Summary
ここで説明するDNA抽出プロトコルは、蚊から高品質のDNA抽出を生成するために磁気ビーズを使用する。これらの抽出は、下流の次世代シーケンシングアプローチに適しています。
Abstract
磁気ビーズと自動DNA抽出装置を用いた最近発表されたDNA抽出プロトコルは、下流の全ゲノムシーケンシングに十分な保存状態の良い個々の蚊から高品質および量のDNAを抽出することが可能であることを示唆した。しかし、高価な自動DNA抽出装置への依存は、多くの研究所にとって非常に困難な場合があります。ここでは、低スループットから中程度のスループットに適した予算に優しい磁気ビーズベースのDNA抽出プロトコルを提供します。ここで説明するプロトコルは、個々の Aedes aegypti 蚊サンプルを使用して正常にテストされました。高品質のDNA抽出に伴うコストの削減により、リソース制限のあるラボや研究に高スループットシーケンシングを適用できます。
Introduction
改良されたDNA抽出プロトコル1の最近の開発は、全ゲノムシーケンシング2、3、4、5、6を含む多くの影響の大きい下流の研究を可能にしました。この磁気ビーズベースのDNA抽出プロトコルは、個々の蚊のサンプルからの信頼性の高いDNA収量を提供し、フィールドコレクションから十分な数のサンプルを取得することに関連するコストと時間を削減します。
近年の人口や景観のゲノミクスの進歩は、全ゲノムシーケンシングのコスト削減と直接相関しています。以前のDNA抽出プロトコル1 は、高スループットシーケンシングに関連する効率を高めますが、資金のない小規模なラボ/研究は、プロトコルを実装するためのコスト(例えば、特殊な機器のコスト)のために、これらの新しい強力な景観と人口ゲノミクスツールの使用をオプトアウトする可能性があります。
ここでは、Neiman et al. 1と同様の磁気ビーズ抽出ステップを使用 して高純度DNAを得るが、組織のリシスおよびDNA抽出のための高コストの器具に依存しない改変DNA抽出プロトコルが提示される。このプロトコルは、高品質DNAの>10 ngを必要とする実験に適しています。
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Protocol
1. DNA抽出前の一般的なサンプル貯蔵および調製物
- サンプルを>70%アルコールに保存して組織を軟化させる場合は、4°Cで1時間(または一晩)の100μL PCRグレードの水でサンプルを水和します。
2. サンプルの中断
- 56°Cでインキュベーターまたは振度熱ブロックをセットします。
- プロテナーゼK(PK)バッファー/酵素ミックスを作ります。プロテインナーゼK(100mg/mL)2 μL、プロテナーゼKバッファー98 μL(合計100 μL)が個々の蚊の抽出に必要です。複数の標本のマスターミックスを準備するには、(すべての個々の標本のために合わせた)合計量を〜15%増加させ、十分な容積の入手可能性を確保します。
- 抽出前にサンプルを水和した場合は、各サンプルチューブから水を捨てます。
- 蚊のティッシュを含んでいる1.5 mLのマイクロ遠心分離管に、PKバッファー/酵素の混合物の100 μLを加える。
- マイクロ遠心分離チューブの害虫を使用して組織を均質化します。
- 室温で9,600 x g で1分間サンプルを遠心分離します。
- 56°Cで2〜3時間のサンプルをインキュベートする。
- インキュベーション中に、DNA抽出工程(ステップ3)を用いて他の試薬を調製する。
3. DNA抽出
- 磁気ビーズマスターミックスを作ります。各サンプルに100 μLのリシスバッファー、100 μLのイソプロパノール、15 μL の磁気ビーズ(合計 215 μL)を混ぜます。複数の反応のためのマスターミックスを準備するには、(すべての個々の標本のために組み合わせた)合計量を〜20%増加させ、十分な量の可用性を確保します。
- インキュベーション時間(ステップ2.7)後、ピペットを使用して各ライセートをクリーンマイクロ遠心チューブまたはマイクロプレートウェルに移します。
- 各サンプルに100 μLのリセートと215 μLの磁気ビーズマスターミックスを加えます。
- ピペットを使って10~20sをよく混ぜ、室温で10分間放置します。時折チューブを軽く振って、磁気ビーズとDNAの結合を最大限に引き出します。
- マグネットビーズのセパレータにチューブ/プレートを置き、溶液がはっきりするまで待ちます。
- ピペットを使用してチューブ/プレートから液体を捨てます。上清を取り除くときは、DNAを保持している磁気ビーズに触れたり邪魔したりしないようにしてください。
- チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、各ウェルに325 μLの洗浄バッファー1を追加します。
- ピペットで十分に混ぜ、室温で1分間インキュベートします。
- 手順 3.5 ~ 3.6 を繰り返します。
- チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、250 μLの洗浄バッファー 1 を各ウェルに追加します。
- ピペットで十分に混ぜ、室温で1分間インキュベートします。
- 手順 3.5 ~ 3.6 を繰り返します。
- チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、各サンプルに250 μLの洗浄バッファー2を加えます。
- 十分に混ぜ合わせ、室温で1分間インキュベートします。
- 手順 3.5 ~ 3.6 を繰り返します。
- チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、250 μLの洗浄バッファー 2 を各ウェルに追加します。
- 十分に混ぜ合わせ、室温で1分間インキュベートします。
- 手順 3.5 ~ 3.6 を繰り返します。
- チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、溶出バッファーを各ウェルに 100 μL 追加します。
- 十分に混ぜ合わせ、室温で2分間インキュベートします。
- マグネットビーズのセパレータ上でチューブ/プレートを上に移動し、溶液がはっきりするまで待ちます。
- 新しいクリーンな0.5マイクロ遠心チューブまたはマイクロプレートウェルに上清をピペット。
- DNAサンプルは4°C(最大1週間)または-80°Cで保存してください。 マイクロプレートを使用している場合は、パラフィルムで覆います。
- 任意の適切な方法を使用してDNAの収量を決定します。
注:本研究では、260/280 nmのDNAフルオロメーターの読み取りと吸光度が利用されました。
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Representative Results
蚊頭/胸郭組織あたりのDNA収量の平均は、100 μLの溶出バッファーを使用して溶出した場合のフルオロメーターを用いて測定した4.121 ng/μL(N = 92、標準偏差3.513)であった。全ゲノムライブラリ構築1,7に必要な10〜30ngゲノムDNA入力要件に対して十分である。DNAの量は、蚊の体の大きさと保存条件に応じて0.3〜29.7 ng/μLの間で変化する可能性があります。ばらつきの高い部分は、研究で使用される磁気ビーズの特性によるものです。磁気ビーズの異なるブランドは、前のレポート1に示すように、より一貫した濃度を生成する可能性があります。また、蚊種の大きさが異なり、DNAの収量はそれらの個体および種のサイズ範囲に依存していることも留意すべきである。DNA濃度が典型的な範囲を下回る場合、タンパク質化K反応(ステップ2.7)でインキュベーション期間を調整してもよいが、この延長は16時間以下でなければならない。さらに、プロテイナーゼKおよび/またはリシスバッファーブランドを切り替えることは、DNA収量1に大きな影響を与える可能性があります。
0.5 mM EDTAを用いた溶出バッファーにおける最終DNAの典型的なマイクロ体積蛍光計の読み取り値を図1に示す。260/280 nmの平均吸光度比は2.3(標準偏差=0.071)であった。データは、全ゲノムシーケンシング3,4に関する前の研究で使用されたサンプルから一貫していた。
抽出のための典型的な試薬および消耗品の費用はおよそ$ 9.50/サンプルである。これらのコストの見積もりには、 材料表に記載されている試薬や、抽出に必要なピペットチップ、チューブ、手袋などの消耗品が含まれます。試薬と消耗品のコストは、任意の典型的な磁気ビーズベースの抽出方法と同等である(表1)。料金は、特定の製品で利用可能な一括購入割引によって多少異なる場合があります。このプロトコルの主なコストメリットは、自動DNA抽出装置を必要としないことです。
図1:フルオロメーター出力 0.5 mM EDTAを用いた溶出緩衝液中に溶出した蚊のDNAの典型的なDNAフルオロメーター出力。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:異なる抽出方法のコスト分析。 この表には、さまざまな抽出方法で 1 営業日に処理されたコストとサンプル数が一覧表示されます。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、他の昆虫種に適合させることができる。Niemanら 1 で導入されたプロトコルの元のバージョンは、Aedes aegypti、 Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, アノフェレス・アラビエンシス, アン・コルッツィー, アン・クスタニ、アン・ダーリンリ、アン・ファネスタス、アン・ガンビア、アン・クアドリアヌラトゥス、アン・ルフィペス、キュレックス・ピピエンス、Cx.クインケファシアトゥス、Cx.フェイレリ、ショウジョウバエ・スズキイ、クリソドラ・アエネコリス・トゥタ・アルソルタ、カイフェリア・リコパこのプロトコルは、これらだけでなく、他の節足動物のために動作することが期待されます。
理想的には、サンプルは、DNA抽出の前に4°Cで70%-80%エタノールに保存する必要があります。典型的には、アフリカで蚊のサンプルを保存するために80%エタノールが使用されます。高温条件により、エタノールの蒸発が加速し、エタノール含有量が意図したより低くなる(70%)。100%エタノール、変性アルコール、75%-90%イソプロパノールまたは擦過アルコールに格納されたサンプルも、Niemanらら1 プロトコルを用いて全ゲノムシーケンシングを成功させており、このプロトコルも同様にうまく機能することが期待される。ここで説明するDNA抽出プロトコルは、シリカで乾燥して保存され、-20°Cで凍結されたサンプルについても試みられた。 しかし、>6~12ヶ月間保存すると故障する可能性が高く(15%~30%)、理想的な保管条件よりも低いことが示唆された。
物理的なサンプル破壊のないDNA抽出は、障害の可能性が高い(33%)1、このプロトコルは、手動の物理的破壊技術を組み込む(ステップ2.5)。サンプルの破壊はまたティッシュの構造の器械1の鋼鉄ビーズを使用して達成することができる。
このプロトコルを用いたDNA抽出のための試薬および消耗コストは、利用可能な他の抽出方法と同等である(表1)。しかし、ここで説明するプロトコルは、自動化されたDNA抽出装置を必要としません。DNA抽出の処理に伴う手作業のために、一人の人は通常12-16サンプルを処理し、1日でDNA定量で終えることができます。これは、自動化されたDNA抽出設定が1日に処理できるものよりも大幅に少ないです。したがって、プロトコルを選択する際には、サンプル処理能力を考慮する必要があります。ただし、このプロトコルが提供する低コストしきい値は、多くのリソース制限のあるラボや調査がハイスループット シーケンシング テクノロジを活用できるようにする必要があります。
Nieman etal. 1およびこのプロトコルの両方で、溶出バッファーは、下流解析に応じて、典型的なTEバッファー、10 mM Tris-Cl、または水に置き換えることができる。EDTAを含む溶出緩衝液は、酵素効率に影響を与える可能性がある。典型的な酵素的せん断ベースのgDNAライブラリ調製プロトコルには、EDTAによる酵素阻害を補償するために添加されたコンディショニング溶液またはエンハンサーが含まれる。また、EDTAは230nm波長11で吸光度を変化させることができることも考慮すべきである。例えば、EDTAの濃度が高いほど、220〜240nm波長の間の吸光度値が 図1 に示すよりも高い吸光度値を生み出す(データは示されていない)。
このプロトコルは、最小限の分子生物学ツールを使用して実験室に簡単に適応させることができます。ここで説明するプロトコルは、ゲノム抽出に関連するコストしきい値を削減し、それによってリソース限定のラボや研究に高スループットシーケンシングの適用を増やすことを試みる。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
我々は、米国が資金を提供する太平洋南西部地域ベクター媒介性疾患優秀センターからの資金援助を認める。 疾病管理予防センター(協同協定1U01CK000516)、CDC助成金NU50CK000420-04-04、USDA国立食品農業研究所(ハッチプロジェクト1025565)、UF/IFASフロリダ医学昆虫学研究所フェローシップ、Tse-Yuチェン、NSF CAMTech IUCRCフェーズII(AWD05009_MOD0030)、フロリダ州保健省(COJJJ)この記事の調査結果と結論は著者のものであり、必ずしも米国魚類野生生物局の見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
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- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
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