Summary
Digital annotation med automatiseret vævsdissektion giver en innovativ tilgang til berigelse af tumor i tilfælde med lavt tumorindhold og kan tilpasses både paraffin og frosne vævstyper. Den beskrevne arbejdsgang forbedrer nøjagtighed, reproducerbarhed og gennemløb og kan anvendes til både forskning og kliniske indstillinger.
Abstract
Tumorberigelse i væv med lavt tumorindhold, dem under 20% tumorindhold afhængigt af metoden, er påkrævet for at generere kvalitetsdata reproducerbart med mange downstream-assays såsom næste generations sekventering. Automatiseret vævsdissektion er en ny metode, der automatiserer og forbedrer tumorberigelse i disse almindelige væv med lavt tumorindhold ved at reducere den brugerafhængige upræcision af traditionel makrodissektion og tids-, omkostnings- og ekspertisebegrænsninger ved laserfangstmikrodissektion ved hjælp af digital billedannoteringsoverlejring på ikke-opnåede dias. Her bruges digitale hæmatoxylin- og eosinannoteringer (H&E) til at målrette mod små tumorområder ved hjælp af et blad, der er 250 μm2 i diameter i ufarvet formalinfast paraffinindlejret (FFPE) eller friske frosne sektioner op til 20 μm i tykkelse til automatiseret tumorberigelse inden nukleinsyreekstraktion og hel exom-sekventering (WES). Automatiseret dissektion kan høste kommenterede regioner i væv med lavt tumorindhold fra enkelte eller flere sektioner til nukleinsyreekstraktion. Det giver også mulighed for registrering af omfattende indsamlingsmålinger før og efter høst, samtidig med at nøjagtigheden, reproducerbarheden og gennemstrømningen øges med udnyttelse af færre dias. Den beskrevne protokol muliggør digital annotation med automatiseret dissektion på animalsk og / eller human FFPE eller frisk frosset væv med lavt tumorindhold og kan også bruges til enhver region af interesseberigelse for at øge tilstrækkeligheden til downstream-sekventeringsapplikationer i kliniske eller forskningsmæssige arbejdsgange.
Introduction
Næste generations sekventering (NGS) bruges i stigende grad til både patientpleje og kræftforskning for at hjælpe med at guide behandlinger og lette videnskabelig opdagelse. Væv er ofte begrænset, og små prøver med variabelt tumorindhold anvendes rutinemæssigt. Tumortilstrækkelighed og integritet forbliver derfor en barriere for at opnå meningsfulde data. Prøver med lavere tumorprocenter kan forårsage vanskeligheder med at skelne sande varianter fra sekventeringsartefakter og er ofte ikke berettiget til NGS1. Tumorberigelse af tilfælde med lavt tumorindhold, dem under 20%, har vist sig at hjælpe med at give tilstrækkeligt materiale til at generere reproducerbare sekventeringsdata og sikre, at lavfrekvente varianter ikke savnes 2,3. Grænserne vil dog variere afhængigt af de anvendte platforme og planlagt brug af de genererede data.
Traditionelt udføres berigelse af tumorregioner til ekstraktion ved manuel makrodissektion eller laserfangst mikrodissektion (LCM) af formalinfast paraffin indlejret (FFPE) dias. Manuel makrodissering eller skrabning af specificerede vævsområder fra dias gør det muligt at fjerne tumorområder til brug i downstream-assays med relativt lave omkostninger, men med lav nøjagtighed og lav præcision 2,4. Minimal teknisk nøjagtighed kan være meget effektiv med tilfælde med højere tumorindhold, hvor store tumorskår er til stede og / eller minimalt vævstab ikke påvirker resultaterne væsentligt, men tilfælde med lavt tumorindhold eller tilfælde med mere dispergeret tumor kræver øget præcision. LCM blev derfor opfundet i 1990'erne og blev en værdifuld måde at præcist fjerne små, definerede, mikroskopiske vævsområder fra formalinfast paraffin indlejret (FFPE) dias 5,6,7,8. LCM kan bruges til at indsamle enkeltcellepopulationer, når der findes kompleks heterogenitet af prøven9, hvilket giver mulighed for indsamling af tidligere vanskelige at adskille cellepopulationer. LCM kræver dog dyre maskiner, der kræver omfattende teknisk ekspertise og praktisk tid 10,11,12,13,14.
Instrumentet, der anvendes til automatiseret vævsdissektion, har præcision mellem LCM (~ 10 μm) og makrodissektion (~ 1 mm)15. Derudover udviser den både omkostnings- og tekniske ekspertisekrav mellem makrodissering og LCM og er designet til at udføre hurtig vævsberigelse fra sekventielle FFPE-dias for at afhjælpe ulemperne ved tidligere metoder15. Automatiseret dissektion på denne måde bruger digitale annoteringer eller billedoverlejringer på scenen på serielt sektionerede ufarvede vævsdias til dissekering og berigelse af interesseområder. Instrumentet bruger plastspindefræsespidser, 1,5 ml opsamlingsrør og kan bruges med en række forskellige væsker til dissektion for at indsamle områder af interesse for downstream-assays inklusive nukleinsyreekstraktion og sekventering. Den roterende plastfræsespids bruger indre og ydre sprøjtetøndereservoirer og et stempel til opsamling af buffer, derefter møller og opsamler væv16. Den variable fræsespidsstørrelsesdiameter (250 μm, 525 μm, 725 μm) kan muliggøre dissektion af separate vævsområder til sammenligning, multifokale regioner, der kan samles eller individuelle små områder fra enkelte eller flere FFPE-dias. Sektionstykkelser, der anvendes til høst, kan justeres ud fra individuelle forsøgsbehov, og brugerne kan sikre, at områder af interesse ikke er blevet udtømt ved at udføre en ekstra H&E på en seriel sektion umiddelbart efter den sidste sektion, der blev brugt til høst.
Automatiseret dissektion blev identificeret som en måde at berige tumorindhold i tilfælde med lavt tumorindhold, og vi testede og udvidede den tilsigtede funktionalitet af et automatiseret vævsdissektionsinstrument, som i øjeblikket markedsføres til brug på FFPE kliniske prøver op til 10 μm i tykkelse. Arbejdet viser, at automatiseret dissektion kan anvendes på både FFPE og friske frosne humane eller animalske vævssektioner op til 20 μm i tykkelse til forskningsformål. Protokollen demonstrerer også en tilgang til digitalt at kommentere og automatisere dissektion til tumorberigelse i væv med lavt tumorindhold og / eller tilfælde med indlejret, dispergeret tumor, hvor meningsfuld makrodissektion er udfordrende eller ikke mulig og viser både kvalitet og udbytte af nukleinsyre, der er tilstrækkelig til NGS. Automatiseret dissektion kan derfor give præcision på mellemniveau og øget gennemstrømning til tumorberigelse og kan også anvendes til at berige andre regioner af interesse eller kombineres med andre platforme til at besvare forskning eller kliniske spørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før initiering skal du indhente passende vævsprøver i henhold til Institutional Review Board (IRB) protokoller. Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i Genentech, Inc.
1. Forberedelse af væv og dias
- Vælg FFPE eller friske frosne vævsblokke, og brug den tilsvarende behandlingsmetode nedenfor.
- Skær vævsbloksektioner på positivt ladede glasglas i den ønskede tykkelse. Seriel sektion FFPE væv i bånd med den første reference sektion skåret i en tykkelse, der passer til H&E farvning (dvs. 4 μm) efterfulgt af 1-4 sektioner i en tykkelse fra 4-20 μm baseret på behovet og vævets tilgængelighed. Saml vævssektionerne på positivt ladede glasmikroskopglas.
BEMÆRK: Friske frosne referencevævssektioner skal straks farves med hæmatoxylin og Eosin (H&E) ved hjælp af rutineprotokoller for frosne sektioner og de ufarvede frosne sektioner, der holdes ved -20 ° C, indtil de er nødvendige til høst. - Lad alle FFPE-sektioner tørre ved stuetemperatur natten over.
- Bag FFPE-referenceglassene ved 60 °C i 30 minutter, og plet derefter med H&E ved hjælp af rutineprotokoller.
- Scan de H&E-farvede dias på et helt diasbillede ved 20x forstørrelse eller derover.
- Kommenter de scannede diasbilleder for tumorområder af interesse ved hjælp af en leverandørleveret visningsplatform eller open source-fremviser. Eksporter disse anmærkninger som enten et skærmbillede med lav forstørrelse, eller gem dem som en metadatafil, der indeholder X-Y-pixelkoordinater, der svarer til polygonhjørner.
BEMÆRK: Førstnævnte er mindre teknisk udfordrende at arbejde med, men sidstnævnte giver fordele inden for procesautomatisering. - Opret digitale masker af de kommenterede interesseområder i overensstemmelse med den anvendte fremgangsmåde, og eksporter de manuelle anmærkninger.
BEMÆRK: Hvis der bruges et skærmbillede / billede af kommentarerne, kan simpel billedbehandlingssoftware bruges til at vælge en region og udfylde hele markeringen. Brug af X-Y-koordinater for hvert investeringsafkast kræver brug af et programmeringssprog til at læse både billeddata og polygonkoordinater for at skabe et lav-mag-billede med udfyldte interesseområder. Brugeren skal arbejde med leverandøren af automatiserede dissektionsinstrumenter for at etablere en proces baseret på deres individuelle softwaretilgængelighed og behov. Hvis scanning, digital diasannotering og/eller oprettelse af digital maske ikke er tilgængelig, kan omhyggelig annotering på dias ved hjælp af en markør udføres og bruges i stedet for en digital maske som referencebillede. Pseudokode til oprettelse af digital maske er angivet i supplerende fil 1.
2. Automatiseret vævsdissektion
- Placer de ufarvede prøvevævsglider på scenen i første til fjerde diasposition, når du bruger digital diasreference. Når du bruger annotering på dias i stedet for en digital indstilling, skal du placere de ufarvede prøvevævsglider på scenen i anden til fjerde diasposition med et referencedias i første position.
- Opret et fræsejob ved hjælp af den automatiserede vævsdissektionssoftware: Job selection > Opret nyt job > sags-id > Navngiv fræsejobbet; gå til Tykkelse > sektion Tykkelse ved hjælp af fanen pil op eller pil ned; gå derefter til Tissue Preparation > Paraffinized or Deparaffinized, Reference Image > From File > Import Image > File for at importere fra rullemenuen som den digitale reference, hvis det er relevant. Vælg Fra fase for slidereference på scenen. Når felterne er færdige, skal du scanne trinnet ved at vælge knappen Scan fase i nederste højre hjørne for at registrere hvert prøvevævsslid i første til fjerde position.
- Vælg vævsområdet til billedoptagelse.
- Hvis du bruger en reference på scenen, skal du trække boksen fra det ene hjørne til det modsatte for at oprette et rektangulært område over væv. Vælg den cirkulære boble under det rektangulære område for at fange scenereferencebilledet. Hvis du bruger et digitalt referencebillede, skal du overlejre billedet på det valgte rektangulære område. Tilpas størrelsen og juster den digitale reference groft i kursuszoom, så den passer bedst til størrelsen og placeringen over prøvevævet.
- Kopiér dette rektangelfelt til resterende udsnitsservietter i den anden til fjerde slideposition ved at vælge kopieringsindstillingen i øverste højre hjørne af referencebilledet. Juster og tilpas størrelsen groft efter behov.
BEMÆRK: Når du bruger et referencebillede på dias i stedet for en digital maske, skal du vælge, hvilket dias på scenen der skal bruges som reference.
- Justere reference- og eksempeldias
- Når referencebilledet er groft justeret på vævsprøvedias i alle diaspositioner, skal du vælge knappen Scan trin i nederste højre hjørne af skærmen for at gå ind i finjusteringstrinnet. Vælg placeringen af første trin og ikonet Transformer værktøj (det tredje ikon nede på værktøjslinjen til højre) for at foretage finjustering og zoomjusteringer af referencen, så den passer bedst til eksempeldiasoverlejringen. Brug glidebjælken Reference til eksempel nederst på skærmen, der skifter mellem referencebillede og eksempelbillede sammen med funktionen Zoom ind og Zoom ud , til at justere og opnå justering af hver diasposition. Repliker denne proces i den anden til fjerde prøve diaspositioner.
- Vælg fræsningsområdet for interesseområde
- Når den optimale prøveoverlejring af hver af de fire slidepositioner er opnået, skal du tegne fræsebanebetegnelser ved hjælp af værktøjsikonet Farvevælger (det tiende ikon nede i værktøjslinjen til højre) på den farvede del af det maskerede referencebillede. Markér feltet Udvid til lignende, hvis flere slides eller områder er anmærket til dissektion, og vælg derefter knappen Hent anmærkninger nederst til højre for at tegne fræsestier på eksempeldias.
- Vælg fræsekurven i den første slideplacering.
BEMÆRK: Når fræsebanen er valgt i den første diasposition, kopieres den til de resterende diaspositioner, og brugen af fræsespidser beregnes. Fræsespidsforbruget i øverste venstre hjørne beregnes ud fra det dækkede areal og den valgte spidsstørrelse. Hvis der beregnes mere end fire tip, kan der vælges en større tipstørrelse for at fange det kommenterede investeringsafkast. Tipstørrelsen kan vælges eller ændres i venstre side af skærmen under pilen Fræsespids , og spidsforbruget genberegnes. - Når fræsestien beregnes, skal du indsamle det kommenterede investeringsafkast med fire eller færre fræsespidser. Vælg knappen Opsætningsfase nederst til højre på skærmen for at bede om indlæsning af fræsespidser fra placerede opsamlingsrør i deres korrekte betegnelse på scenen.
- Fyld reservoiret med 3,0 ml af den dissektionsbuffer, der er mest passende til vævstypen (FFPE eller frisk frosset) og nedstrøms nukleinsyreekstraktionssæt, og vælg dissekeringsknappen i nederste højre hjørne af skærmen. Brug mineralolie af molekylær kvalitet eller en passende buffer fra kommercielt tilgængelige nukleinsyreekstraktionssæt.
BEMÆRK: Automatiseret dissektion af dias og udvalgte regioner af interesse begynder derefter, og prøver indsamles af instrumentet. Enhedshovedet henter fræsespidser fra bagsiden af scenen og fyldes med dissektionsvæske fra reservoiret. Spidser spinder derefter langs fræsestien, der aspirerer prøvevæv fra dias, indtil det er færdigt eller fuldt. Den opsamlede prøve med dissektionsvæske dispenseres derefter i opsamlingsrør placeret bagerst på scenen. - Når den automatiserede dissektion er afsluttet, fjernes opsamlingsrørene og de dissekerede prøveglas fra scenen og placeres i henholdsvis et rørstativ og et glideretable.
BEMÆRK: Friske frosne høste skal tages direkte i nukleinsyreekstraktion i henhold til producentens anvisninger, og friske frosne sektioner efter dissektion skal H&E-farves straks ved hjælp af rutineprotokoller for frosne sektioner. - Bag de post dissekerede vævsglas ved 60 ° C i 30 minutter og plet derefter med H&E ved hjælp af rutinemæssige protokoller.
- Scan de post dissekerede H&E farvede dias på et helt diasbillede ved 20x forstørrelse og / eller arkiv for en reference til, hvilket væv der ikke blev indsamlet og forbliver på diaset.
BEMÆRK: Se trin 1.5 ovenfor for alternative scanningsmuligheder.
3. Nukleinsyreekstraktion
- Pool og pellet vævet. Udfør nukleinsyreekstraktionen ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt sæt og følg producentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FFPE- og FF-museleverafsnit indeholdende metastatisk kolorektal cancer i xenotransplantater blev valgt. Sektioner blev H&E farvet (figur 1A, E, I) og scannet på et helt diasbillede ved 20x forstørrelse. En patolog kommenterede digitalt tumorområder af interesse, og en maske blev genereret ved hjælp af kommerciel software og formateret som et digitalt png-referencebillede (figur 1B, F, J). Serielle 10 μm og 20 μm tykke ufarvede prøveglas blev anbragt på scenen, og automatiseret dissektion blev udført som beskrevet ovenfor. Frisk frosset væv blev opsamlet i en lysisbuffer fra et kommercielt tilgængeligt kit og transporteret direkte til nukleinsyreekstraktion efter producentens anvisninger. FFPE-prøver blev indsamlet ved hjælp af mineralsk mineralolie af molekylær kvalitet, og dissekerede prøver blev samlet sammen og centrifugeret ved 25.000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Supernatanten blev fjernet, og den minimale mineralolie, der kræves, blev brugt til at resuspendere, overføre og samle det dissekerede væv i et enkelt opsamlingsrør for hver prøve korrekt. Prøver blev sendt ved stuetemperatur til en leverandør til nukleinsyreekstraktion, RNA- og DNA-dimensionering, mængde, integritet og renhedsbestemmelse efter producentens anvisninger. Sekventeringsbiblioteker blev oprettet og brugt til hybridisering og optagelse med kommercielle muligheder efter producentens anvisninger. Post dissekerede prøvedias blev H&E farvet ved hjælp af rutinemæssige farvningsprotokoller for at bekræfte dissektionsområder i 10 μm (figur 1C, G, K) og 20 μm (figur 1D, H, L) dias og dissektionsmålinger blev fanget (supplerende tabel 1). Exome-sekventering genererede ca. 75 millioner 100 bp-parrede endelæsninger, hvilket gav en gennemsnitlig dækningsdybde (før fjernelse af duplikatlæsninger) på 150x pr. prøve med 99.9% aflæsninger justeret og en 78% on-target rate. RNA-sekventeringsmålinger viste lidt over 55 millioner bp-parrede aflæsninger, en justeringshastighed på 98% og en duplikeringsrate på 19,4% med 77% konkordante læsninger.
Figur 1; Vellykket dissektion af tumor reden fra frisk frosset og FFPE væv. H&E farvet mus frisk frossen (A-D) og FFPE (E-L) levervæv med kolorektal cancer metastase. 4 μm referencedias anvendt til digital annotation (A, E, I) demonstrerer eksempler med en lav tumorprocent for det samlede vævsområde (I) og distribuerede tumorreder (E), der klassisk giver udfordringer for tumorberigelse. Kommenterede og digitalt maskerede H&E-referencedias (B, F, J) blev genereret, og efter dissektion 10 μm (C, G, K) og 20 μm (D, H, L) H&E-farvede dias demonstrerer vellykket høst af udvalgte områder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Pseudokode bruges til at oprette digitale masker fra annoteringer til brug i automatiseret dissektion. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Eksempel på indfangede målinger fra automatiseret dissektion og nukleinsyreekstraktion. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Præsenteret her er en protokol til anvendelse af digital annotation og automatiseret dissektion til at dissekere tumorregioner fra ffpe med lavt tumorindhold eller friske frosne væv til tumorberigelse og anvendelse i WES. Ved at kombinere digital annotation og maskeoprettelse med automatiseret dissektion reduceres den krævede praktiske tid og ekspertise, der er fælles for klassiske metoder til tumorberigelse inklusive manuel makrodissektion og LCM, betydeligt. Protokollen demonstrerer en potentielt vigtig mellemklasse tumorberigelsesmulighed, der ikke kun giver mulighed for berigelse af lavt tumorindhold, men også berigelse i tilfælde, hvor det er udfordrende at dissekere distribuerede tumorreder væk fra tumoren tilstødende normalt væv til meningsfuld tumorberigelse med høj gennemstrømning og et moderat præcisionsniveau. Mens brugen af vores arbejdsgang for xenograftvæv med lavt tumorindhold demonstreres her, blev det også konstateret, at denne protokol fungerer på tværs af vævstyper, herunder humant, murin og xenograftvæv til en række normale væv og kræftindikationer.
Det kan derfor også finde anvendelse på en bred vifte af anvendelser, hvor berigelse til specifikke regioner af interesse uden væsentlig forurening af baggrundsvæv ville være gavnligt (dvs. at berige for en bestemt hjerneregion) eller endda til fjernelse af vævsområder inden nukleinsyreekstraktion ved hjælp af klassisk makrodissektion.
Der findes mange platforme på markedet til diasscanning og digital annotation. Det er derfor vigtigt at være opmærksom på, at platformskompatibilitet kan medføre begrænsninger, og at bestemte platforme inden for enhver protokol muligvis ikke er bredt tilgængelige i alle laboratorier. Derfor blev der gjort en betydelig indsats for at give alternative muligheder inden for den beskrevne protokol, der vil guide brugerne i at foretage de nødvendige ændringer baseret på deres tilgængelige ressourcer. En mulighed for fjernelse af den digitale annotationskomponent er også blevet bemærket for at give mulighed for omhyggelig manuel annotering på dias. De muligheder, der gives for ændringer, maksimerer brugernes evne til at finde en mulighed, der fungerer med deres nuværende platform og softwaretilgængelighed.
Mens digital annotation og automatiseret dissektion har vist sig at være bredt anvendt på både FFPE og frisk frosset væv, er det vigtigt at bemærke, at grænserne for det automatiserede vævsdissektionsinstrument er blevet skubbet ud over dets tilsigtede anvendelse med FFPE-prøver, og protokollen er kun beregnet til forskningsbrug. Her blev vellykket tumorberigelse demonstreret gennem automatiseret tumordissektion af FFPE med lavt tumorindhold samt friske frosne væv til nukleinsyreekstraktion, WES- og RNA-sekventering. Protokollen viser, at xenograft og humane vævsregioner af interesse kunne beriges før WES- og RNA-sekventering i grundlæggende og translationelle forskningsindstillinger og bemærker også, at andre downstream molekylære anvendelser, herunder PCR, fra begge vævstyper ville være mulige. Protokollen udvider FFPE automatiserede dissektionsmuligheder og lægger grunden til frisk frosset væv automatiseret dissektion, der kan udvikles og valideres yderligere til brug i kliniske omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Charles A Havnar, Oliver Zill, Jeff Eastham, Jeffrey Hung, Jennifer Giltnane, Nicolas Lounsbury, Daniel Oreper, Sarajane Saturnio og Amy A Lo er ansatte og aktionærer i Genentech og Roche, og Mana Javey og Emmanuel Naouri er ansatte og aktionærer i Roche.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Carmina Espiritu og Robin E. Taylor for deres støtte til automatiseret dissektionsudvikling samt Genentech Pathology Core Laboratory-personalet, der støttede dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al.
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).
