Summary
自動組織解剖によるデジタル注釈は、腫瘍含有量の低い症例で腫瘍を濃縮するための革新的なアプローチを提供し、パラフィン組織と凍結組織の両方のタイプに適応可能です。説明したワークフローは、精度、再現性、スループットを向上させ、研究と臨床の両方の場面に適用することができます。
Abstract
腫瘍含量の低い組織における腫瘍富化は、方法によっては腫瘍含量が20%未満のもので、次世代シークエンシングなどの多くの下流アッセイで再現性よく品質データを生成するために必要とされる。自動組織解剖は、デジタル画像注釈を使用して染色されていないスライドにオーバーレイすることにより、従来のマクロ解剖のユーザー依存の不正確さとレーザーキャプチャマイクロ解剖の時間、コスト、専門知識の制限を減らすことによって、これらの一般的で腫瘍含有量の低い組織における腫瘍濃縮を自動化および改善する新しい方法論です。ここでは、デジタルヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)注釈を使用して、染色されていないホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)または厚さ20μm までの新鮮な凍結切片で直径250μmのブレードを使用して、小さな腫瘍領域を標的とし、核酸抽出および全エクソームシーケンシング(WES)の前に腫瘍濃縮を自動化します。自動解剖は、核酸抽出のために単一または複数の切片から腫瘍含量の低い組織内の注釈付き領域を採取することができる。また、収穫前および収穫後の広範な収集メトリックをキャプチャしながら、精度、再現性を向上させ、より少ないスライドでスループットを向上させることもできます。記載されたプロトコルは、動物および/またはヒトFFPEまたは腫瘍含有量の低い新鮮な凍結組織に対する自動解剖によるデジタル注釈を可能にし、臨床または研究ワークフローにおける下流シーケンシングアプリケーションの妥当性を高めるために、関心のある任意の領域エンリッチメントにも使用できます。
Introduction
次世代シーケンシング(NGS)は、治療を導き、科学的発見を促進するために、患者ケアとがん研究の両方にますます利用されています。組織はしばしば限られており、腫瘍含有量が可変の小さな標本が日常的に使用されている。したがって、腫瘍の妥当性と完全性は、意味のあるデータを得るための障壁のままです。腫瘍パーセンテージが低いサンプルは、真のバリアントとシーケンシングアーティファクトを区別するのが難しくなる可能性があり、NGS1に不適格であることがよくあります。腫瘍含量が低い症例(20%未満のもの)の腫瘍濃縮は、再現性のあるシーケンシングデータを生成し、低頻度変異体が見逃されないようにするために十分な材料を得るのに役立つことが示されている2、3。ただし、制限は、使用されるプラットフォームと生成されたデータの計画的な使用によって異なります。
伝統的に、抽出のための腫瘍領域の富化は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)スライドの手動マクロ解剖またはレーザー捕捉マイクロディスセクション(LCM)によって行われる。手動マクロ解剖、またはスライドから特定の組織領域を掻き取ることで、腫瘍領域を除去して下流アッセイに比較的低コストで、しかし精度と精度を低く抑えることができます2,4。腫瘍の広い帯が存在する、および/または最小限の組織損失が結果に有意に影響しないより高い腫瘍含有量の症例では、最小限の技術的精度が非常に効果的であり得るが、腫瘍含有量の低い症例またはより分散した腫瘍を有する症例は、より高い精度を必要とする。したがって、LCMは1990年代に発明され、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)スライド5、6、7、8から組織の小さな、定義された、微視的な領域を正確に除去する貴重な方法となった。LCMは、試料の複雑な不均一性が存在する場合に単一細胞集団を収集するために利用することができ9、以前は分離することが困難であった細胞集団の収集を可能にする。しかし、LCMには、広範な技術的専門知識と実践的な時間を必要とする高価な機械が必要です10,11,12,13,14。
自動組織解剖に使用される装置は、LCM(約10μm)とマクロ解剖(約1mm)の間の精度を備えています15。さらに、マクロ解剖とLCMの間のコストと技術的専門知識の両方の要件を示し、以前の方法の欠点を緩和するために逐次FFPEスライドから迅速な組織濃縮を行うように設計されています15。この方法での自動解剖は、デジタル注釈またはステージ上のスライド参照画像オーバーレイを連続的に切片化された染色されていない組織スライドに利用し、関心領域を解剖および濃縮する。この装置は、プラスチック製のスピニングブレードフライスチップ、1.5mLの収集チューブを使用し、解剖に多数の異なる流体とともに使用して、核酸抽出およびシーケンシングを含む下流アッセイの関心領域を収集することができます。回転するプラスチックフライス加工チップは、内側および外側のシリンジバレルリザーバおよびプランジャーを利用して緩衝液を収集し、次いで、粉砕して組織16を収集する。可変フライスチップサイズ直径(250 μm、525 μm、725 μm)により、比較のために別々の組織領域、プールできる多焦点領域、または単一または複数のFFPEスライドからの個々の小さな領域を解剖することができます。収穫に使用されるセクションの厚さは、個々の実験ニーズに基づいて調整することができ、ユーザーは、収穫に使用された最後のセクションの直後に1つのシリアルセクションで追加のH&Eを実行することによって、関心領域が枯渇していないことを確認できます。
自動解剖は、腫瘍含量の低い症例で腫瘍含量を豊かにする方法として同定され、現在厚さ10μmまでのFFPE臨床検体で使用するために市販されている自動組織解剖器具の意図された機能を試験および拡張した。この研究は、FFPEと、研究目的で厚さ20μmまでの新鮮な凍結ヒトまたは動物の組織切片の両方に自動解剖を適用できることを示している。このプロトコルはまた、意味のある大解剖学が困難であるか実行不可能であり、NGSに十分な核酸の品質と収量の両方を示す、腫瘍含有量の低い組織および/またはネストされた分散腫瘍を有する症例における腫瘍濃縮のためのデジタル注釈付けおよび解剖を自動化するアプローチを実証する。したがって、自動解剖は、腫瘍濃縮のための中レベルの精度とスループットの向上を提供することができ、また、他の関心領域を豊かにするために適用したり、研究や臨床上の質問に答えるために他のプラットフォームと組み合わせることもできます。
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Protocol
開始前に、治験審査委員会(IRB)のプロトコルに従って適切な組織標本を入手してください。ここに記載されているすべての方法は、Genentech, Inc.のInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)によって承認されています。
1. 組織とスライドの準備
- FFPEまたは新鮮な凍結組織ブロックを選択し、以下の対応する処理方法を利用する。
- 組織ブロック切片を所望の厚さで正に帯電したスライドガラス上に切断する。FFPE組織をリボンで連続して切片化し、最初の参照切片をH&E染色に適した厚さ(すなわち、4μm)に切断し、続いて、必要性および組織の入手可能性に基づいて4〜20μmの範囲の厚さで1〜4個の切片を切断する。組織切片を正に帯電したガラス顕微鏡スライド上に集める。
注:新鮮な凍結参照組織切片は、凍結切片および未染色凍結切片の日常的なプロトコールを使用して、ヘマトキシリンおよびEosin(H&E)で直ちに染色し、収穫に必要になるまで-20°Cに保持する必要があります。 - すべてのFFPEセクションを室温で一晩乾燥させます。
- FFPEリファレンススライドを60°Cで30分間ベークし、ルーチンプロトコルを使用してH&Eで染色します。
- H&E 染色されたスライドをスライドイメージャー全体で 20 倍以上の倍率でスキャンします。
- 関心のある腫瘍領域のスキャンされたスライド画像に注釈を付けます ベンダー提供の視聴プラットフォームまたはオープンソースビューアを使用します。これらの注釈を低倍率のスクリーンショットとしてエクスポートするか、ポリゴン頂点に対応する X-Y ピクセル座標を含むメタデータ ファイルとして保存します。
注: 前者は技術的に作業の難しさは低くなりますが、後者はプロセスの自動化に利点をもたらします。 - 使用されているアプローチに沿ってアノテーション付き関心領域のデジタルマスクを作成し、手動アノテーションをエクスポートします。
メモ:注釈のスクリーンショット/画像を使用する場合、簡単な画像処理ソフトウェアを使用して領域を選択し、選択範囲全体を入力できます。各ROIにX-Y座標を使用するには、プログラミング言語を使用して画像データとポリゴン座標の両方を読み取り、関心領域が塗りつぶされた低マグ画像を作成する必要があります。ユーザーは、自動解剖装置ベンダーと協力して、個々のソフトウェアの可用性とニーズに基づいてプロセスを確立する必要があります。スキャン、デジタルスライド注釈、および/またはデジタルマスクの作成が利用できない場合は、マーカーを使用した慎重なスライド上の注釈を実行し、参照画像としてデジタルマスクの代わりに使用することができます。デジタルマスク作成用の擬似コードは、 補足ファイル1で提供されています。
2. 自動組織解剖
- デジタルスライドリファレンスを使用する場合、染色されていないサンプル組織スライドをステージ上に第1〜第4スライド位置に配置します。デジタルオプションではなくスライド上の注釈を使用する場合は、染色されていないサンプル組織スライドをステージ上に2番目から4番目のスライド位置に置き、最初の位置に基準スライドを配置します。
- 自動組織解剖ソフトウェアを使用してフライス加工ジョブを作成する: ジョブ選択 > 新規ジョブ>ケースIDを作成 > フライス加工ジョブに名前を付けます。上矢印タブまたは下矢印タブを使用して、厚さ>セクションの厚さに移動します。次に、パラフィン化または脱パラフィン化>組織調製、参照画像>ファイルから>画像>ファイルのインポートに移動し、該当する場合はデジタル参照としてドロップダウンからインポートします。ステージ上のスライド参照で「ステージから」を選択します。フィールドが完了したら、右下隅にある [ステージのスキャン] ボタンを選択してステージをスキャンし、1 番目から 4 番目の位置にある各サンプル組織スライドをキャプチャします。
- 画像キャプチャする組織領域を選択します。
- ステージ上の参照を使用している場合は、ボックスを一方の角から反対側の角にドラッグして、組織上に長方形の領域を作成します。長方形の領域の下にある円形のバブルを選択して、ステージ参照イメージをキャプチャします。デジタル参照画像を使用する場合は、選択した長方形の領域に画像を重ねます。デジタルリファレンスのサイズを変更して、コースズームで大きく揃えて、サンプル組織上のサイズと位置に最も適したものにします。
- 参照画像の右上隅にあるコピーオプションを選択して、この長方形のフィールドを2番目から4番目のスライド位置の残りのサンプル組織スライドにコピーします。必要に応じて、整列とサイズを大幅に変更します。
メモ: デジタルマスクではなくスライド上の参照画像を使用する場合は、ステージ上のどのスライドを参照として使用するかを選択します。
- 参照スライドとサンプルスライドを揃える
- すべてのスライド位置の組織サンプルスライドに参照画像が大きく揃ったら、画面の右下隅にある [スキャンステージ] ボタンを選択して微調整ステップに進みます。最初のステージ位置と変形ツールアイコン (右側のツールバーの 3 番目のアイコン) を選択して、サンプルのスライドオーバーレイに最も合うように参照の整列とズームを調整します。画面下部の「サンプル参照」スライドバーを使用して、参照画像とサンプル画像を切り替え、ズームイン機能とズームアウト機能を使用して、各スライド位置を調整して配置します。このプロセスを 2 番目から 4 番目のサンプル スライド位置で再現します。
- 対象領域のミリング領域を選択する
- 4 つのスライド位置のそれぞれに最適なサンプルオーバーレイを達成したら、マスクされた参照イメージの色付き部分に カラーピッカー ツールアイコン(右側のツールバーの 10 番目のアイコン)を使用してミリングパス指定を描画します。複数のスライドまたは領域に解剖用の注釈が付けられている場合は、「 類似に拡張」(Extend to Similar) ボックスを選択し、右下の 「注釈を取得」 ボタンを選択して、サンプルスライドにミリングパスを描画します。
- 最初のスライド位置でミリングパスを選択します。
メモ: 最初のスライド位置でミリングパスを選択すると、残りのスライド位置にミリングパスがコピーされ、ミリングチップの使用状況が計算されます。左上隅のミリングチップの使用量は、カバーされる領域と選択したチップサイズに基づいて計算されます。4つ以上のチップが計算される場合、より大きなチップサイズを選択して、注釈付きROIをキャプチャすることができる。チップサイズは、画面の左側の 「ミリングチップ」(Milling Tip ) 矢印で選択または変更でき、チップの使用状況が再計算されます。 - ミリングパスが計算されたら、4つ以下のミリングチップで注釈付きROIを収集します。画面右下の 「ステージをセットアップ」(Setup Stage ) ボタンを選択すると、ステージ上に適切な指定で配置された収集チューブからミリングチップのロードをプロンプト表示します。
- 組織タイプ(FFPEまたは新鮮な凍結)および下流核酸抽出キットのニーズに最も適した3.0 mLの解剖バッファーでリザーバを満たし、画面の右下隅にある 解剖 ボタンを選択します。市販の核酸抽出キットから分子グレードの鉱物油または適切な緩衝液を使用してください。
メモ:スライドと選択した関心領域の自動解剖が開始され、サンプルが機器によって収集されます。ユニットヘッドは、ステージの背面からフライスチップを拾い上げ、リザーバからの解剖液で満たします。その後、チップはフライス加工経路に沿って回転し、サンプル組織をスライドから吸引し、完全または満杯になるまで回転します。次いで、解剖流体と共に収集されたサンプルは、ステージの背面に位置する収集チューブに分配される。 - 自動解剖が完了したら、収集チューブと解剖したサンプルスライドをステージから取り出し、それぞれチューブラックとスライドラックに入れます。
注:新鮮な冷凍収穫物は、製造業者の指示に従って核酸抽出に直接取り込む必要があり、解剖後の新鮮な凍結切片は、凍結切片の日常的なプロトコルを使用して直ちにH&E染色する必要があります。 - 解剖後の組織スライドを60°Cで30分間焼き、その後、日常的なプロトコルを使用してH&Eで染色します。
- H&E染色されたスライドを20倍の倍率でスライドイメージャー全体および/またはアーカイブで解剖した後でスキャンし、どの組織が収集されず、スライド上に残っているかの参照を求めます。
メモ: 別のスキャンオプションについては、上記の手順 1.5 を参照してください。
3. 核酸抽出
- 組織をプールしてペレット化する。市販のキットを使用し、製造元の指示に従って核酸抽出を行います。
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Representative Results
FFPEおよびFF異種移植片における転移性結腸直腸癌を含むマウス肝臓切片を選択した。切片をH&E染色し(図1A、E、I)、スライドイメージャ全体で20倍の倍率でスキャンした。病理学者が関心のある腫瘍領域とマスクにデジタル注釈を付け、市販のソフトウェアを使用して生成し、デジタルpng参照画像としてフォーマットした(図1B、F、J)。連続した10μmおよび20μm厚の染色されていないサンプルスライドをステージ上に配置して、上記のように自動解剖を行った。新鮮な凍結組織を市販のキットから溶解緩衝液に回収し、製造業者の指示に従って核酸抽出に直接運んだ。FFPEサンプルを分子グレードの鉱物油を使用して収集し、解剖したサンプルを一緒にプールし、25,000 x gで4°Cで20分間遠心分離しました。 上清を除去し、必要最小限の鉱物油を使用して、解剖した組織を再懸濁、移し、各サンプルの単一の収集チューブに適切に収集した。サンプルは、核酸抽出、RNA および DNA のサイジング、量、完全性、および純度の決定のために、メーカーの指示に従って室温でベンダーに出荷されました。シーケンシングライブラリーを作成し、メーカーの指示に従って市販のオプションでハイブリダイゼーションおよびキャプチャに使用しました。解剖後のサンプルスライドを、日常的な染色プロトコルを用いてH&E染色し、10μm(図1C、G、K)および20μm(図1D、H、L)の解剖領域を確認し、解剖測定基準を捕捉した(補足表1)。エクソームシーケンシングでは、約7,500万回の100 bpペアエンドリードが生成され、サンプルあたり平均カバレッジ深度(重複読み取りを削除する前)は150倍で、読み取り率は99.9%、オンターゲット率は78%でした。RNAシーケンシングのメトリクスは、5,500万bpのペアエンドリード、98%のアライメント率、19.4%の複製率、77%の一致読み取りを実証しました。
図1;新鮮な凍結およびFFPE組織からの腫瘍巣の解剖に成功した。H&E染色されたマウスの新鮮な凍結(A-D)およびFFPE(E-L)肝臓組織を結腸直腸癌転移で染色した。デジタル注釈(A、E、I)に使用された4 μmの基準スライドは、腫瘍の富化に古典的に課題を提示する全組織面積(I)および分布腫瘍巣(E)に対する腫瘍パーセントが低い例を示しています。注釈付きおよびデジタルマスクされたH&E参照スライド(B、F、J)が生成され、解剖後10μm(C、G、K)および20μm(D、H、L)のH&E染色スライドは、選択された領域の収穫が成功したことを実証する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:自動解剖で使用する注釈からデジタルマスクを作成するために使用される擬似コード。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:自動解剖および核酸抽出から捕捉された測定基準の例。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、腫瘍の濃縮とWESでの使用のために、腫瘍含有量の低いFFPEまたは新鮮な凍結組織から腫瘍領域を解剖するためのデジタル注釈および自動解剖を適用するためのプロトコルを紹介します。デジタルアノテーションとマスク作成を自動解剖と組み合わせることで、手動大解剖やLCMを含む従来の腫瘍濃縮方法に共通する必要な実践的な時間と専門知識が大幅に削減されます。このプロトコルは、腫瘍含有量の低い濃縮だけでなく、腫瘍に隣接する正常組織から離れた分散腫瘍巣を解剖することが困難な場合にも濃縮を可能にする、潜在的に重要な中域腫瘍濃縮オプションを実証し、高いスループットと中程度の精度で意味のある腫瘍濃縮を実現します。ここでは、腫瘍含有量の低い異種移植組織に対する当社のワークフローの使用が実証されていますが、このプロトコルは、さまざまな正常組織および癌適応症に対して、ヒト、マウス、および異種移植組織を含む組織タイプにわたって機能することも判明しました。
したがって、バックグラウンド組織の著しい汚染なしに関心のある特定の領域を濃縮することが有益である(すなわち、特定の脳領域に対して富化すること)または古典的なマクロ解剖を用いた核酸抽出の前に組織の領域を除去するためにさえも、広範囲の用途にも適用することができる。
スライドスキャンとデジタル注釈のための多くのプラットフォームが市場に存在します。したがって、プラットフォームの互換性には限界があり、プロトコル内の特定のプラットフォームがすべてのラボで広く利用できるわけではない可能性があることに注意することが重要です。したがって、記述されたプロトコル内で、利用可能なリソースに基づいて必要な変更を行う際にユーザーを導く代替オプションを提供するために多大な努力が払われました。デジタルアノテーションコンポーネントを削除するオプションも、慎重な手動によるスライド上のアノテーションを可能にするために注目されています。変更のために提供されるオプションは、ユーザーが現在のプラットフォームとソフトウェアの可用性で動作するオプションを見つける能力を最大限に高めます。
デジタル注釈と自動解剖はFFPEと新鮮な凍結組織の両方に広く適用されることが実証されていますが、自動組織解剖器具の境界はFFPE標本での使用目的を超えて押し広げられており、プロトコルは研究目的でのみ使用されています。ここでは、腫瘍含量の低いFFPEの自動腫瘍解剖、ならびに核酸抽出、WESおよびRNAシーケンシングのための新鮮な凍結組織の腫瘍濃縮の成功が実証された。このプロトコルは、WESおよびRNAシーケンシングの前に、基礎およびトランスレーショナル研究環境で異種移植片およびヒト組織領域を濃縮できることを示しており、PCRを含む他の下流分子用途が両方の組織タイプから可能であることにも留意している。このプロトコルは、FFPE自動解剖の選択肢を拡大し、臨床現場での使用のためにさらに開発および検証できる新鮮な凍結組織自動解剖の基礎を築きます。
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Disclosures
チャールズ・A・ハブナー、オリバー・ジル、ジェフ・イーストハム、ジェフリー・ハン、ジェニファー・ギルトナン、ニコラス・ローンズベリー、ダニエル・オレパー、サラジェーン・サトゥルニオ、エイミー・ア・ローはジェネンテックとロシュの従業員および株主であり、マナ・ジャヴェイとエマニュエル・ナウリはロシュの従業員および株主です。
Acknowledgments
著者らは、自動解剖開発におけるCarmina EspirituとRobin E. Taylorの支援、およびこの研究を支援したGenentech Pathology Core Laboratoryのスタッフに感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
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