Summary
Digital anteckning med automatiserad vävnadsdissektion ger ett innovativt tillvägagångssätt för att berika tumör i fall med lågt tumörinnehåll och är anpassningsbart till både paraffin- och frysta vävnadstyper. Det beskrivna arbetsflödet förbättrar noggrannhet, reproducerbarhet och genomströmning och kan tillämpas på både forskning och kliniska miljöer.
Abstract
Tumöranrikning i vävnader med lågt tumörinnehåll, de under 20% tumörinnehåll beroende på metod, krävs för att generera kvalitetsdata reproducerbart med många nedströmsanalyser, såsom nästa generations sekvensering. Automatiserad vävnadsdissektion är en ny metod som automatiserar och förbättrar tumöranrikning i dessa vanliga vävnader med lågt tumörinnehåll genom att minska den användarberoende oprecisionen av traditionell makrodissektion och tids-, kostnads- och expertisbegränsningar för laserfångstmikrodissektion genom att använda digital bildanteckningsöverlägg på oskyddade bilder. Här används digitala hematoxylin- och eosinanteckningar (H&E) för att rikta in sig på små tumörområden med hjälp av ett blad som är 250 μm2 i diameter i oskadad formalinfixerad paraffin inbäddad (FFPE) eller färska frysta sektioner upp till 20 μm i tjocklek för automatiserad tumöranrikning före nukleinsyraextraktion och hel exomsekvensering (WES). Automatiserad dissektion kan skörda kommenterade regioner i vävnader med lågt tumörinnehåll från enstaka eller flera sektioner för nukleinsyraextraktion. Det möjliggör också insamling av omfattande insamlingsmått före och efter skörd samtidigt som noggrannheten, reproducerbarheten och ökar genomströmningen med användning av färre bilder. Det beskrivna protokollet möjliggör digital anteckning med automatiserad dissektion på djur och / eller human FFPE eller färska frysta vävnader med lågt tumörinnehåll och kan också användas för alla regioner av intresseberikning för att öka tillräckligheten för nedströms sekvenseringsapplikationer i kliniska eller forskningsarbetsflöden.
Introduction
Nästa generations sekvensering (NGS) används alltmer för både patientvård och inom cancerforskning för att vägleda behandlingar och underlätta vetenskaplig upptäckt. Vävnaden är ofta begränsad och små prover med varierande tumörinnehåll används rutinmässigt. Tumörtillräcklighet och integritet förblir därför ett hinder för att erhålla meningsfulla data. Prover med lägre tumörprocent kan orsaka svårigheter att skilja sanna varianter från sekvenseringsartefakter och är ofta inte berättigade till NGS1. Tumöranrikning av fall med lågt tumörinnehåll, de under 20%, har visat sig hjälpa till att ge tillräckligt med material för att generera reproducerbara sekvenseringsdata och säkerställa att lågfrekventa varianter inte missas 2,3. Gränserna varierar dock beroende på vilka plattformar som används och planerad användning av de data som genereras.
Traditionellt utförs anrikning av tumörregioner för extraktion genom manuell makrodissektion eller laserfångningsmikrodissektion (LCM) av formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) glidbanor. Manuell makrodissektion, eller skrapning av specificerade vävnadsområden från objektglas, gör att tumörregioner kan avlägsnas för användning i nedströmsanalyser med relativt låg kostnad, men med låg noggrannhet och låg precision 2,4. Minimal teknisk noggrannhet kan vara mycket effektiv med fall med högre tumörinnehåll där stora delar av tumören är närvarande och / eller minimal vävnadsförlust påverkar inte signifikant resultaten, men fall med lågt tumörinnehåll eller fall med mer spridd tumör kräver ökad precision. LCM uppfanns därför på 1990-talet och blev ett värdefullt sätt att exakt ta bort små, definierade, mikroskopiska vävnadsregioner från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) glid 5,6,7,8. LCM kan användas för att samla in encellspopulationer när komplex heterogenitet hos provet finns9 vilket möjliggör insamling av tidigare svåra att separera cellpopulationer. LCM kräver dock kostsamma maskiner som kräver omfattande teknisk expertis och praktisk tid 10,11,12,13,14.
Instrumentet som används för automatiserad vävnadsdissektion har precision mellan LCM (~ 10 μm) och makrodissektioner (~ 1 mm)15. Dessutom uppvisar den både kostnads- och tekniska expertkrav mellan makrodissektion och LCM och är utformad för att utföra snabb vävnadsanrikning från sekventiella FFPE-objekt för att lindra nackdelarna med tidigare metoder15. Automatiserad dissektion på detta sätt använder digitala anteckningar eller bildreferensbildöverlägg på scenen på seriellt sektionerade oskadade vävnadsglas för dissekering och berikande regioner av intresse. Instrumentet använder frässpetsar av plastspinnblad, 1,5 ml uppsamlingsrör och kan användas med ett antal olika vätskor för dissektion för att samla in regioner av intresse för nedströmsanalyser inklusive nukleisk extraktion och sekvensering. Den snurrande plastfrässpetsen använder inre och yttre sprutfatsbehållare och en kolv för att samla buffert, sedan kvarn och samlar vävnad16. Den variabla frässpetsstorlekens diameter (250 μm, 525 μm, 725 μm) kan möjliggöra dissektion av separata vävnadsområden för jämförelse, multifokala regioner som kan poolas eller enskilda små områden från enstaka eller flera FFPE-objektglas. Sektionstjocklekar som används för skörd kan justeras baserat på individuella experimentbehov och användare kan säkerställa att regioner av intresse inte har tömts genom att utföra ytterligare ett H&E på en seriell sektion omedelbart efter den sista sektionen som används för skörd.
Automatiserad dissektion identifierades som ett sätt att berika tumörinnehållet i fall med lågt tumörinnehåll och vi testade och utökade den avsedda funktionaliteten hos ett automatiserat vävnadsdissektionsinstrument, som för närvarande marknadsförs för användning på FFPE-kliniska prover upp till 10 μm i tjocklek. Arbetet visar att automatiserad dissektion kan appliceras på både FFPE och färska frysta vävnadssektioner för människor eller djur upp till 20 μm i tjocklek för forskningsändamål. Protokollet visar också ett tillvägagångssätt för att digitalt kommentera och automatisera dissektion för tumöranrikning i vävnader med lågt tumörinnehåll och / eller fall med kapslad, dispergerad tumör där meningsfull makrodissektion är utmanande eller inte genomförbar och visar både kvalitet och utbyte av nukleinsyra som är tillräcklig för NGS. Automatiserad dissektion kan därför ge precision på mellannivå och ökad genomströmning för tumöranrikning och kan också tillämpas för att berika andra regioner av intresse eller kombineras med andra plattformar för att svara på forskning eller kliniska frågor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Före initiering, skaffa lämpliga vävnadsprover enligt Institutional Review Board (IRB) protokoll. Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i Genentech, Inc.
1. Vävnads- och glidberedning
- Välj FFPE eller färska frysta vävnadsblock och använd motsvarande bearbetningsmetod nedan.
- Skär vävnadsblocksektioner på positivt laddade glasskivor med önskad tjocklek. Seriedela FFPE-vävnaden i band med den första referenssektionen skuren med en tjocklek som är lämplig för H&E-färgning (dvs. 4 μm) följt av 1-4 sektioner med en tjocklek som sträcker sig från 4-20 μm baserat på behovet och vävnadstillgängligheten. Samla vävnadssektionerna på positivt laddade glasmikroskopglas.
OBS: Färska frysta referensvävnadssektioner ska omedelbart färgas med hematoxylin och eosin (H&E) med hjälp av rutinprotokoll för frysta sektioner och de ostoppade frysta sektionerna som hålls vid -20 °C tills de behövs för skörd. - Låt alla FFPE-sektioner torka vid rumstemperatur över natten.
- Grädda FFPE-referensglasen vid 60 °C i 30 minuter och färga sedan med H&E med hjälp av rutinprotokoll.
- Skanna de H&E-färgade bilderna på en hel bildbildare med 20x förstoring eller mer.
- Kommentera de skannade bilderna för tumörregioner av intresse med hjälp av en leverantörs tillhandahållen visningsplattform eller visningsprogram med öppen källkod. Exportera dessa anteckningar som antingen en skärmbild med låg förstoring eller spara dem som en metadatafil som innehåller XY-pixelkoordinater som motsvarar polygonhörn.
OBS: Den förra är mindre tekniskt utmanande att arbeta med, men den senare erbjuder fördelar inom processautomatisering. - Skapa digitala masker av de kommenterade regionerna av intresse i linje med den metod som används och exportera de manuella anteckningarna.
OBS: Om en skärmdump / bild av anteckningarna används kan enkel bildbehandlingsprogramvara användas för att välja en region och för att fylla i hela urvalet. Att använda X-Y-koordinater för varje ROI kräver användning av ett programmeringsspråk för att läsa både bilddata och polygonkoordinater för att skapa en lågmag-bild med ifyllda områden av intresse. Användaren bör arbeta med leverantören av automatiserade dissektionsinstrument för att upprätta en process baserat på deras individuella programvarutillgänglighet och behov. Om skanning, digital bildanteckning och/eller skapande av digital mask inte är tillgängligt kan noggrann anteckning på bilden med hjälp av en markör utföras och användas i stället för en digital mask som referensbild. Pseudokod för skapande av digital mask har tillhandahållits i tilläggsfil 1.
2. Automatiserad vävnadsdissektion
- Placera de oskyddade provvävnadsglasen på scenen i den första till fjärde bildpositionen när du använder digital bildreferens. När du använder anteckningar på bilden i stället för ett digitalt alternativ placerar du de oskyddade provvävnadsbilderna på scenen i den andra till fjärde bildpositionen med en referensbild i den första positionen.
- Skapa ett fräsningsjobb med hjälp av den automatiserade mjukpappersdissektionsprogramvaran: Jobbval > Skapa nytt jobb > Ärende-ID > Namnge fräsningsjobbet; gå till Tjocklek > Sektionstjocklek med hjälp av upp- eller nedpilfliken; gå sedan till Vävnadsberedning > paraffiniserad eller deparaffiniserad, referensbild > från fil > Importera bild > fil för att importera från rullgardinsmenyn som digital referens, om tillämpligt. Välj Från scen för bildreferens på scenen. När fälten är klara skannar du scenen genom att välja knappen Skanna scen i det nedre högra hörnet för att fånga varje provvävnadsbild i den första till fjärde positionen.
- Välj vävnadsområdet för bildtagning.
- Om du använder en scenreferens drar du rutan från ett hörn till det motsatta för att skapa ett rektangulärt område över vävnaden. Välj den cirkulära bubblan under det rektangulära området för att fånga scenreferensbilden. Om du använder en digital referensbild lägger du över bilden på det rektangulära område som valts. Ändra storlek på och justera den digitala referensen grovt i kurszoom för att bäst matcha storleken och positionen över provvävnaden.
- Kopiera det här rektangelfältet till återstående provvävnadsbilder i den andra till fjärde bildpositionen genom att välja kopieringsalternativet i det övre högra hörnet av referensbilden. Justera och ändra storlek grovt efter behov.
När du använder en referensbild på bilden i stället för en digital mask väljer du vilken bild på scenen som ska användas som referens.
- Justera referens- och exempelbilderna
- När referensbilden är grovt justerad på vävnadsprovsbilder i alla bildpositioner väljer du knappen Skanna scen i det nedre högra hörnet av skärmen för att gå till finjusteringssteget. Välj den första scenens position och ikonen för verktyget Omforma (den tredje ikonen nere i verktygsfältet till höger) om du vill göra finjusteringar och zoomjusteringar av referensen så att den bäst matchar exempelbildöverlägget. Använd skjutfältet Referens till exempel längst ned på skärmen och växla mellan referensbild och exempelbild tillsammans med funktionen Zooma in och zooma ut för att justera och uppnå justering av varje bildposition. Replikera den här processen i den andra till fjärde exempelbildpositionen.
- Välj fräsområde för intresseområde
- När optimalt provöverlägg av var och en av de fyra bildpositionerna har uppnåtts ritar du fräsningsbanebeteckningar med hjälp av verktygsikonen för färgväljaren (den tionde ikonen nere i det högra verktygsfältet) på den färgade delen av den maskerade referensbilden. Markera rutan Utöka till liknande om flera bilder eller områden har kommenterats för dissektion och välj sedan knappen Hämta anteckningar längst ned till höger för att rita fräsningsbanor på exempelbilder.
- Markera fräsbanan i den första bildpositionen.
OBS: När fräsbanan är vald i den första bildpositionen kopieras den till de återstående glidpositionerna och frässpetsens användning beräknas. Användningen av frässpetsen i det övre vänstra hörnet beräknas baserat på det område som omfattas och den valda spetsstorleken. Om fler än fyra tips beräknas kan en större spetsstorlek väljas för att fånga den kommenterade avkastningen. Spetsstorlek kan väljas eller ändras på vänster sida av skärmen under frässpetspilen och spetsanvändningen kommer att beräknas om. - När fräsningsbanan beräknas samlar du in den kommenterade avkastningen med fyra eller färre frästips. Välj knappen Inställningssteg längst ned till höger på skärmen för att uppmana till laddning av frässpetsar från placerade uppsamlingsrör i rätt beteckning på scenen.
- Fyll behållaren med 3,0 ml av den dissektionsbuffert som är lämpligast för vävnadstypen (FFPE eller färskfryst) och nedströms nukleinsyraextraktionssatsen och välj dissekera-knappen i skärmens nedre högra hörn. Använd mineralolja av molekylär kvalitet eller en lämplig buffert från kommersiellt tillgängliga nukleinsyraextraktionssatser.
OBS: Automatiserad dissektion av objekt och utvalda regioner av intresse börjar sedan och prover samlas in av instrumentet. Enhetshuvudet tar upp frässpetsar från baksidan av scenen och fylls med dissektionsvätska från behållaren. Spetsar snurrar sedan längs fräsvägen och suger provvävnad från objektglas tills de är färdiga eller fulla. Det uppsamlade provet med dissektionsvätska doseras sedan i uppsamlingsrör som är placerade på baksidan av scenen. - När den automatiska dissektioneringen är klar tar du bort uppsamlingsrören och de dissekerade provglasen från scenen och placerar dem i ett rörställ respektive glidställ.
OBS: Färska frysta skördar ska tas direkt i nukleinsyraextraktion enligt tillverkarens instruktioner och efter dissektion bör färska frysta sektioner H&E-färgas omedelbart med hjälp av rutinprotokoll för frysta sektioner. - Grädda de efterskurna vävnadsglasen vid 60 °C i 30 minuter och färga sedan med H&E med hjälp av rutinprotokoll.
- Skanna inlägget dissekerade H&E-färgade bilder på en hel bildbildare med 20x förstoring och / eller arkiv för en referens av vilken vävnad som inte samlades in och förblir på bilden.
OBS: Se steg 1.5 ovan för alternativa skanningsalternativ.
3. Extraktion av nukleinsyra
- Poola och pelletera vävnaden. Utför nukleinsyraextraktionen med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit och följ tillverkarens instruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FFPE och FF mus leversektioner innehållande metastaserande kolorektal cancer hos xenografter valdes. Sektionerna var H&E-färgade (figur 1A,E,I) och skannade på en hel bildbildare med 20x förstoring. En patolog digitalt kommenterade tumörregioner av intresse och en mask genererades med hjälp av kommersiell programvara och formaterades som en digital png-referensbild (figur 1B, F, J). Seriella 10 μm och 20 μm tjocka ostoppade provglas placerades på scenen och automatiserad dissektion utfördes enligt beskrivningen ovan. Färska frysta vävnader samlades in i en lysbuffert från ett kommersiellt tillgängligt kit och transporterades direkt till nukleinsyraextraktion enligt tillverkarens instruktioner. FFPE-prover samlades in med hjälp av mineralolja av molekylär kvalitet och dissekerade prover slogs samman och centrifugerades vid 25 000 x g i 20 minuter vid 4 °C. Supernatanten avlägsnades och den minimala mineralolja som krävdes användes för att återsuspendera, överföra och samla den dissekerade vävnaden i ett enda uppsamlingsrör för varje prov på lämpligt sätt. Prover skickades vid rumstemperatur till en leverantör för nukleinsyraextraktion, RNA- och DNA-storlek, kvantitet, integritet och renhetsbestämning enligt tillverkarens instruktioner. Sekvenseringsbibliotek skapades och användes för hybridisering och inspelning med kommersiella alternativ enligt tillverkarens instruktioner. Efter dissekerade provglas färgades H&E med hjälp av rutinmässiga färgningsprotokoll för att bekräfta dissektionsområden i 10 μm (figur 1C, G, K) och 20 μm (figur 1D, H, L) bilder och dissektionsmått fångades (tilläggstabell 1). Exomsekvensering genererade cirka 75 miljoner 100 bp parade avläsningar, vilket gav ett genomsnittligt täckningsdjup (innan du tar bort dubbla avläsningar) på 150 gånger per prov, med 99,9% läsningar justerade och en 78% målfrekvens. RNA-sekvenseringsmått visade drygt 55 miljoner bp-parade slutläsningar, en 98% anpassningshastighet och en 19.4% dupliceringsgrad med 77% överensstämmande läsningar.
Figur 1; Framgångsrik dissektion av tumörbon från färsk frusen och FFPE-vävnad. H&E-färgad mus färskfryst (A-D) och FFPE (E-L) levervävnad med kolorektal cancermetastas. 4 μm referensglas som används för digital annotering (A, E, I) visar exempel med låg tumörprocent för det totala vävnadsområdet (I) och distribuerade tumörbon (E) som klassiskt presenterar utmaningar för tumöranrikning. Kommenterade och digitalt maskerade H&E-referensglas (B, F, J) genererades och efter dissektion 10 μm (C, G, K) och 20 μm (D, H,L) H&E-färgade diabilder visar framgångsrik skörd av utvalda områden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1: Pseudokod som används för att skapa digitala masker från anteckningar för användning vid automatiserad dissektion. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 1: Exempel på fångade mätvärden från automatiserad dissektion och nukleinsyraextraktion. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenteras ett protokoll för tillämpning av digital annotering och automatiserad dissektion för att dissekera tumörregioner från lågt tumörinnehåll FFPE eller färska frysta vävnader för tumöranrikning och användning i WES. Att kombinera digital anteckning och maskskapande med automatiserad dissektion minskar avsevärt den nödvändiga praktiska tiden och expertisen som är gemensam för klassiska metoder för tumöranrikning inklusive manuell makrodissektion och LCM. Protokollet visar ett potentiellt viktigt alternativ för tumöranrikning i mellanklass som möjliggör inte bara anrikning av lågt tumörinnehåll utan också anrikning i fall där det är utmanande att dissekera distribuerade tumörbon bort från tumören intilliggande normal vävnad för meningsfull tumöranrikning med hög genomströmning och en måttlig precisionsnivå. Medan användningen av vårt arbetsflöde för xenograftvävnader med lågt tumörinnehåll demonstreras här, fann man också att detta protokoll fungerar över vävnadstyper, inklusive mänskliga, murina och xenograftvävnader för en mängd normala vävnader och cancerindikationer.
Därför kan det också tillämpas på ett brett spektrum av applikationer där anrikning för specifika regioner av intresse utan betydande kontaminering av bakgrundsvävnad skulle vara fördelaktigt (dvs. att berika för en specifik hjärnregion) eller till och med för avlägsnande av vävnadsområden före nukleinsyraextraktion med klassisk makrodissektion.
Många plattformar finns på marknaden för bildskanning och digital anteckning. Det är därför viktigt att vara medveten om att plattformskompatibilitet kan medföra begränsningar och att specificerade plattformar inom något protokoll kanske inte är allmänt tillgängliga i alla laboratorier. Därför gjordes betydande ansträngningar för att tillhandahålla alternativa alternativ inom det beskrivna protokollet som kommer att vägleda användare att göra nödvändiga ändringar baserat på deras tillgängliga resurser. Ett alternativ för att ta bort den digitala anteckningskomponenten har också noterats för att möjliggöra noggrann manuell anteckning på bilden. Alternativen för ändringar maximerar användarnas förmåga att hitta ett alternativ som fungerar med deras nuvarande plattform och programvarutillgänglighet.
Medan digital anteckning och automatiserad dissektion har visat sig tillämpas brett på både FFPE och färsk fryst vävnad, är det viktigt att notera att gränserna för det automatiserade vävnadsdissektionsinstrumentet har skjutits utöver dess avsedda användning med FFPE-prover och protokollet är endast avsett för forskningsanvändning. Här demonstrerades framgångsrik tumöranrikning genom automatiserad tumördissektion av lågt tumörinnehåll FFPE samt färska frysta vävnader för nukleinsyraextraktion, WES- och RNA-sekvensering. Protokollet visar att xenograft- och humanvävnadsregioner av intresse kan berikas före WES- och RNA-sekvensering i grundläggande och translationella forskningsmiljöer och noterar också att andra nedströms molekylära applikationer, inklusive PCR, från båda vävnadstyperna skulle vara möjliga. Protokollet utökar FFPE automatiserade dissektionsalternativ och lägger grunden för färsk fryst vävnadsautomatisk dissektion som kan utvecklas och valideras ytterligare för användning i kliniska miljöer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Charles A Havnar, Oliver Zill, Jeff Eastham, Jeffrey Hung, Jennifer Giltnane, Nicolas Lounsbury, Daniel Oreper, Sarajane Saturnio och Amy A Lo är anställda och aktieägare i Genentech och Roche och Mana Javey och Emmanuel Naouri är anställda och aktieägare i Roche.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Carmina Espiritu och Robin E. Taylor för deras stöd i automatiserad dissektionsutveckling samt Genentech Pathology Core Laboratory-personalen som stödde detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al.
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).
