Summary
A anotação digital com dissecção automatizada de tecidos fornece uma abordagem inovadora para enriquecer tumores em casos de baixo teor de tumor e é adaptável tanto parafina quanto para tipos de tecido congelado. O fluxo de trabalho descrito melhora a precisão, a reprodutibilidade e o throughput e pode ser aplicado tanto em pesquisas quanto em configurações clínicas.
Abstract
O enriquecimento tumoral em tecidos de baixo teor de tumores, aqueles abaixo de 20% do conteúdo tumoral dependendo do método, é necessário para gerar dados de qualidade reprodutivelmente com muitos ensaios a jusante, como o sequenciamento de próxima geração. A dissecção automatizada de tecidos é uma nova metodologia que automatiza e melhora o enriquecimento tumoral nesses tecidos comuns e de baixo teor de conteúdo tumoral, diminuindo a imprecisão dependente do usuário das limitações tradicionais de macrodiscção e tempo, custo e experiência da microdisseção de captura a laser usando sobreposição de anotação de imagem digital em slides não manchados. Aqui, as anotações de hematoxilina digital e eosina (H&E) são usadas para atingir pequenas áreas tumorais usando uma lâmina de 250 μmde diâmetro em parafina fixa de formalina não manchada incorporada (FFPE) ou seções congeladas frescas de até 20 μm de espessura para enriquecimento automatizado de tumores antes da extração de ácido nucleico e sequenciamento de exomatos inteiro (WES). A dissecção automatizada pode colher regiões anotadas em tecidos de baixo teor de tumores de seções únicas ou múltiplas para extração de ácido nucleico. Ele também permite a captura de extensas métricas de coleta pré e pós-colheita, melhorando a precisão, a reprodutibilidade e aumentando o throughput com a utilização de menos slides. O protocolo descrito permite a anotação digital com dissecção automatizada em FFPE animal e/ou humano ou tecidos congelados frescos com baixo teor de tumor e também pode ser usado para qualquer região de enriquecimento de interesse para aumentar a adequação para aplicações de sequenciamento a jusante em fluxos de trabalho clínicos ou de pesquisa.
Introduction
O sequenciamento da próxima geração (NGS) é cada vez mais utilizado tanto para o cuidado do paciente quanto para a pesquisa sobre câncer para ajudar a orientar os tratamentos e facilitar a descoberta científica. O tecido é muitas vezes limitado e pequenos espécimes com conteúdo tumoral variável são usados rotineiramente. A adequação e integridade tumorais, portanto, continuam a ser uma barreira para a obtenção de dados significativos. Amostras com menores percentuais tumorais podem causar dificuldade em distinguir variantes verdadeiras de artefatos sequenciamento e são muitas vezes inelegíveis para NGS1. O enriquecimento tumoral de casos de baixo teor de tumores, aqueles abaixo de 20%, tem sido mostrado para ajudar a produzir material suficiente para gerar dados de sequenciamento reprodutível e garantir que variantes de baixa frequência não sejam perdidas 2,3. No entanto, os limites variam dependendo das plataformas utilizadas e do uso planejado dos dados gerados.
Tradicionalmente, o enriquecimento das regiões tumorais para extração é realizado por macrodissecção manual ou microdissecção de captura a laser (LCM) de lâminas de parafina fixa formalina incorporada (FFPE). A macrodisseção manual, ou raspar áreas de tecido especificadas de lâminas, permite que as regiões tumorais sejam removidas para uso em ensaios a jusante com custo relativamente baixo, mas com baixa precisão e baixa precisão 2,4. A precisão técnica mínima pode ser muito eficaz com casos de maior teor de tumores onde grandes faixas de tumor estão presentes e/ou perda mínima de tecido não impacta significativamente os resultados, mas casos de baixo teor de tumores ou casos com tumor mais disperso requerem maior precisão. A LCM foi, portanto, inventada na década de 1990 e tornou-se uma forma valiosa de remover precisamente pequenas, definidas, regiões microscópicas de tecido de lâminas de parafina fixa formalina incorporadas (FFPE) 5,6,7,8. O LCM pode ser utilizado para coletar populações de células únicas quando existe heterogeneidade complexa da amostra9 permitindo a coleta de populações celulares anteriormente difíceis de separar. No entanto, a LCM requer maquinário dispendioso que requer ampla experiência técnica e tempo prático 10,11,12,13,14.
O instrumento utilizado para dissecção automatizada de tecido tem precisão entre a de LCM (~10 μm) e macrodisseções (~1 mm)15. Além disso, apresenta requisitos de custo e perícia técnica entre o de macrodisseção e LCM e foi projetado para realizar o rápido enriquecimento tecidual a partir de lâminas FFPE sequenciais para aliviar as desvantagens dos métodos anteriores15. A dissecção automatizada desta forma utiliza anotações digitais ou sobreposições de imagem de referência de slides no palco em lâminas de tecido não manchadas em série para dissecar e enriquecer regiões de interesse. O instrumento utiliza pontas de fresagem de lâmina giratórias plásticas, tubos de coleta de 1,5 mL e pode ser usado com uma série de fluidos diferentes para dissecção para coletar regiões de interesse para ensaios a jusante, incluindo extração nucleica e sequenciamento. A ponta de moagem de plástico giratório utiliza reservatórios internos e externos de barris de seringa e um êmbolo para coletar tampão, em seguida, moinhos e coleta tecido16. O diâmetro variável do tamanho da ponta de fresagem (250 μm, 525 μm, 725 μm) pode permitir a dissecção de áreas separadas de tecido para comparação, regiões multifocais que podem ser agrupadas ou pequenas áreas individuais de lâminas FFPE únicas ou múltiplas. As espessuras da seção utilizadas para a colheita podem ser ajustadas com base nas necessidades individuais de experimentos e os usuários podem garantir que regiões de interesse não tenham sido esgotadas realizando um H&E adicional em uma seção serial imediatamente após a última seção usada para a colheita.
A dissecção automatizada foi identificada como uma forma de enriquecer o conteúdo tumoral em casos de baixo teor de tumores e testamos e expandimos a funcionalidade pretendida de um instrumento automatizado de dissecção tecidual, que atualmente é comercializado para uso em amostras clínicas FFPE até 10 μm de espessura. O trabalho mostra que a dissecção automatizada pode ser aplicada tanto ao FFPE quanto a seções frescas de tecido humano ou animal congelados até 20 μm de espessura para fins de pesquisa. O protocolo também demonstra uma abordagem para anotar digitalmente e automatizar dissecção para enriquecimento tumoral em tecidos com baixo teor de tumor e/ou casos com tumor aninhado e disperso onde a macrodisseção significativa é desafiadora ou inviável e mostra qualidade e rendimento de ácido nucleico suficiente para NGS. A dissecção automatizada pode, portanto, fornecer precisão de nível médio e aumento da produtividade para o enriquecimento tumoral e também pode ser aplicada para enriquecer outras regiões de interesse ou combinada com outras plataformas para responder a pesquisas ou perguntas clínicas.
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Protocol
Antes da iniciação, obtenha amostras de tecido adequadas de acordo com os protocolos do Conselho de Revisão Institucional (IRB). Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Genentech, Inc.
1. Preparação de tecidos e slides
- Selecione FFPE ou blocos de tecido congelados frescos e utilize o método de processamento correspondente abaixo.
- Corte as seções do bloco de tecido em lâminas de vidro carregadas positivamente na espessura desejada. Seção serial em série o tecido FFPE em fitas com a primeira seção de referência cortada em uma espessura apropriada para a coloração de H&E (ou seja, 4 μm) seguida por 1-4 seções em uma espessura que varia de 4-20 μm com base na necessidade e disponibilidade de tecido. Colete as seções teciduais em lâminas de microscópio de vidro carregadas positivamente.
NOTA: As seções de tecido de referência congelada fresca devem ser manchadas imediatamente com Hematoxilina e Eosin (H&E) usando protocolos de rotina para seções congeladas e as seções congeladas não manchadas mantidas a -20 °C até que sejam necessárias para a colheita. - Deixe que todas as seções FFPE sequem à temperatura ambiente durante a noite.
- Asse os slides de referência FFPE a 60 °C por 30 minutos e depois manche com H&E usando protocolos de rotina.
- Escaneie os slides manchados de H&E em um imager de slides inteiro a uma ampliação de 20x ou superior.
- Anote as imagens de slides digitalizadas para regiões de interesse tumorais usando uma plataforma de visualização fornecida pelo fornecedor ou pelo visualizador de código aberto. Exporte essas anotações como uma captura de tela de baixa ampliação ou salve-as como um arquivo de metadados contendo coordenadas de pixel X-Y correspondentes a vértices de polígono.
NOTA: O primeiro é menos desafiador tecnicamente para trabalhar, mas o segundo oferece vantagens na automação de processos. - Crie máscaras digitais das regiões de interesse anotadas em consonância com a abordagem utilizada e exporte as anotações manuais.
NOTA: Se uma captura de tela/imagem das anotações for usada, um software simples de processamento de imagem pode ser usado para selecionar uma região e preencher toda a seleção. O uso de coordenadas X-Y para cada ROI requer o uso de uma linguagem de programação para ler os dados de imagem e as coordenadas do polígono para criar uma imagem de baixa mag com regiões de interesse preenchidas. O usuário deve trabalhar com o fornecedor de instrumentos de dissecção automatizado para estabelecer um processo baseado em sua disponibilidade e necessidades individuais de software. Se a digitalização, a anotação do slide digital e/ou a criação de máscaras digitais não estiver disponível, uma anotação cuidadosa no slide usando um marcador pode ser realizada e usada no lugar de uma máscara digital como uma imagem de referência. O pseudocódigo para criação de máscaras digitais foi fornecido no Arquivo Suplementar 1.
2. Dissecção automatizada de tecidos
- Coloque os slides de tecido de amostra não manchados no palco nas posições do primeiro ao quarto slide ao usar referência de slide digital. Ao usar a anotação no slide em vez de uma opção digital, coloque os slides de tecido amostral não manchados no palco nas posições do segundo ao quarto slide com um slide de referência na primeira posição.
- Crie um trabalho de moagem usando o software automatizado de dissecção de tecidos: > criar novo job > Case ID > Nomear o trabalho de moagem; ir para espessura > Espessura da seção usando a aba de seta para cima ou para baixo; em seguida, vá para a preparação de tecidos > parafinado ou desparaffinizado, imagem de referência > do arquivo > arquivo de imagem de importação > arquivo para importar da queda como referência digital, se aplicável. Selecione De Palco para referência de slides no palco. Quando os campos estiverem concluídos, escaneie o estágio selecionando o botão 'Estágio de varredura ' no canto inferior direito para capturar cada deslizamento de tecido amostral na primeira e quarta posição.
- Selecione a área de tecido para captura de imagem.
- Se usar uma referência no palco, arraste a caixa de um canto para o oposto para criar uma área retangular sobre o tecido. Selecione a bolha circular sob a área retangular para capturar a imagem de referência do estágio. Se estiver usando uma imagem de referência digital, sobreponha a imagem na área retangular selecionada. Redimensione e alinhe a referência digital grosseiramente no zoom do curso para melhor corresponder ao tamanho e posição sobre o tecido amostral.
- Copie este campo retângulo em slides de tecido de amostra restantes nas posições de segunda a quarta posições de slides, selecionando a opção de cópia no canto superior direito da imagem de referência. Alinhe e redimensione grosseiramente conforme necessário.
NOTA: Ao usar uma imagem de referência no slide em vez de uma máscara digital, selecione qual slide no palco deve ser usado como referência.
- Alinhe os slides de referência e amostra
- Quando a imagem de referência estiver grosseiramente alinhada em slides de amostra de tecido em todas as posições de slides, selecione o botão 'Estágio de varredura ' no canto inferior direito da tela para mover-se para a etapa de ajuste fino. Selecione a posição do primeiro estágio e o ícone da ferramenta Transform (o terceiro ícone abaixo na barra de ferramentas à direita) para fazer ajustes finos de alinhamento e zoom da referência para melhor corresponder à sobreposição de slides de amostra. Use a barra de deslizamento Referência para Amostra na parte inferior da tela, balançando entre imagem de referência e imagem de amostra, juntamente com o recurso Zoom In e Zoom Out para ajustar e obter alinhamento de cada posição de slides. Replique este processo nas posições de slides de segunda a quarta amostra.
- Selecione a área de fresagem da região de interesse
- Uma vez que a sobreposição de amostra ideal de cada uma das quatro posições de slides seja alcançada, desenhe designações de caminho de fresagem usando o ícone da ferramenta Color Picker (o décimo ícone na barra de ferramentas à direita) na porção colorida da imagem de referência mascarada. Selecione a caixa Extend to Similar se vários slides ou áreas estiverem anotadas para dissecção e, em seguida, selecione o botão Obter anotações(s) no lado inferior direito para desenhar caminhos de fresagem em slides de amostra.
- Selecione o caminho de fresagem na primeira posição de deslizamento.
NOTA: Quando o caminho de fresagem for selecionado na primeira posição de deslizamento, ele será copiado para as posições restantes do slide e o uso da ponta de fresagem será calculado. O uso da ponta de fresagem no canto superior esquerdo é calculado com base na área coberta e no tamanho da ponta selecionado. Se mais de quatro dicas forem calculadas, um tamanho de ponta maior pode ser selecionado para capturar o ROI anotado. O tamanho da ponta pode ser selecionado ou alterado no lado esquerdo da tela sob a seta da ponta de fresagem e o uso da ponta será recalculado. - Quando o caminho de fresagem for calculado, colete o ROI anotado com quatro ou menos pontas de fresagem. Selecione o botão Estágio de configuração no lado inferior direito da tela para solicitar o carregamento de dicas de fresagem de tubos de coleta colocados em sua designação adequada no palco.
- Encha o reservatório com 3,0 mL do tampão de dissecção mais adequado para o tipo de tecido (FFPE ou congelado fresco) e as necessidades do kit de extração de ácido nucleico a jusante e selecione o botão Dissect no canto inferior direito da tela. Use óleo mineral de grau molecular ou um tampão apropriado de kits de extração de ácido nucleico disponíveis comercialmente.
NOTA: A dissecação automatizada de slides e regiões de interesse selecionadas começa e as amostras são coletadas pelo instrumento. A cabeça da unidade pegará pontas de fresagem na parte de trás do palco e encherá com fluido de dissecção do reservatório. As pontas, em seguida, gire ao longo do caminho de fresar aspirando tecido amostral de slides até completar ou cheio. A amostra coletada com fluido de dissecção é então distribuída em tubos de coleta localizados na parte de trás do palco. - Quando a dissecção automatizada estiver completa, remova os tubos de coleta e os slides de amostra dissecados do palco e coloque-os em um rack de tubo e rack de slides, respectivamente.
NOTA: As colheitas congeladas frescas devem ser levadas diretamente para a extração de ácido nucleico, de acordo com as instruções do fabricante e as seções congeladas frescas pós-dissecção devem ser manchadas imediatamente por meio de protocolos de rotina para seções congeladas. - Asse os slides de tecido dissecados ao poste a 60 °C por 30 minutos e depois manche com H&E usando protocolos de rotina.
- Escaneie os slides manchados de H&E em um inteiro imager deslizante em ampliação de 20x e/ou arquivo para uma referência de que tecido não foi coletado e permanece no slide.
NOTA: Consulte a etapa 1.5 acima para obter opções alternativas de digitalização.
3. Extração de ácido nucleico
- Piscina e pelota o tecido. Realize a extração de ácido nucleico usando um kit comercialmente disponível e seguindo as instruções do fabricante.
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Representative Results
Foram selecionadas seções de fígado de camundongos FFPE e FF contendo câncer colorretal metastático em xenoenxertos. As seções foram manchadas de H&E (Figura 1A,E,I) e digitalizadas em um imager de slides inteiro a ampliação de 20x. Um patologista anotou digitalmente regiões tumorais de interesse e uma máscara foi gerada usando software comercial e formatada como uma imagem de referência png digital (Figura 1B,F,J). Slides de amostra não manchados de 10 μm e 20 μm de espessura foram colocados no palco e a dissecção automatizada foi realizada conforme descrito acima. Tecidos congelados frescos foram coletados em um tampão de lise de um kit comercialmente disponível e transportados diretamente para extração de ácido nucleico seguindo as instruções do fabricante. As amostras de FFPE foram coletadas utilizando óleo mineral de grau molecular e amostras dissecadas foram agrupadas e centrifadas a 25.000 x g por 20 min a 4 °C. O supernante foi removido e o óleo mineral mínimo necessário foi usado para resuspend, transferência e coleta do tecido dissecado em um único tubo de coleta para cada amostra adequadamente. As amostras foram enviadas à temperatura ambiente para um fornecedor para extração de ácido nucleico, RNA e dimensionamento de DNA, quantidade, integridade e determinação da pureza seguindo as instruções do fabricante. Bibliotecas de sequenciamento foram criadas e utilizadas para hibridização e captura com opções comerciais seguindo as instruções do fabricante. Slides de amostra pós-dissecados foram manchados de H&E usando protocolos de coloração de rotina para confirmar áreas de dissecção em 10 μm (Figura 1C,G,K) e 20 μm (Figura 1D,H,L) slides e métricas de dissecção (Tabela Suplementar 1). O sequenciamento exome gerou aproximadamente 75 milhões de leituras de ponta emparelhadas de 100 bp, gerando uma profundidade média de cobertura (antes de remover leituras duplicadas) de 150x por amostra, com 99,9% de leituras alinhadas e uma taxa de 78% no alvo. As métricas de sequenciamento de RNA demonstraram pouco mais de 55 milhões de leituras de ponta a pares de bp, uma taxa de alinhamento de 98% e uma taxa de duplicação de 19,4% com leituras concordantes de 77%.
Figura 1; Dissecção bem sucedida de ninhos tumorais de tecido congelado fresco e FFPE. O tecido hepático h&E manchado de camundongos frescos (A-D) e FFPE (E-L) com metástase de câncer colorretal. Slides de referência de 4 μm usados para anotação digital (A, E, I) demonstram exemplos com baixo percentual de tumor para a área total do tecido (I) e ninhos tumorais distribuídos (E) que apresentam desafios clássicos ao enriquecimento tumoral. Slides de referência H&E anotados e digitalmente mascarados (B, F, J) foram gerados e slides manchados de H&E pós-dissecção de 10 μm (C, G, K) e 20 μm (D, H,L) H&E demonstram colheita bem-sucedida de áreas selecionadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Pseudocode utilizado para criar máscaras digitais a partir de anotações para usar em dissecção automatizada. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Tabela suplementar 1: Exemplo de métricas capturadas a partir de dissecção automatizada e extração de ácido nucleico. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Apresentado aqui é um protocolo para a aplicação de anotação digital e dissecção automatizada para dissecar regiões tumorais a partir de baixo teor de tumor FFPE ou tecidos congelados frescos para enriquecimento tumoral e uso em WES. A combinação de anotação digital e criação de máscaras com dissecção automatizada reduz significativamente o tempo prático e a experiência necessárias comuns aos métodos clássicos de enriquecimento tumoral, incluindo a macrodisseção manual e lCM. O protocolo demonstra uma opção potencialmente importante de enriquecimento tumoral de médio alcance que permite não apenas um baixo enriquecimento de conteúdo tumoral, mas também enriquecimento nos casos em que é desafiador dissecar ninhos tumorais distribuídos longe do tecido normal adjacente do tumor para enriquecimento tumoral significativo com alto rendimento e um nível moderado de precisão. Embora o uso do nosso fluxo de trabalho para tecidos de xenoenxerto de baixo teor de tumores seja demonstrado aqui, também foi descoberto que este protocolo funciona entre tipos de tecidos, incluindo tecidos humanos, murinos e xenoenxertos para uma variedade de tecidos normais e indicações de câncer.
Portanto, também poderia se aplicar a uma ampla gama de aplicações onde enriquecer para regiões específicas de interesse sem contaminação significativa do tecido de fundo seria benéfico (ou seja, para enriquecer para uma região cerebral específica) ou mesmo para a remoção de áreas de tecido antes da extração de ácido nucleico usando macrodissecção clássica.
Existem muitas plataformas no mercado para digitalização de slides e anotações digitais. Por isso, é importante estar ciente de que a compatibilidade da plataforma pode apresentar limitações e plataformas especificadas dentro de qualquer protocolo podem não estar amplamente disponíveis em todos os laboratórios. Portanto, esforços significativos foram feitos para fornecer opções alternativas dentro do protocolo descrito que orientará os usuários a fazer quaisquer modificações necessárias com base em seus recursos disponíveis. Uma opção para a remoção do componente de anotação digital também foi observada para permitir uma anotação manual cuidadosa no slide. As opções previstas para modificações maximizarão a capacidade dos usuários de encontrar uma opção que funcione com sua plataforma atual e disponibilidade de software.
Embora a anotação digital e a dissecção automatizada tenham sido demonstradas como amplamente aplicadas tanto ao FFPE quanto ao tecido congelado fresco, é importante notar que os limites do instrumento automatizado de dissecção tecidual foram empurrados para além do uso pretendido com espécimes FFPE e o protocolo destina-se apenas ao uso da pesquisa. Aqui, o enriquecimento tumoral bem sucedido foi demonstrado através da dissecção automatizada do tumor de baixo teor de tumor FFPE, bem como tecidos congelados frescos para extração de ácido nucleico, sequenciamento wes e RNA. O protocolo mostra que as regiões de interesse do xenoenxerto e do tecido humano poderiam ser enriquecidas antes do sequenciamento do WES e do RNA em configurações básicas e translacionais de pesquisa e também notam que outras aplicações moleculares a jusante, incluindo o PCR, de ambos os tipos de tecidos seriam possíveis. O protocolo expande as opções de dissecção automatizada ffPE e estabelece as bases para dissecção automatizada de tecido congelado fresco que poderia ser desenvolvida e validada ainda mais para uso em ambientes clínicos.
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Disclosures
Charles A Havnar, Oliver Zill, Jeff Eastham, Jeffrey Hung, Jennifer Giltnane, Nicolas Lounsbury, Daniel Oreper, Sarajane Saturnio e Amy A Lo são funcionários e acionistas da Genentech e Roche e Mana Javey e Emmanuel Naouri são funcionários e acionistas da Roche.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Carmina Espiritu e Robin E. Taylor por seu apoio no desenvolvimento de dissecção automatizada, bem como a equipe do Genentech Pathology Core Laboratory que apoiou este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
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