Summary
يوفر التعليق التوضيحي الرقمي مع تشريح الأنسجة الآلي نهجا مبتكرا لإثراء الورم في الحالات ذات المحتوى المنخفض من الورم وهو قابل للتكيف مع كل من أنواع البارافين والأنسجة المجمدة. يعمل سير العمل الموصوف على تحسين الدقة والتكرار والإنتاجية ويمكن تطبيقه على كل من الإعدادات البحثية والسريرية.
Abstract
مطلوب إثراء الورم في الأنسجة منخفضة محتوى الورم ، تلك التي تقل عن 20 ٪ من محتوى الورم اعتمادا على الطريقة ، لتوليد بيانات عالية الجودة بشكل متكرر مع العديد من الفحوصات النهائية مثل تسلسل الجيل التالي. تشريح الأنسجة الآلي هو منهجية جديدة تعمل على أتمتة وتحسين إثراء الورم في هذه الأنسجة الشائعة منخفضة محتوى الورم عن طريق تقليل عدم الدقة المعتمدة على المستخدم للتشريح الكلي التقليدي وقيود الوقت والتكلفة والخبرة للتشريح المجهري لالتقاط الليزر باستخدام تراكب التعليق التوضيحي للصور الرقمية على شرائح غير ملطخة. هنا ، يتم استخدام التعليقات التوضيحية الرقمية للهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) لاستهداف مناطق الورم الصغيرة باستخدام شفرة يبلغ قطرها 250 ميكرومتر2 في الفورمالين غير الملون البارافين الثابت المضمن (FFPE) أو الأقسام المجمدة الطازجة التي يصل سمكها إلى 20 ميكرومتر لإثراء الورم الآلي قبل استخراج الحمض النووي وتسلسل الإكسوم الكامل (WES). يمكن للتشريح الآلي حصاد المناطق المشروحة في أنسجة منخفضة محتوى الورم من أقسام واحدة أو متعددة لاستخراج الحمض النووي. كما يسمح بالتقاط مقاييس جمع واسعة النطاق قبل وبعد الحصاد مع تحسين الدقة وقابلية التكرار وزيادة الإنتاجية باستخدام عدد أقل من الشرائح. يتيح البروتوكول الموصوف التعليق التوضيحي الرقمي مع التشريح الآلي على FFPE الحيواني و / أو البشري أو الأنسجة المجمدة الطازجة ذات المحتوى المنخفض من الورم ويمكن استخدامه أيضا لأي منطقة ذات إثراء ذي أهمية لتعزيز كفاية تطبيقات التسلسل النهائي في سير العمل السريري أو البحثي.
Introduction
يتم استخدام تسلسل الجيل التالي (NGS) بشكل متزايد لكل من رعاية المرضى وفي أبحاث السرطان للمساعدة في توجيه العلاجات وتسهيل الاكتشاف العلمي. غالبا ما تكون الأنسجة محدودة ويتم استخدام عينات صغيرة ذات محتوى ورم متغير بشكل روتيني. وبالتالي، تظل كفاية الورم وسلامته عائقا أمام الحصول على بيانات ذات مغزى. قد تسبب العينات ذات النسب المئوية المنخفضة للورم صعوبة في التمييز بين المتغيرات الحقيقية والقطع الأثرية المتسلسلة وغالبا ما تكون غير مؤهلة للحصول على NGS1. وقد ثبت أن إثراء الورم لحالات محتوى الورم المنخفض ، تلك التي تقل عن 20٪ ، يساعد في إنتاج مواد كافية من أجل توليد بيانات تسلسل قابلة للتكرار وضمان عدم تفويت المتغيرات منخفضة التردد 2,3. ومع ذلك ، ستختلف الحدود اعتمادا على المنصات المستخدمة والاستخدام المخطط للبيانات التي تم إنشاؤها.
تقليديا ، يتم إجراء إثراء مناطق الورم لاستخراجها عن طريق التشريح الكلي اليدوي أو التشريح المجهري لالتقاط الليزر (LCM) لشرائح الفورمالين الثابتة البارافين المدمجة (FFPE). يسمح التشريح الكلي اليدوي ، أو كشط مناطق الأنسجة المحددة من الشرائح ، بإزالة مناطق الورم لاستخدامها في الفحوصات النهائية بتكلفة منخفضة نسبيا ، ولكن بدقة منخفضة ودقة منخفضة 2,4. يمكن أن يكون الحد الأدنى من الدقة التقنية فعالا جدا مع حالات محتوى الورم الأعلى حيث توجد مساحات كبيرة من الورم و / أو الحد الأدنى من فقدان الأنسجة لا يؤثر بشكل كبير على النتائج ، ولكن الحالات ذات المحتوى المنخفض للورم أو الحالات ذات الورم الأكثر تشتتا تتطلب دقة أكبر. لذلك تم اختراع LCM في 1990s وأصبح وسيلة قيمة لإزالة المناطق الصغيرة والمحددة والمجهرية بدقة من الأنسجة من شرائح الفورمالين الثابتة البارافين المدمجة (FFPE)5،6،7،8. يمكن استخدام LCM لجمع مجموعات الخلايا الواحدة عند وجود عدم تجانس معقد للعينة9 مما يسمح بجمع مجموعات الخلايا التي كان من الصعب فصلها سابقا. ومع ذلك ، تتطلب LCM آلات مكلفة تتطلب خبرة تقنية واسعة ووقتا عمليا10،11،12،13،14.
تتميز الأداة المستخدمة في تشريح الأنسجة الآلي بدقة بين دقة LCM (~ 10 ميكرومتر) والتشريح الكلي (~ 1 مم)15. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يعرض متطلبات التكلفة والخبرة التقنية بين متطلبات التشريح الكلي و LCM وهو مصمم لإجراء إثراء سريع للأنسجة من شرائح FFPE المتسلسلة للتخفيف من عيوب الطرق السابقة15. يستخدم التشريح الآلي بهذه الطريقة التعليقات التوضيحية الرقمية أو تراكبات الصور المرجعية للشرائح على المسرح على شرائح الأنسجة غير الملطخة المجزأة بشكل متسلسل لتشريح وإثراء المناطق ذات الاهتمام. تستخدم الأداة أطراف طحن شفرة الغزل البلاستيكية ، وأنابيب جمع 1.5 مل ويمكن استخدامها مع عدد من السوائل المختلفة للتشريح لجمع المناطق ذات الأهمية للمقايسات النهائية بما في ذلك استخراج النواة وتسلسلها. يستخدم طرف الطحن البلاستيكي الغزل خزانات برميل المحاقن الداخلية والخارجية ومكبس لجمع المخزن المؤقت ، ثم يطحن ويجمع الأنسجة16. يمكن أن يسمح قطر حجم طرف الطحن المتغير (250 ميكرومتر ، 525 ميكرومتر ، 725 ميكرومتر) بتشريح مناطق الأنسجة المنفصلة للمقارنة ، أو المناطق متعددة البؤر التي يمكن تجميعها أو المناطق الصغيرة الفردية من شرائح FFPE مفردة أو متعددة. يمكن تعديل سمك القسم المستخدم للحصاد بناء على احتياجات التجربة الفردية ويمكن للمستخدمين ضمان عدم استنفاد المناطق ذات الأهمية من خلال إجراء H & E إضافي على قسم تسلسلي واحد مباشرة بعد القسم الأخير المستخدم للحصاد.
تم تحديد التشريح الآلي كوسيلة لإثراء محتوى الورم في حالات محتوى الورم المنخفض وقمنا باختبار وتوسيع الوظيفة المقصودة لأداة تشريح الأنسجة الآلية ، والتي يتم تسويقها حاليا للاستخدام على عينات FFPE السريرية التي يصل سمكها إلى 10 ميكرومتر. يظهر العمل أنه يمكن تطبيق التشريح الآلي على كل من FFPE وأقسام الأنسجة البشرية أو الحيوانية المجمدة الطازجة التي يصل سمكها إلى 20 ميكرومتر لأغراض البحث. يوضح البروتوكول أيضا نهجا لشرح وأتمتة تشريح الورم رقميا لإثراء الورم في الأنسجة ذات المحتوى المنخفض من الورم و / أو الحالات ذات الورم المتداخل والمشتت حيث يكون التشريح الكلي ذي المغزى صعبا أو غير ممكن وإظهار كل من جودة وإنتاجية الحمض النووي الكافي ل NGS. وبالتالي ، يمكن أن يوفر التشريح الآلي دقة متوسطة المستوى وزيادة الإنتاجية لإثراء الورم ويمكن تطبيقه أيضا لإثراء المناطق الأخرى ذات الاهتمام أو دمجه مع منصات أخرى للإجابة على الأسئلة البحثية أو السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
قبل البدء ، احصل على عينات الأنسجة المناسبة وفقا لبروتوكولات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB). تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لشركة Genentech، Inc.
1. إعداد الأنسجة والشرائح
- حدد FFPE أو كتل الأنسجة المجمدة الطازجة واستخدم طريقة المعالجة المقابلة أدناه.
- قم بقص أقسام كتلة الأنسجة على شرائح زجاجية مشحونة إيجابيا بالسمك المطلوب. قسم بشكل مصيلي أنسجة FFPE في شرائط مع قطع القسم المرجعي الأول بسماكة مناسبة لتلطيخ H & E (أي 4 ميكرومتر) متبوعا ب 1-4 أقسام بسماكة تتراوح بين 4-20 ميكرومتر بناء على الحاجة وتوافر الأنسجة. اجمع أقسام الأنسجة على شرائح مجهر زجاجية مشحونة إيجابيا.
ملاحظة: يجب تلطيخ أقسام الأنسجة المرجعية المجمدة الطازجة على الفور بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E) باستخدام بروتوكولات روتينية للأقسام المجمدة والمقاطع المجمدة غير الملطخة التي يتم الاحتفاظ بها عند -20 درجة مئوية حتى تكون هناك حاجة إليها للحصاد. - اترك جميع أقسام FFPE لتجف في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
- اخبز الشرائح المرجعية FFPE على درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم تلطخ باستخدام H & E باستخدام البروتوكولات الروتينية.
- امسح الشرائح الملطخة H&E ضوئيا على جهاز تصوير شريحة كامل بتكبير 20x أو أكبر.
- أضف تعليقات توضيحية على صور الشرائح الممسوحة ضوئيا لمناطق الأورام ذات الأهمية باستخدام منصة عرض مقدمة من مورد أو عارض مفتوح المصدر. قم بتصدير هذه التعليقات التوضيحية إما كلقطة شاشة منخفضة التكبير أو احفظها كملف بيانات وصفية يحتوي على إحداثيات بكسل X-Y المقابلة لرؤوس المضلعات.
ملاحظة: الأول أقل تحديا من الناحية الفنية للعمل معه ، ولكن الأخير يوفر مزايا في أتمتة العمليات. - إنشاء أقنعة رقمية للمناطق ذات الأهمية المشروحة بما يتماشى مع النهج المستخدم وتصدير التعليقات التوضيحية اليدوية.
ملاحظة: إذا تم استخدام لقطة شاشة/صورة للتعليقات التوضيحية، يمكن استخدام برنامج معالجة صور بسيط لتحديد منطقة وملء التحديد بأكمله. يتطلب استخدام إحداثيات X-Y لكل عائد استثمار استخدام لغة برمجة لقراءة كل من بيانات الصورة وإحداثيات المضلع لإنشاء صورة منخفضة الحجم مع ملء المناطق ذات الاهتمام. يجب على المستخدم العمل مع بائع أداة التشريح الآلي لإنشاء عملية بناء على توافر البرامج الفردية واحتياجاتها. في حالة عدم توفر المسح الضوئي و/أو التعليق التوضيحي الرقمي للشرائح و/أو إنشاء قناع رقمي، يمكن إجراء تعليق توضيحي دقيق على الشريحة باستخدام علامة واستخدامه بدلا من القناع الرقمي كصورة مرجعية. تم توفير رمز زائف لإنشاء قناع رقمي في الملف التكميلي 1.
2. تشريح الأنسجة الآلي
- ضع شرائح أنسجة العينة غير الملطخة على المسرح في مواضع الشريحة من الأول إلى الرابع عند استخدام مرجع الشريحة الرقمي. عند استخدام التعليق التوضيحي على الشريحة بدلا من الخيار الرقمي، ضع شرائح أنسجة العينة غير الملطخة على المسرح في مواضع الشريحة من الثانية إلى الرابعة مع شريحة مرجعية في الموضع الأول.
- إنشاء وظيفة طحن باستخدام برنامج تشريح الأنسجة الآلي: اختيار الوظيفة > إنشاء معرف حالة > وظيفة جديدة > تسمية وظيفة الطحن ؛ انتقل إلى سمك > المقطع باستخدام علامة التبويب السهم لأعلى أو لأسفل ؛ ثم انتقل إلى إعداد الأنسجة > البارافينية أو غير البارافينية ، الصورة المرجعية > من الملف > استيراد صورة > ملف للاستيراد من القائمة المنسدلة كمرجع رقمي ، إن أمكن. حدد من المرحلة لمرجع الشريحة على المسرح. عند اكتمال الحقول، قم بمسح المرحلة ضوئيا عن طريق تحديد الزر مسح المرحلة ضوئيا في الزاوية السفلية اليسرى لالتقاط كل شريحة أنسجة عينة في الموضع الأول إلى الرابع.
- حدد منطقة الأنسجة لالتقاط الصورة.
- في حالة استخدام مرجع على المسرح، اسحب المربع من زاوية إلى أخرى لإنشاء مساحة مستطيلة فوق الأنسجة. حدد الفقاعة الدائرية أسفل المساحة المستطيلة لالتقاط صورة مرجع المرحلة. في حالة استخدام صورة مرجعية رقمية، قم بتراكب الصورة على المساحة المستطيلة المحددة. قم بتغيير حجم المرجع الرقمي ومحاذاته بشكل كبير في تكبير المقرر الدراسي لمطابقة الحجم والموضع على أفضل وجه فوق أنسجة العينة.
- انسخ حقل المستطيل هذا إلى شرائح أنسجة العينة المتبقية في مواضع الشريحة من الثانية إلى الرابعة عن طريق تحديد خيار النسخ في الزاوية العلوية اليسرى من الصورة المرجعية. قم بالمحاذاة وتغيير الحجم بشكل كبير حسب الضرورة.
ملاحظة: عند استخدام صورة مرجعية على الشريحة بدلا من قناع رقمي، حدد الشريحة الموجودة على المسرح التي يجب استخدامها كمرجع.
- محاذاة الشرائح المرجعية ونماذج الشرائح
- عندما تتم محاذاة الصورة المرجعية بشكل كبير على شرائح عينة الأنسجة في جميع مواضع الشرائح، حدد زر مرحلة المسح الضوئي في الزاوية السفلية اليسرى من الشاشة للانتقال إلى خطوة المعايرة الدقيقة. حدد موضع المرحلة الأولى وأيقونة أداة التحويل (الرمز الثالث لأسفل في شريط الأدوات الأيسر) لإجراء محاذاة دقيقة وتكبير/تصغير للمرجع لمطابقة تراكب الشريحة النموذجية على أفضل وجه. استخدم شريط الانزلاق "مرجع إلى عينة" في أسفل الشاشة للتبديل بين الصورة المرجعية وصورة العينة إلى جانب ميزة التكبير/التصغير والتصغير لضبط وتحقيق محاذاة كل موضع شريحة. كرر هذه العملية في مواضع شرائح العينة من الثانية إلى الرابعة.
- حدد منطقة الطحن في المنطقة ذات الأهمية
- بمجرد تحقيق تراكب العينة الأمثل لكل موضع من مواضع الشرائح الأربعة، ارسم تسميات مسار الطحن باستخدام أيقونة أداة انتقاء الألوان (الرمز العاشر لأسفل في شريط الأدوات الأيمن) على الجزء الملون من الصورة المرجعية المقنعة. حدد المربع توسيع إلى مشابه إذا تم إضافة تعليقات توضيحية إلى شرائح أو مناطق متعددة للتشريح، ثم حدد الزر الحصول على تعليق توضيحي (تعليقات) توضيحية في أسفل اليسار لرسم مسارات الطحن على شرائح العينة.
- حدد مسار الطحن في موضع الشريحة الأول.
ملاحظة: عند تحديد مسار الطحن في موضع الشريحة الأول، سيتم نسخه إلى مواضع الشريحة المتبقية وسيتم حساب استخدام طرف الطحن. يتم حساب استخدام طرف الطحن في الزاوية العلوية اليسرى استنادا إلى المساحة المغطاة وحجم الطرف المحدد. إذا تم حساب أكثر من أربع تلميحات، يمكن تحديد حجم تلميح أكبر لالتقاط عائد الاستثمار المشروح. يمكن تحديد حجم الطرف أو تغييره على الجانب الأيسر من الشاشة أسفل سهم تلميح الطحن وسيتم إعادة حساب استخدام التلميح. - عند حساب مسار الطحن ، اجمع عائد الاستثمار المشروح مع أربع نصائح أو أقل للطحن. حدد الزر إعداد المرحلة في أسفل يسار الشاشة للمطالبة بتحميل تلميحات الطحن من أنابيب التجميع الموضوعة في تعيينها الصحيح على المسرح.
- املأ الخزان ب 3.0 مل من مخزن التشريح العازل الأنسب لنوع الأنسجة (FFPE أو المجمدة الطازجة) واحتياجات مجموعة استخراج الحمض النووي في المصب وحدد زر التشريح في الزاوية السفلية اليمنى من الشاشة. استخدم الزيوت المعدنية الجزيئية أو المخزن المؤقت المناسب من مجموعات استخراج الأحماض النووية المتاحة تجاريا.
ملاحظة: يبدأ التشريح الآلي للشرائح والمناطق المحددة ذات الأهمية ويتم جمع العينات بواسطة الأداة. سيقوم رئيس الوحدة بالتقاط نصائح الطحن من الجزء الخلفي من المرحلة وملء سائل التشريح من الخزان. ثم تدور النصائح على طول مسار الطحن لشفط عينة الأنسجة من الشرائح حتى تكتمل أو تمتلئ. ثم يتم توزيع العينة التي تم جمعها مع سائل التشريح في أنابيب التجميع الموجودة في الجزء الخلفي من المرحلة. - عند اكتمال التشريح الآلي، قم بإزالة أنابيب التجميع وشرائح العينة المشوهة من المسرح وضعها في رف أنبوب ورف منزلق، على التوالي.
ملاحظة: يجب أن تؤخذ المحاصيل المجمدة الطازجة مباشرة في استخراج الأحماض النووية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ويجب تلطيخ الأقسام المجمدة الطازجة بعد التشريح على الفور باستخدام البروتوكولات الروتينية للأقسام المجمدة. - اخبز شرائح الأنسجة التشريحية عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم قم بالبقع باستخدام H & E باستخدام البروتوكولات الروتينية.
- امسح المنشور الذي تم تشريحه للشرائح الملطخة H&E على جهاز تصوير شريحة كامل عند تكبير 20x و / أو أرشفة للحصول على مرجع للأنسجة التي لم يتم جمعها وما تبقى على الشريحة.
ملاحظة: راجع الخطوة 1.5 أعلاه للحصول على خيارات المسح الضوئي البديلة.
3. استخراج الأحماض النووية
- تجمع وبيليه الأنسجة. قم بإجراء استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا واتباع تعليمات الشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم اختيار أقسام كبد الماوس FFPE و FF التي تحتوي على سرطان القولون والمستقيم النقيلي في xenografts. كانت الأقسام ملطخة H & E (الشكل 1A و E و I) وتم مسحها ضوئيا على جهاز تصوير شريحة كامل عند تكبير 20x. قام أخصائي علم الأمراض بشرح مناطق الأورام ذات الأهمية رقميا وتم إنشاء قناع باستخدام برنامج تجاري وتنسيقه كصورة مرجعية رقمية png (الشكل 1B و F و J). تم وضع شرائح عينة غير ملطخة بسماكة 10 ميكرومتر و 20 ميكرومتر على المسرح وتم إجراء تشريح آلي كما هو موضح أعلاه. تم جمع الأنسجة المجمدة الطازجة في مخزن مؤقت للتحلل من مجموعة متاحة تجاريا ونقلها مباشرة إلى استخراج الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم جمع عينات FFPE باستخدام الزيوت المعدنية الجزيئية وتم تجميع العينات التشريحية معا وطردها مركزيا عند 25000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تمت إزالة المادة الفائقة وتم استخدام الحد الأدنى من الزيت المعدني المطلوب لإنعاش الأنسجة المجزأة ونقلها وجمعها في أنبوب تجميع واحد لكل عينة بشكل مناسب. تم شحن العينات في درجة حرارة الغرفة إلى بائع لاستخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي وتحجيم الحمض النووي والكمية والنزاهة وتحديد النقاء باتباع تعليمات الشركة المصنعة. تم إنشاء مكتبات التسلسل واستخدامها للتهجين والالتقاط مع الخيارات التجارية باتباع تعليمات الشركة المصنعة. تم تلطيخ شرائح العينات بعد تشريحها باستخدام بروتوكولات التلطيخ الروتينية لتأكيد مناطق التشريح في شرائح 10 ميكرومتر (الشكل 1C و G و K) و 20 ميكرومتر (الشكل 1D و H و L) وتم التقاط مقاييس التشريح (الجدول التكميلي 1). ولد تسلسل الإكسوم ما يقرب من 75 مليون قراءة ثنائية النهاية بمقدار 100 نقطة أساس ، مما أدى إلى متوسط عمق التغطية (قبل إزالة القراءات المكررة) بمقدار 150 ضعفا لكل عينة ، مع محاذاة 99.9٪ من القراءات ومعدل 78٪ على الهدف. أظهرت مقاييس تسلسل الحمض النووي الريبي ما يزيد قليلا عن 55 مليون قراءة ثنائية النهاية ، ومعدل محاذاة 98٪ ، ومعدل تكرار 19.4٪ مع قراءات متوافقة بنسبة 77٪.
الشكل 1؛ تشريح ناجح لأعشاش الورم من الأنسجة المجمدة الطازجة و FFPE. H & E الفأر الملطخ الطازج المجمد (A-D) و FFPE (E-L) أنسجة الكبد مع ورم خبيث سرطان القولون والمستقيم. توضح الشرائح المرجعية 4 ميكرومتر المستخدمة في التعليق التوضيحي الرقمي (A ، E ، I) أمثلة ذات نسبة مئوية منخفضة من الورم لإجمالي مساحة الأنسجة (I) وأعشاش الورم الموزعة (E) التي تمثل تحديات كلاسيكية لإثراء الورم. تم إنشاء شرائح مرجعية مشروحة ومقنعة رقميا H & E (B ، F ، J) وأظهرت الشرائح الملطخة H & E بعد التشريح 10 ميكرومتر (C ، G ، K) و 20 ميكرومتر (D ، H ، L) الشرائح الملطخة H & E حصادا ناجحا للمناطق المختارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: يستخدم الرمز الزائف لإنشاء أقنعة رقمية من التعليقات التوضيحية لاستخدامها في التشريح الآلي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: مثال على المقاييس الملتقطة من التشريح الآلي واستخراج الأحماض النووية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يظهر هنا بروتوكول لتطبيق التعليق التوضيحي الرقمي والتشريح الآلي لتشريح مناطق الورم من FFPE منخفض محتوى الورم أو الأنسجة المجمدة الطازجة لإثراء الورم واستخدامه في WES. إن الجمع بين التعليق التوضيحي الرقمي وإنشاء القناع مع التشريح الآلي يقلل بشكل كبير من الوقت العملي المطلوب والخبرة الشائعة في الطرق الكلاسيكية لإثراء الورم بما في ذلك التشريح الكلي اليدوي و LCM. يوضح البروتوكول خيارا مهما محتملا لتخصيب الورم متوسط المدى لا يسمح فقط بتخصيب محتوى الورم المنخفض ولكن أيضا الإثراء في الحالات التي يكون فيها من الصعب تشريح أعشاش الورم الموزعة بعيدا عن الأنسجة الطبيعية المجاورة للورم لإثراء الورم ذي المغزى بإنتاجية عالية ومستوى معتدل من الدقة. في حين أن استخدام سير العمل لدينا لأنسجة xenograft منخفضة محتوى الورم يظهر هنا ، فقد وجد أيضا أن هذا البروتوكول يعمل عبر أنواع الأنسجة ، بما في ذلك الأنسجة البشرية والفئرانية و xenograft لمجموعة متنوعة من الأنسجة الطبيعية ومؤشرات السرطان.
لذلك ، يمكن أن ينطبق أيضا على مجموعة واسعة من التطبيقات حيث يكون التخصيب لمناطق محددة ذات أهمية دون تلوث كبير لأنسجة الخلفية مفيدا (أي إثراء لمنطقة معينة من الدماغ) أو حتى لإزالة مناطق الأنسجة قبل استخراج الحمض النووي باستخدام التشريح الكلي الكلاسيكي.
توجد العديد من المنصات في السوق لمسح الشرائح والتعليقات التوضيحية الرقمية. لذلك من المهم أن تظل على دراية بأن توافق النظام الأساسي قد يمثل قيودا وأن الأنظمة الأساسية المحددة داخل أي بروتوكول قد لا تكون متاحة على نطاق واسع في جميع المختبرات. ولذلك، بذلت جهود كبيرة لتوفير خيارات بديلة في إطار البروتوكول الموصوف من شأنها أن توجه المستعملين في إجراء أي تعديلات ضرورية استنادا إلى مواردهم المتاحة. وأشير أيضا إلى خيار لإزالة عنصر التعليق التوضيحي الرقمي للسماح بالتعليق التوضيحي اليدوي الدقيق على الشريحة. ستزيد الخيارات المقدمة للتعديلات من قدرة المستخدمين على العثور على خيار يعمل مع النظام الأساسي الحالي وتوافر البرامج.
في حين ثبت أن التعليقات التوضيحية الرقمية والتشريح الآلي يتم تطبيقهما على نطاق واسع على كل من FFPE والأنسجة المجمدة الطازجة ، فمن المهم ملاحظة أن حدود أداة تشريح الأنسجة الآلية قد تم دفعها إلى ما هو أبعد من استخدامها المقصود مع عينات FFPE وأن البروتوكول مخصص للاستخدام البحثي فقط. هنا ، تم إثبات إثراء الورم الناجح من خلال تشريح الورم الآلي لمحتوى الورم المنخفض FFPE وكذلك الأنسجة المجمدة الطازجة لاستخراج الحمض النووي ، وتسلسل WES و RNA. ويظهر البروتوكول أنه يمكن إثراء مناطق الإكسينوغرافت والأنسجة البشرية ذات الأهمية قبل تسلسل WES والحمض النووي الريبي في إعدادات البحوث الأساسية والانتقالية، ويلاحظ أيضا أن التطبيقات الجزيئية الأخرى في المراحل النهائية، بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل، من كلا النوعين من الأنسجة ستكون ممكنة. يوسع البروتوكول خيارات التشريح الآلي FFPE ويضع الأساس للتشريح الآلي للأنسجة المجمدة الطازجة التي يمكن تطويرها والتحقق من صحتها لاستخدامها في الإعدادات السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تشارلز أ هافنار، أوليفر زيل، جيف إيستهام، جيفري هونغ، جنيفر جيلتنان، نيكولاس لونسبري، دانيال أوريبر، ساراجين ساتورنيو، وإيمي إيه لو هم موظفون ومساهمون في جينينتيك وروش ومانا جافي وإيمانويل نعوري هم موظفون ومساهمون في روش.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا كارمينا إسبيريتو وروبن تايلور على دعمهم في تطوير التشريح الآلي وكذلك موظفي مختبر Genentech Pathology Core Laboratory الذين دعموا هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al.
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).
