Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generering av en forenklet tredimensjonal hud-på-en-chip-modell i en mikromaskin mikrofluidisk plattform

Published: May 17, 2021 doi: 10.3791/62353
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1,4
1Department of Bioengineering and Aerospace Engineering, Universidad Carlos III de Madrid (UC3M), 2Group of Optics, Photonics and Biophotonics (GOFB). Center for Biomedical Technology, Universidad Politécnica de Madrid, 3Division of Epithelial Biomedicine, CIEMAT, 4Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å generere en tredimensjonal forenklet og uavklart hudmodell ved hjelp av en mikromaskinert mikrofluidisk plattform. En parallell strømningstilnærming tillater in situ-avsetning av et dermalt rom for såing av epitelceller på toppen, alt kontrollert av sprøytepumper.

Abstract

Dette arbeidet presenterer en ny, kostnadseffektiv og pålitelig mikrofluidisk plattform med potensial til å generere komplekse flerlagsvev. Som et konseptbevis er en forenklet og uavklart menneskelig hud som inneholder en dermal (stromal) og et epidermalt (epitel) rom blitt modellert. For å oppnå dette har en allsidig og robust, vinylbasert enhet delt inn i to kamre blitt utviklet, og overvinner noen av ulempene som er tilstede i mikrofluidiske enheter basert på polydimetylsiloksan (PDMS) for biomedisinske applikasjoner, for eksempel bruk av dyrt og spesialisert utstyr eller absorpsjon av små, hydrofobe molekyler og proteiner. Videre ble det utviklet en ny metode basert på parallell strømning, noe som muliggjør in situ-avsetning av både dermale og epidermale rom. Hudkonstruksjonen består av en fibrinmatrise som inneholder menneskelige primære fibroblaster og en monolayer av udødeliggjorte keratinocytter frøet på toppen, som senere opprettholdes under dynamiske kulturforhold. Denne nye mikrofluidiske plattformen åpner muligheten for å modellere menneskelige hudsykdommer og ekstrapolere metoden for å generere andre komplekse vev.

Introduction

Nylig har det blitt gjort fremskritt mot utvikling og produksjon av in vitro menneskelige hudmodeller for analyse av toksisiteten til kosmetiske og farmasøytiske produkter1. Forskere i farmasøytisk og hudpleieindustri har brukt dyr, mus er de vanligste, for å teste sine produkter2,3,4,5. Imidlertid er testing av produkter på dyr ikke alltid prediktivt for responsen hos mennesker, noe som ofte fører til narkotikasvikt eller bivirkninger hos mennesker og følgelig til økonomiske tap5,6. Storbritannia var det første landet som forbød bruk av dyr til kosmetisk testing i 1998. Senere, i 2013, forbød EU testing og godkjennelse av kosmetikk hos dyr (EU Cosmetics Regulation No. 1223/2009)7.

Dette forbudet vurderes også av andre land som i 'The Humane Cosmetics Act' i USA8. I tillegg til etiske bekymringer gjør de anatomiske forskjellene mellom dyr og menneskelig hud dyreforsøk tidkrevende, dyre og ofte ineffektive. Videre forventes den globale in vitro toksikologitestingsmarkedets størrelse å nå 26,98 milliarder USD innen 20259. Av disse grunnene er det behov for å utvikle nye metoder og alternativer for de in vitro-studiene, for eksempel bioengineered menneskelige hudmodeller, som muliggjør testing for sikkerhet og toksiske effekter av kosmetikk og narkotika uten bruk av dyr.

Det finnes to forskjellige typer kommersielt tilgjengelige, in vitro, menneskelige hudmodeller. Den første typen består av stratifiserte epidermale ekvivalenter som inneholder flere lag med differensierende keratinocytter som er frøet på forskjellige materialer. Noen av dem er godkjent av Organisasjonen for økonomisk samarbeid og utvikling (OECD) og validert av (European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) for hudkorrosjon og irritasjonstesting, for eksempel EpiDerm eller SkinEthic10,11,12. Den andre typen er full-skin ekvivalenter med et lag av differensiering menneskelig keratinocytter frøet på en tredimensjonal (3D) stillas som inneholder fibroblaster, for eksempel T-Skin og EpiDerm-FT. Imidlertid dyrkes disse modellene under statiske forhold, noe som gjør at de ikke kan representere menneskelige fysiologiske forhold nøyaktig.

Nylig interesse har fokusert på å generere in vitro 3D-hudmodeller i cellekulturinnsettingsformater (CCI) med dynamisk perfusjon13,14,15,16,17,18,19. Imidlertid kan disse systemene ikke betraktes som stricto sensu som mikrofluidisk hud-på-chips i henhold til deres klassiske definisjon i feltet. Ingbers definisjon for organer-på-en-chip sier at orgelet må plasseres inne i mikrofluidiske kanaler, noe som er en betingelse at bare noen få enheter oppfyller20,21. Skin-on-chips har så langt modellert for det meste enkle epithelia som encellede lag og / eller dermale cellelag skilt av en porøsmembran 22,23. Selv om det har vært noen fremskritt modellering hud i mikrofluidiske systemer16,24, det er for tiden ingen litteratur som viser et organ-on-a-chip system som passer Ingber definisjon, i stand til å produsere en flerlags hud in situ og inkludert både epitelial og stromal komponenter.

I dette arbeidet presenteres en ny, kostnadseffektiv, robust, vinylbasert mikrofluidisk plattform for hud-på-en-chip-applikasjoner. Denne plattformen ble produsert av mikrobearbeiding, som gir mer enkelhet i fabrikasjonsprosessen, samt økt fleksibilitet og allsidighet i utformingen av enheten, og overvinner noen av begrensningene til PDMS25. En måte å introdusere en forenklet hudkonstruksjon gjennom en parallell strømning kontrollert med sprøytepumper ble også designet. Parallell strømning gjør at to væsker med svært forskjellige viskositeter (en buffer og fibrin pre-gel i dette tilfellet) kan perfunderes gjennom en kanal uten å blande seg med hverandre. Som et konseptbevis ble en dermo-epidermal konstruksjon som inneholder fibroblaster innebygd i en fibrinmatrise som etterligner dermis introdusert i enheten, på toppen av hvilken en monolayer av keratinocytter ble lastet for å etterligne den uavklarte epidermis. Høyden på det dermale rommet kan moduleres ved å endre strømningshastighetene. Hovednyheten i dette arbeidet, sammenlignet med tidligere beskrevne modeller22,26,27,28,29, er utviklingen av en 3D-konstruksjon inne i en mikrokammer ved hjelp av mikrofluidikk. Selv om denne artikkelen presenterer en forenklet undifferentiated hud, er det langsiktige målet å generere og karakterisere en fullt differensiert hudkonstruksjon for å demonstrere sin levedyktighet og funksjonalitet for narkotika- og kosmetiske testformål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Chip design og mikromaskinering parametere

  1. Design de mikrofluidiske chiplagene med FreeCAD åpen kildekode-designprogramvare; se tabell 1 for dimensjonene til kanalene. Inkluder fire hull med en diameter på 2,54 mm i designet for å bruke en skreddersydd justering for riktig lagoverlegg.
Lengde (μm) Bredde (μm)
Nedre kammer 28,400 800
Øvre kammer 31,000 800

Tabell 1: Dimensjoner på enhetens øvre og nedre kanaler.

  1. Klipp 95 μm tykke, selvklebende, gjennomsiktige vinylplater i 30 cm x 30 cm firkanter for å passe riktig inn i plotteren.
  2. Bruk Brother CanvasWorkspace-programvaren til å opprette et arbeidsområde på 30 cm x 30 cm, og fyll det med de utformede mønstrene for de forskjellige lagene på brikken (Figur 1A). Lagre den i en .svg fil.
  3. Klipp 30 cm x 30 cm vinylplater med kantplotteren (Figur 1B-D).
    1. Fest vinylplaten til en lav tack limmatte, og eliminer alle luftboblene om nødvendig.
    2. Last opp den .svg filen til plotteren, og sett skjæreparametrene: skjæreblad: nivå 3; skjæretrykk: nivå 0; skjærehastighet: nivå 1. Plasser limmatten med vinylen i plotteren, og start skjæreprosessen.
  4. Klipp toppkanalmønsteret på 12 μm-tykk dobbeltsidig tapevinyl ved å følge de forrige trinnene.

Figure 1
Figur 1: Chipdesign og mikromaskineringsprosess. (A) Programvareoppsett som viser arbeidsområdet fylt med både topp- og bunnmønstre designet for brikken. (B) Kantplotter under skjæringsprosessen; skjæreblad, hele vinylplater og klebematte vises. (C) Mønstret vinyl blir løsnet fra kuttarket. (D) Prøve av et selvklebende vinyllag mønstret med toppkanaldesign. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. PDMS lag fabrikasjon

  1. Bland PDMS og herdemiddel i forholdet 10:1 (v/v), og plasser blandingen under vakuum i 15 minutter for å fjerne luftbobler. Hell 55 ml av blandingen i en 55 cm2 firkantet kulturrett for å oppnå et 2 mm tykt lag. Fjern bobler med en nål.
  2. Herd blandingen (trinn 2.1) i en ovn i 1 time ved 80 °C. Unmold PDMS og kutt den i rektangler med spondimensjonene. Lag hull for slangen med en 18 G sprøytenål.

3. Brikkemontering

MERK: Hvis du vil ha bedre forståelse, kan du se figur 2.

  1. Monter hele enheten ved hjelp av en justeringsenhet for å justere kanaler, innløp og uttak på riktig måte. Stable opp fire vinyllag (med tilsvarende nedre mikropattern) for montering av den nedre kanalen, og hold dekselbåndet på bunnlaget for å unngå å holde seg til justeringen.
  2. Klipp og plasser polykarbonat (PC) porøs membran på toppen av den nedre kanalen for å skille den fra den øvre. Pass på at du ikke dekker innløpene til den nedre kanalen.
  3. Tilsett ti vinyllag med det øvre kammerdesignet. Stikk et dobbeltsidig tapevinyllag med toppkanalmønsteret på toppen. Fjern brikken fra justeringsskuffen og fest den på glasssklie.
  4. Plasser et 2 mm tykt PDMS-ark på toppen av det tosidige tapevinyllaget for å gi passende forankring for slangen og for å unngå lekkasje. Legg en vekt på toppen av brikken over natten for å sikre at brikken er helt vanntett. Steriliser brikken ved å skylle 70% v/ v etanol i 5 min, og vask deretter med destillert H2O.

Figure 2
Figur 2: Mikrofluidisk brikkeenhet. (A) Generell ordning for montering av enheten. Nedre og øvre kamre består av henholdsvis fire og elleve overliggende vinylplater. (B) Topp- og sidevisning av mikrofluidisk brikke. Topp- og bunnkanaler er representert i henholdsvis rosa og blått. (C) Bilde av brikkeenheten ved hjelp av en skreddersydd justeringsenhet. (D) Brikkebilde etter fullført montering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Pumpeforbindelser

MERK: Den grafiske representasjonen av pumpetilkoblinger er vist i figur 3.

  1. Koble pumpe 1 til øvre kammerinntak 1 (UCi1).
  2. Koble pumpe 2 til øvre kammerinntak 2 (UCi2).
  3. Koble pumpe 3 til det nedre kammerinntaket (LCi).
  4. Koble øvre kammeruttak (UCo) og nedre kammeruttak (LCo) til et avfallsrør.
  5. Koble sprøytene til hvert innløp ved hjelp av polytetrafluoretylenrør (PTFE) og 18 G kontakter i rustfritt stål.

Figure 3
Figur 3: Pumpetilkoblinger og innløps-/uttakssted. (A) Diagram som viser tilkoblingen av de tre forskjellige pumpene til de respektive innløpene. Stikkontakter kobles til en avfallsbeholder. (B) Chip bilde med merkede innløp og uttak. Forkortelser: LCi = nedre kammerinntak; LCo = nedre kammeruttak; UCi1 = øvre kammerinntak 1; UCi2 = øvre kammerinntak 2; UCo = øvre kammeruttak. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Cellekultur

MERK: HaCaT-cellelinjen har kommersiell opprinnelse. Menneskelige primære fibroblaster kommer fra friske givere og ble hentet fra samlingen av biologiske prøver av menneskelig opprinnelse registrert i "Registro Nacional de Biobancos para Investigación Biomédica del Instituto de Salud Carlos III".

  1. Arbeid i en cellekultur hette, tidligere sterilisert under ultrafiolett lys og tørket med etanol.
  2. Tine H2B-GFP-HaCaT celler (menneskelig udødeliggjort hud keratinocytter, hKCs) og GFP-menneskelige primære fibroblaster (hFB) ved 37 °C, tilsett 2 ml kulturmedium, og sentrifuger i 7 minutter ved 20 °C ved 250 × g.
    MERK: H2B-GFP-HaCaT celler er menneskelig udødeliggjort keratinocytter modifisert for å uttrykke en hybrid histone H2B-grønn fluorescerende protein (GFP), som gir sine kjerner med grønn fluorescens. GFP-hFB er menneskelige primære fibroblaster forvandlet med vektoren pLZRS-IRES-EGFP for å uttrykke cytoplasmic grønn fluorescens. Disse cellene ble endret etter tidligere publiserte protokoller30,31
  3. Kultur både hKCs og hFB i 1x DMEM supplert med 10% foster bovint serum og 1% av antibiotika / antimykotisk løsning. Forvarm kulturmediet ved 37 °C før bruk.
  4. Løsne cellene ved å vaske dem med 1x fosfatbufret saltvann (PBS), tilsett 2 ml trypsin/etylendiamintetraedsyre (EDTA) og inkuber dem i 10 minutter ved 37 °C.
  5. Deaktiver trypsin og tilsett 4 ml kulturmedium. Resuspend cellene, og overfør dem til et 15 ml rør. Fjern 10 μL for å telle celler på et Neubauer-kammer og bestemme riktig konsentrasjon.
  6. Sentrifuger 15 ml-røret i 7 min ved 20 °C ved 250 × g. Fjern supernatanten, og resuspend pellets ved ønsket konsentrasjon: hFB ved 50,000 celler / ml og hKCs ved 5·× 106 celler / ml.

6. Fibrinogen pre-gel forberedelse

  1. Aktiver trombin ved å legge til 1 ml CaCl2 (1 % w/v i NaCl) i hetteglasset.
  2. Tilsett følgende komponenter for å oppnå 1 ml fibrinhydrgel ved en endelig konsentrasjon av fibrin på 3,5 mg/ml: 59 μL aktivert trombin (10 NIH-enheter/ml), 59 μL traneksaminsyre (Materialtabell, 100 mg/ml), 764 μL kulturmedium som inneholder 50 000 hGB-er/ml, 118 μL fibrinogen (20 mg/ml i NaCl (0,9 % m/v)).
    MERK: Fibrinogen må tilsetts i siste øyeblikk.

7. Parallell strømningsprotokoll

  1. Pump 1x PBS med pumpe 3 gjennom LCi ved 50 μL/min under hele prosessen.
  2. Pumpe offervæske (1x PBS) med pumpe 2 gjennom UCi2 ved 100 μL/min.
  3. Legg sprøyten med forgelen, plasser den raskt i pumpe 1, og kjør den i 200 μL/min (figur 4A).
  4. Stopp pumpene 1 og 2 når pre-gelen går ut av UCo.
  5. La brikken stå uten å fjerne slangen ved 37 °C i minst 10 minutter for å tillate gelering.
  6. Pumpekulturmedium ved 50 μL/t med pumpe 3 til UCi2 over natten.
  7. Blokker UCi1 med en hette.

8. hKC monolayer sådd

  1. Kontroller under mikroskopet at hGB-er er spredt 24 timer etter generering av dermalrommet.
  2. Introduser hKCene med pumpe 2 til UCi2 ved 5 ×·106 celler/ml ved 40 μL/min i 1 min (figur 4B).
  3. La brikken stå over natten ved 37 °C i en fuktighetsmettet inkubator for cellevedlegg.
  4. Pump friskt kulturmedium med pumpe 3 kun gjennom LCi ved 50 μL/min (Figur 4C).

Figure 4
Figur 4: Mikrofluidisk protokoll for generering av dermo-epidermal konstruksjon. (A) Tverrsnitt som viser parallell strømningsprosessen for å generere det dermale rommet. (B) Keratinocytt monolayer sådd 24 timer etter dermal romgenerering. (C) Vedlikehold av cellekultur inne i mikrofluidisk enhet. (D) Tverrsnittsrekreasjon av huden inne i brikken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

9. Analyse av celle levedyktighet

MERK: Live/Dead kit flekker celler med grønn eller rød fluorescens avhengig av deres levende eller døde tilstand. For riktig levedyktighetsdifferensiering må ikke-fluorescerende hKCer og hGB-er brukes i dette trinnet. Alle trinnene i prosedyren utføres gjennom UCi2 med pumpe 2.

  1. Vask toppkanalen med 1x PBS i 5 min ved 50 μL/min for å fjerne kulturmediet.
  2. Pumpeluft for å fjerne 1x PBS ved 50 μL/min.
  3. Klargjør Calcein AM/Ethidium homodimer-1 Kit (Live/Dead)-løsningen ved å følge produsentens anvisninger.
  4. Pump Live/Dead-oppløsning på 50 μL/min i 2 min.
  5. Inkuber 30 min ved 37 °C i mørket.
  6. Vask toppkanalen ved å pumpe 1x PBS ved 50 μL/min i 2 minutter for å fjerne gjenværende reagens.
  7. Vær oppmerksom på prøven under det konfiske mikroskopet. Bruk en eksitasjonsbølgelengde på henholdsvis 495/590 nm og en utslippsbølgelengde på 519/617 nm for levende og døde celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den designede brikken består av to fluidiske kamre skilt av en PC-membran på 5 μm porestørrelse som tillater veksten av cellen ved å tillate passasje av vekstfremmende molekyler fra det nedre kammeret. Det øvre kammeret holder vevskonstruksjonen, i dette tilfellet en monolayer av hKCer på en fibrin hydrogel som inneholder hGB-er.

Kanalens høyde bestemmes av antall limplater som legges til hver kanal. Det nedre kammeret består av 4 lag (380 μm) og det øvre av 10 ensidige tapelag og en dobbeltsidig (962 μm). Dimensjonene på brikken er 4 cm x 2 cm, noe som forbedrer manipulasjonen. De selvklebende vinylplatene gir vanntetthet og gjennomsiktighet for visuell inspeksjon av enheten. PDMS-laget var nyttig for riktig forankring av llthe-slangen for å unngå lekkasje fra hullene der rørene ble festet.

Ifølge publisert litteratur er injiserbarheten av celleholdige hydrogeler i mikrofluidiske kamre ved hjelp av sprøytepumper ikke rapportert til dags dato. Av denne grunn måtte injiserbarheten av fibrin pre-gel vurderes. Vi observerte at under en strøm på 50 μL/min ble sprøyten blokkert. Strømningshastigheter som er høyere enn 200 μL/min, kan imidlertid skade cellene. Reologiske studier ble utført for å teste skjærfortynnende oppførsel av fibrin pre-gel, og fikk viskositeter fra 10 til 50 cP innenfor det valgte strømningshastighetsområdet (50-200 μL / min). Disse resultatene bidro til å etablere arbeidsforholdene til dette systemet.

I dette arbeidet er det utviklet en parallell strømningsmetode basert på genereringen av to overliggende laminære strømmer den nedre er pre-gel, mens den øvre var offervæske (PBS). Numerisk løse Navier-Stokes ligninger og pålegge passende grensebetingelser, fant vi at det var flere mulige løsninger for å oppnå ønsket høyde. Tatt i betraktning skjærhastighetsgrensene som ble etablert tidligere, for å oppnå en hydrogel på ca. 500 μm høyde, var strømningshastighetene henholdsvis 104 og 222 μL / min for offer PBS og pre-gel. I praksis ble mikrostrømningshastigheter på 100 og 200 μL/min brukt til enkelhet. Ved gjeninnført i modellen ble disse verdiene funnet å resultere i en gelhøyde på 576 μm, svært lik de forventede verdiene (Figur 5B). For å eksperimentelt kontrollere funksjonen til den foreslåtte metoden, ble høyden på hydrogelen langs det øvre kammeret målt. En gjennomsnittlig høyde på 550 μm ble observert (Figur 5A), ganske lik prediksjonen av vår matematiske modell.

Figure 5
Figur 5: Matematiske parallelle strømningsløsninger for å velge passende pre-gel og offervæskestrømmer for å oppnå ønsket dermal høyde. (A) Sett forfra på det konfokale bildet av hKCer frøet på toppen av fibringelen for å vurdere høyden. (B) Matematisk løsning for forskjellige høyder avhengig av pre-gel og PBS strømningshastigheter. Forkortelser: hKCs = menneskelig udødeliggjort hud keratinocytter; PBS = fosfatbufret saltvann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ved etablering av protokollen i begynnelsen ble PBS ikke spylt gjennom den nedre kanalen, noe som førte til uoverensstemmelser mellom gelens teoretiske høyde og den som ble målt. Denne høydeforskjellen var ~40 % sammenlignet med den estimerte (Figur 6). Når protokollen var optimalisert og PBS pumpet gjennom det nedre kammeret, ble dette høydetapet løst (figur 5).

Figure 6
Figur 6: Konfokal visning av hKCer frøet på toppen av hydrogelen for å måle høyden når PBS ikke ble pumpet gjennom det nedre kammeret. Forkortelser: hKCs = menneskelig udødeliggjort hud keratinocytter; PBS = fosfatbufret saltvann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7A viser et fluorescerende toppbilde av det øvre kammeret som inneholder en fibrinhydrgel med innebygde GFP-hGB-er, som viser at 24 timer etter lasting er cellene jevnt fordelt langs kammeret og godt spredt. Figur 7B viser sammenfølende GFP-hKCer frøet på toppen av hydrogelen.

Figure 7
Figur 7: Fluorescensbilder av den øvre kanalen som viser forskjellige celler sådd i enheten. (A) Sett ovenifra i det øvre kammeret 24 timer etter parallell strømningsprotokoll som viser hGB-ene som er innebygd i fibringelen. (B) Sammenfallende GFP-hKCer frøet på toppen av hydrogelen 24 timer etter hydrogelgenerering. Stiplet rød linje angir kanalvegger. Skalastenger: 400 μm. Forkortelser: hFB = humane primære fibroblaster; GFP-hKCs = grønn fluorescerende protein-uttrykkende menneskelig udødeliggjort hud keratinocytter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Det er viktig å holde systemet lukket over natten til hKC-sedimentet og festes til hydrogeloverflaten. Når slangen fjernes før cellevedlegg, kommer luftbobler inn i kanalen og fortrenger celler, noe som fører til et ikke-enhetlig samtidig monolag, som vist i figur 8.

Figure 8
Figur 8: Sett hydrogeloverflaten øverst når du fjerner slanger umiddelbart etter hKCs sådd. Stiplet rød linje angir kanalvegger. Skalastang: 400 μm. Forkortelser: hKCs = humane udødelige hud keratinocytter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Celle levedyktighetstesten utført på hFB innebygd i hydrogelen ble utført 24 timer etter lasting ved hjelp av parallell strømningsmetoden, som viser en celle levedyktighet på ~ 95%. Den samme testen utført på hKCs celler 24 timer etter sådd dem på fibrin hydrogel viste lignende resultater. Det neste trinnet var å generere en dermo-epidermal konstruksjon og studere strukturen ved hjelp av konfokal mikroskopi etter 24 timer (figur 9).

Figure 9
Figur 9: Rekonstruert 3D-konfikalt bilde av den udifferensierte hudmodellen i mikrofluidisk brikke. Gul stiplet linje indikerer overflaten på hydrogelen som skiller hKCer (øverst) fra hFB-ene som er innebygd i gelen (bunnen). Forkortelser: hFB = humane primære fibroblaster; hKCs = humane udødelige hud keratinocytter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Det er avgjørende å finne en likevekt mellom skjærfortynnende oppførsel av fibrinogengelen og dens gelasjonstid: Hvis det tar for lang tid å etablere parallellstrømmen, koagulerer den og blokkerer systemet; Hvis gelasjonsprosessen er for langsom, vil hGB-er i hydrogelen sedimentere som vist i figur 10. Oppførselen til denne forbigående tilstanden kan reguleres ved å variere trombinkonsentrasjonen.

Figure 10
Figur 10: Konfokalt bilde av en fibrinhydrgel som viser sedimenterte hGB-er (i rødt) på grunn av langsom fibringeletid. En hKCs monolayer (i blått) vises på toppen av gelen. Forkortelser: hFB = humane primære fibroblaster; hKCs = humane udødelige hud keratinocytter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Under enhetens planifisering og bakre eksperimentelle praksis oppstod noen komplikasjoner som måtte løses for å oppnå en optimalt fungerende enhet og godt strukturert vev. Disse problemene vises i tabell 2sammen med løsningene for feilsøking.

Problemer Løsninger
Vi presenterer en 3D-hydrogel i det øvre kammeret, og etterlater ledig plass over til frø keratinocytter på toppen etter dermal generasjon Påfør en parallell strøm av to væsker (PBS og pre-gel) med forskjellige viskositeter for å skape et dermalt rom med kontrollert høyde.
Feiljustering av kanal under stabling av vinylplater Bruk av en skreddersydd justeringslinje for å stable opp alle arkene på riktig sted
Oppnå en samtidig keratinocyttmonolayer på toppen av fibringelen for å simulere epidermis Tillat cellefeste til gelen før du fjerner rørene fra brikken, og forhindrer at luftbobler kommer inn i kanalen og fortrenger cellene.
Hydrogel høydetap langs kanalen på grunn av pre-gel lekkasje til den nedre kanalen under parallell strømningsprotokoll gjennom porøs membran. Pump PBS gjennom den nedre kanalen under parallell strømningsetablissement.
Fibroblast sedimentering inne i gelen Trombinkonsentrasjonen ble litt økt for å akselerere fibringelering

Tabell 2: Problemstillinger som ble funnet under utviklingen av det aktuelle arbeidet og løsningene som ble brukt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Motivasjonen for å utvikle denne metoden var ønsket om å modellere hudsykdommer og studere effekten av nye og innovative terapier i en plattform med høy gjennomstrømning. Til dags dato produserer dette laboratoriet disse dermo-epidermale ekvivalentene ved å støpe- enten manuelt eller ved hjelp av 3D-bioprintingsteknologien - fibringelen med fibroblaster i en cellekulturinnleggsplate og sådd keratinocyttene på toppen av den. Når keratinocyttene når samløp, blir 3D-kulturen utsatt for luftvæskegrensesnittet, som induserer keratinocyttdifferensiering, genererer en stratifisert epidermis og følgelig en fullt utviklet interfollicular menneskelig hud32,33,34. Imidlertid er disse 3D-kulturene, om enn svært relevante klinisk, dyre, tidkrevende og etterligner ikke fysiologiske forhold.

Tissue-on-a-chip-teknologi gir en plattform for å etterligne fysiologiske forhold i cellekulturen, og dermed muliggjøre en bedre forståelse av toksisitet, effekt og levering av legemiddelkandidater13,14,15,16,17,18,19,35. De fleste vevene modellert på mikrofluidiske "klassiske" chips består av enkeltlag av celler, for det meste epitelceller22,26,42,27,28,36,37,38,39,40,41 . Modelleringen av mer komplekse, flerlags vev har blitt hindret av vanskeligheten med å generere homogene og overliggende vevslag.

Den viktigste nyheten i dette arbeidet, sammenlignet med tidligere enheter22,43, er utviklingen av en metode for å generere en uavklart og forenklet hudkonstruksjon ved hjelp av mikrofluidikk. Videre er en annen viktig innovasjon med hensyn til andre publiserte teknologier44 utformingen av et relativt enkelt, kostnadseffektivt, brukervennlig engangsbrikkesystem laget av biokompatible vinylplater som tillater ad hoc-fabrikasjon. Dette systemet unngår bruk av silisiumskiver og kompliserte plasmabindingsprosedyrer som trengs med PDMS25. Sjetonger basert på dette materialet krever generering av wafere som er spesifikke for hver forskjellige chipdesign, noe som øker prisen på prototypingsprosessen. Alt dette gjør den nåværende "klassiske" teknologien dyr, kompleks og ikke veldig fleksibel.

For å overvinne disse begrensningene, ved å bruke hud som vevsmodell, presenterer vi en veldig fleksibel, billig og robust mikrofluidisk plattform basert på vinyllag, produsert av mikromaskinering. Vi presenterer også en ny metodikk basert på den parallelle strømmen av laminære væsker som gjør det mulig å in situ-generasjonen av en bilayerhudkonstruksjon med et lavere dermalt rom som inneholder hFB og et øvre epidermalt rom som består av en monolayer av hKCer. Brikken består av to kamre skilt av en porøs PC-membran. Den øvre kanalen inneholder hudkonstruksjonen og etterlater ledig plass for å tillate hKC-differensiering og stratifisering og / eller perfusjon av kulturmedium, luft eller til og med stoffer i fremtiden. Det nedre kammeret er kontinuerlig perfundert med kulturmedium for å fremme cellevekst. Bruk av en porøs membran kan føre til tap av en del av forgelen fra det øvre kammeret til den nedre når den utsettes for høyt trykk på grunn av pumpekraft. Å introdusere en PBS-strømning i det nedre kammeret kompenserer denne trykkforskjellen og unngår denne lekkasjen.

Fordelingen av hKCer på hydrogeloverflaten er et viktig aspekt når du genererer en hudmodell. Når de ikke er homogent spredt, kan genereringen av en jevn monolayer og derfor den epidermale differensiering hemmes. På samme måte må hGB-er fordeles likt i hydrogelen for å ligne deres naturlige plassering der de finnes i ekte hud. For å unngå cellesedimentering eller rørblokkering må hydrogelsammensetning (spesielt trombinkonsentrasjon) studeres nøye for å kontrollere gelasjonstider og skjærfortynnende oppførsel.

Til tross for disse oppmuntrende funnene, er det nødvendig med fremtidig arbeid for å demonstrere systemets langsiktige funksjon som er nødvendig for å fremme riktig spredning og differensiering av hKC-monolayeren for å danne en godt differensiert menneskelig hud, inkludert et stratum corneum. Foruten hud, vil dette systemet tillate generering av andre komplekse, flerlags vevskonstruksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker oppriktig Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán og Juan Francisco Rodríguez for svært nyttige forslag, diskusjoner og / eller foreløpige data. Vi takker også bidragene fra Sergio Férnandez, Pedro Herreros og Lara Stolzenburg til dette prosjektet. Spesiell takk gå til Dr. Marta García for GFP-merket hFB og hKCs. Til slutt anerkjenner vi den utmerkede tekniske hjelpen til Guillermo Vizcaíno og Angélica Corral. Dette arbeidet ble støttet av "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Dette arbeidet ble også støttet av "Programa de excelencia", Project EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amchafibrin Rottafarm Tranexamic acid
Antibiotic/antimycotic Thermo Scientific HyClone
Calcium chloride Sigma Aldrich
Culture plates Fisher
DMEM Invitrogen Life Technologies
Double-sided tape vynil ATP Adhesive Systems GM 107CC, 12 µm thick
Edge plotter Brother Scanncut CM900
FBS Thermo Scientific HyClone
Fibrinogen Sigma Aldrich Extracted from human plasma
Glass slide Thermo Scientific
GFP-Human dermal fibroblasts - Primary. Gift from Dr. Marta García
H2B-GFP-HaCaT cell line ATCC Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García
Live/dead kit Invitrogen
PBS Sigma Aldrich
Polycarbonate membrane Merk TM 5 µm pore size
Polydimethylsiloxane Dow Corning Sylgard 184
Sodium chloride Sigma Aldrich
Syringes Terumo 5 mL
Thrombin Sigma Aldrich 10 NIH/vial
Transparent adhesive vinyl Mactac JT 8500 CG-RT, 95 µm thick
Trypsin/EDTA Sigma Aldrich
Tubing IDEX Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McNamee, P., et al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).
  2. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
  3. Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).
  4. Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
  5. Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).
  6. Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
  7. Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A. Pronko et al. Reply. Physical Review Letters. 86 (7-12), 1387 (2001).
  8. H.R.2858 - Humane Cosmetics Act. 114th Congress. , Available from: https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858 (2016).
  9. Global in-vitro toxicology testing market report: size, share & trends analysis 2014-2015. , Available from: https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html (2018).
  10. Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. Tissue engineered human skin equivalents. Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).
  11. OECD. In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431. OECD Guideline for Testing of Chemicals. , (2019).
  12. Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients. International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).
  13. vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).
  14. Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
  15. Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents. Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).
  16. Wu, R., et al. Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function. Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).
  17. Materne, E. -M., et al. The multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526 (2015).
  18. Schimek, K., et al. Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications. Bioengineering. 5 (2), 43 (2018).
  19. Alberti, M., et al. Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing. Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).
  20. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature BIotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  21. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).
  22. Wufuer, M., et al. Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment. Scientific Reports. 6, 37471 (2016).
  23. Ramadana, Q., Ting, F. C. W. In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin. Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).
  24. Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898 (2020).
  25. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  26. Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  27. Huh, D. A human disease model of drug toxicity - induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice. Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).
  28. Beckwitt, C. H., et al. Liver ' organ on a chip '. Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).
  29. Poceviciute, R., Ismagilov, R. F. Human-gut-microbiome on a chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 500-501 (2019).
  30. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  31. Escámez, M. J., et al. Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement. Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).
  32. Llames, S. G., et al. Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin. Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).
  33. Llames, S., et al. Clinical results of an autologous engineered skin. Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).
  34. Cubo, N., Garcia, M., del Cañizo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. 3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis. Biofabrication. 9 (1), 015006 (2016).
  35. Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip. Biomaterials. 116, 48-56 (2017).
  36. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).
  37. Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535 (2016).
  38. Marx, U., et al. Human-on-a-chip' developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man. Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).
  39. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  40. Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation. Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).
  41. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).
  42. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
  43. O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture. Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).
  44. Ren, K., Chen, Y., Wu, H. New materials for microfluidics in biology. Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).

Tags

Bioingeniør utgave 171
Generering av en forenklet tredimensjonal hud-på-en-chip-modell i en mikromaskin mikrofluidisk plattform
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Risueño, I., Valencia, L.,… More

Risueño, I., Valencia, L., Holgado, M., Jorcano, J. L., Velasco, D. Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (171), e62353, doi:10.3791/62353 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter