En magnetisk-perle-basert mygg DNA-ekstraksjonsprotokoll for neste generasjons sekvensering
Summary
Beskrevet her er en DNA-ekstraksjonsprotokoll ved hjelp av magnetiske perler for å produsere DNA-ekstraksjoner av høy kvalitet fra mygg. Disse ekstraksjonene er egnet for en nedstrøms neste generasjons sekvenseringstilnærming.
Abstract
En nylig publisert DNA-ekstraksjonsprotokoll ved hjelp av magnetiske perler og et automatisert DNA-ekstraksjonsinstrument antydet at det er mulig å trekke ut DNA av høy kvalitet og kvantitets-DNA fra en godt bevart individuell mygg som er tilstrekkelig for nedstrøms hele genomsekvensering. Imidlertid kan avhengighet av et dyrt automatisert DNA-ekstraksjonsinstrument være forbudt for mange laboratorier. Her gir studien en budsjettvennlig magnetisk-perle-basert DNA-ekstraksjonsprotokoll, som er egnet for lav til middels gjennomstrømning. Protokollen beskrevet her ble vellykket testet ved hjelp av individuelle Aedes aegypti myggprøver. De reduserte kostnadene forbundet med DNA-ekstraksjon av høy kvalitet vil øke anvendelsen av høy gjennomstrømningssekvensering til ressursbegrensede laboratorier og studier.
Introduction
Nylig utvikling av en forbedret DNA-ekstraksjonsprotokoll1 har tillatt mange nedstrømsstudier med høy effekt som involverer hele genomsekvensering2,3,4,5,6. Denne magnetiske perlebaserte DNA-ekstraksjonsprotokollen gir pålitelig DNA-utbytte fra individuelle myggprøver, noe som igjen reduserer kostnadene og tiden forbundet med å skaffe seg et tilstrekkelig antall prøver fra feltsamlinger.
Nylige fremskritt innen befolknings- og landskapsgenomikk er direkte korrelert med avtagende kostnader ved hele genomsekvensering. Selv om den forrige DNA-utvinningsprotokollen1 øker effektiviteten forbundet med sekvensering med høy gjennomstrømning, kan mindre laboratorier/studier uten midlene velge bort å bruke disse nye kraftige landskaps- og populasjonsgenomikkverktøyene på grunn av kostnadene ved å implementere protokollen (f.eks. kostnader ved spesialiserte instrumenter).
Her presenteres en modifisert DNA-ekstraksjonsprotokoll som bruker et lignende magnetisk perleutvinningstrinn som Neiman et al.1 for å oppnå DNA med høy renhet, men er ikke avhengig av dyre instrumenter for vevslys og DNA-ekstraksjon. Denne protokollen er egnet for eksperimenter som krever >10 ng av dna av høy kvalitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her kan tilpasses andre insektarter. Den opprinnelige versjonen av protokollen introdusert i Nieman et al.1 har blitt testet på flere arter, inkludert Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absutaol, og Keiferia lycopersicella<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner finansieringsstøtte fra Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases finansiert av U.S. Centers for Disease Control and Prevention (Cooperative Agreement 1U01CK000516), CDC grant NU50CK000420-04-04, USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch-prosjektet 1025565), UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship til Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) og Florida Department of Health (Contract CODQJ). Funnene og konklusjonene i denne artikkelen er de av forfatteren(e) og representerer ikke nødvendigvis synspunktene til U.S. Fish and Wildlife Service.
Materials
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
