Summary
यहां वर्णित मच्छरों से उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए निष्कर्षण का उत्पादन करने के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके एक डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल है। ये निष्कर्षण एक डाउनस्ट्रीम अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त हैं।
Abstract
चुंबकीय मोतियों और एक स्वचालित डीएनए निष्कर्षण उपकरण का उपयोग करके हाल ही में प्रकाशित डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल ने सुझाव दिया कि डाउनस्ट्रीम पूरे जीनोम अनुक्रमण के लिए पर्याप्त एक अच्छी तरह से संरक्षित व्यक्तिगत मच्छर से उच्च गुणवत्ता और मात्रा डीएनए निकालना संभव है। हालांकि, एक महंगे स्वचालित डीएनए निष्कर्षण उपकरण पर निर्भरता कई प्रयोगशालाओं के लिए निषेधात्मक हो सकती है। यहां यह अध्ययन बजट के अनुकूल चुंबकीय-मनका आधारित डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जो कम से मध्यम थ्रूपुट के लिए उपयुक्त है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल का व्यक्तिगत एडीज एजिप्टी मच्छर के नमूनों का उपयोग करके सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया । उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए निष्कर्षण से जुड़ी कम लागत संसाधन सीमित प्रयोगशालाओं और अध्ययनों के लिए उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के आवेदन में वृद्धि होगी।
Introduction
बेहतर डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल1 के हालिया विकास ने कई उच्च प्रभाव वाले डाउनस्ट्रीम अध्ययनों की अनुमति दी है जिसमें संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण 2 ,3,4,5,6शामिल हैं । यह चुंबकीय मनका आधारित डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल व्यक्तिगत मच्छर नमूनों से विश्वसनीय डीएनए उपज प्रदान करता है, जो बदले में क्षेत्र संग्रह से पर्याप्त संख्या में नमूने प्राप्त करने से जुड़े लागत और समय को कम करता है।
जनसंख्या और परिदृश्य जीनोमिक्स में हाल की प्रगति सीधे पूरे जीनोम अनुक्रमण की घटती लागत के साथ सहसंबद्ध हैं। हालांकि पिछले डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल1 उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के साथ जुड़े क्षमता बढ़ जाती है, छोटे प्रयोगशालाओं/धन के बिना अध्ययन प्रोटोकॉल को लागू करने की लागत के कारण इन नए शक्तिशाली परिदृश्य और जनसंख्या जीनोमिक्स उपकरणों का उपयोग करने से बाहर निकलना हो सकता है (जैसे, विशेष उपकरणों की लागत) ।
यहां, एक संशोधित डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है जो उच्च शुद्धता डीएनए प्राप्त करने के लिए Neiman एट अलके रूप में एक समान चुंबकीय मनका निष्कर्षण कदम का उपयोग करता है, लेकिन ऊतक लाइसिस और डीएनए निष्कर्षण के लिए उच्च लागत वाले उपकरणों पर भरोसा नहीं करता है। यह प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए के >10 एनजी की आवश्यकता वाले प्रयोगों के लिए उपयुक्त है।
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Protocol
1. सामान्य नमूना भंडारण और डीएनए निष्कर्षण से पहले तैयारी
- यदि ऊतक को नरम करने के लिए नमूना को 1 घंटे (या रात भर) 4 डिग्री सेल्सियस पर 100 माइक्रोन पीसीआर-ग्रेड पानी > में हाइड्रेट करें।
2. नमूना व्यवधान
- 56 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर या हिलते हुए हीट ब्लॉक सेट करें।
- प्रोटीनेज के (पीके) बफर/एंजाइम मिक्स करें । प्रत्येक व्यक्ति मच्छर निकालने के लिए प्रोटीनेज के 2 माइक्रोन (100 मिलीग्राम/एमएल) और प्रोटीनेज के 98 माइक्रोन बफर (कुल 100 माइक्रोन) की आवश्यकता होती है। कई नमूनों के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए, पर्याप्त मात्रा की उपलब्धता सुनिश्चित करने के लिए कुल राशि (सभी व्यक्तिगत नमूनों के लिए संयुक्त) ~ 15% तक बढ़ाएं।
- यदि नमूने निकालने से पहले हाइड्रेटेड थे, प्रत्येक नमूना ट्यूब से पानी त्यागें ।
- मच्छर ऊतक युक्त 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में, पीके बफर/एंजाइम मिश्रण के 100 माइक्रोल जोड़ें।
- माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब मूसल का उपयोग करके ऊतक को समरूप करें।
- कमरे के तापमान पर 9,600 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए नमूनों को सेंट्रलाइज करें।
- 56 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे के लिए नमूना इनक्यूबेट।
- इनक्यूबेशन के दौरान, डीएनए निष्कर्षण चरण (चरण 3) का उपयोग करके अन्य अभिकर् ती तैयार करें।
3. डीएनए निष्कर्षण
- एक चुंबकीय मनका मास्टर मिश्रण करें। प्रत्येक नमूने के लिए, लाइसिस बफर के 100 माइक्रोन, आइसोप्रोपेनॉल के 100 माइक्रोन, और चुंबकीय मोतियों की 15 माइक्रोन (कुल 215 माइक्रोन) मिलाएं। कई प्रतिक्रियाओं के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए, पर्याप्त मात्रा की उपलब्धता सुनिश्चित करने के लिए कुल राशि (सभी व्यक्तिगत नमूनों के लिए संयुक्त) को ~ 20% तक बढ़ाएं।
- इनक्यूबेशन समय (चरण 2.7) के बाद, प्रत्येक लिसेट को एक साफ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब या पिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट पर स्थानांतरित करें।
- प्रत्येक नमूने में चुंबकीय मनका मास्टर मिश्रण के 100 μL lysate और 215 μL जोड़ें।
- 10-20 एस के लिए इसे अच्छी तरह से मिलाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें और फिर इसे कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए खड़े होने दें। चुंबकीय मोतियों और डीएनए के बंधन को अधिकतम करने के लिए कभी-कभी ट्यूब को धीरे से हिलाएं।
- ट्यूब/प्लेट को चुंबकीय मनका विभाजक पर रखें और समाधान स्पष्ट होने तक प्रतीक्षा करें।
- पिपेट का उपयोग करके ट्यूब/प्लेट से तरल को त्यागें। सुपरनेट को हटाते समय कोशिश करें कि डीएनए को पकड़े चुंबकीय मोतियों को स्पर्श या परेशान न करें।
- ट्यूब/प्लेट को चुंबकीय मनका विभाजक से दूर ले जाएं और प्रत्येक अच्छी तरह से 325 μL वाशिंग बफर 1 जोड़ें।
- कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए पाइपिंग और इनक्यूबेट करके अच्छी तरह से मिलाएं।
- 3.5-3.6 चरणों को दोहराएं।
- ट्यूब/प्लेट को चुंबकीय मनका विभाजक से दूर ले जाएं और प्रत्येक अच्छी तरह से 1 धोने के 250 माइक्रोन जोड़ें।
- कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए पाइपिंग और इनक्यूबेट करके अच्छी तरह से मिलाएं।
- 3.5-3.6 चरणों को दोहराएं।
- ट्यूब/प्लेट को चुंबकीय मनका विभाजक से दूर ले जाएं और प्रत्येक नमूने में 250 μL वाशिंग बफर 2 जोड़ें।
- कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं।
- 3.5-3.6 चरणों को दोहराएं।
- ट्यूब/प्लेट को चुंबकीय मनका विभाजक से दूर ले जाएं और प्रत्येक अच्छी तरह से 2 धोने वाले बफर 2 के 250 माइक्रोन जोड़ें।
- कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं।
- 3.5-3.6 चरणों को दोहराएं।
- ट्यूब/प्लेट को चुंबकीय मनका विभाजक से दूर ले जाएं और प्रत्येक अच्छी तरह से 100 माइक्रोन एल्यूशन बफर जोड़ें।
- कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं।
- ट्यूब/प्लेट को चुंबकीय मनका विभाजक पर ले जाएं और समाधान स्पष्ट होने तक प्रतीक्षा करें ।
- एक नए स्वच्छ 0.5 माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब या माइक्रोप्लेट अच्छी तरह से सुपरनेट में पिपेट करें।
- डीएनए नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस (1 सप्ताह तक) या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अगर किसी माइक्रोप्लेट का इस्तेमाल किया जा रहा है तो उसे पैराफिल्म से कवर करें।
- किसी भी उपयुक्त विधि का उपयोग करके डीएनए पैदावार का निर्धारण करें।
नोट: इस अध्ययन में, डीएनए फ्लोरोमीटर पढ़ने और 260/280 एनएम पर अवशोषण का उपयोग किया गया ।
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Representative Results
प्रति व्यक्ति मच्छर सिर/छाती ऊतक औसत डीएनए उपज ४.१२१ एनजी/μL (एन = ९२, मानक विचलन ३.५१३) एक फ्लोरोमीटर का उपयोग कर मापा गया था जब elution बफर के १०० μL का उपयोग कर eluted । यह संपूर्ण जीनोम पुस्तकालयनिर्माण1,7के लिए आवश्यक 10-30 एनजी जीनोमिक डीएनए इनपुट आवश्यकताओं के लिए पर्याप्त है। मच्छर के शरीर के आकार और संरक्षण की स्थिति के आधार पर डीएनए की मात्रा 0.3-29.7 एनजी/μL के बीच भिन्न हो सकती है। कुछ उच्च परिवर्तनशीलता अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले चुंबकीय मोतियों की विशेषता के कारण होती है। चुंबकीय मोतियों के विभिन्न ब्रांड अधिक सुसंगत सांद्रता का उत्पादन कर सकते हैं, जैसा कि पिछली रिपोर्ट1में दर्शाया गया है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि मच्छर की विभिन्न प्रजातियां आकार में भिन्न होती हैं और डीएनए उपज उन व्यक्तिगत और प्रजातियों के आकार की श्रेणियों पर निर्भर करती है। यदि डीएनए एकाग्रता विशिष्ट श्रेणियों से नीचे है, तो कोई भी प्रोटीनज़ के रिएक्शन (चरण 2.7) में इनक्यूबेशन अवधि को समायोजित कर सकता है, लेकिन यह विस्तार 16 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए। इसके अलावा, प्रोटीन के और/या लाइसिस बफर ब्रांडों को स्विच करने से डीएनए यील्ड1पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है ।
0.5 एमएम ईडीटीए के साथ एल्यूशन बफर में अंतिम डीएनए का विशिष्ट माइक्रोवॉल्यूम फ्लोरोमीटर रीडिंग चित्र 1में दिखाया गया है। 260/280 एनएम के लिए औसत अवशोषण अनुपात 2.3 (मानक विचलन = 0.071) था। यह आंकड़े पिछले अध्ययनों में उपयोग किए गए नमूनों से3,4संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण के लिए उपयोग किए गए नमूनों के अनुरूप थे ।
ठेठ अभिकर्ण और निष्कर्षण के लिए उपभोग्य लागत के आसपास है $9.50/ इन लागत अनुमानों में सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध अभिकर्ण, और अन्य उपभोग्य पदार्थ जैसे पिपेट टिप्स, ट्यूब और निष्कर्षण के लिए आवश्यक दस्ताने शामिल हैं। रिएजेंट और उपभोग्य लागत किसी भी विशिष्ट चुंबकीय-मनका-आधारित निष्कर्षण विधि(तालिका 1) केबराबर है। किसी भी उत्पाद के लिए उपलब्ध थोक खरीद छूट के आधार पर लागत कुछ भिन्न हो सकती है। इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लागत लाभ स्वचालित डीएनए निष्कर्षण उपकरण की आवश्यकता नहीं से आता है।
चित्रा 1:फ्लोरोमीटर आउटपुट। मच्छर डीएनए का विशिष्ट डीएनए फ्लोरोमीटर आउटपुट 0.5 m EDTA के साथ एल्यूशन बफर में है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
तालिका 1: विभिन्न निष्कर्षण विधियों के लिए लागत विश्लेषण। तालिका में विभिन्न निष्कर्षण विधियों के लिए एक कार्य दिवस में संसाधित नमूनों की लागत और संख्या को सूचीबद्ध किया गया है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल को अन्य कीट प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। निमैन एट अल में पेश किए गए प्रोटोकॉल के मूल संस्करण का परीक्षण कई प्रजातियों पर किया गयाहै, जिनमें एडीज एजिप्टी, एई. बुस्की, एई. टैनिओरिचस, एनोफेल्स अरेबियंस, ए कोलुज़ी, एएन शामिल हैं। कौस्तानी, एक प्यारे, एक मजेदार, एक गाम्बियाई, एक क्वाड्रिननुलाटस, एक रुफिप्स, क्यूक्स पिपियंस, सीक्स क्विंक्विफासिटस, सीक्स थेइलेरी, ड्रोसोफिला सुजुकी, क्रिसोमेला एनेकोलिस टुटा एब्सोलुटा, और केफेरिया लाइकोर्सीला2,8, 9,100 उम्मीद है कि यह प्रोटोकॉल इनके साथ-साथ अन्य आर्थ्रोपोड के लिए भी काम करेगा।
आदर्श रूप में, डीएनए निष्कर्षण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 70%-80% इथेनॉल में नमूनों को संग्रहीत किया जाना चाहिए। आमतौर पर, अफ्रीका में मच्छरों के नमूनों के भंडारण के लिए 80% इथेनॉल का उपयोग किया जाता है। उच्च तापमान की स्थिति इथेनॉल के वाष्पीकरण में तेजी लाने और इथेनॉल सामग्री को इच्छित (70%) से कम बना सकती है। 100% इथेनॉल, विकृत शराब, 75%-90% आइसोप्रोपेनॉल या रगड़ शराब में संग्रहीत नमूनों के परिणामस्वरूप निमैन एट अल 1 प्रोटोकॉल का उपयोग करके सफल पूरे जीनोम अनुक्रमण भीहुए हैं, और यह उम्मीद की जाती है कि यह प्रोटोकॉल समान रूप से अच्छा प्रदर्शन करेगा। यहां वर्णित डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल में सिलिका में सूखे संग्रहित नमूनों पर भी कोशिश की गई है और -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हैं । हालांकि, >6-12 महीनों के लिए संग्रहीत होने पर विफलता की अधिक (15%-30%) संभावना थी, यह सुझाव देते हुए कि ये आदर्श भंडारण स्थितियों से कम थे।
शारीरिक नमूना व्यवधान के बिना डीएनए निष्कर्षण विफलता (33%)1की एक उच्च संभावना है के रूप में, इस प्रोटोकॉल एक मैनुअल शारीरिक व्यवधान तकनीक (चरण 2.5) शामिल हैं। ऊतक लाइसिस यंत्र पर स्टील मोतियों का उपयोग करके नमूना व्यवधान भी प्राप्त किया जासकताहै ।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके डीएनए निष्कर्षण के लिए अभिकर् ता और उपभोग्य लागत उपलब्ध अन्य निष्कर्षण विधियों(तालिका 1)के साथ तुलनीय है। हालांकि, यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लिए स्वचालित डीएनए निष्कर्षण उपकरण की आवश्यकता नहीं है। डीएनए निष्कर्षण प्रसंस्करण में शामिल शारीरिक श्रम के कारण, एक व्यक्ति आम तौर पर 12-16 नमूनों की प्रक्रिया और एक दिन में डीएनए परिमाणीकरण के साथ खत्म कर सकते हैं । यह काफी कम है जो स्वचालित डीएनए निष्कर्षण सेटअप प्रति दिन प्रक्रिया कर सकते हैं । इस प्रकार, प्रोटोकॉल चुनते समय, नमूना प्रसंस्करण क्षमता को ध्यान में रखा जाना चाहिए। हालांकि, कम लागत सीमा इस प्रोटोकॉल प्रदान करता है कई संसाधन सीमित प्रयोगशालाओं और अध्ययन उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में लाभ उठाने के लिए सक्षम होना चाहिए ।
निमैन एट अल1 और इस प्रोटोकॉल दोनों में, एल्यूशन बफर को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के आधार पर ठेठ टीई बफर, 10 एमएम ट्रिस-सीएल या पानी के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। कुछ ईडीटीए युक्त एक एल्यूशन बफर एंजाइम दक्षता को प्रभावित कर सकता है। विशिष्ट एंजाइमेटिक बाल्डरिंग-आधारित जीडीएनए लाइब्रेरी तैयारी प्रोटोकॉल में ईडीटीए द्वारा एंजाइम अवरोध की भरपाई के लिए जोड़े गए कंडीशनिंग समाधान या एन् वर्सेर शामिल हैं। यह भी विचार किया जाना चाहिए कि EDTA 230 एनएम तरंगदैर्ध्य11पर अवशोषण बदल सकता है । उदाहरण के लिए, ईडीटीए की उच्च सांद्रता चित्र 1 (डेटा नहीं दिखाए गए डेटा) की तुलना में 220-240 एनएम तरंगदैर्ध्य के बीच एक उच्च अवशोषण मूल्य पैदा करेगी।
इस प्रोटोकॉल को आसानी से न्यूनतम आणविक जीव विज्ञान उपकरणों के साथ प्रयोगशालाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल जीनोम निष्कर्षण से जुड़े लागत थ्रेसहोल्ड को कम करने का प्रयास करता है और इस तरह संसाधन सीमित प्रयोगशालाओं और अध्ययनों के लिए उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के अनुप्रयोग को बढ़ाता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम वेक्टर जनित रोगों के लिए उत्कृष्टता के प्रशांत दक्षिण पश्चिम क्षेत्रीय केंद्र से धन समर्थन स्वीकार रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए अमेरिका के केंद्रों द्वारा वित्त पोषित (सहकारी समझौता 1U01CK000516), सीडीसी अनुदान NU50CK000420-04-04, USDA राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान (हैच परियोजना 1025565), UF/IFAS फ्लोरिडा मेडिकल कीट विज्ञान प्रयोगशाला फैलोशिप TSE-यू चेन, NSF CAMTech IUCRC चरण द्वितीय अनुदान (AWD05009_MOD0030), और फ्लोरिडा स्वास्थ्य विभाग (अनुबंध CODQJ) । इस लेख में निष्कर्ष और निष्कर्ष लेखक (ओं) के हैं और जरूरी नहीं कि अमेरिकी मछली और वन्यजीव सेवा के विचारों का प्रतिनिधित्व करें।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
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