stolzenburg til dette projekt. Særlig tak til Dr. Marta García for GFP-mærket hFBs og hKCs. Endelig anerkender vi guillermo Vizcaínos og Angélica Corrals fremragende tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Projekt S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Dette arbejde blev også støttet af "Programa de excelencia", Project EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
| Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Culture plates | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
| Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
| Glass slide | Thermo Scientific | ||
| GFP-Human dermal fibroblasts | - | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
| H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
| Live/dead kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Syringes | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
| Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |
References
- McNamee, P., et al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
- Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).
- Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
- Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
- Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A.
- H.R.2858 - Humane Cosmetics Act. 114th Congress. , Available from: https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858 (2016).
- Global in-vitro toxicology testing market report: size, share & trends analysis 2014-2015. , Available from: https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html (2018).
- Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B.
- OECD. In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431. OECD Guideline for Testing of Chemicals. , (2019).
- Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients. International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).
- vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).
- Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
- Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents. Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).
- Wu, R., et al. Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function. Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).
- Materne, E. -M., et al. The multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526 (2015).
- Schimek, K., et al. Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications. Bioengineering. 5 (2), 43 (2018).
- Alberti, M., et al. Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing. Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E.
- Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).
- Wufuer, M., et al. Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment. Scientific Reports. 6, 37471 (2016).
- Ramadana, Q., Ting, F. C. W. In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin. Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).
- Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898 (2020).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Huh, D. A human disease model of drug toxicity - induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice. Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).
- Beckwitt, C. H., et al. Liver ' organ on a chip '. Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).
- Poceviciute, R., Ismagilov, R. F.
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
- Escámez, M. J., et al. Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement. Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).
- Llames, S. G., et al. Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin. Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).
- Llames, S., et al. Clinical results of an autologous engineered skin. Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).
- Cubo, N., Garcia, M., del Cañizo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. 3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis. Biofabrication. 9 (1), 015006 (2016).
- Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip. Biomaterials. 116, 48-56 (2017).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535 (2016).
- Marx, U., et al. Human-on-a-chip' developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man. Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation. Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture. Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).
- Ren, K., Chen, Y., Wu, H. New materials for microfluidics in biology. Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).
