Summary
Die digitale Annotation mit automatisierter Gewebedissektion bietet einen innovativen Ansatz zur Anreicherung von Tumoren in Fällen mit niedrigem Tumorgehalt und ist sowohl an Paraffin- als auch an gefrorene Gewebetypen anpassbar. Der beschriebene Workflow verbessert die Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und den Durchsatz und kann sowohl in der Forschung als auch in der klinischen Umgebung angewendet werden.
Abstract
Eine Tumoranreicherung in Geweben mit niedrigem Tumorgehalt, die je nach Methode unter 20% Tumorgehalt liegen, ist erforderlich, um Qualitätsdaten reproduzierbar mit vielen nachgelagerten Assays wie Next Generation Sequencing zu generieren. Die automatisierte Gewebedissektion ist eine neue Methodik, die die Tumoranreicherung in diesen häufigen Geweben mit niedrigem Tumorgehalt automatisiert und verbessert, indem sie die benutzerabhängige Ungenauigkeit der traditionellen Makrodissektion und die Zeit-, Kosten- und Fachkenntnissebeschränkungen der Laser-Capture-Mikrodissektion durch die Verwendung digitaler Bildannotationsüberlagerungen auf ungefärbten Objektträgern verringert. Hier werden digitale Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Annotationen verwendet, um kleine Tumorbereiche mit einer Klinge mit einem Durchmesser von250 μm 2 in ungefärbtem Formalin fixed paraffin embedded (FFPE) oder frischen gefrorenen Abschnitten mit einer Dicke von bis zu 20 μm für die automatisierte Tumoranreicherung vor der Nukleinsäureextraktion und der Sequenzierung ganzer Exome (WES) anzusprechen. Die automatisierte Dissektion kann annotierte Regionen in Geweben mit niedrigem Tumorgehalt aus einzelnen oder mehreren Abschnitten für die Nukleinsäureextraktion ernten. Es ermöglicht auch die Erfassung umfangreicher Erfassungsmetriken vor und nach der Ernte bei gleichzeitiger Verbesserung der Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Erhöhung des Durchsatzes bei Auslastung von weniger Objektträgern. Das beschriebene Protokoll ermöglicht eine digitale Annotation mit automatisierter Dissektion von tierischem und/oder menschlichem FFPE oder frischem gefrorenem Gewebe mit niedrigem Tumorgehalt und könnte auch für jede Region von Interesse verwendet werden, um die Angemessenheit für nachgelagerte Sequenzierungsanwendungen in klinischen oder Forschungsabläufen zu erhöhen.
Introduction
Next Generation Sequencing (NGS) wird zunehmend sowohl für die Patientenversorgung als auch in der Krebsforschung eingesetzt, um Behandlungen zu leiten und wissenschaftliche Entdeckungen zu erleichtern. Das Gewebe ist oft begrenzt und kleine Proben mit variablem Tumorgehalt werden routinemäßig verwendet. Tumoradäquanz und -integrität bleiben daher ein Hindernis für die Gewinnung aussagekräftiger Daten. Proben mit niedrigeren Tumoranteilen können Schwierigkeiten bei der Unterscheidung von wahren Varianten von Sequenzierungsartefakten verursachen und sind oft nicht für NGS1 geeignet. Es hat sich gezeigt, dass die Tumoranreicherung von Fällen mit niedrigem Tumorgehalt, die unter 20% liegen, dazu beiträgt, ausreichend Material zu liefern, um reproduzierbare Sequenzierungsdaten zu generieren und sicherzustellen, dass niederfrequente Varianten nicht übersehen werden 2,3. Die Grenzen variieren jedoch je nach den verwendeten Plattformen und der geplanten Nutzung der generierten Daten.
Traditionell erfolgt die Anreicherung von Tumorregionen für die Extraktion durch manuelle Makrodissektion oder Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) von Formalin fixed paraffin embedded (FFPE) Objektträgern. Die manuelle Makrodissektion oder das Abkratzen bestimmter Gewebebereiche von Objektträgern ermöglicht die Entfernung von Tumorregionen für die Verwendung in nachgeschalteten Assays mit relativ geringen Kosten, aber mit geringer Genauigkeit und geringer Präzision 2,4. Minimale technische Genauigkeit kann sehr effektiv sein bei Fällen mit höherem Tumorgehalt, in denen große Tumorschwaden vorhanden sind und / oder minimaler Gewebeverlust die Ergebnisse nicht signifikant beeinflusst, aber Fälle mit niedrigem Tumorgehalt oder Fälle mit stärker dispergiertem Tumor erfordern eine erhöhte Präzision. LCM wurde daher in den 1990er Jahren erfunden und wurde zu einem wertvollen Weg, um kleine, definierte, mikroskopisch kleine Geweberegionen aus formalin fixen Paraffin eingebetteten (FFPE) Objektträgern 5,6,7,8 präzise zu entfernen. LCM kann verwendet werden, um Einzelzellpopulationen zu sammeln, wenn eine komplexe Heterogenität der Stichprobe besteht9, was die Sammlung von zuvor schwer zu trennenden Zellpopulationen ermöglicht. LCM erfordert jedoch kostspielige Maschinen, die umfangreiches technisches Know-how und praktische Zeit erfordern 10,11,12,13,14.
Das für die automatisierte Gewebedissektion verwendete Instrument weist eine Genauigkeit zwischen LCM (~10 μm) und Makrodissektionen (~1 mm)15 auf. Darüber hinaus weist es sowohl Kosten- als auch technische Qualifikationsanforderungen zwischen Makrodissektion und LCM auf und wurde entwickelt, um eine schnelle Gewebeanreicherung von sequentiellen FFPE-Objektträgern durchzuführen, um die Nachteile früherer Methodenzu lindern 15. Die automatisierte Dissektion auf diese Weise verwendet digitale Anmerkungen oder Referenzbildüberlagerungen auf der Bühne auf seriell geschnittene, ungefärbte Gewebeobjektträger, um Bereiche von Interesse zu sezieren und anzureichern. Das Instrument verwendet Kunststoff-Spinnmesser-Frässpitzen, 1,5-ml-Sammelrohre und kann mit einer Reihe verschiedener Flüssigkeiten zur Dissektion verwendet werden, um Bereiche zu sammeln, die für nachgeschaltete Assays von Interesse sind, einschließlich der Nukleinextraktion und -sequenzierung. Die sich drehende Kunststoff-Frässpitze verwendet innere und äußere Spritzenbehälter und einen Kolben, um Puffer zu sammeln, dann zu mahlen und sammelt Gewebe16. Der variable Durchmesser der Frässpitze (250 μm, 525 μm, 725 μm) kann die Dissektion von separaten Gewebebereichen zum Vergleich, multifokalen Regionen, die gepoolt werden können, oder einzelnen kleinen Bereichen aus einzelnen oder mehreren FFPE-Objektträgern ermöglichen. Die für die Ernte verwendeten Abschnittsdicken können basierend auf den individuellen Experimentanforderungen angepasst werden, und die Benutzer können sicherstellen, dass die interessierenden Regionen nicht erschöpft sind, indem sie unmittelbar nach dem letzten für die Ernte verwendeten Abschnitt eine zusätzliche H & E an einem seriellen Abschnitt durchführen.
Die automatisierte Dissektion wurde als eine Möglichkeit identifiziert, den Tumorgehalt in Fällen mit niedrigem Tumorgehalt anzureichern, und wir testeten und erweiterten die beabsichtigte Funktionalität eines automatisierten Gewebedissektionsinstruments, das derzeit für den Einsatz an klinischen FFPE-Proben mit einer Dicke von bis zu 10 μm vermarktet wird. Die Arbeit zeigt, dass die automatisierte Dissektion sowohl auf FFPE- als auch auf frisch gefrorene menschliche oder tierische Gewebeschnitte mit einer Dicke von bis zu 20 μm für Forschungszwecke angewendet werden kann. Das Protokoll demonstriert auch einen Ansatz zur digitalen Annotation und Automatisierung der Dissektion für die Tumoranreicherung in Geweben mit niedrigem Tumorgehalt und / oder Fällen mit verschachtelten, dispergierten Tumoren, bei denen eine sinnvolle Makrodissektion eine Herausforderung darstellt oder nicht durchführbar ist, und zeigt sowohl die Qualität als auch die Ausbeute an Nukleinsäuren, die für NGS ausreichen. Die automatisierte Dissektion kann daher eine mittlere Präzision und einen erhöhten Durchsatz für die Tumoranreicherung bieten und könnte auch zur Bereicherung anderer interessanter Regionen oder in Kombination mit anderen Plattformen zur Beantwortung von Forschungs- oder klinischen Fragen eingesetzt werden.
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Protocol
Besorgen Sie sich vor der Einleitung geeignete Gewebeproben gemäß den Protokollen des Institutional Review Board (IRB). Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Genentech, Inc. genehmigt.
1. Gewebe- und Objektträgervorbereitung
- Wählen Sie FFPE oder frisch gefrorene Gewebeblöcke und verwenden Sie die entsprechende Verarbeitungsmethode unten.
- Schneiden Sie Gewebeblockabschnitte auf positiv geladene Glasobjektträger in der gewünschten Dicke. Serielles Schneiden des FFPE-Gewebes in Bändern mit dem ersten Referenzabschnitt, der mit einer für die H & E-Färbung geeigneten Dicke (dh 4 μm) geschnitten wird, gefolgt von 1-4 Abschnitten mit einer Dicke von 4-20 μm, je nach Bedarf und Gewebeverfügbarkeit. Sammeln Sie die Gewebeabschnitte auf positiv geladenen Glasmikroskopobjektträgern.
HINWEIS: Frische gefrorene Referenzgewebeabschnitte sollten sofort mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt werden, wobei Routineprotokolle für gefrorene Abschnitte und die unbefleckten gefrorenen Abschnitte bei -20 ° C verwendet werden, bis sie für die Ernte benötigt werden. - Lassen Sie alle FFPE-Abschnitte über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.
- Backen Sie die FFPE-Referenzobjektträger bei 60 ° C für 30 Minuten und färben Sie sie dann mit H & E unter Verwendung von Routineprotokollen.
- Scannen Sie die mit H&E gebeizten Dias auf einem ganzen Dia-Imager mit 20-facher Vergrößerung oder mehr.
- Kommentieren Sie die gescannten Diabilder für Tumorregionen von Interesse mit einer vom Anbieter bereitgestellten Anzeigeplattform oder einem Open-Source-Viewer. Exportieren Sie diese Anmerkungen entweder als Screenshot mit geringer Vergrößerung oder speichern Sie sie als Metadatendatei mit X-Y-Pixelkoordinaten, die Polygon-Eckpunkten entsprechen.
HINWEIS: Ersteres ist technisch weniger schwierig zu handhaben, aber letzteres bietet Vorteile in der Prozessautomatisierung. - Erstellen Sie digitale Masken der kommentierten Bereiche von Interesse entsprechend dem verwendeten Ansatz und exportieren Sie die manuellen Anmerkungen.
HINWEIS: Wenn ein Screenshot/Bild der Anmerkungen verwendet wird, kann eine einfache Bildverarbeitungssoftware verwendet werden, um einen Bereich auszuwählen und die gesamte Auswahl auszufüllen. Die Verwendung von X-Y-Koordinaten für jeden ROI erfordert die Verwendung einer Programmiersprache, um sowohl die Bilddaten als auch die Polygonkoordinaten zu lesen, um ein Low-Mag-Bild mit ausgefüllten Bereichen von Interesse zu erstellen. Der Benutzer sollte mit dem Anbieter von automatisierten Sezierinstrumenten zusammenarbeiten, um einen Prozess basierend auf seiner individuellen Softwareverfügbarkeit und seinen Bedürfnissen zu etablieren. Wenn das Scannen, die digitale Folienanmerkung und/oder die Erstellung digitaler Masken nicht verfügbar ist, kann eine sorgfältige On-Slide-Annotation mit einer Markierung durchgeführt und anstelle einer digitalen Maske als Referenzbild verwendet werden. Pseudocode für die Erstellung digitaler Masken wurde in der Zusatzdatei 1 bereitgestellt.
2. Automatisierte Gewebedissektion
- Platzieren Sie die unbefleckten Objektträger der Probe auf der Bühne in der ersten bis vierten Objektträgerposition, wenn Sie eine digitale Objektträgerreferenz verwenden. Wenn Sie eine On-Slide-Annotation anstelle einer digitalen Option verwenden, platzieren Sie die unbefleckten Probengewebeobjektträger auf dem Tisch in der zweiten bis vierten Objektträgerposition mit einem Referenzobjektträger an der ersten Position.
- Erstellen Sie einen Fräsauftrag mit der automatisierten Gewebedissektionssoftware: Auftragsauswahl > Neuen Auftrag > Fall-ID erstellen > Benennen Sie den Fräsauftrag; Wechseln Sie zu Dicke > Schnittstärke (Compression Section Thickness), indem Sie die Pfeilregisterkarte nach oben oder unten verwenden. Wechseln Sie dann zu Tissue Preparation > Paraffinized oder Deparaffinized, Reference Image > From File > Import Image > File to import from the dropdown as the digital reference, falls zutreffend. Wählen Sie Aus Bühne für Folienreferenz auf der Bühne aus. Wenn die Felder ausgefüllt sind, scannen Sie den Tisch, indem Sie die Schaltfläche Scan-Stufe in der unteren rechten Ecke auswählen, um jeden Objektträger des Probengewebes an der ersten bis vierten Position zu erfassen.
- Wählen Sie den Gewebebereich für die Bilderfassung aus.
- Wenn Sie eine Referenz auf der Bühne verwenden, ziehen Sie die Box von einer Ecke zur gegenüberliegenden Ecke, um einen rechteckigen Bereich über dem Gewebe zu erzeugen. Wählen Sie die kreisförmige Blase unter dem rechteckigen Bereich aus, um das Bühnenreferenzbild aufzunehmen. Wenn Sie ein digitales Referenzbild verwenden, überlagern Sie das Bild auf dem ausgewählten rechteckigen Bereich. Ändern Sie die Größe und richten Sie die digitale Referenz grob im Kurszoom aus, um der Größe und Position über dem Probengewebe am besten zu entsprechen.
- Kopieren Sie dieses Rechteckfeld auf die verbleibenden Objektträger der Probe in der zweiten bis vierten Objektträgerposition, indem Sie die Kopieroption in der oberen rechten Ecke des Referenzbildes auswählen. Richten Sie die Größe nach Bedarf grob aus und ändern Sie die Größe.
HINWEIS: Wenn Sie ein Referenzbild auf der Folie anstelle einer digitalen Maske verwenden, wählen Sie aus, welche Folie auf der Bühne als Referenz verwendet werden soll.
- Ausrichten der Referenz- und Beispielfolien
- Wenn das Referenzbild auf Gewebeprobenobjektträgern in allen Objektträgerpositionen grob ausgerichtet ist, wählen Sie die Schaltfläche " Scan-Bühne" in der unteren rechten Ecke des Bildschirms, um in den Feinjustierungsschritt zu gelangen. Wählen Sie die erste Bühnenposition und das Symbol "Werkzeug transformieren" (das dritte Symbol unten in der rechten Symbolleiste), um die Referenz so auszurichten, dass sie der Beispielfolienüberlagerung am besten entspricht. Verwenden Sie den Schieberegler "Verweis auf Stichprobe " am unteren Bildschirmrand, der zwischen Referenzbild und Beispielbild wechselt, sowie die Funktion "Ein - und Auszoomen ", um jede Folienposition anzupassen und auszurichten. Replizieren Sie diesen Prozess in den Positionen des zweiten bis vierten Beispielobjektträgers.
- Wählen Sie den Fräsbereich der Region von Interesse
- Sobald eine optimale Probenüberlagerung jeder der vier Objektträgerpositionen erreicht ist, zeichnen Sie Fräsbahnbezeichnungen mit dem Symbol des Farbwählerwerkzeugs (das zehnte Symbol unten in der rechten Symbolleiste) auf dem farbigen Teil des maskierten Referenzbildes. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Auf Ähnliches erweitern, wenn mehrere Folien oder Bereiche zum Analysieren mit Anmerkungen versehen sind, und wählen Sie dann die Schaltfläche Anmerkung(en) abrufen unten rechts, um Fräspfade auf Beispielfolien zu zeichnen.
- Wählen Sie den Fräsweg in der ersten Schlittenposition aus.
HINWEIS: Wenn der Fräspfad in der ersten Schlittenposition ausgewählt wird, wird er auf die verbleibenden Gleitpositionen kopiert und die Frässpitzennutzung berechnet. Der Frässpitzenverbrauch in der oberen linken Ecke wird basierend auf der abgedeckten Fläche und der ausgewählten Spitzengröße berechnet. Wenn mehr als vier Spitzen berechnet werden, kann eine größere Trinkgeldgröße ausgewählt werden, um den kommentierten ROI zu erfassen. Die Spitzengröße kann auf der linken Seite des Bildschirms unter dem Pfeil Frässpitze ausgewählt oder geändert werden, und die Spitzenverwendung wird neu berechnet. - Wenn der Fräsweg berechnet wird, erfassen Sie den kommentierten ROI mit vier oder weniger Frässpitzen. Wählen Sie die Schaltfläche Stufe einrichten unten rechts auf dem Bildschirm, um das Laden von Frässpitzen aus platzierten Auffangrohren in ihrer richtigen Bezeichnung auf der Bühne aufzufordern.
- Füllen Sie das Reservoir mit 3,0 ml des Dissektionspuffers, der für den Gewebetyp (FFPE oder frisch gefroren) und den nachgeschalteten Nukleinsäure-Extraktionskit am besten geeignet ist, und wählen Sie die Schaltfläche Sezieren in der unteren rechten Ecke des Bildschirms. Verwenden Sie Mineralöl in molekularer Qualität oder einen geeigneten Puffer aus kommerziell erhältlichen Nukleinsäure-Extraktionskits.
HINWEIS: Die automatisierte Sezierung von Dias und ausgewählten Bereichen von Interesse beginnt dann und Proben werden vom Instrument gesammelt. Der Gerätekopf nimmt Frässpitzen von der Rückseite des Tisches auf und füllt sich mit Dissektionsflüssigkeit aus dem Reservoir. Die Spitzen drehen sich dann entlang des Fräsweges und saugen das Probengewebe von Objektträgern bis zur Fertigstellung oder Füllung ab. Die gesammelte Probe mit Dissektionsflüssigkeit wird dann in Auffangröhrchen auf der Rückseite der Bühne dosiert. - Wenn die automatisierte Dissektion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Sammelröhrchen und die sezierten Objektträger von der Bühne und legen Sie sie in ein Röhrchengestell bzw. ein Objektträgergestell.
HINWEIS: Frisch gefrorene Ernten sollten gemäß den Anweisungen des Herstellers direkt in die Nukleinsäureextraktion gebracht werden, und nach der Dissektion sollten frische gefrorene Abschnitte sofort mit Routineprotokollen für gefrorene Abschnitte gefärbt werden. - Backen Sie die postdissektierten Gewebeobjektträger bei 60 ° C für 30 Minuten und färben Sie sie dann mit H & E unter Verwendung von Routineprotokollen.
- Scannen Sie die postdissektierten H & E-gefärbten Dias auf einem ganzen Dia-Imager mit 20-facher Vergrößerung und / oder Archiv, um eine Referenz darüber zu erhalten, welches Gewebe nicht gesammelt wurde und auf dem Dia verbleibt.
HINWEIS: Siehe Schritt 1.5 oben für alternative Scanoptionen.
3. Nukleinsäure-Extraktion
- Legen Sie das Gewebe zusammen und pelletieren Sie es. Führen Sie die Nukleinsäureextraktion mit einem handelsüblichen Kit und gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
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Representative Results
FFPE- und FF-Mausleberschnitte, die metastasierenden Darmkrebs in Xenotransplantaten enthielten, wurden ausgewählt. Die Abschnitte wurden H & E-gefärbt (Abbildung 1A, E, I) und auf einem ganzen Dia-Imager mit 20-facher Vergrößerung gescannt. Ein Pathologe annotierte digitale Tumorregionen von Interesse und eine Maske wurde mit kommerzieller Software generiert und als digitales png-Referenzbild formatiert (Abbildung 1B, F, J). Serielle 10 μm und 20 μm dicke, ungefärbte Probenobjektträger wurden auf die Bühne gelegt und die automatisierte Dissektion wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Frisches gefrorenes Gewebe wurde in einem Lysepuffer aus einem handelsüblichen Kit gesammelt und gemäß den Anweisungen des Herstellers direkt in die Nukleinsäureextraktion getragen. FFPE-Proben wurden mit molekularem Mineralöl entnommen und die sezierten Proben wurden zusammengepoolt und bei 25.000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das minimal benötigte Mineralöl wurde verwendet, um das sezierte Gewebe in einem einzigen Entnahmeröhrchen für jede Probe entsprechend auszusetzen, zu übertragen und zu sammeln. Die Proben wurden bei Raumtemperatur an einen Lieferanten zur Nukleinsäureextraktion, RNA- und DNA-Größenanpassung, Menge, Integrität und Reinheitsbestimmung gemäß den Anweisungen des Herstellers geliefert. Sequenzierungsbibliotheken wurden erstellt und für die Hybridisierung und Erfassung mit kommerziellen Optionen gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Postdissektierte Probenobjektträger wurden mit Routine-Färbeprotokollen gefärbt, um Sezierbereiche in 10 μm (Abbildung 1C, G, K) und 20 μm (Abbildung 1D, H, L) zu bestätigen, und es wurden Dissektionsmetriken erfasst (Ergänzende Tabelle 1). Die Exome-Sequenzierung generierte etwa 75 Millionen 100-bp-Paired-End-Reads, was zu einer durchschnittlichen Abdeckungstiefe (vor dem Entfernen doppelter Lesevorgänge) von 150x pro Stichprobe führte, wobei 99,9 % der Lesevorgänge ausgerichtet waren und eine Zielrate von 78 % erreicht wurde. RNA-Sequenzierungsmetriken zeigten etwas mehr als 55 Millionen bp Paired-End-Lesevorgänge, eine Ausrichtungsrate von 98% und eine Duplizierungsrate von 19,4% mit 77% konkordanten Lesevorgängen.
Abbildung 1; Erfolgreiche Sezierung von Tumornestern aus frischem gefrorenem und FFPE-Gewebe. H & E färbte Maus frisch gefrorenes (A-D) und FFPE (E-L) Lebergewebe mit Darmkrebsmetastasen. 4-μm-Referenzfolien für die digitale Annotation (A, E, I) zeigen Beispiele mit einem niedrigen Tumoranteil für die gesamte Gewebefläche (I) und verteilte Tumornester (E), die klassischerweise Herausforderungen an die Tumoranreicherung darstellen. Kommentierte und digital maskierte H&E-Referenzobjektträger (B, F, J) wurden generiert und nach der Dissektion 10 μm (C, G, K) und 20 μm (D, H,L) H&E gefärbte Objektträger zeigen eine erfolgreiche Ernte ausgewählter Flächen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Datei 1: Pseudocode, der verwendet wird, um digitale Masken aus Anmerkungen zu erstellen, die in der automatisierten Sezierung verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Beispiel für erfasste Metriken aus der automatisierten Dissektion und Nukleinsäureextraktion. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Hier wird ein Protokoll für die Anwendung von digitaler Annotation und automatisierter Dissektion vorgestellt, um Tumorregionen von FFPE mit niedrigem Tumorgehalt oder frischem gefrorenem Gewebe für die Tumoranreicherung und den Einsatz in WES zu sezieren. Die Kombination von digitaler Annotation und Maskenerstellung mit automatisierter Dissektion reduziert die erforderliche praktische Zeit und das Know-how, die für klassische Methoden der Tumoranreicherung, einschließlich manueller Makrodissektion und LCM, üblich sind, erheblich. Das Protokoll zeigt eine potenziell wichtige Option zur Tumoranreicherung im mittleren Bereich, die nicht nur eine Anreicherung mit niedrigem Tumorgehalt ermöglicht, sondern auch eine Anreicherung in Fällen, in denen es schwierig ist, verteilte Tumornester außerhalb des Tumors neben normalem Gewebe zu sezieren, um eine sinnvolle Tumoranreicherung mit hohem Durchsatz und einem moderaten Maß an Präzision zu erreichen. Während die Verwendung unseres Workflows für Xenotransplantatgewebe mit niedrigem Tumorgehalt hier demonstriert wird, wurde auch festgestellt, dass dieses Protokoll über Gewebetypen hinweg funktioniert, einschließlich menschlicher, muriner und Xenotransplantatgewebe für eine Vielzahl von normalen Geweben und Krebsindikationen.
Daher könnte es auch für eine breite Palette von Anwendungen gelten, bei denen eine Anreicherung für bestimmte Regionen von Interesse ohne signifikante Kontamination des Hintergrundgewebes von Vorteil wäre (d. H. Für die Anreicherung für eine bestimmte Gehirnregion) oder sogar für die Entfernung von Gewebebereichen vor der Nukleinsäureextraktion mittels klassischer Makrodissektion.
Auf dem Markt gibt es viele Plattformen für Dia-Scanning und digitale Annotation. Es ist daher wichtig, sich darüber im Klaren zu sein, dass die Plattformkompatibilität Einschränkungen mit sich bringen kann und spezifizierte Plattformen innerhalb eines Protokolls möglicherweise nicht in allen Labors allgemein verfügbar sind. Daher wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um alternative Optionen innerhalb des beschriebenen Protokolls bereitzustellen, die die Benutzer bei der Durchführung erforderlicher Änderungen auf der Grundlage ihrer verfügbaren Ressourcen unterstützen. Eine Option zum Entfernen der digitalen Anmerkungskomponente wurde ebenfalls erwähnt, um eine sorgfältige manuelle Folienanmerkung zu ermöglichen. Die für Änderungen bereitgestellten Optionen maximieren die Fähigkeit der Benutzer, eine Option zu finden, die mit ihrer aktuellen Plattform- und Softwareverfügbarkeit funktioniert.
Während digitale Annotation und automatisierte Dissektion nachweislich sowohl auf FFPE als auch auf frisches gefrorenes Gewebe angewendet werden, ist es wichtig zu beachten, dass die Grenzen des automatisierten Gewebedissektionsinstruments über seine beabsichtigte Verwendung mit FFPE-Proben hinaus verschoben wurden und das Protokoll nur für Forschungszwecke gedacht ist. Hier wurde eine erfolgreiche Tumoranreicherung durch automatisierte Tumordissektion von FFPE mit niedrigem Tumorgehalt sowie frischem gefrorenem Gewebe für die Nukleinsäureextraktion, WES- und RNA-Sequenzierung demonstriert. Das Protokoll zeigt, dass Xenotransplantat- und menschliche Geweberegionen von Interesse vor der WES- und RNA-Sequenzierung in Grundlagen- und translationalen Forschungsumgebungen angereichert werden könnten, und stellt auch fest, dass andere nachgelagerte molekulare Anwendungen, einschließlich PCR, aus beiden Gewebetypen möglich wären. Das Protokoll erweitert die automatisierten FFPE-Dissektionsoptionen und legt den Grundstein für die automatisierte Dissektion von frischem gefrorenem Gewebe, die für den Einsatz in klinischen Umgebungen weiterentwickelt und validiert werden könnte.
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Disclosures
Charles A Havnar, Oliver Zill, Jeff Eastham, Jeffrey Hung, Jennifer Giltnane, Nicolas Lounsbury, Daniel Oreper, Sarajane Saturnio und Amy A Lo sind Mitarbeitende und Aktionäre von Genentech und Roche sowie Mana Javey und Emmanuel Naouri sind Mitarbeitende und Aktionäre von Roche.
Acknowledgments
Die Autoren danken Carmina Espiritu und Robin E. Taylor für ihre Unterstützung bei der Entwicklung automatisierter Dissektionen sowie den Mitarbeitern des Genentech Pathology Core Laboratory, die diese Arbeit unterstützt haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
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